專利名稱：用于向哺乳動物皮膚輸送多核苷酸的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及用于向哺乳動物皮膚細胞輸送多核苷酸疫苗的方法和裝置。更具體地，本發(fā)明提供用于使用電波和電擊(electroporation)來將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置。
背景技術(shù)：
為了本公開的目的，術(shù)語“脈沖間隔”意味著從一個脈沖的開始到下一脈沖的開始的時間。
以下討論以下公開物 美國專利No.6010613； 美國專利No.6603998； 美國專利No.6713291； “Enhancement of Cellular Immune Response to a Prostate Cancer DNAVaccine by Intradermal Electroporation”，Roos等人，在《分子理論》中，第13卷，No.2，2006年2月，320-327頁(在此稱為Roos等人)； “The Effect of pulse repetition frequency on the uptake intoelectropermeabilized cells in vitro with possible applications inelectrochemotherapy”，Pucihar等人的在Bioelectrochemistry 57(2002)，第167-172頁(在此稱為Pucihar等人)； Vernhes MC，Cabanes PA，Tessie J.Chinease Hamster ovary cells sensitivityto localized electrical stress，Bioelectrochemistry and Bioenergetics.1999，4817-25； Daskalov I，Mudrov N，Peycheva E.Exploring new instrumentation.Parameters for electrochemotherapy.Attacking tumors with bursts of biphasicpulses instead of single pulses.1999，IEEE Eng.Med.Biol 62-66； Chang DC，Cell poration and cell fusion using an oscillating electric field.1989 Biophys J.56641-652；以及 Tekle E，Astumian RD，Chock PB.Electroporation by using bipolaroscillating electric fieldAn improved method for DNA transfection of NIH 3T3cells.1991Proc.Natl.Acad.Sci.884230-4234。
在此通過參考并入的美國專利No.6010613公開了使用諸如由Cyto Pulse公司、810Cromwell Park Drive，Suite T，Glen Burnie，MD 21061的PA-4000系統(tǒng)(在此稱為PulseAgile)提供的具有寬的間隔電波的電擊。更具體地，美國專利No.6010613公開了向材料施加一系列至少三個單個、操作員控制的獨立編程的DC電脈沖，其中，該一系列至少三個DC電脈沖具有以下特征中的一個、兩個或三個(1)至少三個脈沖中的至少兩個在脈沖幅度上彼此不同；(2)至少三個脈沖中的至少兩個在脈沖寬度上彼此不同；以及(3)至少三個脈沖中的第一組兩個脈沖的第一脈沖間隔不同于該至少三個脈沖中的第二組兩個脈沖的第二脈沖間隔。
為了在此討論和公開的目的，上述向物質(zhì)施加具有特征(1)、(2)和(3)的一系列至少三個單個、操作員控制的獨立編程的DC電脈沖，在此被稱為“PulseAgile”。
在美國專利No.6010613中公開的說明書和與PulseAgile系統(tǒng)相關(guān)的文檔提供了脈沖間隔等于或大于0.1秒，即100毫秒。以下，將具有等于或大于100毫秒脈沖間隔的PulseAgile生成的電波稱為“寬間隔PulseAgile電波”或“慢PulseAgile電波”。
在美國專利No.6010613中，沒有呈現(xiàn)具體證據(jù)來證明，所送藥的疫苗成功地從基因表達出該疫苗，或提供改進的T細胞應(yīng)答，包括由于該疫苗的成功基因表達而引起的好蛋白質(zhì)的分泌得到改善。
在此都通過引用附于此的美國專利No.6603998和美國專利No.6713291都公開了使用寬間隔PulseAgile電波或慢PulseAgile電波來向生物細胞輸送多核苷酸疫苗。
Roos等公開了使用寬間隔PulseAgile電波或慢PulseAgile電波來將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中。Roos等還公開了通過檢測表達熒光素酶(luciferase)蛋白質(zhì)的遺傳標記來證實多核苷酸疫苗的成功的遺傳表達。另外，Roos等公開了通過使用寬間隔PulseAgile電波或慢PulseAgile電波來將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中，存在改進的T細胞應(yīng)答，包括由于多核苷酸疫苗的成功的遺傳表達而引起的好的蛋白質(zhì)的分泌改善。在Roos等中，T細胞應(yīng)答用產(chǎn)生PSA特異性IFN(γ)的CD8+T細胞來代表。
除了在Roos等的公開物中公開的有益結(jié)果以外，存在通過使用慢PulseAgile電波而觀察到的兩個不期望的結(jié)果。第一個不期望的結(jié)果是，每個慢PulseAgile電波送藥過程花費大約3.5秒。由于使用刺到哺乳動物皮膚中的針來送藥導(dǎo)致不舒適或疼痛，因此對于這3.5秒的送藥過程哺乳動物將不得不忍受大約3.5秒的不舒適或疼痛。
在Roos等中公開的第二個不期望的結(jié)果是，每個慢PulseAgile電波導(dǎo)致能感知的肌肉收縮。肌肉收縮本身也可能導(dǎo)致不舒適或疼痛。通常，為運送多核苷酸疫苗，將向哺乳動物施加多個脈沖波形。因此，將伴隨這這種慢PulseAgile電波而發(fā)生具有多次額外的肌肉不舒適或疼痛的多次肌肉收縮。
Pucihar等公開了在其2002年的
公開日之前，已經(jīng)結(jié)合化學(xué)療法藥劑使用電脈沖來治療癌癥細胞。早前的電脈沖具有1Hz的頻率，從而每個脈沖產(chǎn)生一次相關(guān)的強直性收縮(肌肉收縮)。注意，1Hz意味著每個周期1000毫秒。所討論的電脈沖規(guī)程是具有均勻的(uniform)脈沖幅度、均勻的脈沖寬度和均勻的脈沖間隔的脈沖的所有脈沖序列?；瘜W(xué)療法藥劑包括小的不滲透的親水分子。Pucihar等的研究涉及將癌變細胞用非滲透性親水小分子熒光黃(LuciferYellow)處理后進行體外(而非體內(nèi))實驗。Pucihar等發(fā)表的研究探索了各種脈沖重復(fù)頻率以便超過強直性收縮的頻率(以便使連續(xù)的肌肉收縮融入到平穩(wěn)的運動中)。在Pucihar等中存在如下陳述通過40Hz或更快的刺激頻率，使連續(xù)的肌肉收縮融入到平穩(wěn)的運動中。該40Hz脈沖頻率使用均勻脈沖幅度、均勻脈沖寬度和均勻脈沖間隔的脈沖。注意，40Hz意味著每個周期25毫秒。
Vernhes等人公開了CHO細胞在體外經(jīng)0.5到100Hz的脈沖頻率電擊后，其活力和滲透性很高。
Daskalov等人公開了，對體內(nèi)腫瘤細胞以1Hz和1kHz輸送八個雙極性脈沖時，產(chǎn)生類似的對電化學(xué)療法(electrochemotherapy)的應(yīng)答。
Chang公開了高頻正弦波以短脈沖的形式能在體外有效地電擊COS-M-6細胞。
Tekle等人公開了以60kHZ到1MHZ的頻率輸送的單極或雙極矩形波脈沖有效地體外轉(zhuǎn)染(transfect)NIH 3T3細胞。
Pucihar、Vernhes等人、Daskalov等人、Chang或Tekle等人的文獻中都沒有公開與多核苷酸疫苗接種、與多核苷酸疫苗的成功遺傳表達、或與T細胞應(yīng)答改善(包括由于多核苷酸疫苗的成功遺傳表達而引起的期望的蛋白質(zhì)的分泌改善的的任何關(guān)系的描述。
鑒于以上，期望提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置，其用少于3.5秒的時間運送多核苷酸疫苗。
另外，期望提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置，其向哺乳動物皮膚施加多個PulseAgile電波并且這多個施加的電波僅導(dǎo)致一次肌肉收縮。
要成功運送多核苷酸疫苗，必須證明所運送的多核苷酸疫苗成功進行遺傳表達。另外，所送藥的多核苷酸要成功表達，必須證明因多核苷酸疫苗的成功遺傳表達而產(chǎn)生了所需蛋白質(zhì)。
因此，雖然現(xiàn)有技術(shù)的上述內(nèi)容指出使用電擊裝置是公知的，但上述現(xiàn)有技術(shù)不教導(dǎo)或啟示具有如下期望的特征的組合的用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置(1)提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置，其用少于3.5秒運送多核苷酸疫苗；(2)向哺乳動物皮膚施加多個PulseAgile電波、并且這多個施加的電波僅導(dǎo)致一次肌肉收縮；(3)給出所送藥的多核苷酸疫苗的成功遺傳表達的證明；以及(4)給出由于多核苷酸疫苗的成功遺傳表達而提供所需蛋白質(zhì)的證明。前述期望的特征由用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的本發(fā)明的特有方法和裝置提供，本發(fā)明將從以下描述中變得清晰。還將清楚地呈現(xiàn)本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的其他優(yōu)點。
前述期望的特征由用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的本發(fā)明的特有方法和裝置提供，本發(fā)明將從以下描述中變得清晰。還將清楚地呈現(xiàn)本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的其他優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法包括以下步驟 (a.)將多核苷酸疫苗送藥到送藥點處的皮膚中， (b.)對送藥點附近的皮膚施加針電極， (c.)施加一系列至少三個單個、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒的脈沖間隔的窄間隔電波，以通過電擊將多核苷酸疫苗輸送到皮膚細胞中。該一系列至少三個波形具有以下特征中的一個、兩個或三個(1)至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；(2)至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及(3)至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔。
該一系列至少三個單個、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒的脈沖間隔的窄間隔電波在此被稱為“快PulseAgile電波”或“窄間隔PulseAgile電波”。
優(yōu)選地，該窄間隔電波具有少于幾毫秒的脈沖間隔。
通過本發(fā)明方法的一個實施例，順序地進行步驟(a.)和步驟(b.)。例如，首先將DNA疫苗注入到皮膚中以形成小泡。然后，將針電極放置到跨騎該小泡的皮膚中。在這方面，可以使用“Derma Vax”系統(tǒng)。
通過本發(fā)明方法的另一實施例，使用用多核苷酸疫苗預(yù)先涂覆的電極來同時進行步驟(a.)和步驟(b.)。在這方面，可以使用“Easy Vax”系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的裝置，其包括窄間隔電波發(fā)生器，其能夠施加一系列至少三個單個、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒的脈沖間隔的窄間隔電波，以及已適于接觸被施加了多核苷酸疫苗的皮膚的電極。
一系列至少三個波形具有以下特征中的一個、兩個或三個特征(1)至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；(2)至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及(3)至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔，且電極被連接到所述窄間隔電波發(fā)生器。
通過本發(fā)明的裝置的一個實施例，在用電極接觸皮膚之前就已經(jīng)向皮膚施加了多核苷酸疫苗。這可以通過使用皮下注射針來實現(xiàn)。
通過本發(fā)明的裝置的另一實施例，將多核苷酸疫苗預(yù)先涂覆在電極上，且在電極與皮膚接觸的同時施加給皮膚。
提供快PulseAgile電波或窄間隔PulseAgile電波且使用任何適當?shù)碾姌O來向哺乳動物皮膚施加的裝置由Cyto Pulse公司、810 Cromwell Park Drive，Suite T，Glen Bumie，MD 21061制造，且已知為名稱“Derma Vax”。
關(guān)于Cyto Pulse公司的“Derma Vax”系統(tǒng)的更多信息在以下公開中在互聯(lián)網(wǎng)上登陸URL網(wǎng)址www.cytopulse.com/dna vaccine.shtml，接下來點擊題為“Derma Vax Data Sheet(99Kb)”的鏈接，就能找到題為“Derma VaxTMClinical Evaluation Intra-dermal System”的信息頁。該信息頁的直接網(wǎng)址是http://www.cytopulse.com/pdf/Datasheet％20Derma％20Vax.pdf。
提供快PulseAgile電波或窄間隔PulseAgile電波、且使用了適于哺乳動物皮膚施用的預(yù)涂覆電極的裝置由Cyto Pulse公司制造，且已知為名稱“EasyVax”。
提供快PulseAgile電波或窄間隔PulseAgile電波的裝置也由Cyto Pulse公司制造，且已知為名稱“CCEP-40波形發(fā)生器”。如上所述，對于“CCEP-40波形發(fā)生器”的說明可參見上述題為“Derma VaxTMClinical EvaluationIntra-dermal System”的信息頁。
上述簡短描述較寬泛地闡述了本發(fā)明的的更重要特征，以便可以更好地理解以下的詳細描述，且以便可以更好地理解對現(xiàn)有技術(shù)的解釋。當然，存在此后描述的本發(fā)明的額外的特征，且將用于所附的權(quán)利要求的主題。
在這方面，在更詳細地說明本發(fā)明的原理的一些實施方式之前，應(yīng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用上不局限于該解釋的的細節(jié)和在以下描述或圖中圖示的組件的布置。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)且以各種方式進行其他實施例。而且，還應(yīng)理解，在此使用的短語和術(shù)語是用于描述的目的，且不應(yīng)該認為是限制。
如此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，該公開所基于的概念可以容易地被利用作為用于設(shè)計實現(xiàn)本發(fā)明的若干目的的其他結(jié)構(gòu)、方法和系統(tǒng)的基礎(chǔ)。因此，重要的是，權(quán)利要求被看作包括其不脫離本發(fā)明的精神和范圍的等同解釋。
因此，本發(fā)明的目的是，提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的新的改進的方法和裝置，其用少于3.5秒運送多核苷酸疫苗。
本發(fā)明的另一目的是，提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的新的改進的方法和裝置，其向哺乳動物皮膚施加多個PulseAgile電波，并且這多個施加的電波僅導(dǎo)致一次肌肉收縮。
本發(fā)明的再一目的是，提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的新的改進的方法和裝置，其給出所送藥的多核苷酸疫苗成功進行遺傳表達的證據(jù)。
本發(fā)明的再一目的是，提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的新的改進的方法和裝置，其給出由于多核苷酸疫苗的成功遺傳表達而提供所需蛋白質(zhì)的證據(jù)。
在所附且構(gòu)成本公開的一部分的權(quán)利要求中具體地指出了本發(fā)明的這些以及其他目的、以及限定本發(fā)明的新穎性的各種特征。為了更好地理解本發(fā)明、通過其使用而獲得的其操作優(yōu)點和具體目的，應(yīng)該必須參考附圖和其中示出了本發(fā)明的優(yōu)選實施例的描述性主題。
在學(xué)習(xí)了以下詳細的描述之后，將更好地理解本發(fā)明，且上述目的以及除了上述目的以外的目的將變得更清楚。這種描述參考附圖進行，在附圖中 圖1例示，用“Derma Vax”儀器電擊輸送熒光素酶質(zhì)粒時，施加快PulseAgile電波相比于施加慢PulseAgile電波而引起的熒光素酶表達的比較。
圖2例示，用“Derma Vax”儀器電擊輸送熒光素酶質(zhì)粒時，施加快PulseAgile電波相比于施加慢PulseAgile電波而引起的、對Dengue 1 DNA疫苗接種的T細胞應(yīng)答的比較。
圖3例示，用“Derma Vax”儀器電擊輸送熒光素酶質(zhì)粒時，施加快PulseAgile電波相比于施加慢PulseAgile電波而引起的熒光素酶表達的比較。
具體實施例方式 提供了一種方法和裝置用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中，且以下將參考附圖描述所述方法和裝置。
對于“Derma Vax”和“CCEP-40波形發(fā)生器”說明如下 DERMA VAX說明 操作 模式1-由經(jīng)過訓(xùn)練的護理專家來進行的疫苗輸送 觸摸屏 打開參數(shù)進入窗口 用病人ID進入 用疫苗ID進入 用電極ID進入 接種信息屏幕 SKIN-測量皮膚每秒電阻并顯示 READY-接通高壓電源 START-啟動脈沖(pulsing) DONE-接種完成 模式2-由經(jīng)過訓(xùn)練的IT專家建立 脈沖參數(shù) 下載數(shù)據(jù)文件 輸送電極 疫苗輸送量- 2個小泡x 25μl每IDA-4-6 2個小泡x 50μl每IDA-6-6 輸送目標-皮膚/真皮 電極 把手(handle)--用酒精清潔后可反復(fù)使用 tip- 無菌 單獨包裝 一次性 IDA-4-4 IDA-4-6IDA-6-6 行間距 4mm 4mm6mm 針/行 R 6 6 針間距 15.mm 1.5mm 1.5mm 針直徑 0.3mm 0.3mm 0.3mm 針長度 2mm 3mm3mm V/d最大2500v/cm2500v/cm 1667v/em CCEP-40波形發(fā)生器 脈沖 皮膚電阻脈沖-每秒5伏特4μs 脈沖規(guī)程參數(shù) 在一組中的參數(shù) 脈沖寬度 50μs到1ms50到1000伏特 50μs到10ms50到300伏特 脈沖電流行程(trip)26amps 負荷范圍 15到1500ohms 脈沖數(shù)量 1到10 最大占空因數(shù) 50％ 間隔 200μs到1秒(脈沖開始到脈沖開始) 組數(shù)量3 脈沖測量 內(nèi)部數(shù)字化器(digitizer) 水平12比特 采樣脈沖寬度/8最小100μs 內(nèi)部存儲以及存儲在外部USB盤(USB key)上的數(shù)據(jù) 數(shù)據(jù)類型 原始數(shù)據(jù)DV<日期>.xml 日志數(shù)據(jù) DV<日期>.txt CSV數(shù)據(jù) DV<日期>.csv 所有數(shù)據(jù)自動地存儲在內(nèi)部存儲器中，且可以下載到外部USB盤 存儲的且可從內(nèi)部閃存獲得的最大數(shù)據(jù)日志＞20000 前面板 計算機 操作系統(tǒng)WindowsTM Mobile 6.0 界面觸摸屏 具有照明的行/主開關(guān)(Line/Mains Switch) 緊急停止按鈕(將計算機復(fù)位到就緒狀態(tài)) 觸摸屏 USB端口 電極連接器費希爾系列(Fischer Series)4032 后面板 功率條目IEC 320 以太網(wǎng) RJ45 電氣和機械方面 CCEP-40A有把手的箱子 寬度32mm×高度20mm×長度40mm 寬度12.6英寸×高度7.9英寸×長度15.7英寸 重量25磅，11.3kg 工作溫度10到40℃ 主電壓 100到250vac 保險絲 5A slo blo，5mm×20mm 電源保留＞斷電后5分鐘 以下闡述使用用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞的本發(fā)明裝置實施本發(fā)明方法的實驗。
實驗1 目的和范圍 該實驗的目的是比較(使用Cyto Pulse的“Derma Vax”系統(tǒng)的)快PulseAgile電波與(使用Cyto Pulse的PA-4000系統(tǒng)的)慢PulseAgile電波。新的Derma Vax系統(tǒng)可以比PA-4000更快地輸送脈沖。
背景 Anna-Karin Roos醫(yī)生披露了至少兩個在小鼠皮膚中引發(fā)良好熒光素酶表達的波形。所使用的系統(tǒng)是PA-4000，且使用慢PulseAgile電波。已經(jīng)給使用“CCEP-40波形發(fā)生器”的Derma Vax系統(tǒng)裝配了新能力。一個顯著的不同是Derma Vax系統(tǒng)可以輸送具有更短脈沖間隔的脈沖。也就是說，通過“DermaVax”系統(tǒng)，可以提供少于100毫秒的脈沖間隔。該實驗將評估使用快PulseAgile電波對活體中熒光素酶表達的效果。
方法 使用的質(zhì)粒來自Aldeveron的gWizLuciferase，在無菌PBS中5mg/ml被稀釋到0.5mg/ml。
系統(tǒng)Derma Vax#F2LQ2608851 電極真皮內(nèi)陣列(4mm間隙，每行6針，2行)平行行電極。
注射用帶有呼吸孔的50ml錐管來約束小鼠。將小鼠頭向前插入管中。尾巴垂在我的左手食指上。用小剪刀除去尾根的一小塊毛發(fā)。用27號、0.5英寸的針配結(jié)核菌素注射器，在尾根和骶骨右側(cè)真皮內(nèi)注入20微升。該部位用Sharpee筆標記。將數(shù)行針插在注射點周圍，使電極間隙從左向右，由此使這些行頭尾相連。啟動所選的電擊方案，移除針。在骶骨左側(cè)重復(fù)該過程。
組(即籠)。所有時間以毫秒示出。
方案籠1籠2 V/d 1 1125 1125 V1 450450 PW 10.05 0.05 #1 1 1 PI1 3000.2 V/d21125 1125 V2 450450 PW 20.05 0.05 #2 1 1 PI2 500100 V/d 3 275275 V3 110110 PW 310 10 #3 8 8 PI 330020 將小鼠送回它們的籠。
18-24小時后，使小鼠吸入CO2，實施安樂死。用6mm打孔器從兩個注射部位分別切取組織進行活檢。用剪刀取皮下組織，向皮膚和皮下組織加入1ml裂解緩沖液。樣品在冰上維持直到進行測試。
組織用模型IKA組織勻漿器進行勻漿。向白色測試板中添加1ml勻漿物的50微升樣品。將已知量的熒光素酶用裂解緩沖液進行三倍系列稀釋，制得標準品。熒光素酶測定試劑盒中的試劑A向每孔加50微升。將該板至于96孔發(fā)光計(luminometer)。加50微升試劑B，測量在一秒鐘內(nèi)得到的光。
將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excell電子數(shù)據(jù)表，用于數(shù)據(jù)分析。
結(jié)果見圖1?？祀姴ǚ桨负吐姴ǚ桨傅倪z傳表達在統(tǒng)計學(xué)上是等同的。
結(jié)果 ng/每個部位 籠1 籠2 PA慢PA快 22 43 464 510 486 283 180 267 197 168 -------------------------------- 平均270 254 SD 200 172 CV 746 8 令人驚訝且未預(yù)料的結(jié)果是用脈沖間隔少于100毫秒的快PulseAgile電波，可以將多核苷酸疫苗電擊到哺乳動物皮膚細胞中、并伴隨成功的遺傳表達。
更令人驚訝且未預(yù)料的結(jié)果是用脈沖間隔為數(shù)毫秒的快PulseAgile電波，可以將多核苷酸疫苗電擊到哺乳動物皮膚細胞中、并伴隨成功的遺傳表達。而傳統(tǒng)認為，脈沖間隔的時間常量在僅數(shù)毫秒的水平時，不能實現(xiàn)成功的電擊。
實驗2 目的和范圍 該實驗的目的是比較(使用Cyto Pulse的“Derma Vax”系統(tǒng)的)快PulseAgile電波與(使用Cyto Pulse的PA-4000系統(tǒng)的)慢PulseAgile電波而引發(fā)的T細胞應(yīng)答。新的Derma Vax系統(tǒng)可以比PA-4000更快地輸送脈沖。更具體地，該研究的目的是，比較用Pulse Agile Derma Vax輸送表達prM-E和NS1-NS3的Dengue 1質(zhì)粒進行DNA免疫而引發(fā)的T細胞應(yīng)答。
背景 Anna-Karin Roos醫(yī)生披露了至少兩個在小鼠皮膚中引發(fā)良好熒光素酶表達的波形。所使用的系統(tǒng)是PA-4000，且使用慢PulseAgile電波。已經(jīng)給使用“CCEP-40波形發(fā)生器”的Derma Vax系統(tǒng)裝配了新能力。一個顯著的不同是Derma Vax系統(tǒng)可以輸送具有更短脈沖間隔的脈沖。也就是說，通過“DermaVax”系統(tǒng)，可以提供少于100毫秒的脈沖間隔。該實驗將評估使用快PulseAgile電波對活體中T細胞應(yīng)答的效果。
方法 使用的質(zhì)粒Dengue 1 prM-E和Dengue 1 NS1-NS3都是5mg/ml，在相同的無菌PBS中分別稀釋到0.5mg/ml。
系統(tǒng)Derma Vax#07-0215DV 電極真皮內(nèi)陣列(4mm間隙，每行6針，2行)平行行電極。
注射用帶有呼吸孔的50ml錐管來約束小鼠。將小鼠頭向前插入管中。尾巴垂在我的左手食指上。用小剪刀除去尾根的一小塊毛發(fā)。用27號、0.5英寸的針配結(jié)核菌素注射器，在尾根和骶骨右側(cè)真皮內(nèi)注入20微升。將數(shù)行針插在注射點周圍，使電極間隙從左向右，由此使這些行頭尾相連。啟動所選的電擊方案，移除針。在骶骨左側(cè)重復(fù)該過程。
組(即籠)。所有時間以毫秒示出。
方案 組P 組Q 對照 V/d 1112511250 V1 450 450 0 PW 1 0.050.050 #1 1 1 0 PI 1 0.2 300 0 V/d 211251125 V2 450 450 PW 2 0.050.05 #2 1 1 PI 2 30 300 V/d 3275 275 3110 110 PW 3 10 10 #3 8 8 PI 3 20 100 將小鼠送回它們的籠。
免疫的兩周后，小鼠吸入CO2來實施安樂死，收集脾，進行胞內(nèi)細胞因子測定。
結(jié)果 以下示出的結(jié)果是伽馬干擾素陽性的CD8陽性細胞的百分比。
所述結(jié)果已減去未免疫動物的背景值。 快(組P) 慢(組O) 6.424.03 5.386.11 4.353.36 4.282.75 2.062.16 平均 4.503.68 SD1.621.53 測試結(jié)果參見圖2。對這些測試結(jié)果進行Student’s T檢驗，發(fā)現(xiàn)快電波方案和慢電波方案之間存在統(tǒng)計學(xué)上不明顯的差異。鑒于此，快電波方案和慢電波方案在強化T細胞方面是統(tǒng)計學(xué)等同的。
結(jié)論 進行活體電擊時，Derma Vax”系統(tǒng)輸送的快PulseAgile電波與“DermaVax”系統(tǒng)輸送的慢PulseAgile電波引起等同的T細胞應(yīng)答。
表1 用快PulseAgile電波電擊比用慢PulseAgile電波電擊 減少了能感知到的肌肉收縮。
參數(shù)快Pulse Agile 慢Pulse Agile 脈沖的輸送次數(shù) 1010 總輸送時間 0.23秒3.5秒 感知的肌肉收縮次數(shù) 1 10 顯然，采用快PulseAgile電波(相比于慢PulseAgile電波)，輸送時間比3.5秒少得多，且甚至當輸送了10個脈沖時僅感知到1次肌肉收縮。
參考圖3，如下進行DNA輸送(DNA是多核苷酸)。
小鼠用4％異氟烷(Baxter Medical AB，Kista，Sweden)麻醉，免疫期間面罩中維持2-2.5％異氟烷。用29G胰島素級注射器(Micro-Fine U-100，BDConsumer Healthcare，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，在尾根部附近雙側(cè)真皮內(nèi)，注入20μg DNA的PBS溶液。
隨后，在注射區(qū)域隆起的皮膚上放置針陣列電極，施加電壓(2個脈沖，1125V/cm，50μ秒+8個脈沖，275V/cm，10毫秒)。改變脈沖間隔，以實施快和慢的PulseAgile方案。
所使用的針陣列電極是Cyto Pulse Intradermal array(四針，4mm間隙，兩行)(Cyto Pulse Sciences公司，Glen Burnie，MD)。使用Derma Vax電擊系統(tǒng)(Cyto Pulse Sciences公司)來進行電擊。
從以上清楚看出，本發(fā)明通過提供將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的新的改進方法和裝置，實現(xiàn)了上述的所有目標，本發(fā)明的方法和裝置具有使用優(yōu)勢，且施用多核苷酸疫苗的時間少于3.5秒。本發(fā)明提供的將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置，向哺乳動物皮膚施加了多個PulseAgile電波，但這多個施加的電波僅導(dǎo)致一次肌肉收縮。本發(fā)明提供的將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置，能給出所運送的多核苷酸疫苗成功遺傳表達的證據(jù)。本發(fā)明提供的將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置，能給出由于送藥的多核苷酸疫苗成功遺傳表達而提供所需蛋白質(zhì)的證明。
本發(fā)明的使用方式和操作方式也是從上述公開的內(nèi)容可明顯體現(xiàn)出的，因此，不需要對使用方式和操作方式進一步討論。
因此，雖然在附圖中示出了本發(fā)明且上述結(jié)合呈現(xiàn)的事務(wù)具體且詳細地描述了上述內(nèi)容確實是本發(fā)明的最實際和優(yōu)選的實施例，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚，可以在不脫離在此闡述的原理和概念的情況下進行許多修改，包括但不限于在方法、組件和使用的尺寸、材料、形狀、形式、功能和方式上的改變。
權(quán)利要求
1.一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法，包括以下步驟
(a.)將多核苷酸疫苗送藥到送藥點處的皮膚中，
(b.)對送藥點附近的皮膚施加針電極，
(c.)施加一系列至少三個單個的、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒脈沖間隔的窄間隔電波，以通過電擊將多核苷酸疫苗輸送到皮膚細胞中，
其中，該一系列至少三個波形具有以下特征中的一個、兩個或三個特征(1)該至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；(2)該至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及(3)該至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，順序地執(zhí)行步驟(a.)和步驟(b.)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，使用用多核苷酸疫苗預(yù)先涂覆的電極來同時進行步驟(a.)和步驟(b.)。
4.一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的裝置，包括
窄間隔電波發(fā)生器，其能夠施加一系列至少三個單個的、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒脈沖間隔的窄間隔電波，其中，該一系列至少三個波形具有以下特征中的一個、兩個或三個特征(1)該至少三個波形中的至少兩個在波形幅度上彼此不同；(2)該至少三個波形中的至少兩個在波形寬度上彼此不同；以及(3)該至少三個波形中的第一組兩個波形的第一波形間隔不同于該至少三個波形中的第二組兩個波形的第二波形間隔，以及
連接到所述窄間隔電波發(fā)生器的電極，其中，所述電極已適于接觸被施加了多核苷酸疫苗的皮膚。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的裝置，其中，在用所述電極接觸皮膚之前已向皮膚施加了多核苷酸疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的裝置，其中，將多核苷酸疫苗預(yù)先涂覆在電極上，并在電極與皮膚接觸的同時施加到皮膚上。
7.一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法，包括以下步驟
(a.)將多核苷酸疫苗送藥到送藥點處的皮膚中，
(b.)對送藥點附近的皮膚施加針電極，
(c.)施加一系列具有少于100毫秒脈沖間隔的窄間隔電波，以通過電擊將多核苷酸疫苗輸送到皮膚細胞中。
8.一種用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的裝置，包括
窄間隔電波發(fā)生器，其能夠施加一系列具有少于100毫秒脈沖間隔的窄間隔電波，以及
連接到所述窄間隔電波發(fā)生器的電極，其中，所述電極已適于接觸被施加了多核苷酸疫苗的皮膚。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供用于將多核苷酸疫苗輸送到哺乳動物皮膚細胞中的方法和裝置，以增加T細胞應(yīng)答并減少由于長電波的施加以及由于肌肉收縮而導(dǎo)致的疼痛和不舒適。該方法包括(a)將多核苷酸疫苗送藥到送藥點處的皮膚中，(b)對送藥點附近的皮膚施加針電極，(c)施加一系列至少三個單個的、操作員控制的、獨立編程的、具有少于100毫秒脈沖間隔的窄間隔電波，以通過電擊將15多核苷酸疫苗輸送到皮膚細胞中。
文檔編號A61K48/00GK101778643SQ200880025576
公開日2010年7月14日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月21日
發(fā)明者理查德·E·沃爾特斯, 德林·C·沃爾特斯, 艾倫·D·金, 安娜-卡林·魯斯 申請人:塞托·帕爾斯科技公司