用于成像的經標記的iigf結合肽的制作方法

專利名稱：用于成像的經標記的iigf結合肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及適合體內光學成像的經標記的cMet結合肽。肽是用適合在紅色至近紅外區域中成像的光學報道基團進行標記。還公開了特別可用于結腸直腸癌(CRC)的診斷 的體內成像方法。
背景技術：
WO 2005/030266公開了存在著對早期診斷結腸直腸癌(CRC)的醫學需求。WO 2005/030266公開了對CRC中異常表達的生物靶標具有親和力的光學成像造影劑。生物靶 標選自C0X-2、β-聯蛋白、E-鈣黏著蛋白、P-鈣黏著蛋白、各種激酶、Her-2、基質金屬蛋 白酶(MMP)、細胞周期蛋白、P53、胸苷酸合成酶、VEGF受體、EGF受體、K_ras、結腸腺瘤性息 肉蛋白、組織蛋白酶B、uPAR、cMet、黏蛋白和胃泌素受體。這些靶標中優選的據說(第7頁 第 11-12 行)Mi :cMet,MMP-14,C0X-2, β -聯蛋白和組織蛋白酶 B。WO 2005/030266 的載 體可以是肽、擬肽部分(pi^ptoid moiety)、寡核苷酸、寡糖、脂質相關化合物或者傳統的有 機藥物樣小分子。報道部分優選是能與電磁波頻譜紫外部分到紅外部分的波長區域中的光 發生相互作用的染料。肝細胞生長因子(HGF)，也稱擴散因子(scatter factor, SF)，是一種參與各種生 理過程如創傷愈合和血管發生的生長因子。HGF與其高親和力受體(cMet)的相互作用牽涉 到腫瘤生長、侵入和轉移。Knudsen等人綜述了 HGF和cMet在前列腺癌中的作用，這對成像和治療可能具 有意義[Adv. Cancer Res. ,91, 31-67 (2004)]。診斷和治療用的經標記的抗met抗體在WO 03/057155 有描述。WO 2004/078778公開了能結合cMet或者包含cMet和HGF的復合物的多肽或多 聚肽構建物。大約10種不同結構類別的肽已被描述。WO 2004/078778的公開中，肽可用 供體外和體內應用的可檢測標記物進行標記，或者用供治療應用的藥物進行標記。可檢測 標記物可以是酶、熒光化合物、光學染料、順磁性金屬離子、超聲造影劑或放射性核素。WO 2004/078778的優選標記據稱是放射性的或順磁性的，且最優選包含被金屬螯合劑螯合的 ^^ I^l ο

發明內容
本發明提供適合體內光學成像的成像劑，其包含cMet結合環肽和光學報道成像 部分，該光學報道成像部分適合于用綠色至近紅外波長500-1200nm的光對哺乳動物身體 進行體內成像。cMet結合環肽與WO 2004/078778的肽結構類別之一有關，對cMet具有最 佳結合親和力。如WO 2004/078778中所述，這些肽衍自噬菌體展示，并通過它們對cMet的 親和力和與HGF的競爭的缺乏進行選擇。本發明的cMet結合肽優選其至少一個末端受到代 謝抑制基團(Mre)的保護。這對體內應用來說是一個重要的考慮，因為體內內源酶類和肽酶 會將肽快速代謝，結果造成cMet結合親和力的喪失，從而導致體內選擇性靶向性的喪失。根據本發明教導，體內使用cMet結合肽的最佳方式涉及到使用光學報道分子而不是其他成像模式(例如核成像、MRI成像或超聲成像)，且還提供了優選的光學成像報道分子。優選綠色至近紅外區域(波長500-1200nm的光)，因為該區域與內源組織和 材料如血紅蛋白、嚇啉、黑色素和膠原的光譜重疊最小[Licha，Topics Curr. Chem. ,222, 1-29 (2002)]。自身熒光的其他重要促進因素是NADH、FAD和彈性蛋白。發明詳述在第一方面，本發明提供包含式I的綴合物的成像劑 (I)其中Z1連接到cMBP的N末端，且為H或Mig ；Z2連接到cMBP的C末端，且為OH、OBc或MIG，其中Be為生物相容性陽離子；cMBP為包含以下氨基酸序列(SEQ-I)的17-30個氨基酸的cMet結合環肽Cysa-Xl-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6 ；其中X1 為 AsruHis 或 Tyr ；X2 為 Gly、Ser, Thr 或 Asn ；X3 為 Thr 或 Arg;X4 為 Ala、Asp、Glu、Gly 或 Ser ；X5 為 Ser 或 Thr ；X6 為 Asp 或 Glu ；而Cysa_d各自為半胱氨酸殘基，使得殘基a與b和c與d環化形成兩個獨立的二 硫鍵；Mig為代謝抑制基團，其為能抑制或阻礙cMet肽的體內代謝的生物相容性基團；L為式-㈧m_的合成接頭基團，其中每個A獨立為-CR2-、-CR = CR-,-C ^ C_、_CR2 CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR (C = 0) NR-,-NR (C = S) NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2scr2-、-CR2NRCR2-、C4_8環雜亞烷基基團、C4_8環亞烷基基團、C5_12亞芳基基團或C3_12雜 亞芳基基團、氨基酸、糖或單分散性聚乙二醇(PEG)結構單元；每個R獨立選自H、CV4烷基、C2_4烯基、C2_4炔基、Ch烷氧基烷基或CH羥基烷基；m為1-20的整數；η為0或1的整數；IM為適合于用綠色至近紅外波長600-1200nm的光對哺乳動物身體進行體內成像 的光學報道成像部分。術語“成像劑”是指適合于對哺乳動物身體進行體內成像的化合物。優選地，哺乳動物是人受試對象。成像可以是侵入式的(例如手術中的或內窺鏡檢查的)，或者是非侵入式的。優選的成像方法是內窺鏡檢查法。雖然式I的綴合物適用于體內成像，但它也可 具有體外應用(例如生物樣品中的CMet定量測定或者組織樣品中的cMet的顯示)。優選 地，成像劑用于體內成像。Z1基團取代最后一個氨基酸殘基的胺基團。因此，當Z1為H時，cMBP的氨基末端 終止于最后一個氨基酸殘基的游離NH2基團。Z2基團取代最后一個氨基酸殘基的羰基基團。 因此，當Z2為OH時，cMBP的羧基末端終止于最后一個氨基酸殘基的游離CO2H基團，當Z2為 OBc時，該末端羧基基團被電離為CO2Be基團。術語“代謝抑制基團”(Mre)是指能抑制或阻礙cMBP肽在氨基末端(Z1)或羧基末 端(Z2)處的體內代謝的生物相容性基團。這種基團是本領域技術人員公知的，對于肽胺末 端而言適宜選自N-乙酰化基團-NH(C = O)Rg,其中酰基基團-(C = O)Rg具有選自而_6烷 基基團、C3,芳基基團的Re，或者包含聚乙二醇(PEG)結構單元。下文描述到接頭基團(L) 的合適PEG基團。優選的這種PEG基團是式IA或IB的生物修飾物(biomodifier)。優選 的這種氨基末端Mre基團是乙酰基、芐氧羰基或三氟乙酰基，最優選乙酰基。對于肽羧基末端而言合適的代謝抑制基團包括甲酰胺、叔丁酯、芐酯、環己酯、氨 基醇或聚乙二醇(PEG)結構單元。cMBP肽的羧基末端氨基酸殘基的合適MIG基團，是其中 氨基酸殘基的末端胺被CV4烷基基團、優選甲基基團進行N-烷基化。優選的這種Mre基團 是甲酰胺或PEG，最優選這種基團是甲酰胺。式I表示_(L)n[IM]部分可在Z\Z2或cMBP的任何合適位置連接。對于Z1或Z2，當 ZVZ2任一者為Mig時，-(L) JIM]部分可連接到所述Mig基團。當Z1為H或者Z2為OH時，-(L) n[IM]部分在Z1或Z2位置的連接分別產生出式[IM]-(L)n-[cMBP]-Z2或Z1-EcMBP]-(L) n-[IM]的化合物。對cMBP在任一肽末端處的代謝的抑制，也可通過以這種方式連接-(L) n[IM]部分來實現，但_(L)n[IM]超出了本發明的Mre的定義。式I的-(L)n-部分可在IM的任何合適位置處連接。-(L)n-部分或者代替IM的 現有取代基，或者共價連接到IM的現有取代基。-(L)n-部分優選通過IM的羧基烷基取代
基連接。術語“cMet結合環肽”(cMBP)是指能結合肝細胞生長因子(HGF)高親和力受體 (也稱CMet(C-Met或肝細胞生長因子受體))的肽。本發明的合適的cMBP肽對cMet/HGF 復合物的cMet的表觀Kd小于約20nM。cMBP肽包含脯氨酸殘基，已知這種殘基能抑制主鏈 酰胺鍵的順式/反式異構化。本發明的cMBP肽包括任何這種異構體。術語“生物相容性陽離子”(Be)是指能與電離的、帶負電荷的基團形成鹽的帶正電 荷的反荷離子，其中所述帶正電荷的反荷離子也是無毒的，因此適合給予哺乳動物身體，特 別是人身體。合適的生物相容性陽離子的實例包括堿金屬鈉或鉀離子；堿土金屬鈣和鎂 離子；以及鋁離子。優選的生物相容性陽離子是鈉和鉀，最優選鈉。術語“氨基酸”是指L-或D-氨基酸、氨基酸類似物(例如萘丙氨酸)或氨基酸 模擬物，它們可以是天然的或者純粹是合成的，且可以是光學純的，也即為單一對映異構體 并因此具有手性，或者是對映異構體的混合物。本文使用常規的氨基酸三字母或單字母縮 寫。優選地，本發明的氨基酸是光學純的。術語“氨基酸模擬物”是指天然氨基酸的合成類 似物，其為電子等排體，即已被設計來模擬天然化合物的立體和電子結構。這種電子等排體是本領域技術人員公知的，包括但不限于縮肽(cbpsip印tide)、逆-反肽(retro-inverso ρ 印 tide)、硫代酰胺、環烷或 1，5-二取代四唑[參見 M. Goodman, Biopolymers, 24 137, (1985)]。術語“肽”是指包含兩個或多個如上定義的通過肽鍵(將一個氨基酸的胺連接到 另一個氨基酸的羧基的酰胺鍵)連接的氨基酸的化合物。術語“肽模擬物”或“模擬物”是 指這樣的生物活性化合物，它們模擬肽或蛋白質的生物活性，但在化學性質上不再屬于肽， 也就是說，它們不再含有任何肽鍵(即氨基酸之間的酰胺鍵)。因此，術語肽模擬物以更廣 的含義使用，以包括在性質上不再完全屬于肽的分子，如假肽、半肽和擬肽。術語“光學報道分子成像部分”(IM)是指能夠在光學成像程序中用綠色至近紅外 波長(500-1200nm，優選600-1000nm)的光直接或間接檢測的熒光染料或發色團。優選地， IM具有熒光性質。設想到，式I的接頭基團-(A)m-的一個作用是使IM與cMBP肽的活性位點隔開。 這在成像部分體積相對較大時是特別重要的，使得與酶的相互作用不受削弱。這可通過柔 性(例如簡單的烷基鏈)和/或剛性(例如環烷基或芳基間隔基)的組合來實現，所述柔 性使得體積大的基團具有自身進行定位以避開活性位點的自由度，所述剛性則將IM定向 成避開活性位點。還可用接頭基團的性質來修飾成像劑的生物分布。因此例如在接頭中引 入醚基團將有助于使血漿蛋白結合減至最低。當-(A)m-包含聚乙二醇(PEG)結構單元或者 1-10個氨基酸殘基的肽鏈時，接頭基團可起到修飾成像劑的體內藥代動力學和血液清除速 率的作用。這種“生物修飾性”接頭基團可加速成像劑從背景組織(如肌肉或肝臟)和/或 從血液的清除，從而因為背景干擾較少而得到較好的診斷影像。生物修飾性接頭基團還可 用來促進特定的排泄途徑，例如通過腎臟排泄而不是通過肝臟排泄。術語“糖”是指單糖、二糖或三糖。合適的糖包括葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、甘露 糖和乳糖。任選地，糖可進行官能化以便容易與氨基酸偶聯。因此例如，氨基酸的葡糖胺衍 生物可通過肽鍵與其他氨基酸綴合。天冬酰胺的葡糖胺衍生物(可從NovaBiochem市售獲
得)是其中一個實例 優詵的特征成像劑的分子量適宜最高為8000道爾頓。優選地，分子量在2800-6000道爾頓的 范圍，最優選3000-4500道爾頓，尤其優選的是3200-4000道爾頓。本發明的優選成像劑其兩個肽末端都被Mre基團保護，即優選Z1和Z2都是Mig,而 這兩個Mre通常會是不同的。如上所述，Ζ7Ζ2任一者可任選等于_(L)n[IM]。兩個肽末端以 這種方式進行保護對于體內成像應用是重要的，因為否則就會發生快速代謝，結果造成對 cMet的選擇性結合親和力的喪失。當Z1和Z2均為Mig時，優選Z1為乙酰基，Z2為伯酰胺。最優選地，Z1為乙酰基，Z2為伯酰胺，"(L)JIM]部分連接到cMBP的賴氨酸殘基的ε胺側 鏈。本發明的優選的cMBP肽對cMet/HGF復合物的cMet的結合的Kd小于約IOnM(基 于熒光偏振測定的測量值)，最優選在1-5ηΜ的范圍，理想的是小于3nM。式I的cMBP的肽序列(SEQ-I) Cysa-Xl-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6(SEQ-I)是17-mer肽序列，其主要負責與cMet的選擇性結合。當本發明的cMBP肽包含超 過17個氨基酸殘基時，其余的氨基酸可以是半胱氨酸之外的任何氨基酸。額外的未受保護 的半胱氨酸殘基會造成已確定的Cysa-Cysb 二硫鍵和Cyf-Cysd 二硫鍵出現不合需要的攪亂 (scrambling).額外的肽優選包含至少一個具有適于使_(L)n[IM]部分容易綴合的側鏈的 氨基酸殘基。合適的這種殘基包括供與胺官能化的-(L)n [IM]基團綴合的Asp殘基或Glu 殘基，或者供與羧基官能化的或活性酯官能化的_ (L) η [IM]基團綴合的Lys殘基。供與-(L) η[ΙΜ]綴合的氨基酸殘基適宜位于遠離cMBP肽(SEQ-I)的17-mer結合區域的位置，優選位 于C末端或N末端。優選地，供綴合的氨基酸殘基是Lys殘基。用已知的氨基酸置換物苯丙氨酸和萘丙氨酸，評估SEQ-I的色氨酸殘基的置換。 不管怎樣都發現cMet親和力的喪失，這提示色氨酸殘基對活性是重要的。優選的是cMBP肽還包含N末端絲氨酸殘基，從而得到18-mer (SEQ-2)Ser-Cysa Xl-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6O(SEQ-2)除了 SEQ-I或優選地SEQ-2外，cMBP最優選還包含(i) C或N-cMBP肽末端的4個氨基酸殘基以內的Asp殘基或Glu殘基，且-(L)nIM 用胺基團官能化，該胺基團綴合到所述Asp殘基或Glu殘基的羧基側鏈而產生酰胺鍵；(ii) C或N-cMBP肽末端的4個氨基酸殘基以內的Lys殘基，且-(L)nIM用羧基基 團官能化，該羧基基團綴合到所述Lys殘基的ε胺側鏈而產生酰胺鍵。優選的cMBP肽包含22-mer氨基酸序列(SEQ-3)Ala-Gly-Ser-Cysa-Xl-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-Gly-Thr。 (SEQ-3)本發明的cMBP肽優選其中X3等于Arg。cMBP肽優選除了包含SEQ-I、SEQ_2或SEQ-3外，還在N末端或C末端包含選自以 下的接頭肽-Gly-Gly-Gly-Lys-(SEQ-4)、-Gly-Ser-Gly-Lys-(SEQ-5)或-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys-(SEQ-6)。接頭肽的Lys殘基是綴合_(L)n[IM]部分的最優選位置。尤其優選的cMBP肽包 含SEQ-3以及SEQ-4接頭肽，從而具有26-mer氨基酸序列(SEQ-7)Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr -Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys。 (SEQ-7)SEQ-l、SEQ-2、SEQ-3 和 SEQ-7 的 cMBP 肽優選 Z1 = Z2 = Mig,最優選 Z1 =乙酰基和 Z2 =伯酰胺。
-(L)JIM]部分適宜連接到Z1基團或Z2基團任一者，或者連接到cMBP肽的異于SEQ-I的cMet結合序列的氨基酸殘基。優選的氨基酸殘基和綴合位點如上所述。當-(L) n[IM]部分連接到Z1或Z2時，它可通過綴合到N末端或C末端而代替Z1或Z2，這樣就阻斷 體內代謝。優選的IM基團具有廣泛的離域電子體系，例如花菁、部花菁、吲哚花菁、酞花 菁、萘花菁、三苯基次甲(triphenylmethine)、口卜啉、pyrilium 染料、thiapyrilium 染 料、squarylium 染料、croconium 染料、azulenium 染料、青定苯月安、benzophenoxazinium 染料、benzothiaphenothiazinium 染料、蒽醌、萘醌、陰丹士林(indathrene)、 phthaloylacridone、三苯酚合苯醌(trisphenoquinone)、偶氮染料、分子內和分 子鍵電荷轉移染料和染料復合物、環庚三烯酮、四嗪、bis(dithiolene)復合物、 bis(benzene-dithiolate)復合物、碘苯胺染料、bis (S，0-dithiolene)復合物。也可使用 熒光蛋白如綠色熒光蛋白(GFP)和具有不同的吸收/發射特性的GFP修飾物。某些稀土金 屬(例如銪、釤、鋱或鏑)的復合物在某些情形中使用，如熒光納米晶體(量子點)。可使用的發色團的具體實例包括熒光素、磺酰羅丹明101(TeXaSRed)、羅丹明B、 羅丹明 6G、羅丹明 19、吲哚花菁綠、Cy2、Cy3B、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7、Cy7. 5,Marina Blue、 Pacific Blue、OregonGreen 488、Oregon Green 514、四甲基羅丹明以及 Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、 Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700 和 Alexa Fluor 750。特別優選花菁染料。Licha 等 人綜述了用于體內光學成像的染料和染料綴合物[Topics Curr. Chem. ,222,1-29(2002)； Adv. Drug Deliv. Rev. ,57,1087-1108(2005)]。優選的屬熒光團的花菁染料為式II (II)其中每個X'獨立選自-C(CH3)2、-S-、-0-或-C[(CH2)aCH3] [(CH2)bM]-,其中a為0-5的整數，b為1_5的整數，M為基團G或者 選自SO3M1或H ；每個Y'獨立代表1-4個選自以下的基團H、-CH2NH2, -SO3M1, -CH2COOM1, -NCS禾口 F，且其中V基團被置于芳環的任何位置；Q'獨立選自出、50#、朋2、0)(^、銨、酯基團、芐基和基團6;M1 為 H 或 Bc ；1為1-3的整數；
m為1-5的整數；其中X'、V和Q'中至少一個包含基團G ；G為適合于連接到cMBP肽的活性基團或官能團。G基團與cMBP肽的互補基團反應，從而在花菁染料熒光團和cMBP肽之間形成共價鍵。G可以是可與肽的互補官能團反應的活性基團，或者可包括可與cMBP肽的活性基團 反應的官能團。活性基團和官能團的實例包括活性酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、鹵代乙酰 胺、酰基商、酰胼、乙烯砜、二氯三嗪、亞磷酰胺、羥基、氨基、巰基、羰基、羧酸和硫代磷酸酯。 優選G是活性酯。術語“活化酯”或“活性酯”是指相關羧酸的酯衍生物，它被設計成為更好的離 去基團，從而使得更容易與親核體如胺反應。合適的活性酯的實例有N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、硫代琥珀酰亞胺酯、五氟苯酚、五氟苯硫酚、對硝基苯酚、羥基苯并三氮唑和 PyBOP (即苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鐺六氟磷酸鹽)。優選的活性酯是N-羥基 琥珀酰亞胺酯或五氟苯酚酯，尤其是N-羥基琥珀酰亞胺酯。在式II的一個優選實施方案中每個V 選自-C (CH3) 2-和-C (CH3) [ (CH2) 4M]-，其中M為G基團或-SO3M1 ；每個Y'代表SO3M^H或1_4個F原子；每個Q'選自G基團和SO3M1 ；1優選為2，m優選為3、4或5 ；其中當X'或Q'為G基團時，它最優選為琥珀酰亞胺酯。特別優選的花菁染料為式III (III)其中R1和R2獨立為H或SO3M1,且R1和R2中至少一個為SO3M1,其中M1為H或Bc ；R3和R4獨立為Cy烷基或CV6羧基烷基；R5、R6、R7 和 R8 獨立為 Ra 基團；其中Ra為Cp4烷基、Cp6羧基烷基或-(CH2)kSO3M1,其中k為數值為3或4整數。條件是該花菁染料在R1基團、R2基團和Ra基團中具有總共1-4個S0#取代基。選擇優選的式III染料，從而使至少一個CV6羧基烷基基團得以存在，以利于與 cMBP的綴合。各個優選的式III染料在表1中總結表1 各個花菁染料的化學結構 其中Rf = - (CH2) 5C00H。尤其優選的式II染料是Cy5#和Alexa647，最理想是Cy5**。當合成的接頭基團(L)存在時，它優選包含利于與[IM]和Z^cMBPFZ2的綴合的 末端官能團。當L包含1-10個氨基酸殘基的肽鏈時，氨基酸殘基優選選自甘氨酸、賴氨酸、 精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或絲氨酸。當L包含PEG部分時，它優選包含衍自式IA或IB的 單分散性PEG樣結構的寡聚化的單元 (IA)式IA的17-氨基-5-氧代-6-氮雜-3，9，12，15-四氧雜十七烷酸其中ρ為1-10的整數。或者，可使用基于式IB的丙酸衍生物的PEG樣結構 (IB)其中ρ如對式IA所定義，q為3-15的整數。在式IB中，ρ優選為1或2，q優選為5-12。當接頭基團不包含PEG或肽鏈時，優選的L基團具有這樣的主鏈，其由2-10個原 子、最優選2-5個原子、尤其優選2或3個原子連接在一起而構成-(A)m-部分。2個原子的 最小接頭基團主鏈帶來的優點是，成像部分得到很好的隔開，使得任何不合需要的相互作 用減至最低。在式I中，η優選為O或1，最優選0，即不存在接頭基團。本發明的優選的成像劑為式IV
(L)n[IM] (IV)其中(L)JIM]基團連接到Lys殘基的ε氨基基團。優選的式IV的成像劑為Mre (N 末端Ala)等于乙酰基和Mre (C末端Lys)等于伯酰胺。在式IV中，η優選為0，IM優選為花 菁染料，最優選式II的花菁染料。特別優選的式IV成像劑為IM = Cy5**或Alexa647，理 想的是Cy5**。本發明的式Z^tcMBPFZ2的肽可通過包括以下步驟的制備方法獲得(i)固相肽合成法合成出這樣的線性肽其肽序列與所需的cMBP肽相同，且其中 Cysa和Cysb未受保護，Cysc殘基和Cysd殘基具有硫醇保護基；(ii)用堿的水溶液處理步驟(i)得到的肽，產生具有連接Cysa和Cysb的第一二 硫鍵的單環肽；(iii)除去Cyf和Cysd硫醇保護基并環化，產生連接Cyf和Cysd的第二二硫鍵， 即為所需的雙環肽產物ZLtcMBPFZ2。術語“保護基”是指這樣的基團，它能抑制或阻礙不需要的化學反應，但它被設計 成具有足夠的反應性，使得它可在不會改變分子的其余部分的足夠溫和的條件下從它所涉 及的官能團上切割下來。脫保護后，就獲得所需的產物。胺保護基是本領域技術人員公知 的，適宜選自Boc (其中Boc為叔丁氧基羰基)、Fmoc (其中Fmoc為芴基甲氧基羰基)、三氟 乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde [即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代環己亞基)乙基]或Npys (即 3-硝基-2-吡啶亞磺酰基)。合適的硫醇保護基有Trt (三苯甲基),Acm (乙酰胺基甲基)、 t-Bu (叔丁基)、叔丁基硫、甲氧基芐基、甲基芐基或Npys (3-硝基-2-吡啶亞磺酰基)。更 多的保護基的使用在'Protective Groups in Organic Synthesis', Theorodora W. Greene 和 Peter G. M. Wuts，(John ffiley&Sons, 1991)中有描述。優選的胺保護基是 Boc 和 Fmoc， 最優選Boc。優選的胺保護基是Trt和Acm。實施例1和2提供更多的具體細節。固相肽合成的更多細節在P.Lloyd-Williams， F. Albericio 禾口 E. Girald ;Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins, CRC Press，1997中有描述。cMBP肽最好在惰性氣體下保存并放在冰箱中。當在 溶液中使用時，最好避免7以上的pH，因為這會有二硫鍵發生攪亂(scrambling)的風險。成像劑可如第三方面(下文)中所述進行制備。在第二方面，本發明提供包含第一方面的成像劑以及生物相容性載體的藥物組合 物，所述藥物組合物為適合于哺乳動物給藥的形式。“生物相容性載體”是使得組合物生理上可耐受，即組合物能給予哺乳動物身體而 不造成毒性或過度不舒服的流體，尤其是液體，成像劑可懸浮或溶解于其中。生物相容性載 體適宜是可注射載體液體，如無菌無熱原注射用水；水溶液如鹽水(有利的是可對其進行 平衡處理，使得注射用的最終產品是等滲的)；一種或多種張力調節物質(血漿陽離子與生物相容性反荷離子的鹽)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、甘醇(例如甘油)或者其他非離子型多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。優 選地，生物相容性載體是無熱原注射用水或者等滲鹽水。成像劑和生物相容性載體各自在合適的瓶或罐中供應，所述瓶或罐包括密封容 器，其能使無菌完整性和/或放射性安全性得以保持，任選還含有惰性頂空氣體(例如氮氣 或氬氣)，同時便于通過注射器或套管注入或提取溶液。優選的這種容器是隔膜密封小瓶， 其有不透氣密封件卷邊套口，密封件上還加頂封(通常為鋁材)。密封件適合于用皮下注射 器針頭進行單次或多次穿刺(例如為卷邊套口的隔膜密封件)，同時保持無菌完整性。這種 容器具有如下的額外優點密封件如需要的話能承受真空(例如改變頂空氣體或者使溶液 脫氣)，且能承受壓力變化如壓力下降而不讓外部大氣氣體如氧氣或水蒸氣進入。優選的多劑量容器包括裝有患者多次用劑量的單個大瓶(例如10-30cm3體積)， 據此可在制品有效期內的不同時間將患者各次劑量抽取到臨床級注射器中，以適應臨床情 況。預充注射器被設計成裝有單次人用劑量或者“單位劑量”，因此優選是適合臨床使用的 一次性注射器或其他注射器。本發明的藥物組合物優選具有適合單個患者的劑量，且如上 所述在合適的注射器或容器中提供。藥物組合物可任選含有另外的賦形劑，如抗微生物防腐劑、pH調節劑、填充劑、穩 定劑或重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)調節劑。術語“抗微生物防腐劑”是指能抑制潛 在有害的微生物如細菌、酵母或霉菌的生長的物質。視所采用的劑量而定，抗微生物防腐劑 還可顯示一定的殺細菌性質。本發明的抗微生物防腐劑的主要作用是抑制任何這種微生物 在藥物組合物中的生長。但是，抗微生物防腐劑還可任選用于抑制潛在有害的微生物在藥 盒的一種或多種用來在臨用時制備所述組合物的成分中的生長。合適的抗微生物防腐劑包 括尼泊金酯類，即尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯或尼泊金丁酯或者它們的混合物； 芐醇；苯酚；甲酚；溴化十六烷基三甲銨(cetrimide)和硫柳汞。優選的抗微生物防腐劑是 尼泊金酯類。術語“pH調節劑”是指可用于確保組合物的pH在人或哺乳動物給藥的可接受范圍 內(大約PH 4.0-10. 5)的化合物或者化合物的混合物。合適的這種pH調節劑包括藥物可 接受的緩沖劑如三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、磷酸鹽或TRIS [即三(羥甲基)氨基 甲烷]，和藥物可接受的堿如碳酸鈉、碳酸氫鈉或它們的混合物。當組合物以藥盒形式應用 時，PH調節劑可任選在單獨的瓶或容器中提供，使得藥盒使用者可進行PH調節，作為多步 驟程序的一部分。術語“填充劑”是指在生產和凍干過程中可促進物料處理的藥物可接受的增量劑。 合適的填充劑包括無機鹽如氯化鈉，和水溶性糖或糖醇如蔗糖、麥芽糖、甘露糖醇或海藻 糖。第二方面的藥物組合物可在無菌制造(即清潔室)條件下進行制備，以得到所需 的無菌非熱原產品。優選的是，關鍵成分尤其是相關試劑加器械與成像劑接觸的那些部分 (例如瓶)是無菌的。各成分和試劑可通過本領域公知的方法進行滅菌，包括無菌過濾， 使用例如Y輻照、高壓滅菌、干熱或化學處理(例如用環氧乙烷)進行終末滅菌。優選預 先對一些成分進行滅菌，使得需要進行的操作數目達致最小。但是，作為預防措施，優選包 括至少無菌過濾步驟作為藥物組合物的制備中的最終步驟。
第二方面的藥物組合物可任選從藥盒制備，如下文對第四方面所述。在第三方面，本發明提供制備第一方面的成像劑的方法，所述方法包括步驟 (i)-(iv)之一⑴使其中Z1為H，Z2為Mig的式ZqcMBPFZ2的cMBP肽，與式YMDdIM]的化 合物反應，得到其中[IM]在Z1位置綴合的式I成像劑；(ii)使其中Z1 = Z2 = Mig, cMBP包含C或N-cMBP肽末端的4個氨基酸殘基以內 的Asp殘基或Glu殘基，且cMBP肽的所有其他Asp/Glu殘基受到保護的式Z1- [cMBP] -Z2的 cMBP肽，與式Y2-(L)n-[IM]的化合物反應，得到其中[IM]在cMBP肽的所述Asp殘基或Glu 殘基綴合的式I成像劑；(iii)使其中Z1SMre, Z3為Z2基團或活化酯，且cMBP肽的所有其他Asp/Glu殘 基受到保護的式Z^cMBPFZ3的cMBP肽，與式Y2-(L)n-[IM]的化合物反應，得到其中[IM] 在Z2位置綴合的式I成像劑； (iv)使其中Z1 = Z2 = Mig,且cMBP包含C或Ν-cMBP肽末端的4個氨基酸殘基以內 的Lys殘基的式Z1-^MBP]-Z2的cMBP肽，與式ΥΜ ^ΙΜ]的化合物反應，得到其中[IM] 在cMBP肽的Lys殘基綴合的式I成像劑；其中Z1WMBPJ2JltM^n和IM如第一方面(上文)中所定義，和Z3為Z2基團或活化酯；Y1為羧酸基團、活化酯基團、異硫氰酸酯基團或硫氰酸酯基團；Y2為胺基團。術語“活化酯”或“活性酯”及其優選的實施方案如上所述。Y2優選為伯胺基團或 仲胺基團，最優選伯胺基團。化合物Z1-CcMBP]-Z2優選Z1和Z2都等于MIG。優選的cMBP肽和Z7Z2基團如第一 方面中所描述。具體的說，如對第一方面的優選cMBP肽所述，優選的是cMBP肽包含Asp、 Glu或Lys殘基以促進綴合。尤其優選的是cMBP肽包含Lys殘基，如在步驟(iv)中所描 述。Z^tcMBPj-Z2的制備在第一實施方案(上文)中作了描述。其中Z3為活性酯的 ZqcMBPFZ3肽可通過常規方法從其中Z2為OH或生物相容性陽離子(Be)的Ζ^^ΜΒΡ -Ζ2 制備。經官能化的適合與肽綴合的光學報道染料(IM)，可從GEHealthcare Limited、 Atto-Tec,Dyomics,Molecular Probes和其他廠商市售獲得。這種染料大多是作為NHS酯提供。Licha(Ii)以及 Flanagan 等人[Bioconj. Chem.，§，751-756 (1997) ] ；Lin 等人 [同上，1^，605-610 (2002)]和 Zaheer[Mol. Imaging, 1 (4), 354-364 (2002)]描述了將合適 的光學報道分子(IM)特別是染料與氨基酸和肽綴合的方法。將接頭基團(L)綴合到cMBP 肽的方法使用的是與單獨的染料(見上)相似的化學，且是本領域公知的。在第四方面，本發明提供用于制備第二方面的藥物組合物的藥盒，所述藥盒包含 無菌、固體形式的第一方面的成像劑，使得當用第二方面的生物相容性載體的無菌供應品 (sterile supply)進行復溶時，發生溶解而得到所需的藥物組合物。在該情況中，成像劑以及上文所述的其他任選賦形劑，可作為凍干粉在合適的瓶或容器中提供。于是成像劑被設計成可用所需的生物相容性載體復溶成無菌、無熱原形式 的藥物組合物，以備給予哺乳動物。成像劑的優選的無菌固體形式是凍干固體。如對藥物組合物所述(上文)，無菌固 體形式優選在藥物級容器中供應。若藥盒進行凍干，制劑可任選包含選自糖類(優選甘露 糖醇、麥芽糖)或三(羥甲基)甲基甘氨酸的冷凍保護劑。在第五方面，本發明提供對哺乳動物身體進行體內光學成像的方法，所述方法 包括使用第一方面的成像劑或第二方面的藥物組合物來獲得體內cMet過量表達或定位 (localisation)的部位的圖像。術語“光學成像”是指任何基于與紅色至近紅外區域中的光(波長600-1200nm)的相互作用，而形成供進行疾病的檢測、分期(staging)或診斷、進行疾病發展的跟蹤或者 進行疾病治療的跟蹤的圖像的方法。光學成像還包括所有不使用任何器械和涉及使用諸 如各種觀察儀器、導管和光學成像設備(例如斷層掃描顯示用的計算機輔助硬件)的器械 的直接顯現方法。模式和測量技術包括但不限于發光成像；內窺鏡檢查法；熒光內窺鏡 檢查法；光學相干斷層掃描；透射成像；時間分辨透射成像；共焦成像；非線性顯微鏡檢； 光聲成像；聲光學成像；光譜術；反射光譜術；干涉測量術；相干干涉測量術；擴散光學斷 層掃描和熒光介導擴散光學斷層掃描(連續波、時域和頻域系統)；以及光散射、吸收、偏 振、發光、熒光壽命、量子產額和猝滅的測量。這些技術的更多細節由以下文獻提供(Tuan Vo-Dinh (編輯)"‘Biomedical Photonics Handbook”(2003)，CRC Press LCC ;Mycek 和 Pogue (編輯)"Handbook of Biomedical Fluorescence，，(2003), MarcelDekker, Inc.； Splinter 禾口 Hopper :‘‘An Introduction to Biomedical Optics，，(2007), CRC Press LCC0綠色至近紅外區域中的光優選波長為600-1000nm。光學成像方法優選是熒光內窺 鏡檢查法。第五方面的哺乳動物身體優選是人身體。成像劑的優選實施方案如對第一方面 (上文)所述。具體的說，優選的是采用熒光染料。在第五方面的方法中，成像劑或藥物組合物優選地預先給予了所述哺乳動物身 體。所謂“預先給予”是指在成像前已經進行了涉及臨床醫生的步驟，其中成像劑被例如作 為靜脈注射劑給予患者。這個實施方案包括使用第一實施方案的成像劑來制造用于對涉及 cMet的哺乳動物身體疾病狀態進行體內診斷成像的診斷劑。第五方面的優選光學成像方法是熒光反射成像(FRI)。在FRI中，將本發明的成像 劑給予待診斷的受試對象，隨后用激發光——通常是連續波(CW)激發一對受試對象的組 織表面進行照射。光使報道分子(IM)激發。用熒光檢測器檢測來自成像劑的由激發光產 生的熒光。優選將返回的光過濾，以分離出熒光分量(fluorescence component)(單獨地 或部分地)。從熒光形成圖像。通常進行最小限度的處理(不用處理器來計算光學參數如 壽命、量子產額等)，圖像反映出熒光強度。成像劑被設計成在疾病區域聚集，從而產生更高 的熒光強度。因此，疾病區域在熒光強度圖像中產生正反差。圖像優選用C⑶相機或芯片 獲取，使得有可能進行實時成像。激發用的波長隨所用的染料類型而變。用于產生激發光的設備可以是常規的激發 光源如激光器(例如離子激光器、染料激光器或半導體激光器)；鹵素光源或氙光源。可 任選使用各種光學過濾器來獲得最佳激發波長。優選的FRI方法包括以下步驟
(i)用激發光照射哺乳動物身體中的目的組織表面；(ii)用熒光檢測器檢測通過成像部分(IM)的激發產生的、來自成像劑的熒光；(iii)任選將熒光檢測器檢測到的光進行過濾，以分離出熒光分量；(iv)從步驟(ii)或(iii)的熒光形成所述目的組織表面的圖像。
在步驟(i)中，激發光優選性質上為連續波(CW)。在步驟(iii)中，檢測到的光優 選進行過濾。尤其優選的FRI方法是熒光內窺鏡檢查法。第五方面的另選成像方法使用的是FDPM(頻域光子遷移)。這在重要的是IM在 組織當中的檢測深度更深的情況中，比連續波(CW)方法更具優勢[Sevick-Muraca等人， Curr. Opin. Chem. Biol. ,6,642-650 (2002)]。對于這種頻域/時域成像，如果IM具有能根 據要成像的損害處的組織深度和所采用的儀器的類型進行調整的熒光性質，則是有利的。FDPM方法如下(a)使所述哺乳動物身體的具有不均勻組成的光散射生物組織暴露于來自光源的 具有預定時間變動強度(time varying intensity)的光以激發成像劑，組織將激發光多次 散射；(b)檢測因響應所述暴露從組織發出的多次散射光發射；(c)通過用處理器建立多個數值，從所述發射定量所述組織各處的熒光特性，所述 數值各自對應于所述組織當中不同位置的熒光特性水平，而熒光特性水平隨組織的不均勻 組成而異；和(d)通過根據步驟(C)的數值將組織的不均勻組成進行作圖，產生出所述組織的 圖像。步驟(c)的熒光特性優選對應于成像劑的吸收，且優選還包括在給予成像劑前先 將多個對應于所述組織的吸附和散射系數的數量進行作圖。步驟(c)的熒光特性優選對應 于熒光壽命、熒光量子效率、熒光產額和成像劑吸收中的至少一個。熒光特性優選獨立于發 射強度和獨立于成像劑濃度。步驟(c)的定量優選包括(i)建立所述數值的估計量，(ii)確定計算發射量作為 估計量的函數，(iii)將計算發射量與所述檢測的發射量進行比較，以確定誤差，(iv)提供 熒光特性的修正估計量作為誤差的函數。定量優選包括從模擬組織的多次光散射行為的數 學關系來確定所述數值。第一選項的方法優選還包括通過檢測所述熒光特性的變化來監測 所述組織的體內代謝性質。第五方面的光學成像優選用來幫助促進結腸直腸癌(CRC)的管理。術語“CRC 的管理”是指在以下方面的用途疾病進展的檢測、分期、診斷、監測或者治療的監測。 Sevick-Muraca 等人[Curr. Opin. Chem. Biol. ,6,642-650(2002)]綜述了合適的光學成像 方法的更多細節。在第六方面，本發明提供對哺乳動物身體的結腸直腸癌(CRC)的疾病進展進行檢 測、分期、診斷、監測或者對疾病治療進行監測的方法，所述方法包括第五方面的體內光學 成像方法。下文詳述的非限制性實施例對本發明進行說明。實施例1提供本發明的cMBP肽 (化合物1)的合成。實施例2提供作為陰性對照的相關肽的合成，在所述相關肽中化合物 1的肽序列被攪亂(scrambled)。實施例3提供本發明的優選染料即花菁染料Cy5**的合成。實施例4提供Cy5**的活性酯的合成。實施例5提供本發明的花菁染料與肽(cMBP肽 和對照)的綴合。化合物3-7以這種方式進行比較。實施例6提供體外測定肽與cMet的 親和力的方法。結果顯示結合是選擇性的，即使當連接有光學報道分子成像部分(花菁染 料)時也是如此。實施例7提供化合物5和7在癌癥的動物模型中的體內試驗的數據。化 合物5可見較高的腫瘤背景比，而化合物7(陰性對照)不能區分腫瘤和背景。
縮寫 使用常規的單字母或三字母氨基酸縮寫。Acm:乙酰胺基甲基 ACN (或 MeCN)乙腈Boc:叔丁氧基羰基DCM: 二氯甲烷DMF: 二甲基甲酰胺DMSO 二甲亞砜Fmoc :9_芴基甲氧基羰基HBTU :0-苯并三唑-1-基-N，N，N' ,N'-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽HPLC 高效液相色譜法HSPyU :0_ (N-琥珀酰亞胺基)-N，N，N' ,N'-四亞甲基脲鐺六氟磷酸鹽NHS =N-羥基-琥珀酰亞胺NMM :N-甲基嗎啉NMP :1-甲基-2-吡咯烷酮Pbf =2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃_5_磺酰基PBS:磷酸緩沖鹽水tBu 叔丁基TFA:三氟乙酸TIS:三異丙基硅烷Trt:三苯甲基 表2 本發明的化合物的結構。實施例1 化合物1的合成步驟(a)警保護的前體線件肽的合成前體線性肽具有以下結構Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-CyS-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-LyS-NH2在Applied Biosystems 433A 肽合成儀上，采用 Fmoc 化學法從 0. Immol Rink Amide Novagel 樹脂出發，裝配肽基樹脂 H-Ala-Gly-Ser (tBu) -Cys (Trt) -Tyr (tBu) -Cys (A cm)-Ser (tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ty r (tBu) -Glu (OtBu) -Thr ( ￥Me'Mepro) -Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Gly-Gly-Gly-Lys (Boc)-聚 合物。在各偶聯步驟中應用過量的Immol預活化氨基酸(使用HBTU)。將Glu-Thr假脯 氨酸(Novabiochem 05_20_1122)摻入在序列中。將樹脂轉移到氮氣鼓泡設備，用乙酸酐 (Immol)和NMM(Immol)溶于DCM(5mL)的溶液處理60分鐘。過濾去除酸酐溶液，將樹脂用 DCM洗滌，在氮氣流下干燥。在含有2. 5% TIS,2. 5% 4_硫甲酚和2. 5%水的TFA(IOmL)中，同時進行側鏈保護 基的去除和肽從樹脂的切割達2小時30分鐘。過濾移取樹脂，真空去除TFA，向殘余物加入 二乙醚。所形成的沉淀物用二乙醚洗滌，風干，得到264mg的粗肽。用制備型HPLC 純化粗肽(梯度20-30% B，40min，其中 A = Η20/0· 1% TFA 和 B=ACN/O. TFA，流速10mL/min，柱子Phenomenex Luna 5μ C18(2)250x 21. 20mm，檢測UV 214nm，產物保留時間30min)，得到IOOmg的純化合物1線性前體。用分析型HPLC 分析該純產物(梯度10-40% B，lOmin，其中 A = H20/0. 1 % TFA, B = ACN/O. 1 % TFA,流 速0. 3mL/min，柱子PhenomenexLuna 3μ C18(2)50x 2mm，檢測UV 214nm，產物保留時 間6. 54min)。用電噴霧質譜進行進一步的產物表征(MH22+計算值1464. 6，MH22+實測值 1465. 1)。步驟(b)單環Cys4-16 二硫鍵的形成Cys4-16 ；Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-CyS-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-LyS-NH2 ο將得自步驟(a)的線性前體(IOOmg)溶于5 % DMSO/水(200mL)中，用氨將溶液調 至PH 6。將反應混合物攪拌5天。然后用TFA將溶液調至pH 2，真空蒸發除去大部分的溶 齊IJ。將殘余物(40mL)分批注射到制備型HPLC柱上，進行產物純化。用制備型HPLC純化殘余物(梯度0 % B，IOmin,然后0_40 % B,40min,其 中 A = Η20/0· 1 % TFA, B = ACN/O. 1 % TFA,流速10mL/min，柱子Phenomenex Luna 5 μ C18 (2) 250χ 21. 20讓，檢測=UV 214nm，產物保留時間:44min)，得到72mg的純化合物1 單環前體。用分析型HPLC分析該純產物(作為異構體Pl至P3的混合物)(梯度10_40% B, lOmin，其中 A = Η20/0· 1% TFA, B = ACN/O. 1% TFA，流速0· 3mL/min，柱子Phenomenex Luna 3μ C18(2)50x 2mm，檢測UV 214nm，產物保留時間5. 37min (Pl) ；5. 61min(P2)； 6. 05min(P3))o用電噴霧質譜進行進一步的產物表征(MH22+計算值1463. 6，MH22+實測值 1464. I(Pl) ； 1464. 4 (P2) ； 1464. 3 (P3))。步驟(c)第二 Cys6-14 二硫鍵的形成(化合物1)將得自步驟(b)的單環前體(72mg)在氮氣保護下溶于75% AcOH/水(72mL)。依 次加入IM HCl (7. 2mL)和0. 05M I2的AcOH(4. 8mL)溶液，將混合物攪拌45分鐘。加入IM 抗壞血酸(ImL)，產生無色混合物。真空蒸發掉大部分的溶劑，用水/0. 1% TFA(4mL)稀釋 殘余物(18mL)，用制備型HPLC純化產物。用制備型HPLC純化殘余物(梯度0 % B，IOmin,然后20-30 % B, 40min,其 中 A = Η20/0· 1 % TFA, B = ACN/O. 1 % TFA,流速10mL/min，柱子Phenomenex Luna 5 μ C18 (2) 250χ 21. 20mm,檢測=UV 214nm,產物保留時間:43_53min)，得到 52mg 的純化合 物1。用分析型HPLC分析該純產物(梯度10-40% B，lOmin，其中A = H20/0. 1 % TFA, B = ACN/O. 1 % TFA,流速0· 3mL/min,柱子Phenomenex Luna 3 μ C18 (2) 50x 2mm,檢測 UV 214nm，產物保留時間6.54min)。用電噴霧質譜進行進一步的產物表征(MH22+計算值 1391. 5，MH22+ 實測值1392. 5)。實施例2 化合物2的合成Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-CyS-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-LyS-NH2化合物2是陰性對照，其中化合物1的肽序列已被攪亂。步驟(a)警保護的前體線件肽的合成
在Applied Biosystems 433A 肽合成儀上，采用 Fmoc 化學法從 0. Immol Rink Amide Novagel 樹脂出發，裝配肽基樹脂 H-Thr (tBu) -Gly-Glu (OtBu) -Cys (Trt) -Thr (tBu) -Cys(Acm)-Pro-Tyr(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Acm)-Glu(OtBu) -Cys (Trt) -Gly-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Ser (￥Me'Mepro) -Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys (Boc)-聚 合物。在各偶聯步驟中應用過量的Immol預活化氨基酸(使用HBTU)。將Tyr-Ser假脯 氨酸(Novabiochem 05_20_1014)摻入在序列中。將樹脂轉移到氮氣鼓泡設備，用乙酸酐 (Immol)和NMM(Immol)溶于DCM(5mL)的溶液處理60分鐘。過濾去除酸酐溶液，將樹脂用 DCM洗滌，在氮氣流下干燥。在含有2. 5% TIS,2. 5% 4_硫甲酚和2. 5%水的TFA(IOmL)中，同時進行側鏈保護基的去除和肽從樹脂的切割達2小時10分鐘。過濾移取樹脂，真空去除TFA，向殘余物加入 二乙醚。所形成的沉淀物用二乙醚洗滌，風干，得到216mg的粗肽。用制備型HPLC 純化粗肽(梯度20-30% B，40min，其中 A = Η20/0· 1 % TFA, B = ACN/0. 1 % TFA,流速50mL/min，柱子Phenomenex Luna 5 μ C18 (2) 250x 50mm,檢測UV 214nm，產物保留時間34. lmin)，得到純的DX-1662陰性對照線性前體，溶于200mL的ACN/ 水中。用分析型HPLC分析該純產物(梯度10-40% B，5min，其中A = H20/0. TFA， B = ACN/0. 1 % TFA,流速0· 6mL/min,柱子Phenomenex Luna 3 μ C18 (2) 20x 2mm,檢測 UV 214nm，產物保留時間3.52min)。用電噴霧質譜進行進一步的產物表征(MH22+計算值 1464. 6，MH22+ 實測值=1464. 9)。步驟(b)單環Cys4-16 二硫鍵的形成Cys4-16 ；Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-CyS-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-LyS-NH2將DMSO(IOmL)加到得自步驟(a)的陰性對照線性前體溶液(200mL，參見4. 3. 1)， 用氨將溶液調至PH7。將反應混合物在40°C下加熱18小時，然后在60°C下加熱60分鐘。 然后用TFA將溶液調至pH 2，真空蒸發除去ACN。將殘余物進行制備型HPLC純化。用制備型HPLC純化殘余物(梯度0 % B，5min,然后20-30 % B, 60min,其 中 A = Η20/0· 1 % TFA 和 B = ACN/0. 1 % TFA,流速50mL/min，柱子Phenomenex Luna 5yC18(2)250x 50mm，檢測=UV 214nm，產物保留時間29. 6min)，得到純的陰性對照單元 前體在IOOmL的ACN/水中的溶液。用分析型HPLC分析該純產物(梯度10-40% B, 5min, 其中 A = Η20/0· 1 % TFA, B = ACN/0. 1 % TFA,流速0· 6mL/min,柱子Phenomenex Luna 3yC18(2)20x 2mm，檢測UV 214nm，產物保留時間3. 46min)。用電噴霧質譜進行進一步 的產物表征(MH22+計算值=1463. 6，MH22+實測值=1463. 7)。步驟(c)第二 Cys6-14 二硫鍵的形成(化合物2)Cys4-16,6-14 ；Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys-Glu-Cys-Gl y-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。用AcOH(IOOmL)稀釋得自步驟(b)的陰性對照單環前體溶液(IOOmL)。在氬氣保 護下依次加入IM HCl (5mL)和0. 05M I2的AcOH溶液(7mL)，將混合物攪拌20分鐘。加入 IM抗壞血酸(ImL)，產生無色混合物。真空蒸發掉大部分的溶劑，用水/0. 1% TFA(IOOmL)稀釋殘余物(30mL)，用制備型HPLC純化產物。用制備型HPLC純化殘余物(梯度0 % B，IOmin,然后20-30 % B, 60min,其 中 A = Η20/0· 1 % TFA 和 B = ACN/0. 1 % TFA,流速50mL/min，柱子Phenomenex Luna 5μ C18(2)250x 50mm,檢測=UV 214nm,產物保留時間:32· 8min)，得到30mg的純化合物 2。用分析型HPLC分析該純產物(梯度10-40% B，10min，其中A = H20/0. 1 % TFA, B =ACN/0. 1 % TFA,流速0· 3mL/min,柱子Phenomenex Luna 3 μ C18 (2) 50x 2mm,檢測 UV 214nm，產物保留時間6.54min)。用電噴霧質譜進行進一步的產物表征(MH22+計算值 1391. 5，MH22+ 實測值1392. 5)。實施例3 花菩染料2-丨「IE, 3E, 5E)-5-「1-(5-羧基戊基)-3, 3- 二甲基磺 基-1,3-二氫-2H-吲哚-2-亞基1戊-1,3-二烯基丨-3-甲基-1,3-雙(4-磺基丁 某)-3H-吲哚鑰-5-磺酸鹽(05**)的合成 Cy5**(3a) 5-甲基氧代庚烷磺酸 在冰浴冷卻下，將2-甲基乙酰乙酸乙酯(50g)于DMF(25ml)的溶液在1小時內滴 加到氫化鈉(12. Og的60% NaH于礦物油中)于DMF (IOOml)的懸浮液，(內部溫度0_4°C )。 將此混合物攪拌45分鐘讓其升溫到環境溫度，然后再次冷卻。然后在15分鐘內滴加1， 4-丁烷磺內酯(45g)于DMF(25ml)的溶液。將最終混合物在60°C下加熱18小時。旋轉蒸 發除去溶劑，殘余物在水和二乙醚之間分配。收集含水層，用新鮮的二乙醚洗滌，旋轉蒸發 得到粘稠泡沫。將此中間體溶于水(IOOml)中，攪拌下15分鐘內加入氫氧化鈉(17. Sg)。 將混合物在90°C下加熱18小時。加入濃鹽酸( 40ml)將冷卻的反應混合物調至 pH2。 將溶液在真空下旋轉蒸發和干燥。用含有2%鹽酸的乙醇(3x150ml)洗滌黃色固體。將乙 醇溶液過濾，在真空下旋轉蒸發和干燥，得到黃色固體。收率70g。(3b) 2, 3- 二甲基-3- (4~磺基丁基)_3Η_ Π引晚~5~磺酸，二鉀鹽 將4-胼基苯磺酸(40g)、5_甲基_6_氧代庚烷磺酸(得自3a ;60g)和乙 酸(500ml)混合并回流加熱6小時。將溶劑過濾，在真空下旋轉蒸發和干燥。固體溶于 甲醇(IL)中。向其中加入2M氫氧化鉀的甲醇溶液(300ml)。將所得混合物攪拌3小 時，然后用旋轉蒸發將溶劑體積減少50%。將所得的沉淀物過濾，用甲醇洗滌，真空干 燥。收率 60g。MS (LCMS) :MH+362。實測準確質量362· 0729。MH+= C14H2tlNO6S2 要求 m/z 362. 0732 (-0. 8ppm)。(3c) 2, 3- 二甲基-1, 3-雙(4_磺基丁基)_3Η_吲哚鑰_5_磺酸鹽，二鉀鹽 將2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)_3!1-吲哚-5-磺酸(得自313;6(^)與1，4 丁烷 磺內酯(180g)和四亞甲基砜(146ml) —起在140°C下加熱16小時。將所得的紅色固體用 二乙醚洗滌，研磨成粉末，真空干燥。收率60g。(3d)Cy5#,作為 TFA 鹽將1_(5'-羧基戊基)-2，3，3_三甲基-吲哚鐺溴(indolenium bromide)_5_磺酸 K+鹽(2. 7g)、丙二醛雙苯亞胺單鹽酸鹽(960mg)、乙酸酐(36ml)和乙酸(18ml)在120°C下 加熱1小時，產生深棕紅色溶液。將此反應混合物冷卻至環境溫度。向混合物加入2，3_ 二 甲基-1，3-雙(4-磺基丁基)-3H-吲哚鐺-5-磺酸鹽(得自3c;8.1g)和乙酸鉀(4. 5g)， 在環境溫度下攪拌18小時。所得的藍色溶液用乙酸乙酯沉淀，真空干燥。粗染料用液相 色譜純化(RPC18.水+0. 1 % TFA/MeCN+0. 1 % TFA梯度)。收集含有主要染料峰的流份，合 并在一起，真空干燥，得到標題染料 2g。UV/Vis (水+0. TFA) :650nm。MS (MALDI-TOF) MH+887. 1。MH+ = C38H50N2O14S4 要求 m/z 887. 1。實施例4 :2-「(比，3￡,5￡)-5-(1-{6-「(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基 1_6_ 氧 代己基丨_3, 3- 二甲基-5-磺基-1, 3- 二氫-2H- Π引卩朵~2~亞基)戊-1, 3- 二烯基1 -3-甲 某-1,3-雙(4-磺某丁某)-3Η-吲哚鑰-5-磺酸鹽，二異丙某乙胺鹽(05 **的NHS酯) 的合成 將Cy5# (實施例3 ； IOmg)溶于無水DMSO (3ml)中，向其中加入HSPyU (20mg)和N， N' - 二異丙基乙胺(80 μ 1)。將所得的溶液混合3小時，此時TLC(RPC18.水/MeCN)揭示 反應完成。所得染料在乙酸乙酯/ 二乙醚中進行沉淀分離，過濾，用乙酸乙酯洗滌，真空干 燥。UV/Vis (水)650nm。MS(MALDI_T0F)MH+983· 5。MH+= C42H53N3O16S4 要求 m/z 984.16。實施例5 染料的綴合,化合物3-7的合成Cys4-16,6-14 ；Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Ty r-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys (Cy5) -NH2 (化合物 3)。將化合物1 (IOmg)、ΝΜΜ(4 μ L)和 Cy5NHS 酯(5. 7mg ；GEHealthcare PA15104)溶于 NMP(ImL)中，攪拌此反應混合物7小時。然后用5% ACN/水(SmL)稀釋反應混合物，用制 備型HPLC純化產物。用制備型HPLC 純化粗肽(梯度5-50% B，40min，其中 A = H20/0. 1 % HC00H, B =ACN/0. 1 % HC00H,流速10mL/min，柱子Phenomenex Luna 5μ C18(2)250x 21. 20mm, 檢測:UV 214nm,產物保留時間35. 5min)，得到8. Img的純化合物3。用分析型HPLC分 析該純產物(梯度5-50% B, lOmin，其中 A = H20/0. 1 % HCOOH 和 B = ACN/0. 1 % HC00H, 流速0. 3mL/min，柱子Phenomenex Luna3 μ C18 (2) 50x 2mm，檢測UV 214nm，產物保留時 間8. 15min)。用電噴霧質譜進行進一步的產物表征(MH22+計算值1710. 6，MH22+實測值 1711. 0)。化合物4按相似方式制備——電噴霧質譜(MH22+計算值1710. 6，MH22+實測值 1710.9)。其他的染料-肽綴合物(化合物5-7)通過類似的方法制備。Alexa647購自 Molecular Probes(A20106)化合物5 (MH22+ 計算值1825. 7，MH22+ 實測值1825. 9)，化合物6 (MH22+ 計算值1811. 7，MH22+ 實測值=1812. 0)，化合物7 (MH22+ 計算值1825. 7，MH22+ 實測值1826. 2)。實施例6 體外熒光偏振測定熒光偏振方法的原理可簡單描述如下單色光通過水平偏振濾光器，激發樣品中的熒光分子。只有那些正確取向在垂直 偏振平面的分子會吸收光而受到激發，并隨后發射光線。發射光在水平平面和垂直平面上 都進行測量。各向異性值(A)是根據以下方程所得的光強度之間的比例。
水平偏光器的強度垂直偏光器的強度
熒光各向異性測量是在384孔微量滴定板中，在結合緩沖液(PBS，0.01 % Tween-20, pH 7. 5)中，以10 μ L的體積，用Tecan Safire熒光偏振讀板器(Tecan，美國) 在激發646nm/發射678nm下進行。染料標記的肽的濃度保持恒定(20nM)，人或小鼠c-Met/ Fc嵌合體(R&D Systems)或腦信號蛋白6A(R&D Systems)的濃度在0_150nM的范圍變化。 將結合混合物在微量培養板中30°C下平衡10分鐘。將所觀察到的各向異性的變化擬合于 以下方程 其中robs為所觀察到的各向異性，rfree為游離肽的各向異性，rbound為結合的 肽的各向異性，Kd為解離常數，cMet為總c-Met濃度，P為總染料標記肽濃度。該方程假定 合成的肽和受體以1 1化學計量在溶液中形成可逆復合物。數據擬合用GraphPad Prism 軟件通過非線性回歸進行，以獲得Kd值(一位點結合)。測試化合物3和4結合人和小鼠c-Met (Fe嵌合體)的情況。結果顯示化合物3與 人c-Met結合的Kd為3+/-lnM。化合物4與人c-Met無結合。此外，化合物3和4顯示在 試驗范圍內沒有結合小鼠c-Met。使用相同的方法，發現化合物5對人cMet的Kd為1. InM。實施例7 化合物5和7的體內試騎(a)動物樽型本研究中用到54只雌性BALB c/A裸(Bom)小鼠。動物的使用得到地方倫理委員 會的批準。BALB c/A裸鼠為近交無免疫應答的小鼠品系，與其他裸鼠品系相比對人腫瘤有 高接受率。小鼠到來時為4周齡，在研究開始時體重大約20克。將動物關在用HEPA過濾空 氣單獨通風的籠子(IVC，Scanbur BK)中。動物能隨意獲取“Rat and Mousenr. 3Breeding” 食物(Scanbur BK)和自來水，自來水通過加HCL至ImM的摩爾濃度酸化(pH 3. 0)。結腸癌 細胞 HCT-15 衍自人結腸癌，根據 Zeng 等人[Clin. Exp. Metastasis, 21,409-417. (2004)] 的報道能表達c-Met。該細胞系當皮下接種到裸鼠中時證明具有致瘤性[Flatmark等人， Eur. J. Cancer 40,1593-1598(2004)]。生長和制備HCT-15細胞，以供在含有10%血清和青霉素/鏈霉素的RPMI (Sigma 目錄號R0883)中進行皮下接種。在傳代數為四時(P4)制備原種(stock)，在含有5% DMSO 的培養基中以3xl07個細胞/小瓶的密度在液氮中冷凍保存。在移植的當天，將細胞在37°C 水浴中快速解凍(大約2分鐘)，洗滌并重懸于PBS/2%血清中(在1200rpm下離心10分 鐘)。每次細胞被吸入到給藥注射器中時，就確保了小瓶中的細胞的徹底混合。在動物處于 輕度氣體麻醉下，用細孔針(25G)將0.1ml體積的細胞懸浮液皮下注射在肩部和背部。然 后將動物送回籠子中，讓腫瘤生長13-17天。在進行接種程序前，讓動物有至少5天的適應 期。(b)程序所有試驗物質都用PBS從冷凍干燥粉末復溶。對一小疊白色打印紙進行成像以獲 得平場圖像(flat field image)，其用來校正照射不均勻性。在物理固定過程中將試驗物質靜脈內注射在側尾靜脈中。注射體積為0. 1ml，對應于每只動物Inmol試驗物質的劑量。 注射后將動物送回籠子。在臨成像前通過頸椎脫位將動物處死。每種試驗物質的最佳成像 時間點，根據在有限數目的動物(η = 1-6)中在皮膚和肌肉組織中的洗出速率的比較進行 估計。化合物3和4的成像時間點為注射后120分鐘。對于每只動物，在死后切取皮下生 長的腫瘤。從其中一個腫瘤的邊緣切下大約1.6mm厚和3-4mm直徑的切片。然后對比來自 同一動物的正常結腸區域對腫瘤切片進行成像。(C)成像
通過臨床腹腔鏡進行成像，該腹腔鏡經改裝能使用光源來激發報道分子和使用濾 光系統來提取熒光分量。用635nm激光器激發報道分子。用Hamamatsu ORCA ERG C⑶相機 作為檢測器。該相機以O增益的2x2裝倉模式(2x2binning mode with Ogain)操作。結 腸成像的標準暴露時間為10秒。系統校準測量表明，動物成像系統的10秒暴露時間對應 于臨床上相關的光源、視野和距組織表面距離的40微秒暴露。通過系統校準數據對圖像中 的強度分布進行照射不均勻性的校正。從置于腫瘤和正常結腸背景上的目的區域，計算靶 標與背景比。用應用于接收器運行特性分析的標準評分系統，對圖像進行目測評分。(d)結果化合物5的腫瘤-正常結腸比為1. 46 1，而相應的具有相同染料的經攪亂對照 肽(化合物7)該比為1.04 1。化合物5具有容易鑒別的腫瘤，而用化合物7不能與背景 進行區別。
權利要求
包含式I的綴合物的成像劑(I)其中Z1連接到cMBP的N末端，且為H或MIG；Z2連接到cMBP的C末端，且為OH、OBc或MIG，其中Bc為生物相容性陽離子；cMBP為包含以下氨基酸序列(SEQ-1)的17-30個氨基酸的cMet結合環肽Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6；其中X1為Asn、His或Tyr；X2為Gly、Ser、Thr或Asn；X3為Thr或Arg；X4為Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；X5為Ser或Thr；X6為Asp或Glu；而Cysa-d各自為半胱氨酸殘基，使得殘基a與b和c與d環化形成兩個獨立的二硫鍵；MIG為代謝抑制基團，其為能抑制或阻礙cMet肽的體內代謝的生物相容性基團；L為式-(A)m-的合成接頭基團，其中每個A獨立為-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-、-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8環雜亞烷基基團、C4-8環亞烷基基團、C5-12亞芳基基團或C3-12雜亞芳基基團、氨基酸、糖或單分散性聚乙二醇(PEG)結構單元；每個R獨立選自H、C14烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羥基烷基；m為1-20的整數；n為0或1的整數；IM為適合于用綠色至近紅外波長600-1200nm的光對哺乳動物身體進行體內成像的光學報道成像部分。F2008800242291C00011.tif
2.權利要求1的成像劑，其中cMBP除了包含SEQ-I外，還包含C或N_cMBP肽末端的4 個氨基酸殘基以內的Asp殘基或Glu殘基，且-(L)nIM用胺基團官能化，該胺基團綴合到所 述Asp殘基或Glu殘基的羧基側鏈而產生酰胺鍵。
3.權利要求1或權利要求2的成像劑，其中cMBP除了包含SEQ-I外，還包含C或N_cMBP 肽末端的4個氨基酸殘基以內的Lys殘基，且-(L)nIM用羧基基團官能化，該羧基基團綴合 到所述Lys殘基的ε胺側鏈而產生酰胺鍵。
4.權利要求1-3中任一項的成像劑，其中cMBP包含SEQ-2或SEQ-3的氨基酸序列 Ser-Cysa-Xl-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6 (SEQ-2)；Ala-Gly-Ser-Cysa-Xl-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6 -Gly-Thr(SEQ-3)。
5.權利要求1-4中任一項的成像劑，其中X3為Arg。
6.權利要求1-5中任一項的成像劑，其中cMBP除了包含SEQ-l、SEQ-2或SEQ-3外，還 在N末端或C末端包含選自以下的接頭肽-Gly-Gly-Gly-Lys-(SEQ-4)、-Gly-Ser-Gly-Lys -(SEQ-5)或-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys-(SEQ-6)。
7.權利要求6的成像劑，其中cMBP具有以下氨基酸序列(SEQ-7) Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys ο
8.權利要求1-7中任一項的成像劑，其中Z1和Z2均獨立為Μκ。
9.權利要求8的成像劑，其中Z1為乙酰基，Z2為伯酰胺。
10.權利要求1-9中任一項的成像劑，其中η為O。
11.權利要求1-10中任一項的成像劑，其中IM為在600-1000nm范圍內具有最大吸光 度的染料。
12.權利要求11的成像劑，其中IM為花菁染料。
13.權利要求12的成像劑，其中花菁染料具式III R3 R4 R5 R6 (III) 其中R1和R2獨立為H或SO3M1,且R1和R2中至少一個為SO3M1,其中M1為H或B。； R3和R4獨立為Cy烷基或Cp6羧基烷基； R5、R6、R7和R8獨立為Ra基團；其中Ra為Cy烷基、CV6羧基烷基或-(CH2)kSO3M1,其中k為數值為3或4的整數。 條件是該花菁染料在R1基團、R2基團和Ra基團中具有總共1-4個SO3M1取代基。
14.權利要求1-13中任一項的成像劑，其中cMBP如權利要求7中所定義，Z1和Z2如權 利要求9中所定義，IM如權利要求3和13中所定義。
15.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1-14中任一項的成像劑以及生物 相容性載體，為適合于哺乳動物給藥的形式。
16.權利要求15的藥物組合物，所述藥物組合物具有適合于單個患者的劑量，在合適 的注射器或容器中提供。
17.一種制備權利要求1-14中任一項的成像劑的方法，所述方法包括步驟(i)-(iv)之⑴使其中Z1為H和Z2為Mig的式ZLtcMBPFZ2的cMBP肽，與式YMDHIM]的化合 物反應，得到其中[IM]在Z1位置綴合的式I成像劑；(ii)使其中Z1 = Z2 = Mig,且cMBP包含C或N_cMBP肽末端的4個氨基酸殘基以內的Asp殘基或Glu殘基，且cMBP肽的所有其他Asp/Glu殘基受到保護的式ZLkMBPFZ2的 cMBP肽，與式Y2-(L)n-[IM]的化合物反應，得到其中[IM]在cMBP肽的所述Asp殘基或Glu 殘基綴合的式I成像劑；(iii)使其中Z1為Mre，Z3為Z2基團或活化酯，且cMBP肽的所有其他Asp/Glu殘基受 到保護的式ZqcMBPFZ3的cMBP肽，與式y2(L)n-[IM]的化合物反應，得到其中[IM]在Z2 位置綴合的式I成像劑；(iv)使其中Z1= Z2 = Mig,且cMBP包含C或N_cMBP肽末端的4個氨基酸殘基以內的 Lys殘基的式Z1-[cMBP]-Z2的cMBP肽，與式Y1-(L)n-[IM]的化合物反應，得到其中[IM]在 cMBP肽的Lys殘基綴合的式I成像劑；其中Z^cMBPJ^M^L、!!禾口 IM如權利要求1中所定義，和 Z3為Z2基團或活化酯；Y1為羧酸基團、活化酯基團、異硫氰酸酯基團或硫氰酸酯基團；Y2為胺基團。
18.權利要求17的方法，其中使用步驟(iv)的反應。
19.一種用于制備權利要求15或16的藥物組合物的藥盒，所述藥盒包含無菌、固體形 式的權利要求1-14的成像劑，使得當用權利要求15或16的生物相容性載體的無菌供應品 進行復溶時，發生溶解而得到所需的藥物組合物。
20.權利要求19的藥盒，其中所述無菌固體形式為凍干固體。
21.一種對哺乳動物身體進行體內光學成像的方法，所述方法包括使用權利要求1-14 的成像劑或權利要求15或16的藥物組合物來獲得體內cMet過量表達或定位的部位的圖 像。
22.權利要求21的方法，其中權利要求1-14的成像劑或權利要求15或16的藥物組合 物預先給予了所述哺乳動物身體。
23.權利要求22的方法，所述方法包括以下步驟(i)用激發光照射哺乳動物身體中的目的組織表面；( )用熒光檢測器檢測通過成像部分(IM)的激發產生的、來自成像劑的熒光；(iii)任選將熒光檢測器檢測到的光進行過濾，以分離出熒光分量；(iv)從步驟(ii)或(iii)的熒光形成所述目的組織表面的圖像。
24.權利要求23的方法，其中步驟(i)的激發光性質上是連續波(CW)。
25.權利要求22的方法，所述方法包括(a)使所述哺乳動物身體的具有不均勻組成的光散射生物組織暴露于來自光源的具有 預定時間變動強度的光以激發成像劑，組織將激發光多次散射；(b)檢測因響應所述暴露從組織發出的多次散射光發射；(c)通過用處理器建立多個數值，從所述發射定量所述組織各處的熒光特性，所述數值 各自對應于所述組織當中不同位置的熒光特性水平，而熒光特性水平隨組織的不均勻組成 而異；和(d)根據步驟(c)的數值將組織的不均勻組成進行作圖，據此產生出所述組織的圖像。
26.權利要求21-25中任一項的方法，其中所述光學成像方法包括熒光內窺鏡檢查法。
27.權利要求21-26中任一項的方法，其中所述體內光學成像用來幫助對結腸直腸癌(CRC)的疾病進展進行檢測、分期、診斷、監測或者對該疾病的治療進行監測。
28. 一種對哺乳動物身體的結腸直腸癌(CRC)的疾病進展進行檢測、分期、診斷、監測 或者對疾病的治療進行監測的方法，所述方法包括權利要求21-26中任一項的體內光學成像方法。
全文摘要
本發明涉及適合于體內光學成像的經標記的cMet結合肽。所述肽用適合于在紅色至近紅外區域進行成像的光學報道基團進行標記。還公開了藥物組合物和藥盒以及體內成像方法，它們尤其可用于對結腸直腸癌(CRC)的疾病進展進行檢測、分期、診斷和監測，或者對該疾病的治療進行監測。
文檔編號A61K47/48GK101848734SQ200880024229
公開日2010年9月29日 申請日期2008年5月16日 優先權日2007年5月16日
發明者A·卡思伯特森, E·W·約翰內森 申請人:通用電氣醫療集團股份有限公司