用于治療雷特綜合征和突觸病癥的igf的制作方法

專利名稱：用于治療雷特綜合征和突觸病癥的igf的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于治療雷特綜合征(Rett Syndrome)以及其它突觸功能和成熟之障 礙的方法。
背景技術：
雷特綜合征(RTT)是一種與X染色體基因甲基CpG結合蛋白2 (MeCP2)的突變相 關的發育病癥。MeCP2編碼調節轉錄的蛋白質。其形成與甲基化基因序列結合的轉錄阻遏 物復合物并誘導染色質凝聚。雷特綜合征患者幾乎全部為女性，所述患者表現出與眾不同的手部運動、腦生長 減慢、語言和運動技能衰退、癲癇發作、認知障礙和智力遲鈍。皮層結構相對保守，但是樹突 結構改變并且樹突棘似乎在結構上不成熟。已經建立了雷特綜合征的小鼠模型(Chen等，Nat Genet. 27(3) =327-31, 2001 ； Guy 等，Nat Genet. 27(3) :322_6，2001 ；Shahbazian 等，Neuron 35(2) :243_54，2002)。 MeCP2敲除(KO)小鼠表現出運動和呼吸表型、較小的錐體神經元以及電生理異常，這表明 突觸和神經元不成熟。MeCP2截短突變導致運動和社交功能障礙、突觸可塑性和記憶力的改變。在滿足一定條件下的MeCP2K0小鼠模型中MeCP2水平的恢復使運動功能恢復(Guy 等，Science 315(5815) :1143_7，2007)。KO小鼠中BDNF表達增加可逆轉運動和電生理表 型(Chang等，Neur0n49(3) :341_8，2006)。這些和其它數據表明，在小鼠模型中，突觸仍然 處于不成熟狀態，進行合適的治療(即便在發育后期)可重新恢復功能。

發明內容
強烈需要發現用于治療雷特綜合征和其它具有突觸和神經元不成熟或突觸可塑 性改變的病癥(例如孤獨癥譜系障礙)的新的和/或更好的可選擇方法。根據促進突觸成熟的基因和分子可能恢復MeCP2K0小鼠的突觸和行為功能這一 假說，本申請人測定了胰島素樣生長因子(IGFl)或IGFl的肽片段(1-3) IGF-I (又稱為甘 氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸，甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸以及GPE)，出乎意料地發現它們是用 于恢復MeCP2KO小鼠功能和人RTT治療的可行的候選化合物。這兩種分子和其它類似分子(例如也可以用在本發明中的(1-3) IGF-I類似物)可透過血腦屏障，因此可作為用于RTT和其 它病癥的小分子治療劑進行全身施用。反之，較大的分子例如腦源性神經營養因子(BDNF) 和大多數其它突觸可塑性分子不能透過血腦屏障，因此需要直接進行腦輸注，這在人中是 不可行的。根據本發明的一個方面，提供了用于治療雷特綜合征的方法。所述方法包括向需 要此治療的對象施用有效量的胰島素樣生長因子(IGFl)、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I 類似物來治療所述對象。在一些實施方案中，施用IGFl。優選地，所述IGFl是重組IGFl或人IGFl。在優選 的實施方案中，所施用的IGFl的劑量是約0. l-10mg/kg/天，更優選是約0. l_2mg/kg/天。在一些實施方案中，施用(1-3)IGF_1。在優選的實施方案中，所施用的(1_3) IGF-I的劑量是約0. l-100mg/kg/天，更優選是約6_20mg/kg/天。在又一些實施方案中，施用(1-3) IGF-I類似物。優選地，所述(1_3) IGF-I類似物 是 Gly-Pro ；Pro-Glu ； (1-3) IGF-I 替換類似物，其中 Gly-Pro-Glu 中的 Gly 被替換為 Ala、 Ser、Thr或Pro中的任一個，或者其中Gly-Pro-Glu中的Pro被替換為Ala、Ser、Thr或Gly 中的任一個，或者其中Gly-Pro-Glu中的Glu被替換為AsruAsp或Gln中的任一個；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸(1-3) IGF-I ；具有一個或兩個D-氨基酸的(1_3) IGF-I類似物；或者具 有一個或兩個不可水解肽鍵的(1-3) IGF-I類似物。在一些實施方案中，施用相關治療分子。優選地，所述相關治療分子是IGF-I促 分泌素、生長激素或前體、生長激素促分泌素、生長激素釋放肽或生長激素釋放激素或類似 物。在所述方法的優選實施方案中，所述對象是人。在所述方法的某些實施方案中，所述IGFl、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I類似物 經口服、靜脈內、肌內、鼻內、腹膜內、皮下或鞘內施用。所述IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I類似物可在診斷出雷特綜合征之后施 用，或者可在診斷出雷特綜合征之前預防性施用。在另一些實施方案中，所述對象沒有其它需要用IGFl、(1-3) IGF-I或(1-3) IGF-1 類似物進行治療的癥狀。在另一些實施方案中，所述方法還包括首先檢測該對象中編碼甲基化CpG結合蛋 白2(MeCP2)之基因的突變。在一些實施方案中，所述方法還包括向所述對象施用第二治療劑，其中所述第二 治療劑是tPA，BDNF，調節抑制的分子例如苯并二氮雜:^類，或者是作為神經遞質激動劑、 拮抗劑或類似物的分子；其中所述第二治療劑和所述IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-1類似 物和/或相關治療分子以有效治療所述對象的組合量施用。在前述方法中，IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子的量可 有效恢復突觸功能和/或使突觸成熟、鞏固突觸和/或調節神經元可塑性。根據本發明的另一個方面，提供了用于治療對象中突觸功能和/或成熟之障礙的 方法。所述方法包括向需要此治療的對象施用有效量的胰島素樣生長因子(IGFl)、甘氨 酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸((1-3) IGF-1)和/或(1-3) IGF-I類似物以治療所述對象。在一些實施方案中，施用IGFl。優選地，所述IGFl是重組IGFl或人IGFl。在優選的實施方案中，所施用的IGFl的劑量是約0. l-10mg/kg/天，更優選是約0. l_2mg/kg/天。在另一些實施方案中，施用(1-3)IGF_1。在優選的實施方案中，所施用的(1_3) IGF-I的劑量是約0. l-100mg/kg/天，更優選是約6_20mg/kg/天。
在又一些實施方案中，施用(1-3) IGF-I類似物。優選地，所述(1_3) IGF-I類似物 是 Gly-Pro ；Pro-Glu ； (1-3) IGF-I 替換類似物，其中 Gly-Pro-Glu 中的 Gly 被替換為 Ala、 Ser、Thr或Pro中的任一個，或者其中Gly-Pro-Glu中的Pro被替換為Ala、Ser、Thr或Gly 中的任一個，或者其中Gly-Pro-Glu中的Glu被替換為AsruAsp或Gln中的任一個；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸(1-3) IGF-I ；具有一個或兩個D-氨基酸的(1_3) IGF-1類似物；或者具 有一個或兩個不可水解肽鍵的(1-3) IGF-I類似物。在一些實施方案中，施用相關治療分子。優選地，所述相關治療分子是IGF-I促 分泌素、生長激素或前體、生長激素促分泌素、生長激素釋放肽或生長激素釋放激素或類似 物。在所述方法的優選實施方案中，所述對象是人。在所述方法的某些實施方案中，所述IGFl、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I類似物 經口服、靜脈內、肌內、鼻內、腹膜內、皮下或鞘內施用。所述IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I類似物可在診斷出雷特綜合征之后施 用，或者可在診斷出雷特綜合征之前預防性施用。在優選的實施方案中，所述病癥是孤獨癥、孤獨癥譜系障礙、安格爾曼綜合征 (Angelmann' s Syndrome)、結節性硬化、脆性X綜合征、精神分裂癥、抑郁癥、神經退行性疾 病(包括帕金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默病)、中風或外傷。在另一些實施方案中，所述對象沒有其它需要用IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I類似物進行治療的癥狀。在一些實施方案中，所述方法還包括首先檢測所述對象中作為疾病遺傳基礎之基 因的突變或者作為該基因之靶標或下游的基因中的突變。在另一些實施方案中，所述方法還包括向所述對象施用第二治療劑，其中所述第 二治療劑是tPA，BDNF,調節抑制的分子例如苯并二氮雜革類，或者是作為神經遞質激動 齊U、拮抗劑或類似物的分子。在這些實施方案中，其中所述第二治療劑和所述IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I類似物以有效治療所述對象的組合量施用。在前述方法中，IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I類似物的量可有效恢復突觸 功能和/或使突觸成熟、鞏固突觸和/或調節神經元可塑性。根據本發明的第三個方面，提供了用于促進突觸成熟的方法。所述方法包括使含 有一個或多個突觸的一個或多個神經元與一定量的IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I 類似物相接觸，所述量可有效促進所述一個或多個神經元的一個或多個突觸的成熟。在一些實施方案中，所述一個或多個神經元與IGFl接觸。優選地，所述IGFl是重 組IGFl或人IGFl。在另一些實施方案中，所述一個或多個神經元與(1-3) IGF-I或(1-3) IGF-1類似 物接觸。優選地，所述(1-3) IGF-I類似物是Gly-Pro ；Pro-Glu ； (1-3) IGF-I替換類似物，其 中Gly-Pro-Glu中的Gly被替換為Ala、Ser、Thr或Pro中的任一個，或者其中Gly-Pro-Glu 中的Pro被替換為Ala、Ser、Thr或Gly中的任一個，或者其中Gly-Pro-Glu中的Glu被替換為Asn、Asp或Gln中的任一個；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸(1-3) IGF-1 ；具有一個或兩個 D-氨基酸的(1-3) IGF-I類似物；或者具有一個或兩個不可水解肽鍵的(1-3) IGF-I類似 物。在另一些實施方案中，施用相關治療分子。優選地，所述相關治療分子是IGF-I促 分泌素、生長激素或前體、生長激素促分泌素、生長激素釋放肽或生長激素釋放激素或類似 物。
在優選的實施方案中，所述一個或多個神經元是人神經元。在某些實施方案中，所述一個或多個神經元在體外接觸。在另一些實施方案中，所 述一個或多個神經元在體內接觸。優選地，所述在體內接觸是通過向對象施用IGFl、(l-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I類似物來進行。優選地，所述IGFU (1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I類似物經口服、靜脈內、肌內、鼻內、腹膜內、皮下或鞘內施用。可以相似方式用來治療本文所述疾病的其它相關治療分子包括IGF-I促分泌素、 生長激素或前體、生長激素促分泌素、生長激素釋放肽、生長激素釋放激素及其類似物。本文所述的治療方法還可包括施用上調或增強抑制的分子，例如苯并二氮雜罩類 或本領域技術人員公知的其它分子。所述上調或增強抑制的分子可單獨使用或者與本文所 述的IGFl、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-1類似物等組合使用。參照本發明的詳細描述，本發明的這些和其它方面以及各種優點和實用性將變得 更為明顯。本發明的每個方面可包含多個實施方案，其可通過下文描述來理解。


圖1 經(1-3) IGF-I處理的MeCP2K0動物中第5層錐體神經元的突觸電流的增加幅度。A0急性皮層切片(acute cortical slice)中細胞內自發性興奮性突觸后電流 (excitatory postsynaptic current, EPSC)記錄的代表性描記線。描記線代表野生型 (WT)、敲除型(KO)或利用(1-3) IGF-I處理兩周的KO型(KO-T) 0小鼠是28-32日齡。B.所有測量細胞中EPSC幅度的累積分布。分布表示與WT相比，KO有提高的較小 幅度事件百分率。(1-3) IGF-I處理部分但顯著地逆轉此趨勢。C.所有WT、K0和KO-T的記錄細胞中所觀察的每神經元之EPSC的平均EPSC幅度。 與WT神經元相比，KO神經元的平均EPSC幅度顯著降低。與KO相比，KO-T中平均EPSC幅 度適度但顯著地增加。D.反映EPSC頻率的EPSC事件間間隔分布在WT、K0和KO-T組之間細微但顯著地改變。圖2.樹突棘密度和形態的結構定量。A.在P28對運動皮層中第五層錐體細胞進行高爾基體染色能稀疏標記神經元和 棘的形態。B.較大放大倍數(100X)的共聚焦成像能清楚描述不同亞類的樹突棘，包括絲狀 偽足型(F)、蘑菇型(M)、短粗型(S)和纖細型(T)的棘。C.將所觀察的這些棘數量的加和除以所量化的每個神經元的樹突長度，得到其中 敲除型組織中神經元與野生型組織相比表現出棘密度降低的趨勢。利用(1-3) IGF-I處理的敲除型組織表現出與野生型更相似的棘密度值。D.就每一處理而言的某些類型的棘的百分數。與野生型和利用(1-3) IGF-I處理 的敲除型相比，敲除型中的蘑菇型或“成熟”棘減少。經處理未被改善的敲除型中也存在過 度體現(over-representation)的“纖細型，，棘。E.野生型、敲除型和用(1-3) IGF-I處理的敲除型之間的平均樹突分枝厚度沒有變化。
圖3.成年MeCP2雜合小鼠的視覺皮層可塑性被(1_3) IGF-I抑制。未單眼剝奪(WT)或單眼剝奪輸入4天(WT MD)的個體幼齡(P28)動物的眼優勢 指數(ODI)分布，反映了皮層表面對傳遞到每只眼的刺激的相對活化。分析區域通常包括 900-1300個像素的皮層表面，ODI值是由兩只眼睛驅動的每一像素處的光信號強度得到的 (參見方法部分)。每只動物的平均ODI值用于D部分的群體分析。A.在這里所描述的幼齡動物中，與未剝奪的動物(實線)相比，在WT MD動物(虛 線)中觀察到了偏向睜開眼群體ODI移動。B.對側眼單眼剝奪(MD，虛線)或未單眼剝奪(實線)的成年野生型(黑線)和 MeCP2雜合小鼠(粉色線)。C.未處理的(紫色虛線)或用(1-3) IGF-I處理的(紅色實線)的MD之后的成 年MeCP2+/_小鼠。未處理的小鼠顯示出視覺驅動(通過ODI測量的)從閉合眼朝向睜開 眼的移動，與發育中的動物相似(如A中)-證明可塑性延長并且表示不成熟突觸持續到成 年期。在MD期用(1-3) IGF-I處理使可塑性消失，保持成年動物典型的眼優勢特性(如B 中)。D.發育中的野生型小鼠(約P28，左)和成年野生型小鼠(約P60，右)的平 均ODI值。ODI正值表示來自對側眼睛的驅動較高，因此保持組織化，而負值表示來自 同側眼睛的驅動較高，因此改變了環路。野生型 t”、單眼剝奪后的野生型“wt MD”、 MeCP2+/" “+/_”、單眼剝奪后的MeCP2+/-( “+/-MD”)以及在單眼剝奪期間用(1-3) IGF-I 處理的MeCP2+/-( “+/-MD-t”)。MD后，野生型成年動物的視覺皮層仍然以對側眼為優勢， 而在成年MeCP2+/_小鼠中，對側眼的驅動嚴重減少并且ODI向同側眼移動。在MeCP2+/_小 鼠的MD過程中用(1-3) IGF-I處理能防止眼優勢向同側眼移動。P28野生型動物的ODI值 來自 Tropea 等人(Tropea 等，2006)。圖4 :MeCP2敲除動物的心臟功能、運動功能和生存受損，用(1_3) IGF-I處理后得 到恢復A. (1-3) IGF-I降低MeCP2缺陷型小鼠中心動過緩的頻率。匯集對不同處理小鼠所 觀察到的心率分布，以每分鐘跳動次數(bpm)表示。Y軸描述實驗組內超過給定bpm值(X 軸)的觀察百分率。在8周齡動物(WT或K0)之間進行比較，一些動物用(1-3) IGF-I處理 了 6周(KO-T)。與野生型分布(黑色)相比，KO分布(粉紅色)左移，表示心率分布顯著 降低。KO-T分布(綠色)在這兩條曲線之間，表明部分地恢復了 KO表型，使其趨向更正常 的野生型分布。B. (1-3) IGF-I處理提高MeCP2缺陷型小鼠的運動功能。通過將動物置于配有運 動監測器(紅外光束)的籠中測量了基線夜間活動。Y軸顯示10小時內的光束阻斷次數； 每一條帶表示不同的實驗組。在6-17周齡間每周記錄夜間活動，更幼齡動物的數據還顯示在圖6中。如所預料的，MeCP2K0小鼠表現出比野生型同窩小鼠顯著減少的活動。然而，用 (1-3) IGF-I處理的KO小鼠的活動多于載體處理的KO動物(KO)，但是少于WT。用(1_3) IGF-I處理的野生型小鼠(WT-T)的活動并不比WT的顯著增加。“N”=每組的動物數。C. (1-3) IGF-I處理的MeCP2K0小鼠具有比載體處理的對照小鼠更長的預期壽命。 用載體處理的MeCP2-/y小鼠(K0,紅線)或用(1-3) IGF-I處理的MeCP2_/y小鼠(Κ0-Τ， 綠線)的Kaplan-Meier生存曲線。X軸表示出生后的天數，Y軸表示生存概率。用(1_3) IGF-I處理的MeCP2-/y小鼠表現出比用載體處理的同窩小鼠顯著更長的預期壽命(P = 0. 54*10~-7，log rank 檢驗)。2 周齡后，每天給MeCP2-/y 小鼠 IP 注射(1-3) IGF-I (0. Olmg/ g體重/天)。“η”是每個實驗組的小鼠數。圖5 對內源信號進行光學成像以測量視覺皮層中眼優勢可塑性。Α.內源信號的光學成像可用于推導初級視覺皮層(Vl)中每只眼的驅動強度。i.視覺路徑的示意圖，顯示由每只眼向Vl的輸入。ii.所述光學成像設置的示意圖。將麻醉大鼠置于顯示周期性漂移之條帶狀刺激 的監測器的前方。用紅光(630nm)照射顱骨表面，并用CXD照相機成像。iii.當刺激對側眼(左，紅色信號)或同側眼(右，藍色信號)時具有代表性光信 號水平的Vl雙眼區中的血管圖案(白色圓圈)。對側眼的信號比同側眼的強。B.幼齡小鼠中單眼剝奪后的眼優勢移動。i.單眼眼瞼縫合4天，ii.除去眼瞼縫合后，依次刺激每只眼并記錄Vl中的視覺反應。iii.短期單眼剝奪引起被剝奪的對側眼的輸入(紅色)減弱，而未被剝奪的同側 眼的輸入(藍色)增強。C-D.在野生型動物中當在不同條件下刺激每只眼時Vl的雙眼區域中信號強度的 示意圖。紅色圓圈和藍色圓圈分別表示對側眼和同側眼所驅動的光信號強度。由每個像素 處的每只眼的相對驅動強度推導出右側的眼優勢指數(ODI)分布。顯示三個條件正常成 年野生型小鼠(C)、單眼剝奪4天后的幼齡小鼠⑶以及MD 4天后的成年小鼠。在野生型 小鼠中，在發育過程中對側眼的MD引起信號強度和ODI向睜開的同側眼移動。在成年動物 中在相似MD期后未觀察到這樣的可塑性。圖6 幼齡MeCP2缺陷型小鼠中的(1-3) IGF-I處理和運動功能。通過將動物置于配有運動監測器(紅外光束)的籠中測量了基線夜間活動。Y軸 顯示10小時內的光束阻斷次數；每一條帶表示不同的實驗組。在4-5周齡間每周記錄夜間 活動。在此，與周齡更大的動物(圖4B)相比，MeCP2K0小鼠沒有表現出比野生型同窩動物 活動更少，并且處理沒有改變活動水平。“N” =每組的動物數。圖7 (1-3) IGF-I增加海馬中神經元胞體大小。與野生型(WT)相比，MeCP2K0動物中海馬CA3區中神經元的胞體大小(細胞周長， μπι)顯著減小。(1-3) IGFl處理增加了 KO動物(Κ0_Τ)中的平均胞體大小。所述處理對野 生型動物(WT_T)中的胞體大小沒有影響。圖8 (1-3) IGF-I增加BDNF和tPA的表達與生物活性。A. (1-3) IGF-I (GPE)處理對BDNF表達水平(在mRNA水平上)的影響。單眼剝奪 顯著降低對側Vl的BDNF表達水平。(1-3) IGF-I處理能增加表達，盡管不能達到對照水平。RNA水平是利用Tropea等，2006中所述的微陣列分析得到的。B.對NeuN (綠色)和前體BDNF (ProBDNF)(紅色)抗體進行雙染色。蛋白質表達證明(1-3) IGF-I (GPE)處理能夠通過提高BDNF蛋白質表達來調節單眼剝奪作用，但是不能 調節至對照水平。抗_前體BDNF和抗-NeuN由CHEMIC0N獲得并且以1 500的濃度使 用。溶液和孵育時間如下在含有5% BSA、0. 去利通(triton)、10%血清的PBS中預孵 育。在下述溶液中于4度下與第一抗體一起孵育3天含有2% BSA、5%血清、0. 1 %曲拉通 (triton)的PBS。在PBS中清洗后，在與第一抗體的溶液相同的溶液中孵育第二生物素化 的(對前體BDNF而言)或Alexa綴合的(對NeuN而言)抗體(1 200)2小時。通過加 Aextravidine trite (Sigma-I 300)檢測所述前體 BNDF 標記。C. (1-3) IGF-I (GPE)處理對tPA的mRNA表達水平的影響。相對于對照和被剝奪的 動物，GPE處理顯著上調tPA的mRNA表達。D.對NeuN(紅色)和tPA (綠色)抗體進行雙染色。tPA染色是蛋白質表達的指 示，其存在于細胞體的尖端部分(pimcta)中，并且在MD中未顯示出相對于對照的顯著變 化。然而，tPA的表達水平似乎由于(1-3) IGF-I (GPE)處理而強烈增加。抗_tPA購自Oxford BiomedicalResearch并以1 500的濃度使用。孵育條件如下將自由漂浮的切片在含有 以下物質的封閉液中預孵育10%血清、0.3%曲拉通和PBS，然后置于第一抗體與下述物 質的混合物中過夜血清、0. 3%曲拉通、PBS、抗-tPA 1 500和抗-Neu-N 1 500。利 用與Alexa488和Alexa594綴合的第二抗體使染色顯色。E. (1-3) IGF-I (GPE)對BDNF活化的作用模式。GPE通過直接影響BDNF表達和控 制tPA(已知其將前體BDNF切割成成熟BDNF)對其的生物活化來促進BDNF活性。圖9 重組人IGFl (rhIGFl)表現出與(1-3) IGF-I相似的效力。rhIGFl與(1_3) IGF-I相似地提高P60MeCP2K0小鼠中測定的所有成熟信號，包括 (A)突觸傳導水平和(B)環路穩定性(通過抑制眼優勢可塑性)。應當理解，附圖僅僅是示例性的，而并非實施本發明所必需的。
具體實施例方式雷特綜合征(RTT)是一種由編碼甲基化CpG結合蛋白2(MeCP2)的基因的突變引 起的X連鎖智力遲鈍的嚴重形式。相當的證據表明，在作為雷特綜合征(RTT)的模型而制備的MeCP2敲除(KO)小鼠 中，突觸處于不成熟狀態。MeCP2的可能靶標似乎是IGFBP3。在MeCP2K0小鼠和人RTT患 者中IGFBP3水平上調，并且IGFBP3轉基因小鼠具有MeCP2K0小鼠的一些腦病變。另外，RTT患者中腦生長緩慢和身體生長遲緩可能表示IGFl/生長激素缺乏。已經在孤獨癥患者(以及患有腦病和腦白質疾病的患者)的腦脊液(CSF)中檢測 到了低濃度的IGFl ；而在RTT患者的CSF中則未檢測到IGFl缺乏，樣本量小。在此，我們表明成年MeCP2突變小鼠表現出不成熟皮層環路的生理信號標志，包 括較弱的體外突觸功能和持久性的體內皮層可塑性。利用(1-3) IGFl (又稱為GPE，是胰島 素樣生長因子I(IGFl)的3個氨基酸的活性片段)的全身性處理通過刺激突觸功能和穩定 環路的可塑性使成年RTT小鼠的環路恢復到更成熟的水平。此外，利用三肽的處理可改善 敲除小鼠的心動過緩、提高其運動功能和延長其壽命，我們觀察到敲除小鼠在這些方面顯著降低。我們的結果表明，(1-3) IGFl是用于藥理學治療雷特綜合征(并可能用于由延遲的突觸成熟引起的其它CNS疾病)的強力的候選化合物。基于這些發現，我們已測定了胰島素樣生長因子(IGFl)或IGFl的末端片段(1_3) IGF-I (又稱為甘氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸，甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸或GPE)，出乎意料地 發現其恢復MeCP2K0小鼠的功能，因此可用作人RTT治療劑。這些分子和其它類似分子(例 如也可以用在本發明中的(1-3) IGF-I類似物)均能透過血腦屏障，因此可作為用于RTT和 其它病癥的小分子治療劑進行全身施用。不希望受任何特定理論或IGFl作用機制所束縛，認為IGFl可彌補MeCP2損失的 影響通過上調BDNF (直接上調和通過tPA對BDNF切割上調)；通過PI3K起作用來鞏固突 觸或調節一系列神經元功能；通過彌補MeCP2對IGFBP的作用；通過上調抑制或抑制性環 路；或者通過直接影響乙酰化(例如H3和H4組蛋白的乙酰化)或MeCP2介導的轉錄。因此，在一些方面中，本發明包括向對象施用有效量的IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子來治療所述對象。術語“治療”旨在包括預防、改善、防止 或治愈病癥。病癥出現以后治療的目的在于減少、改善或完全消除所述病癥和/或其一個 或多個相關癥狀或者防止其惡化。在開始出現病癥之前對對象的治療(即預防性治療)的 目的在于降低發生病癥的風險和/或如果后來發生病癥則減輕其嚴重程度。本文所用的術 語“預防”指預防性治療具有發生病癥風險的對象，其中所述治療導致所述對象發生病癥的 概率降低，或導致所述病癥的嚴重程度低于不進行該治療時的概率增加。與不治療的對象 相比，治療可降低患有病癥的對象的死亡率或延長其預期壽命，如本發明所述。“對象”應指人或動物，包括但不限于狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、嚙齒動物 (例如大鼠和小鼠)以及靈長類動物(例如猴)。優選的對象是人對象。所述人對象可以 是兒童、成年或老年對象。除雷特綜合征以外，本發明的方法還廣泛應用于其它疾病。腦發育(以及腦發育 疾病)，包括神經形成、神經元遷移、細胞分化和生長以及突觸成熟。因為本文所述的數據涉 及IGFl/(1-3) IGF-I對突觸功能和成熟的作用以及對與突觸傳遞和信號轉導有關的分子 的作用，所以涉及突觸(包括作為恢復功能損失之方法的突觸重建)的病癥、病況或疾病均 可用本發明治療。因此，可用本發明的方法和組合物治療的病癥、病況或疾病的實例包括 雷特綜合征、孤獨癥、孤獨癥譜系障礙、安格爾曼綜合征、結節性硬化、脆性X綜合征、精神 分裂癥、抑郁癥、神經退行性疾病(包括帕金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默病)、中風或腦部 外傷。在優選的實施方案中，所述病癥、病況或疾病是其中突觸功能和/或成熟是病癥、病 況或疾病的致病因素的那些。在一個特別優選的實施方案中，所述病癥、病況或疾病是雷特 綜合征。所述對象可已知患有可進行這樣治療的特定病癥、病況或疾病，或者可疑似患有 這樣的病癥、病況或疾病。在一些實施方案中，所述對象沒有其它需要用IGF1、(1-3) IGF-I、 (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子進行治療的癥狀。孤獨癥和孤獨癥譜系障礙是臨床診斷的具有單基因和復雜多基因病因的病癥。單 基因病況例如雷特綜合征和脆性X導致了一小部分孤獨癥病例(約5-10%)。然而，因為 單基因還可促成多基因病況，所以用于單基因病況的治療劑可能影響比例大得多的孤獨癥 病例。
將本發明的治療方法應用于某些病癥、病況或疾病是基于對IGFl信號傳導途徑 (包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和Akt/PKB)的理解。PI3K直接涉及結節性硬化以及涉及PTEN基因的某些形式的孤獨癥。最近BDNF通 過PI3K影響PSD95變化并因此增加興奮性突觸強度的證據提高了 PI3K的潛在重要性。因 此，通過IGFl、(1-3) IGF-I、(1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子提高PI3K水平可彌補 由于認知下降或神經退行性疾病(包括帕金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默病)引起的記憶 力減退。因為PSD95的變化涉及突觸功能障礙的發育性病癥例如脆性X綜合征，所以IGF1、 (1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子可用于治療這些病癥。
Akt是抗凋亡途徑的中心部分。其涉及對抗由于中風和阿爾茨海默病引起的神經 元損失以及涉及腦部創傷或損傷后的神經保護。Akt影響GSK3i3途徑，其涉及精神分裂癥 (鋰作用于此途徑)。應用IGFl直接作用于Akt或間接作用于PI3K來增加海馬齒狀回中 神經形成。這樣的神經形成是抗抑郁作用的主要可能機制，因此IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子可用于治療精神分裂癥或抑郁癥。更廣泛地，IGFl促進神經形成和細胞生存、神經元生長和分化以及突觸成熟。因 此，利用IGFl、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子的治療具有可用于多種 病因的多種神經退行性疾病(包括帕金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默病)、多發性硬化和脊 髓病(例如ALS)的潛力。在某些情形下，可采用聯合治療來治療病癥。(1-3) IGF-1/IGF1鞏固突觸并促進 某些類型的可塑性(其依賴于使一組潛在的廣泛可用的突觸中一些弱突觸穩定化)。可 塑性對于促進中風后的功能性重組是重要的，尤其是在聯合治療中，例如(除IGF1、(1-3) IGF-I、(1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子以外)康復治療和施用其它分子例如tPA， BDNF，調節抑制的分子(例如苯并二氮雜罩類)或者是作為神經遞質激動劑、拮抗劑或類似 物的分子。這些分子為治療協同提供有益作用。許多苯并二氮雜罩類是本領域熟知的，包括催眠的苯并二氮雜$類和抗焦慮的苯 并二氮雜:f類。相似地，與苯并二氮雜$受體相作用的相關種類的藥物即“非苯并二氮雜 $類”也可以與苯并二氮雜$類相同的方式用在本發明所述的方法中。在一個具體實施方案中，如下文實施例中所示，(1-3) IGF-I上調tPA。tPA促進突 觸的功能和結構重組。因此(1-3) IGF-I和tPA以正反饋方式起作用。相似地，(1-3) IGF-I 上調BDNF，IGFl、(1-3) IGF-I、(1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子與BDNF相組合很可 能比單獨使用的效果更好。在某些實施方案中，本發明涉及治療方法，所述方法包括施用有效量的(1-3) IGF-I類似物。本文所用的“(1-3)IGF-1類似物”(或“GPE”類似物)包括具有基本上與 (1-3) IGF-I相似的藥理學性能和治療活性的化合物。可將本領域中公知的(1-3) IGF-I類似物用在本發明中。EP 0366638描述了(1_3) IGF-I類似物Gly-Pro和Pro_Glu。W002/16408描述了多種(1_3) IGF-I類似物，包括其中 Gly-Pro-Glu中的Gly被替換為Ala、Ser、Thr或Pro中的任一個的那些；其中Gly-Pro-Glu 中的Pro被替換為Ala、Ser、Thr或Gly中的任一個的那些；或者其中Gly-Pro-Glu中的 Glu被替換為Asn、Asp或Gln中的任一個的那些。描述于W002/16408中的其它(1_3)IGF-I類似物包括(1-3) IGF-I酰胺和硬脂酸鹽/酯。W002/16408中所述的具體類似物 還包括下述物質(1-3) IGF-I酰胺、硬脂酸(1-3)IGF-1、Gly-Pro-D-谷氨酸鹽(GP-D-E) Gly-Pro-Thr (GPT) Gly-Glu-Pro (GEP) Glu-Gly-Pro (EGP) Glu-Pro-Gly (EPG)，所有這些均可 利用標準技術容易地合成。美國專利7，041，314描述了可用于本發明中的其它(1-3) IGF-I 類似物和擬肽。(1-3) IGF-I類似物還可以是本文所述的不可水解肽，例如具有一個或多個(即 一個或兩個)不可水解肽鍵或氨基酸的肽。優選的不可水解肽包括含有D-氨基酸的肽、 含有a- Ψ [CH2NH]-還原酰胺肽鍵的肽、含有Ψ [CONH2]-酮基亞甲基肽鍵的肽、含有 a- Ψ [CH (CN) NH]-(氰基亞甲基)氨基肽鍵的肽、含有Ψ [CH2CN (OH)]-(氰基亞甲基)-羥 基亞乙基肽鍵的肽、含有Ψ [CH2O]-肽鍵的肽以及含有a- Ψ [CH2S]-硫代亞甲基肽鍵的 肽。可用于本發明中的其它(1-3) IGF-I類似物可被確定為具有一個或多個至少基本 等同于(1-3) IGF-I的性質(例如本文所述的性質)或可通過本領域技術人員公知的多種 方法(例如通過血腦屏障的能力的測定方法等)進行評價的(1-3) IGF-I性質的那些類似 物。可用于以與IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-1類似物相似的方式治療本文所述疾病 的其它“相關治療分子”包括IGF-I促分泌素、生長激素或前體、生長激素促分泌素、生長激 素釋放肽或生長激素釋放激素及其類似物。IGF-I促分泌素是本領域公知的，例如美國公開的專利申請2006/0100287中所描 述的那些。生長激素或其前體包括人生長激素(hGH)，例如Nutropin (Genentech)、 Protropin (Genentech)、Humatrope (Lilly)、Genotropin (Pfizer)、Norditropin (Novo) > Saizen (Merck Serono)以及 Omnitrope (Sandoz)。生長激素促分泌素、生長激素釋放肽、生長激素釋放激素和類似物包括伊帕瑞林 (ipamorelin)及其衍生物(例如由伊帕瑞林衍生的生長激素促分泌素，描述于Ankersen 等 Eur. J.Med. Chem. 34(10) :783_790，1999 中)；MK677 (Merck ；N-[I(R) {[1，2_ 二氫-1-甲 磺酰基螺-(3H-吲哚_3，4’ -哌啶)-1’ -基]羰基}-2-(苯基甲氧基)-乙基]-2-氨 基-2-甲基丙酰胺甲磺酸鹽)；NN703(他莫瑞林(tabimorelin)，Novo Nordisk)及其 衍生物(基于NN703的C-末端修飾的GH促分泌素，描述于Ankersen等Eur. J. Med. Chem. 35 (5) 487-497, 2000 中)；SM 130686 (Sumitomo)；卡莫瑞林(Pfizer)；舍莫瑞林 (Salk Institute,Bio-Technology General)；格瑞林(ghrelin)；海沙瑞林(艾沙瑞林)； 他莫瑞林；CP 464709 (Pfizer) ；LY 426410 (Lilly) ；LY 444711 (Lilly ；顯示增加 IGF-1 水 平(Seyler 等，Drug Devel. Res. 49 (4) :260_265，2000)) ；W02002057241 中所公開的 8_(氨 基烷氧基氨基)-8H-二苯并[a，e]三唑并[4，5]-環庚烯；W02002056873中所述的2-取代 的二苯并[a, e]l，2，3-三唑并[4，5_c] [7]輪烯_8_酮；美國專利No. 4，411，890和公開號 WO 89/07110,WO 89/07111 中所述的生長激素釋放肽 GHRP-1、GHRP_2 和 GHRP-6 ；B-HT920 ； 生長激素釋放激素(GHRH，又稱為GRF)及其類似物，以及美國專利6，559，150中所述的其它 生長激素促分泌素。以有效量施用IGFl、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子來治療對象中的病癥、病況或疾病。有效量是足以提供醫療上所期望反應的治療劑劑量。例如，所期望反應可以是抑制病癥、病況或疾病的進展。這可僅包括暫時性延緩病癥、病況或疾病的 進展，但是更優選地，其包括永久性終止病癥、病況或疾病的進展。這可通過本領域一般技 術人員公知的常規診斷方法來監測。應當理解，本發明的治療劑用于治療或預防病癥、病況或疾病，也就是說，它們可 預防性地用于具有發展成病癥、病況或疾病的風險的對象。因此，有效量是可降低病癥、病 況或疾病的發生的風險，減輕病癥、病況或疾病發生的嚴重程度或者可能完全預防病癥、病 況或疾病的發生的量。確定有效量所涉及的因素是本領域一般技術人員眾所周知的，并且僅利用常規實 驗即可確定。一般而言，優選使用本發明治療劑(單獨或與其他治療劑組合使用)的最大 劑量，即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。然而，本領域一般技術人員應當理解，患者可 出于醫療原因、生理原因或實際任何其它原因而堅持使用較低劑量或可耐受的劑量。IGFl、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子可單獨施用、以藥物組 合物施用或者與其它治療劑或方案組合施用。任選地，可同時或依次施用其它治療劑。當 同時施用所述其它治療劑時，它們可在同一制劑或分開的制劑中同時施用。當將所述其它 治療劑與IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子在時間上分開施用時， 所述其它治療劑可與IGFl、(1-3) IGF-I、(1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子可彼此依 次施用。施用這些化合物的時間間隔可以是約幾分鐘或者可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11或者12小時，或者更長，包括1、2、3、4、5、6、7天或以上。可用在本發明方法中的藥物組合物優選是無菌的并含有有效量的IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子，用于以適用于向對象施用的重量單位或體 積單位形式產生所期望的反應。可根據不同的參數，尤其是根據所用的施用方式和對象的 狀態來選擇向對象施用的藥理劑的劑量。其它因素包括所期望的治療期。在對象對所施用 的初始劑量反應不足的情形下，可在患者耐受允許的程度上施用較高的劑量(或通過不同 的、更局部化的遞送途徑有效地施用更高的劑量)。可由各醫生或獸醫調整藥理劑的劑量， 尤其是在有任何并發癥的情形下。治療有效量通常為0. 01mg/kg至約1000mg/kg，優選為 約0. lmg/kg至約200mg/kg，最優選為約0. 2mg/kg至約20mg/kg，每日施用一劑或多劑，施 用一天或多天。還進行了全身施用(1-3) IGF-I或IGFl并對腦功能產生作用的一些研究。在Tropea 等(Nat Neurosci 9，660-8，2006)中，腹膜內(IP)輸注(1_3)IGF_1，同 時進行單眼剝奪(MD)。以約20 μ g/g/天注射(1-3) IGF-17天。在針對發育中的大鼠(P21)進行的另一項研究(Sizonenko等，BrainRes 922， 42-50，2001)中，誘導缺血2小時后單次注射(1-3) IGF-I (6. 7 μ g/g) 0在另一項研究(Lupien等，JNeurosci Res 74，512-23，2003)中，用 IGFl 處理糖 尿病大鼠以改善通常在糖尿病中觀察到的聽力缺陷。給成年大鼠(約400g)植入微型泵， 就每只動物而言，所述微型泵每天釋放20 μ g，相對于每天約0. 05 μ g/g。在此情形下，皮下 釋放7. 5周。在另一項研究(Saatman等，Exp Neurol 147，418-27，1997)中，在猴中每 12 小時 通過皮下注射1 μ g/g(相當于每天2 μ g/g)或通過皮下泵(每天4yg/g)遞送IGF114天，觀察其運動學習(motor learning)的提高。Aberg 等(J Neurosci 20，2896-903，2000)用微型泵將重組 IGFl (Genentech， South San Francisco, CA)經皮下遞送給P50大鼠，遞送6天或20天，劑量分別為1. 25mg/ kg/ 天和 0. 9mg/kg/天。FDA 批準的 Increlex (Tercica, rhIGFl)的劑量為 0. 08-0. 12mg/kg，每日兩次等 于 0. 16-0. 24mg/kg/天。就本文所述的本發明方法而言，IGFl的優選劑量是約0. 01-50mg/kg/天，更優選 約0. l-10mg/kg/天，以每日一劑或多劑的方式施用。優選地，IGFl是人IGFl (hIGFl)，優選 地，IGFl是重組制備的(rIGFl)，最優選地是重組人IGFl (rhIGFl)。更優選地，重組IGFl的 劑量是約0. l-2mg/kg/天。尤其考慮將FDA批準的rhIGFl的劑量用于本發明的方法中，但 如本文中所述，還可預計施用更高或更低的劑量。就本文所述的本發明方法而言，(1-3) IGF-I的優選劑量是約0. l-100mg/kg/天， 以每日一劑或多劑的方式施用。更優選地，(1-3)IGF-1的劑量為約6-20mg/kg/天。對本領域普通技術人員而言，將本發明的藥理劑有效遞送至所期望的組織、細胞 或體液的各種施用方式是已知的。本發明分子的施用包括但不限于口服、靜脈內輸注、皮下 注射、肌內、局部、貯庫型注射(cbpoinjection)、植入、定時釋放方式、腔內、鼻內、吸入、腫 瘤內、眼內以及控制釋放。本發明的藥物組合物還可經胃腸外、經粘膜(例如口含)、經鼻、 經直腸、陰道內、舌下、粘膜下或經皮施用。優選地，施用是胃腸外施用，即不通過消化道而 是通過一些其它途徑施用，例如通過靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、眼眶內(intraorbital)、 囊內、椎管內、胸骨內、動脈內或皮內施用。技術人員能認識到待考慮選擇的施用方式的具 體優點和缺點。本發明不限于本文所公開的具體施用方式。本領域中的標準參考文獻(例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences,20th Edition, Lippincott, Williams and Wilkins, Baltimore MD, 2001)提供了用于遞送在藥物載體中的各種藥物制備物和制劑的 施用方式和配制方法。可用于施用本發明藥理劑的其它方案是本領域普通技術人員公知 的，其中所述劑量、施用方案、施用部位、施用方式等可與本文所述有所不同。在基本上與上文所述相同的條件下將本發明的藥理劑施用給非人的哺乳動物，例 如用于測試目的或獸用治療目的。本領域普通技術人員應當理解，本發明適用于人和動物 的疾病。當施用時，本發明的藥物制劑以藥學上可接受的量和藥學上可接受的組合物進行 施用。術語“藥學上可接受的”意指不影響活性成分的生物活性效力的無毒物質。這樣的 制劑通常可含有鹽、緩沖劑、防腐劑、相容性載體以及任選地其它治療劑。當用在藥物中時， 所述鹽應當是藥學上可接受的，但是非藥學上可接受的鹽可方便地用于制備其藥學上可接 受的鹽并且不排除在本發明范圍之外。這樣的藥理學上和藥學上可接受的鹽包括但不限于 由下述酸制備的那些鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、富 馬酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，藥學上可接受的鹽可被制成堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如鈉 鹽、鉀鹽或鈣鹽。需要時，可將本發明的藥理劑或藥理組合物與藥學上可接受的載體相組合。本文 所用的術語“藥學上可接受的載體”意指適于向人施用的一種或多種相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質。術語“載體”表示活性成分與其組合可有助于施用的天然或合成的有機成分或無機成分。藥物組合物的成分還能與本發明的藥理劑以不具有實質上影響所 期望的藥物效力之相互作用的方式共混以及彼此混合。藥物組合物可含有上文所述的合適的緩沖劑，包括乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甘 氨酸、硼酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、氫氧化物(以及其它堿)以及前述化合物的藥學上可接受 的鹽。所述藥物組合物還可任選地含有合適的防腐劑，例如苯扎氯銨、氯丁醇、對羥基苯甲 酸酯類和硫柳汞。所述藥物組合物可方便地存在于單位劑型中并且可通過藥學領域中熟知的任意 方法制備。所有方法均包括將活性劑與載體相組合的步驟，所述載體由一種或多種輔助成 分組成。一般而言，通過以下步驟制備組合物將活性化合物均勻緊密地與液體載體、微細 固體載體或這兩種載體相組合，然后，必要時使產品成型。當希望全身遞送化合物時，可將它們配制成通過注射進行胃腸外施用，例如通過 推注或連續輸注。供注射的制劑可與所添加的防腐劑一起存在于單位劑型中，例如存在于 安瓿或多劑量容器中。組合物可采取在油性載體或水性載體中的混懸液、溶液或乳液的形 式，并可含有配方劑(formulatory agent)，例如助懸劑、穩定劑和/或分散劑。供胃腸外施用的藥物制劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可將活 性化合物的混懸液配制成合適的油性注射混懸劑。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油 (例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂質體。水性注射混懸劑 可含有能增加混懸液粘度的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡萄糖。任選地，所述混 懸劑還可含有合適的穩定劑或增加化合物溶解度以允許制備高濃度溶液的試劑。或者，所述化合物可以是使用前與合適的載體(例如鹽水、緩沖劑或無菌無熱原 的水)一起構建的粉末形式。適用于口服施用的組合物可以作為離散的單位存在，例如膠囊、片劑、丸劑、錠劑， 其各自含有預定量的活性化合物。其它組合物包括在水性液體或非水性液體中的混懸液， 例如糖漿劑、酏劑、乳劑或凝膠劑。供口服施用的藥物制劑可以固體賦形劑形式得到，任選地研磨所得混合物，并加 工顆粒混合物以在加入合適的輔助劑之后(必要時)得到片劑或糖錠核心。合適的賦形劑 尤其是填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇，或纖維素制備物，例如玉米淀粉、 小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖 維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。必要時，可加入崩解劑，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、 瓊脂或藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。任選地，口服制劑還可配制在鹽水或緩沖液(即用于中和 內部酸環境的EDTA)中或者可不加任何載體進行施用。還可具體預期的是上述成分的口服劑型。可對所述成分進行化學修飾使得口服遞 送的衍生物有效。一般而言，所預期的化學修飾是將至少一個部分連接到所述成分自身分 子上，其中所述部分使得可以(a)抑制蛋白質水解；以及(b)從胃或腸吸收到血流中。還期 望的是增加成分的總體穩定性和增加體內循環時間。就成分(或衍生物)而言，釋放部位可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)或 大腸。本領域技術人員可利用在胃中不溶解但是在腸的十二指腸或其它部位釋放物質的制 齊U。優選地，通過保護所述分子或在胃環境以外處(例如在腸中)釋放生物活性分子來避免釋放對胃環境造成有害影響。為了保證完全抵抗胃酸，在至少5.0的pH下不滲透的包衣是必不可少的。用作腸溶包衣的更常見惰性成分的實例是偏苯三酸醋酸纖維素(CAT)、鄰苯二甲酸羥丙基甲基 纖維素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、鄰苯二甲酸聚醋酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D、 Aquateric、鄰苯二甲酸聚醋酸纖維素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S以及蟲膠。這些包衣 可用作混合膜。還可將目的并不在于保護免受胃酸影響的包衣或包衣混合物用在片劑上。這可包 括糖包衣或使片劑更易于吞咽的包衣。膠囊可由用于遞送干治療劑(即粉末)的硬殼(例 如明膠)構成，就液體形式而言，可使用軟明膠殼。囊殼材料可以是稠淀粉或其它可食用的 紙。對于丸劑、錠劑、模制片或模印片而言，可使用濕壓制技術(moist massingtechnique)。可利用惰性材料稀釋或增加治療劑的體積。這些稀釋劑可包括碳水化合物，尤其 是甘露醇、α-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡萄糖和淀粉。還可將某些無機鹽用作 填充劑，包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些可商購的稀釋劑是Fast-Fl0、EmdeX、STA-RX 1500、Emcompress 以及 Avicell0崩解劑可包含在固體形式的治療劑制劑中。用作崩解劑的材料包括但不限于淀 粉，包括可商購的基于淀粉的崩解劑Explotab。羥乙酸淀粉鈉、Amberlite、羧甲基纖維素 鈉、超級支鏈淀粉(ultramylopectin)、藻酸鈉、明膠、橙皮油(orange peel)、酸羧甲基纖維 素、天然海綿和膨潤土均可使用。另一種形式的崩解劑是不溶性陽離子交換樹脂。粉末樹 膠可用作崩解劑以及粘合劑，這些可包括粉末化樹膠例如瓊脂、卡拉牙膠(Karaya)或黃蓍 膠。藻酸及其鈉鹽也可用作崩解劑。粘合劑可用于使治療劑粘在一起形成硬片，其包括來自天然產物的材料，例如阿 拉伯膠、黃蓍膠、淀粉和明膠。其它粘合劑包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基 纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)均可用在醇溶液中使治 療劑成顆粒。抗摩擦劑可包含在治療劑制劑中以防止在制劑制備過程中粘連。潤滑劑可用作治 療劑和模具壁之間的層，并且這些潤滑劑可包括但不限于硬脂酸(包括其鎂鹽和鈣鹽)、聚 四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。還可使用可溶性潤滑劑，例如十二烷基硫酸鈉、 十二烷基硫酸鎂、不同分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。可加入助流劑，所述助流劑可在制備過程中提高藥物的流動性能并在壓制過程中 有助于重新調整。所述助流劑可包括淀粉、滑石、熱解二氧化硅和水合硅酸鋁。為促進治療劑溶解在水性環境中，可加入表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑可 包括陰離子型去污劑，例如十二烷基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉。可使用 陽離子型去污劑，其可包括苯扎氯銨或芐索氯銨(benzethomium chloride) 0可作為表面 活性劑包含在制劑中的可能的非離子型去污劑的清單是聚桂醇400 ；硬脂酸聚烴氧40酯； 聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60 ；單硬脂酸甘油酯；聚山梨酯40、60、65和80 ；蔗糖脂肪酸 酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可單獨或以不同比例的混合物存在于制 劑中。可口服使用的藥物制劑包括由明膠制得的推入配合式(push-fit)膠囊以及由明 膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制得的密封軟膠囊。所述推入配合式膠囊可含有活性成分與填充劑(例如乳糖)、粘合劑(例如淀粉)和/或潤滑劑(例如滑石或硬脂酸鎂)以及 任選的穩定劑的混合物。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或混懸在合適的液體(例如脂肪 油、液體石蠟或液體聚乙二醇)中。此外，還可加入穩定劑。就鼻內或吸入施用而言，可利用合適的拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二 氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體，以來自加壓器或噴霧器的氣霧噴霧劑形式方便 地遞送用于本發明的化合物。在加壓氣霧劑的情形下，可通過提供閥門來確定劑量單位以 遞送經計量的量。用于吸入器或吹入器中的例如明膠的藥囊和藥筒可被配制成含有所述化 合物與合適的粉末基質(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。本發明還包括經肺遞送分子。當吸入時，分子被遞送到哺乳動物的肺中并透過肺 上皮襯里到達血流。
考慮用于實施本發明的是設計成用于經肺遞送治療產品的多種機械裝置，包括但 不限于噴霧器、計量劑量吸入器和粉末吸入器，所有這些均是本領域技術人員所熟悉的。本發明還包括經鼻(或鼻內)遞送的藥物組合物。經鼻遞送使得可以在將治療產 品施用給鼻以后直接將本發明藥物組合物遞送到血流中，而不需要將產品沉積到肺中。就經鼻施用而言，可用的裝置是與計量劑量噴霧器相連的小硬瓶。在一個實施方 案中，所述計量劑量是通過將本發明的藥物組合物溶液吸到限定體積的室中來遞送的，所 述室具有形成所需尺寸的孔，以便當壓縮所述室中的液體時通過形成噴霧而使氣霧劑制劑 氣霧化。壓縮所述室來施用本發明的藥物組合物。在一個具體實施方案中，所述室是活塞 式布置。這樣的裝置是可商購的。或者，使用具有形成所需尺寸的孔或開口的塑料擠瓶，以便當擠壓時通過形成噴 霧而使氣霧劑制劑氣霧化。所述開口通常在瓶的頂部，一般而言，所述頂部通常為錐形，以 與鼻通道部分匹配，從而有效施用氣霧劑制劑。優選地，所述經鼻吸入器將提供計量量的氣 霧劑制劑，用于施用經測量劑量的藥物。除上述制劑以外，還可將所述化合物配制成貯庫型制劑。這樣的長效制劑可利用 合適的聚合物或疏水性材料(例如作為可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂或難溶性衍生 物例如難溶性鹽來配制。所述藥物組合物還可包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑 的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二醇。所述分子適用于多種藥物遞送系統。關于藥物遞送方法的簡要綜述見于Langer， Science 249 1527-1533，1990，其在此通過引用并入本文。治療劑可被包含在控制釋放系統中。術語“控制釋放”旨在指任意含有藥物的制 劑中藥物從制劑中釋放的方式和特性是受控的。這指立即釋放制劑以及非立即釋放制劑， 其中非立即釋放制劑包括但不限于持續釋放制劑和延遲釋放制劑。以常規意義使用的術語 “持續釋放”(又稱為“延長釋放”)指長期逐漸釋放藥物并且優選地(雖然不是必需地)導 致長期基本上恒定的藥物血液水平的藥物制劑。以常規意義使用的術語“延遲釋放”指其 中在施用制劑和藥物從制劑中釋放之間具有時間延遲的藥物制劑。“延遲釋放”可包括或不 包括長期逐漸釋放藥物，因此可以是或不是“持續釋放”。利用長期持續釋放的植入物可能特別適用于治療慢性病癥。本文所用的“長期”釋放意指將植入物構建和布置成使治療水平的活性成分遞送至少7天，優選30-60天。長期 持續釋放的植入物是本領域普通技術人員所熟知的，其包括上文所述的一些釋放系統。本發明還包括藥盒的用途。在本發明的一些方面中，所述藥盒可包含藥物制劑瓶、 藥物制劑稀釋瓶和本文中所述的本發明分子。含有藥物制劑的稀釋劑的瓶是任選的。所述 稀釋瓶含有稀釋劑例如生理鹽水，用于稀釋分子的濃溶液或冷凍干燥粉末。說明書可包含 將特定量的稀釋劑與特定量的濃藥物制劑混合從而制備供注射或輸 注的最終制劑的說明。 說明書可包含利用有效量的分子來治療對象的說明。還應當理解的是含有制劑的容器(不 論所述容器是瓶、具有隔膜的瓶、具有隔膜的安瓿以及輸注袋等)可含有當將制劑進行高 壓滅菌或其它滅菌時可變色的標記(例如常用的標志物)。本發明還包括將診斷方法與治療結合的用途。例如，假設已知雷特綜合征在多數 病例中與編碼MeCP2的基因的突變或變異有關并且由其引起，那么可首先篩查對象的該突 變。可進行這樣的篩查以確定對象對利用本文所述IGF1、(1-3) IGF-U (1_3) IGF-I類似物 和/或相關治療分子進行治療的適用性。還可以相同方式診斷和治療患有其它具有遺傳基 礎并且適于本發明所述治療的疾病、病況和病癥的對象。尤其是，具有作為MeCP2靶標基因 或下游基因的基因之突變或變異的對象適于本發明所述的治療并且可以同樣的方式進行 診斷和治療。標準的臨床診斷方法是本領域中眾所周知的。通常，這些方法包括從對象得到樣 品，所述樣品可不限于組織樣品、活組織切片檢查、流體樣品(例如血液、尿、唾液、腦脊髓 液)等，然后對所述樣品進行診斷步驟。技術人員可利用多種眾所周知的方法來分析樣品， 例如多種核酸檢測和擴增方法(包括基于聚合酶鏈反應的方法)以及多種蛋白質檢測方法 (包括基于抗體的檢測方法)。在其它情形下，可使用成像技術進行非侵入式診斷。診斷方法還可與治療方法聯用以在治療中追蹤疾病過程并幫助選擇合適的治療 方法。診斷方法和治療方法的這種聯合應用是醫學領域中所常規采用的。通過下述實施例進一步舉例說明本發明，所述實施例不應當以任何方式解釋為進 一步限制本發明。實施例實施例1:雷特綜合征(RTT)是影響萬分之一至一萬五千分之一的生命的X染色體相關神經 病(Chahrour和Zoghbi，2007)。該疾病的特征在于出生后表面上發育正常，然后生長突然 減慢，這與獲得性運動和語言技能的進行性損失、固定的手部運動、肌肉張力減退、自主神 經功能障礙和嚴重的認知障礙有關。仍然沒有針對RTT的特殊治療，治療主要是對癥的并 且是個體化的。在約85%的RTT患者中，病因是編碼甲基化CpG結合蛋白2(MeCP2)的基因的突 變(Amir等，1999)，MeCP2是全局性轉錄阻遏物(Nan等，1998)，其在神經元成熟和突觸形 成之后在中樞神經系統(CNS)中高度表達(Cohen等，2003 ；Shahbazian等，2002b)。已經 建立了小鼠模型，其中CNS特異性MeCP2缺失足以引起Rett樣癥狀(Gemelli等，2006 ；Guy 等，2001 ；Shahbazian等，2002a)，并且即使在疾病晚期活化MeCP2蛋白也可恢復突變表型 (Giacometti等，2007 ；Guy等，2001)。因此，小鼠模型表明RTT的一個重要特征還在于，它 是可逆的_所涉及的CNS環路似乎不萎縮，而是仍然處于不穩定的不成熟狀態，而隨后環路的活化可修復該綜合征的后果。例如，MeCP2突變小鼠中皮層和海馬腦環路的特征在于類 似于正常不成熟環路的較弱興奮性突觸(Chao等，2007 ；Dani等，2005 ；Nelson等，2006)。
雖然很難鑒定可促進此表型的MeCP2靶標基因(Tudor等，2002)，但是最充分表征 的MeCP2調節靶標是腦源性神經營養因子BDNF (Chen等，2003)，公知BDNF激發成熟和促進 突觸更強壯(Schuman，1999)，并且實際上可恢復突變小鼠的活動水平以及減少突變表型的 一些癥狀(Chang等，2006)。遺憾的是，BDNF透過血腦屏障的效率差，這阻礙了其治療應用。 盡管如此，可因此由鑒定能類似刺激突觸成熟的藥劑而導致在人中進行的介入性治療。在CNS治療中具有相似前景的另一種多效的生長因子是胰島素樣生長因子 1 (IGF-I)。與BDNF相似，IGFl在正常發育過程中在CNS中廣泛表達(Bondy，1991)，其 強烈促進神經元細胞存活和突觸成熟(Liu等，1993)，并有助于發育中的皮層的功能可塑 性成熟(Tropea等，2006)。雖然BDNF通過涉及PI3K/pAkt/PSD95的途徑刺激突觸強壯 (Yoshii和Constantine-Paton，2007)以強化突觸后器并促進突觸功能，但是IGFl也刺激 相同路徑(Tropea等，2006 ；Zheng和Quirion，2004)，并且還表明顯著升高興奮性突觸后 電流(Ramsey等，2005 ；Xing等，2007)。IGFl的生物作用還通過與可對RTT和其他疾病具 有重要意義的IGF結合蛋白(IGFBP 1-6)的結合來調節。例如，IGFBP3具有MeCP2蛋白結 合位點，由于MeCP2缺陷型小鼠和Rett患者缺少此甲基化阻遏物，因此異常表達高水平的 IGFBP3 (Itoh等，2007)，IGFBP3反過來抑制IGFl-實際上在幾種形式的ASD中已經觀察到 了受抑制的IGFl水平(Riikonen等，2006)。與BDNF不同，IGFl能透過血腦屏障，尤其是以其三肽形式(1_3) IGF-1 (Baker 等，2005)，其在腦中仍然具有強的神經營養作用(Guan等，2004 ；Itoh等，2007 ；Saura等， 1999 ；Sizonenko等，2001)。考慮到這具有通用性以及實際上IGFl已被批準用于人臨床試 驗(需要引證)這一事實，IGF-I信號傳導以更適于治療性施用給RTT患者的形式提供了 可比較的BDNF靶標，用于參與刺激突觸成熟和逆轉RTT表型的關鍵分子路徑。因此，我們 研究了全身性遞送的(1-3) IGF-I在用于克服作為RTT病生理學特征的突觸和神經元的不 成熟性(Johnston等，2001 ；Kaufmarm等，1997)以及改善所述疾病小鼠模型中Rett樣癥狀 中的潛能。實驗步驟小鼠匹配和基因分型我們利用了 Chen等人(Chen等，2001)的MeCP2種系無效 等位基因。如Chen等人所述(Chen等，2001)進行了基因分型。(1-3) IGF-I處理就生存測定、夜間活動分析和免疫印跡分析而言，每日通過腹 膜內注射施用(1-3) IGF-I (Bachem Biosciences#H22468,0. 01mg/g 體重，載體=鹽水， 0.01% BSA) 0在P15開始處理并在整個實驗過程中維持所述處理。就細胞內生理學實驗而 言，每日給小鼠注射(0. 01mg/g體重，載體=鹽水，0. 01% BSA)，注射2周，從P15至P28-32， 然后將小鼠用于制備急性切片。就光學成像實驗而言，從眼瞼縫合當天至成像當天，每日給 小鼠注射(1-3) IGF-I (0. 02mg/g 體重，載體=鹽水，0. 01% BSA)。生理切片準備利用Vibratome將感覺運動皮層上的或附近的冠狀斷面(300 μ m 厚)切到< 4°C的ACSF中。切片后，將切片于37°C下孵育20分鐘，在剩余實驗中置于室溫 下。將切片轉移到Warner室中并記錄視覺識別的位于第五層的錐體神經元。人工腦脊液 (ACSF)含有 126mMNaCl、25mM NaHCO3UmM NaHPO4,3mM KCl、2mM MgSO4、2mMCaCI2 以及 14mM葡萄糖，將其調節至315-320m0sm和pH 7. 4，并通入95% 02/5% C02。細胞內移液管溶液含 有 IOOmM 葡萄糖酸鉀、20mM KClUOmM HEPES、4mM MgATP、0. 3mM NaGTP 以及 IOmM 磷酸肌酸鈉。細胞內全細胞記錄用Sutter P-80拉管器(Sutter Instruments)拉出硼硅 酸鹽移液管(3-5MQ，WPI)。利用配有紅外微分干涉差顯光學(infrared-DIC optics) (Zeis s)的Achroplan 40倍水浸式鏡頭使細胞顯現并用投射至視頻監視器上的紅外照相 機(Hamamatsu)檢測。利用 Multiclamp 700B 放大器(Axon Instruments)由自定義采 集和實時分析軟件(以Matlab (Mathworks，Natick, ΜΑ)編寫)啟動實驗，所述放大器與 BNC-2110連接器模塊和M系列雙通道采集卡(National Instruments)相連。達到吉伽封 口和破裂，并連續檢驗全細胞記錄的低水平滲漏和串聯電阻。就每一記錄而言，在電壓鉗中 施加5mV試驗脈沖約10次以測量輸入電阻和串聯電阻。然后在電流鉗中施加約10個脈沖 (500ms，40-140pA，增量為IOpA)以量化誘發的放電率和細胞興奮性。經檢驗，組與組之間 的接入電阻、滲漏和細胞內興奮性一致。最后，在IOkHz下對-60mV電壓鉗下的自發性EPSC 采樣并在IkHz下低通過濾。利用以Matlab寫成的用戶軟件包進行分析，根據自動化閾值 檢測所有事件并由實驗者單獨對每個事件進行盲法校驗。Golgi染色將P28小鼠樣品(< Icm)于10%福爾馬林和3%重鉻酸鉀中固定 24小時。然后于室溫下在黑暗中將組織轉移到2%硝酸銀中2天。然后將這些樣品斷面以 50 μ m厚切到蒸餾水中。將對應于運動皮層的斷面固定在載玻片上，晾干10分鐘，然后通過 以95%乙醇、100%乙醇和二甲苯依次清洗來脫水，然后用蓋玻片密封。利用Zeiss Pascal 5Exciter共聚焦顯微鏡于10X (全細胞)和100X (棘成像)下獲取圖像。內源信號的光學成像將成年(> P60)野生型(SVEV或BL6)和MeCP2 (+/-)突變 雌性(BL6)用于此實驗。野生型對照組由野生型同窩出生的MeCP2+/_雌性或野生型年齡 匹配的SVEV雌性組成。為進行單眼剝奪，利用Averting). 016ml/g)麻醉動物，將一只眼睛 的眼瞼縫合4天。在成像前除去縫合，被剝奪的眼睛重新睜開。僅將其中剝奪縫合完整并 且被剝奪眼睛的狀況看上去健康的動物用于成像期。為激活IGF-I信號傳導，在整個剝奪 期每日腹膜內(IP)注射含有(1-3) IGF-I的溶液。就成像期而言，用烏拉坦(1.5g/kg;每 20-30分鐘IP施用全劑量的20%，至達到最終劑量，在首次施用時還一起注射0. 02ml 1% 的氯普噻噸(cloroprothixene))麻醉小鼠。暴露出顱骨，將定制的板粘在頭上以使活動降 到最少。用dremel鉆孔器將Vl上的顱骨鉆薄，并用瓊脂糖鹽水溶液(1. 5% )和玻璃蓋玻 片覆蓋。在成像期中，不停地給動物充氧，用加熱毯維持動物的溫度，用硅酮油周期性地處 理眼睛；連續監測生理條件。將麻醉小鼠置于監測器前方，監測器顯示對任何一只眼睛的周 期性刺激(單眼)；所述刺激由飄移的垂直或水平白條組成，白條的尺寸為9° X72°，以 9秒/循環在均勻的灰色背景上飄移。用紅光(630nm)照射顱骨表面，在每個25分鐘的刺 激期中，用CCD照相機(Cascade 512B,Roper Scientific)以15幀/秒的速度捕獲亮度變 化。利用時域高通濾波器(135幀)除去慢信號噪音，然后用計算機對信號進行處理，以便在 每個像素下提取對應于刺激頻率的時域快速傅里葉變換(FFT)成分。使用FFT幅度來測量 視覺誘發的每只眼睛的反應強度。眼優勢指數由每個像素下的每只眼睛的反應(R)導出， 為ODI = (R對側-R同側)/(R對側+R同側)。雙眼區定義為刺激與成像半球同側的眼睛 所活化的區域。
心率測量使用尾夾傳感器(Mouse OX Oximeter-Oakmont，PA)測量實時心臟脈 搏速率。不麻醉小鼠，而是將其物理性地約束在具有合適開口的塑料筒中。在記錄期之前， 將所述筒置于飼養實驗動物的籠中過夜以便進行適應。在整個記錄時間中體溫維持在約 82-84° F。我們記錄了每只小鼠的3次15分鐘的實驗，小鼠為8周齡并且從P15開始用載 體或(1-3) IGF-I處理。夜間活動測量利用紅外線光束激發的運動監測室(Opto-Varimax-MiniA ； Columb us Instruments，Columbus，OH)測定自主運動活動。就每次實驗而言，在開始記 錄之前，將小鼠置于所述室中至少3小時。在正常的12小時黑暗循環(下午7點至上午7 點)中監測運動。針對每個動物的每個時間點，采集一個黑暗循環。結果為了測試(1-3) IGF-I處理是否影響RTT疾病的主要特征的進展，在2周齡突變動 物的生命期間對其每日進行腹膜內注射。然后如下文所述獲得突觸生理學、突觸分子組成 和皮層可塑性的測量值以及與健康相關的測量值，例如心率、運動活動水平和壽命。(1-3) IGF-I對MeCP2突變小鼠的突觸生理學的影響最近的研究報道了 MeCP2_/y小鼠多個腦區域的神經元表現出自主性活動顯著減 少(Chang 等，2006 ；Chao 等，2007 ；Dani 等，2005 ；Nelson 等，2006)，這是通過 BDNF 過量表 達來恢復的表型(Chang等，2006)。相似地，急性施用IGF-I衍生物表明能將大鼠海馬培養 物中誘發的興奮性突觸后電流(EPSC)幅度提高40% (Ramsey等，2005 ；Xing等，2007)。因 此，為了測試(1-3) IGF-I恢復MeCP2-/y生理表型的效力，我們獲得了急性腦切片中的細胞 內全細胞記錄，測量了第五層皮層神經元中的興奮性突觸驅動(自發性EPSC幅度和頻率) (圖1A)。在此，與野生型動物中所測量的EPSC相比，由_/y動物記錄的EPSC的幅度顯著 降低(圖1B)。在由(1-3) IGF-I處理的MeCP2-/y動物記錄的EPSC中，該趨勢被部分地逆 轉，其幅度顯著高于載體處理的MeCP2-/y小鼠的EPSC幅度(圖1B)。當在細胞間進行平均 時也可觀察到這些差異(圖1C)。在所有這些測量值中，經檢驗，組與組之間的接入電阻、滲 漏和細胞內興奮性也一致(數據未顯示)。對EPSC間隔定量也顯示野生型和MeCP2-/y動 物之間的EPSC事件之間的間隔稍微提高(EPSC頻率降低)(P = 0. 04,Kolmogorov-Smirnov 檢驗；圖1D)。因此，我們的發現表明MeCP2_/y小鼠的皮層細胞中興奮性突觸驅動降低，并 且在用(1-3) IGF-I處理后其得到部分恢復，這部分地歸因于EPSC幅度的改變，是此區域中 突觸介導興奮性傳遞的強度改變的結果。(1-3) IGF-I處理刺激皮層棘成熟我們推測，RTT是由突觸成熟和穩定性的缺陷(這在樹突狀接觸點的結構中應當 是物理上明顯的)引起的。此外，由于敲除的特征在于興奮性突觸傳遞的缺陷，所述缺陷能 通過(1-3) IGFl處理而部分地改善，我們預計可能存在樹突棘的結構和密度方面的可比較 的改變。因此，我們利用golgi染色來稀疏且清楚地標記神經元，并用高分辨共聚焦成像來 測量標記細胞中樹突棘的密度和形態，將分析限定至關鍵期小鼠(P28)的運動皮層節段的 第五層錐體神經元。雖然低倍放大成像清楚地描述了這些錐體細胞的分枝程度(圖2A)，但是我們可利用更高倍數的放大來計數突觸接觸點(圖2B)并確定每個棘的形態類別。我們將棘分為 大而圓的(“蘑菇型”，M)、短而粗的(“短粗型”，S)、短而細的(“纖細型”，T)或絲狀偽足型(F)。比較每單位分枝的棘密度，表明敲除型神經元中棘密度降低的趨勢可在敲除型中通 過處理來顯著改善(圖2C)。分析每一病癥中存在的每種類型的棘的比例(圖2D)，表明敲 除型中的蘑菇型(成熟)棘不足通過處理得到部分恢復，而敲除型中達到過度呈現的纖細 型(不成熟)棘不受處理的影響。最后，在病癥之間未檢測到分枝厚度定量(圖2E)的任 何差異。這些結果一起表明，敲除型中樹枝狀接觸點的數量不足和不成熟狀態可能以利用 (1-3) IGFl處理之后得到部分恢復的方式鞏固興奮性傳遞功能缺陷。MeCP2缺陷引起成年小鼠中異常的眼優勢可塑性上文提供的功能數據(圖1)和結構數據(圖2)以及MeCP2表達的時間選擇 (Shahbazian 等，2002b)和恢復實驗數據(Giacometti 等，2007 ；Guy 等，2007)表明，MeCP2 缺陷可能引起突觸和神經元成熟不完全(Johnston等，2001 ;Kaufmann等，1997)。如果 Rett的癥狀是由于腦環路不成熟使得突觸處于發育不良或衰退狀態而引起的，那么我們推 測MeCP2K0小鼠中皮層環路的其他結果將不能維持穩定的呈現，并且突觸將更易于并且傾 向于適應其環境而改變。我們利用已經充分建立的用于測試稱為“眼優勢可塑性”的皮層 可塑性的模型(Hofer等，2006)評價了這些現象，其中測量了對兩眼中的每只眼的視覺皮 層反應(圖5A)，然后使更占優勢的眼閉合數天(單眼剝奪，MD)，此后再次測量皮層反應以 了解輸入改變數天可如何改變對兩眼的反應。在小鼠中，對側眼通常在皮層中占優勢(圖 5A和5C)，但是如果環路仍然不成熟、不穩定，則閉合優勢眼可導致皮層“轉移”至另一只眼 (Gordon和Stryker, 1996)，因此導致“眼優勢指數” (ODI)移動(圖5B和5D)。然而，如果 大腦環路成熟且穩定(例如在成年動物中)，那么ODI將不發生改變(圖5E)。我們推斷，如果MeCP2缺陷型小鼠中的突觸發育受到抑制，那么成年小鼠視覺 皮層中的突觸將仍將對短期MD敏感。為了測量刺激眼睛引起的皮層反應，我們利用了 內源信號的光學成像技術，該技術檢測去氧血紅蛋白水平，去氧血紅蛋白水平與神經元 活動密切相關，并且是皮層可塑性的高度敏感和可靠的度量值(Hofer等，2006 ；Smith和 Trachtenberg, 2007)。因為成年MeCP2_/y小鼠不耐受此分析所需的麻醉，所以我們利用了 MeCP2雜合雌性小鼠，其出現的癥狀較輕(圖3)。我們首先測量了幼齡WT小鼠(出生后28 天)的眼優勢可塑性，并且發現4天MD使群體ODI明顯移動(圖3A)。然而，當將未剝奪的 小鼠(黑色實線)與單眼剝奪的小鼠(黑色虛線)進行比較時，在WT成年小鼠(P60)中重 復此模式未產生群體ODI的移動(圖3B)。與之相反，年齡匹配的MeCP2突變(+/-)小鼠顯 示出現視覺驅動反應向睜開眼顯著移動(圖3B，粉紅色線)。這些結果表明，在成年MeCP2 突變視覺皮層中，在不平衡的視覺驅動之后存在持久的快速突觸可塑性，這是不成熟皮層 的典型特征并且與MeCP2缺陷后突觸成熟度或穩定性的缺陷是一致的。(1-3) IGF-I處理抑制成年MeCP2+/_小鼠的眼優勢可塑性OD可塑性的發育改變部分受到IGF-I路徑活化的控制，施用(1_3) IGF-1可消除 野生型幼齡小鼠中的OD可塑性(Tropea等，2006)。因此，我們測試了(1_3) IGF-I處理是 否可穩定在成年MeCP2突變小鼠中觀察到的延長的OD可塑性。對P60日齡或以上的雌性 MeCP2+/"小鼠單眼剝奪4天并同時用(1-3) IGF-I處理。圖3C顯示(1-3) IGF-I處理抑制 了成年MeCP2+/_小鼠中的OD可塑性，表明實際上(1_3) IGF-I快速誘導突觸穩定化或成 熟。在所有動物中，在幼齡(P28)小鼠中或成年(P60)MeCP2缺陷型小鼠中觀察到了眼優勢可塑性，但是在正常成年小鼠中或利用(1-3) IGF-I處理的MeCP2缺陷型小鼠中沒有觀察到 眼優勢可塑性(圖3D)。(1-3) IGF-I處理部分恢復MeCP2_/y小鼠的心動過緩
除了檢測(1-3) IGF-I改善神經生理癥狀的效力以外，我們還探尋表征其對機體 一般健康狀況的影響。臨床和實驗證據顯示了雷特綜合征患者中自主系統功能紊亂，比如 呼吸節律不穩定以及基線心迷走緊張下降(Julu等，2001)。對通過交感神經系統調節血壓 自穩態的反饋機制(例如過度換氣誘導的心率降低)的控制差，這在雷特綜合征患者中是 常見的并且可引起威脅生命的心率失常(Acampa和Guideri，2006 Julu等，2001)。心臟 自主神經功能異常的發病機理(盡管還沒有很好地了解)表明腦干中的不成熟的神經元連 接可能是原因。為了考察MeCP2-/y小鼠中的心率異常和(1_3) IGF-1處理的作用，我們監 測了未麻醉的野生型和利用載體或(1-3) IGF-I處理的MeCP2-/y動物中的實時心臟心率。 野生型小鼠表現出規律的心率測量值分布，以約750次/分鐘為中心(圖4A)。相比之下， MeCP2-/y小鼠表現出了更不規律的心率，平均心率更低，利用(1-3) IGF-I處理之后不規律 心率的發生率顯著降低。(1-3) IGF-I施用增加運動活動并延長壽命MeCP2-/y小鼠在4_6周齡時開始出現雷特樣癥狀，這時它們逐漸變得嗜睡，出現 步態共濟失調并在10-12周齡間死亡(Chen等，2001)。因此通過計算籠區內的夜間紅外 線光束交叉事件還記錄了小鼠6周后的基線運動活動(圖4B)。在此，與野生型小鼠(WT) 相比，MeCP2敲除小鼠(KO)表現出運動活動水平顯著降低，但是利用(1-3) IGF-I處理的 (KO-T)則此水平升高。此升高對敲除型動物是特異性的，其中處理不能增加野生型動物 (WT-T)的活動。這些結果與在更幼齡的動物中所測量的其中在敲除型小鼠中未檢測到活動 改變的那些形成對比(圖6)，表明表型的出現是與疾病進展的表達相一致的。最后，與MeCP2K0同窩小鼠相比，利用(1_3) IGF-1處理的MeCP2_/y小鼠還表現出 預期壽命增加約50% (0. 5生存概率從約60天增加到90天)。我們還測量了(1-3) IGFl處理對海馬神經元胞體體積的影響。如上文對運動活動 所述，利用(1-3) IGFl處理了小鼠。如圖7所示，與野生型動物相比，MeCP2K0動物中海馬 CA3區中神經元胞體的體積顯著受損。(1-3) IGFl處理增加了 KO動物的平均胞體體積，但 是對野生型動物的胞體體積沒有影響。討論在此研究中，我們提供了(1-3) IGF-I減輕RTT疾病小鼠模型中RTT癥狀的證據。 一系列證據支持了 MeCP2突變動物顯示CNS中的不成熟環路的特征持續到成年期這一假 設。首先，單個神經元和突觸表現出興奮性突觸后電流的降低，表示突觸接觸的不成熟或不 穩定。第二，PSD-95(成熟功能性突觸及其強度的標志)在缺少MeCP2的腦中下調。第三， 成年MeCP2+/_小鼠中的視覺皮層連接在單眼剝奪之后表現出通常是幼齡小鼠的特征的突 觸變化。利用(1-3) IGF-I (已知其刺激IGF-I信號傳導并模擬BDNF路徑促進神經元和突 觸成熟)全身處理MeCP2敲除小鼠導致基本上改善這些度量譜，并且還改善了敲除型小鼠 中所觀察到的心率、運動活動和壽命的缺陷。盡管這些作用非常顯著，但需重點強調的是利用(1-3) IGF-I處理的MeCP2敲除小 鼠仍然出現全部癥狀并在成熟前死亡。像在患者中一樣，此疾病在小鼠中的進展包括幾乎無癥狀的早期階段，然后是4到8周的進行性惡化期，并且通常在10-12周間死亡。(1-3)IGF-I處理的小鼠與對照小鼠在同樣齡期出現癥狀，但明顯活得更長并在疾病后期保持活 動增加。IGF-I水平通常隨年齡而降低，并且IGF-I水平在嚙齒動物和人中的人為增加與肌 肉丟失減少和運動增加有關(Rudman等，1990)。相似的作用可能是(1_3) IGF-I介導的，并 且可導致(1-3) IGF-I處理的小鼠易于接近食物和水。(1-3) IGF-I處理還可能增加樹枝向 外生長或成年神經形成(Aberg等，2000 ；Aberg等，2003)，并因此可促進信號傳導和環路的 整體穩健性與穩定化。雖然沒有觀察到作為敲除或處理的結果的細胞體體積的變化，但是 觀察到了作為敲除和處理結果的總腦重量的小變化。我們的結果構成了在成年MeCP2+/_腦內皮層連接持續呈不成熟狀態的第一個功 能證據。雌性MeCP2突變小鼠具有幾乎正常的壽命(8-10個月)，并且出現癥狀比雄性突變 小鼠的更輕微、更晚。因此，在雌性MeCP2突變腦內觀察到的對突觸可塑性的顯著影響相當 出乎意料。由于隨機X失活，雌性MeCP2+/_小鼠腦內大約50%的神經元表達野生型MeCP2 蛋白。這說明突變神經元對整個突觸網絡具有支配性影響，與早期基因恢復的實驗結果是 一致的，其證明在> 70%的神經元中再活化MeCP2表達不阻止MeCP2_/y小鼠癥狀的發展 (Giacometti等，2007)。我們推測(1_3) IGF-I通過穩定突觸接觸來降低成年突變小鼠中的 OD可塑性，雖然其還可能增加突觸接觸的數目。(1-3) IGF-I還似乎在穩定視覺皮層中的突 觸接觸方面迅速起作用，因為用于單眼剝奪試驗的小鼠僅在光學成像前被處理4天。我們 不能排除(1-3) IGF-I影響非神經元細胞的可能性；例如，(1-3) IGF-I處理可增加在腦中的 血管密度和葡萄糖利用，或者對周圍組織具有其它作用。在上述實驗中，(1-3) IGF-I是通 過腹膜內注射施用給小鼠的。其它遞送方法也是可行的，例如靜脈內輸注或者心室內遞送 可更有效，并且可能進一步提高癥狀的恢復程度。總之，我們已表明，全身性遞送(1-3) IGF-I可顯著提高MeCP2突變小鼠的生理行 為和存活。我們還提供了以下直接證據MeCP2缺陷導致不成熟的突觸功能和組織化，這可 通過施用(1-3)IGF-1由可涉及PI3K/Akt/PSD-95路徑的機制來進行部分地恢復。雖然還 需要進一步研究以闡明(1-3) IGF-I的準確作用機制，但是本文所提供的結果指出了(1-3) IGF-I以及IGFl信號傳導對治療雷特綜合征的潛在用途。針對RTT的成功治療對其它孤獨 癥譜系障礙和神經發育疾病以及(如果表型顯著重疊)基因敏感性和所建議的潛在神經生 物學機制具有重要意義。實施例2. (1-3) IGF-I增加BDNF和tPA的表達和生物活性研究了(1-3) IGF-I處理對MD期間BDNF和tPA的表達和生物活性的影響。如上 文所述對小鼠進行MD并用(1-3) IGF-I處理。圖8A顯示(1-3) IGF-I處理對BDNF表達水平(在mRNA表達水平上)的影響。單 眼剝奪顯著降低了對側Vl中的BDNF表達水平。(1-3) IGF-I處理能增加進行MD的動物中 的表達，但是不能增加到對照水平。圖8B顯示對NeuN(綠色)和前體BDNF(紅色)抗體的雙染色。蛋白質表達證實， (1-3) IGF-I處理能通過增加BDNF蛋白質表達來調節MD作用，但是不能調節至對照水平。圖8C顯示(1-3) IGF-I處理對tPA的mRNA表達水平的影響(在mRNA水平上)。 相對于對照和被剝奪的動物而言，(1-3) IGF-I處理顯著上調了 tPA的mRNA表達。圖8D顯示對NeuN (紅色)和tPA (綠色)抗體的雙染色。tPA染色是蛋白質表達的標志，其存在于細胞體的尖端部分中，并且在MD中相對于對照未顯示出顯著變化。然而， tPA的表達水平似乎通過(1-3) IGF-I處理而強烈增加。圖8E代表(1-3) IGF-I對BDNF活化的作用模型。(1_3) IGF-I通過直接影響BDNF 表達和通過tPA控制BDNF生物活化(已知tPA將前體BDNF切割成成熟BDNF)而促進BDNF 活性。實施例3 =IGFl表現出與(1-3) IGF-I同樣的效力上述數據針對于促進IGFl信號傳導的IGFl的(1_3) IGF-I片段上。我們還測試 了已經被批準用于人患者中兒童施用(用于身材矮小適應癥)的全長IGFl肽的作用。我 們已經證明了(1-3) IGF-I和重組人IGFl (rhIGFl)作用的相關性。我們測定了直接應用這 兩種分子時對突觸傳遞的作用，并且發現它們各自可比較地成功地誘發突觸活動的顯著增 加(圖9A)。此外，利用(1-3) IGF-I或rhIGFl，眼優勢可塑性過程中皮層環路的成熟度(即 如實施例1所示)被促進至相似程度(180 μ g/kg/天，ip遞送，于2周時開始，如圖9B所 示)°參考文獻Aberg, M. A. , Aberg, N. D. , Hedbacker, H. , Oscarsson, J. , and Eriksson, P.S. 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權利要求
一種治療雷特綜合征的方法，包括向需要這種治療的對象施用有效量的胰島素樣生長因子1(IGF1)、(1-3)IGF-1、(1-3)IGF-1類似物和/或相關治療分子來治療所述對象。
2.權利要求1的方法，其中施用IGFl。
3.權利要求2的方法，其中所述IGFl是重組IGFl。
4.權利要求2或3的方法，其中所述IGFl是人IGFl。
5.權利要求2-4的方法，其中所施用的IGFl的劑量是約0.l-10mg/kg/天。
6.權利要求5的方法，其中所施用的IGFl的劑量是約0.l-2mg/kg/天。
7.權利要求1的方法，其中施用(1-3)IGF-1。
8.權利要求7的方法，其中所施用的(1-3)IGF-I的劑量是約0. Ι-lOOmg/kg/天。
9.權利要求8的方法，其中所施用的(1-3)IGF-I的劑量是約6-20mg/kg/天。
10.權利要求1的方法，其中施用(1-3)IGF-I類似物。
11.權利要求10的方法，其中所述(1-3)IGF-I類似物是Gly-Pro ;Pro-Glu ； (1-3) IGF-I替換類似物，其中Gly-Pro-Glu中Gly被替換為Ala、Ser、Thr或Pro中的任一個， 或者其中Gly-Pro-Glu中的Pro被替換為Ala、Ser、Thr或Gly中的任一個，或者其中 Gly-Pro-Glu中的Glu被替換為Asn, Asp或Gln中的任一個；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸 (1-3) IGF-I ；具有一個或兩個D-氨基酸的(1-3) IGF-I類似物；或者具有一個或兩個不可 水解肽鍵的(1-3) IGF-I類似物。
12.權利要求1的方法，其中施用相關治療分子。
13.權利要求12的方法，其中所述相關治療分子是IGF-I促分泌素、生長激素或前體、 生長激素促分泌素、生長激素釋放肽或生長激素釋放激素或類似物。
14.權利要求1-13中任一項的方法，其中所述對象是人。
15.權利要求1-14中任一項的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-1類似物 和/或相關治療分子經口服、靜脈內、肌內、鼻內、腹膜內、皮下或鞘內施用。
16.權利要求1-15中任一項的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-1類似物 和/或相關治療分子在診斷出雷特綜合征之后施用。
17.權利要求1-15中任一項的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-1類似物 和/或相關治療分子在診斷出雷特綜合征之前預防性施用。
18.權利要求1-17中任一項的方法，其中所述對象沒有其它需要用IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子進行治療的癥狀。
19.權利要求1-18中任一項的方法，還包括首先測試所述對象中編碼甲基CpG結合蛋 白2(MeCP2)之基因的突變。
20.權利要求1-19中任一項的方法，還包括向所述對象施用第二治療劑，其中所述第 二治療劑是tPA，BDNF，調節抑制的分子例如苯并二氮雜$類，或者是作為神經遞質激動 齊U、拮抗劑或類似物的分子；其中所述第二治療劑和所述IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類 似物和/或相關治療分子以有效治療所述對象的組合量施用。
21.權利要求1-20中任一項的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-1類似物 和/或相關治療分子的量可有效恢復突觸功能和/或使突觸成熟、鞏固突觸和/或調節神 經元可塑性。
22.—種治療對象中突觸功能和/或成熟的障礙的方法，包括向需要這種治療的對象施用有效量的胰島素樣生長因子I(IGFl)、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子來治療所述對象。
23.權利要求22的方法，其中施用IGF1。
24.權利要求23的方法，其中所述IGFl是重組IGFl。
25.權利要求23或24的方法，其中所述IGFl是人IGFl。
26.權利要求23-25的方法，其中所施用的IGFl的劑量是約0.l-10mg/kg/天。
27.權利要求26的方法，其中所施用的IGFl的劑量是約0.l_2mg/kg/天。
28.權利要求22的方法，其中施用(1-3)IGF-1。
29.權利要求28的方法，其中所施用的(1-3)IGF-I的劑量是約0. Ι-lOOmg/kg/天。
30.權利要求29的方法，其中所施用的(1-3)IGF-I的劑量是約6_20mg/kg/天。
31.權利要求22的方法，其中施用(1-3)IGF-I類似物。
32.權利要求31的方法，其中所述(1-3)IGF-I類似物是Gly-Pro ;Pro-Glu ； (1-3) IGF-I替換類似物，其中Gly-Pro-Glu中的Gly被替換為Ala、Ser、Thr或Pro中的任一 個，或者其中Gly-Pro-Glu中的Pro被替換Ala、Ser、Thr或Gly中的任一個，或者其中 Gly-Pro-Glu中的Glu被替換為Asn, Asp或Gln中的任一個；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸 (1-3) IGF-I ；具有一個或兩個D-氨基酸的(1-3) IGF-I類似物；或者具有一個或兩個不可 水解肽鍵的(1-3) IGF-I類似物。
33.權利要求22的方法，其中施用相關治療分子。
34.權利要求33的方法，其中所述相關治療分子是IGF-I促分泌素、生長激素或前體、 生長激素促分泌素、生長激素釋放肽或生長激素釋放激素或類似物。
35.權利要求22-34中任一項的方法，其中所述對象是人。
36.權利要求22-35中任一項的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I類似物 和/或相關治療分子經口服、靜脈內、肌內、鼻內、腹膜內、皮下或鞘內施用。
37.權利要求22-36中任一項的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I類似物 和/或相關治療分子在診斷出所述病癥之后施用。
38.權利要求22-36中任一項的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I類似物 和/或相關治療分子在診斷出所述病癥之前預防性施用。
39.權利要求22-38中任一項的方法，其中所述病癥是孤獨癥；孤獨癥譜系障礙；安 格爾曼綜合征；結節性硬化；脆性X綜合征；精神分裂癥；抑郁癥；神經退行性疾病，包括帕 金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默病；中風或外傷。
40.權利要求22-39中任一項的方法，其中所述對象沒有其它需要用IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子進行治療的癥狀。
41.權利要求22-40中任一項的方法，還包括首先檢測所述對象中作為所述病癥遺傳 基礎之基因的突變或者作為該基因之靶標或下游的基因的突變。
42.權利要求22-41中任一項的方法，還包括向所述對象施用第二治療劑，其中所述第 二治療劑是tPA，BDNF，調節抑制的分子例如苯并二氮雜:^類，或者是神經遞質激動劑、拮 抗劑或類似物的分子；其中所述第二治療劑和所述IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-1類似物 和/或相關治療分子以有效治療所述對象的組合量施用。
43.權利要求22-42中任一項的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I類似物 和/或相關治療分子的量可有效恢復突觸功能和/或使突觸成熟、鞏固突觸和/或調節神 經元可塑性。
44.一種促進突觸成熟的方法，包括使含有一個或多個突觸的一個或多個神經元與一定量的胰島素樣生長因子1 (IGFl)、 (1-3) IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子相接觸，所述量可有效促進所述一個 或多個神經元的一個或多個突觸的成熟。
45.權利要求44的方法，其中使所述一個或多個神經元與IGFl接觸。
46.權利要求45的方法，其中所述IGFl是重組IGFl。
47.權利要求45或權利要求46的方法，其中所述IGFl是人IGFl。
48.權利要求44的方法，其中使所述一個或多個神經元與(1-3)IGF-I接觸。
49.權利要求44的方法，其中使所述一個或多個神經元與(1-3)IGF-I類似物接觸。
50.權利要求49的方法，其中所述(1-3)IGF-I類似物是Gly-Pro ;Pro-Glu ； (1-3) IGF-I替換類似物，其中Gly-Pro-Glu中的Gly被Ala、Ser、Thr或Pro中的任一個替換，或者 其中Gly-Pro-Glu中的Pro被Ala、Ser、Thr或Gly中的任一個替換，或者其中Gly-Pro-Glu 中的Glu被Asn、Asp或Gln中的任一個替換；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸(1-3) IGF-I ；具有 一個或兩個D-氨基酸的(1-3) IGF-I類似物；或者具有一個或兩個不可水解肽鍵的(1-3) IGF-I類似物。
51.權利要求44的方法，其中使所述一個或多個神經元與所施用的相關治療分子接觸。
52.權利要求51的方法，其中所述相關治療分子是IGF-I促分泌素、生長激素或前體、 生長激素促分泌素、生長激素釋放肽或生長激素釋放激素或類似物。
53.權利要求44-52中任一項的方法，其中所述一個或多個神經元是人神經元。
54.權利要求44-53中任一項的方法，其中使所述一個或多個神經元在體外接觸。
55.權利要求44-53中任一項的方法，其中使所述一個或多個神經元在體內接觸。
56.權利要求55的方法，其中所述在體內接觸是通過向對象施用IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I類似物和/或相關治療分子來進行的。
57.權利要求56的方法，其中所述IGFl、(1-3)IGF-I、(1-3) IGF-I類似物和/或相關 治療分子經口服、靜脈內、肌內、鼻內、腹膜內、皮下或鞘內施用。
全文摘要
本發明涉及利用IGF1、(1-3)IGF-1、(1-3)IGF-1類似物和/或相關治療分子來治療雷特綜合征和其它突觸功能和成熟之障礙的方法。
文檔編號A61K38/30GK101820896SQ200880024937
公開日2010年9月1日 申請日期2008年6月6日 優先權日2007年6月8日
發明者埃馬努埃拉·科梅蒂, 姆里甘卡·蘇爾, 納撒·R·威爾遜, 達妮埃拉·特羅佩亞, 魯道夫·耶尼施 申請人:麻省理工學院;懷特黑德生物醫學研究院