專利名稱：：用于靶向病毒感染的dsRNA的制作方法
技術領域：
：本發明涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶的雙鏈核糖核酸UsRNA),尤其涉及乾向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB;NM—002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶a多肽(PIK4CA;NM_002650)的雙鏈核糖核酸，并涉及其在治療由正鏈RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)感染介導的病理過程中的用途。
背景技術：
：RNA依賴的RNA聚合酶正鏈RNA病毒形成了由許多不同亞家族組成的大的病毒超家族。這些病毒涵蓋植物界和動物界兩界，引起的病理學范圍從輕微的表型到嚴重的衰弱疾病。正鏈RNA病毒聚合酶超群的構成如下。I.小RNA病毒組(HAV、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒)、諾達病毒(nodaviruses)、虹豆花葉病毒屬(comoviruses)、線蟲傳多面體病毒組(nepoviruses)、馬鈴薯Y病毒組(potyviruses)、大麥花葉病毒組(bymoviruses)、南方菜豆花葉病毒組(sobemoviruses)和黃癥病毒組(Luteovimses)(黃化病毒、黃矮病毒和巻葉病毒)。II.香石竹斑駁病毒組(Carmoviruses)、番癡叢矮病毒纟且(tombusviruses)、香石々個環斑病毒纟且(dianthoviruses)、痘病毒屬(pestiviruses)、披膜病毒(togaviruses)、伊科病毒(echoviruses)、登革病毒、丙型肝炎病毒、黃病毒屬(flavivimses)。III.煙草花葉病毒組(Tobamoviruses)、煙草脆裂病毒組(tobraviruses)、大麥病毒組(hordeiviruses)、tricornaviruses、甲病毒、風滲病毒屬(rubiviruses)、真菌傳桿狀病毒組(furoviruses)、戊型肝炎病毒、馬鈴薯X病毒組(potexviruses)、香石竹潛病毒組(carlaviruses)、蕪青黃花葉病毒組(tymoviruses)和蘋果褪綠葉斑病毒。正鏈RNA病毒的基因組編碼RNA依賴的RNA聚合酶，所述RNA聚合酶是唯一含有這類病毒中保守基序的病毒蛋白。由于這類病毒含有顯著的系統發育變異性，所以該保守性是意義重大的，人們預計存在病毒感染細胞和維持穩定復制的多種方式。除許多不同之外，該類中的所有病毒都依賴RNA依賴的正鏈RNA轉錄這一單個基本步驟。由于該步驟對病毒生活周期是必需的，所以病毒使用許多宿主蛋白質來啟動和維持RNA依賴的RNA聚合酶活性。不與宿主因子相互作用，則病毒不能存活。因此，可用于抑制病毒感染的治療介入將是阻斷病毒宿主的相互作用。如果宿主因子對病毒是必需的，但對宿主不是必需的，那么可操縱這些宿主因子，便可實現阻斷病毒感染的能力。已經證實，靶向宿主蛋白質是干擾HIV、HCV、天花病毒等病毒感染和復制的有效方法。正鏈RNA病毒的重要性是對人類健康和生存力的影響。幾種正鏈RNA病毒感染人類，并在許多情況下導致使人虛弱的疾病和/或病態。幾種對人類健康造成特別的負擔的病毒是登革病毒(出血熱)、HCV(慢性肝病、肝功能衰竭、纖維樣變性和癌)和HEV(暴發性肝功能衰竭)。由這些病毒引起的肝臟和血液疾病導致全世界數以百萬的死亡，并且花費醫療工業數十億美元用于肝臟相關的疾病。找到控制病毒感染的治療方法的意義重大，并且可改善全世界人類健康。因此，存在有效治療由HCV和其它正鏈RNA病毒(以上所列)引起的感染這一未滿足的需求。該說明書也涉及雙鏈RNA分子(dsRNA)。已經表明，dsRNA以已知為RNA干擾(RNAi)的高度保守性調節機制來阻斷基因的表達。WO99/32619(Fire等人)公開了至少長25個核苷酸的dsRNA在秀麗線蟲(C.elegans)中抑制基因表達的用途。也已經表明，dsRNA在其它生物體包括植物(參見例如WO99/53050，Waterhouse等人；和WO99/61631，Heifetz等人)、果蠅(參見例如Yang，D等人，Curr.Biol,(2000)10:1191-1200)和哺乳動物(參見WO00/44895,Limmer;和DE10100586.5，Kreutzer等人)中降解草巴RNA。現在，這種天然機制已經成為研發治療由于基因異常或不想要的調節引起的病癥的新型藥劑的焦點。PCT公開號WO2003016572、WO2003070750和WO2005028650中公開了先前研發治療由HCV感染引發的疾病的、基于核酸的RNAi藥物的努力。PCT公開號WO2006074346中公開了使用RNAi藥物治療RSV感染的先前的努力。盡管在RNAi領域有顯著進步，并且在治療由病毒感染介導的病理過程中有進展，但仍然需要能夠抑制病毒感染進程、并且能夠治療與病毒感染相關的疾病的藥劑。本發明公開了滿足這種需要的化合物、組合物和方法，并提供了其它益處。發明概述本發明提供了用于治療正鏈RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰質炎病毒)感染的組合物和方法，所述組合物和方法通過降低細胞中(其中這類病毒可復制，如肝臟)人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性(5多肽(P1K4CB;NM—002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA;NM—002650)的活性的水平。本文么、開了正鏈RNA病毒的增殖可通過4吏用雙鏈核凈唐核酸(dsRNA)來抑制，從而沉默對病毒增殖必需的人宿主細胞基因PIK4CB和/或P1K4CA的表達。本發明提供了多種實施方案，尤其包括用于抑制細胞中磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)水平表達或活性的雙鏈核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，且其中有義鏈包含第一序列和反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PI4K的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述互補區域長度低于30個核苷酸和其中所述dsRNA與表達所述PI4K基因的細胞接觸后，抑制所述PIK4基因表達。這些dsRNA可具有化學修飾，且可與其它部分綴合。此外，這些dsRNA可提供于藥物組合物中。一個實施方案方法是用于抑制細胞中磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)基因或磷脂酰肌醇4-激酶催化性P多肽(PIK4CA)基因的方法，所述方法包括下列步驟(a)向細胞中引入雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，且其中有義鏈包含第一序列和反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PIK4CB或PIK4CA的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述互補區域長度低于30個核苷酸；和(b)將步驟(a)中產生的細胞維持足夠時間以獲得PIK4CB基因(或PIK4CA，根據選擇)的mRNA轉錄物的降解，從而抑制PIK4CB基因(或PIK4CA,根據選擇)在細胞中的表達或活性。備選地，本發明涉及治療由正鏈RNA病毒感染介導的病理學過程的方法，所述方法包括向需要此種治療的患者施用本發明的dsRNA。正鏈RNA病毒可選自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)和登革病毒。備選的實施方案包括用于抑制PIK4CB或PIK4CA在細胞中表達的載體；和包含這類載體的細胞。一個備選的實施方案包括治療HCV感染的方法，所述方法包括向需要此種治療的患者施用治療有效量的包含本發明dsRNA的藥物組合物。附圖簡述圖l.HCV構建體的結構。A.完整的HCV基因組。B.亞基因組HCV復制子，用于克隆A(亞基因組復制子)細胞。將結構蛋白用5，UTR下游的新霉素抗性基因和荄火蟲螢光素酶報告基因替代。C.移除了HCV蛋白質的報告構建體用于克隆Ar細胞(缺少亞基因組復制子的細胞)。圖2.命中目標的siRNA的表型確認。重新分析來自大規模激酶組siRNA篩選的命中目標的siRNA。A.測試dsRNA為分別的雙鏈體PIK4CA1-PIK4CA4(柱1-4)、為PIK4CASmartPool(柱5)、為分別的雙鏈體PIK4CB1-PIK4CB4(柱6畫9)或為PIK4CBSmartPool(柱10)的結果。結果相對于GAPDH(對照；柱11)來測量。使用每孔25nM的dsRNA、用克隆A細胞進行測定；Bright-Glo活性在轉染后72小時進行測量。靶向GAPDH的dsRNA(柱11)用作陰性對照，且靶向pGL2的dsRNA(柱12)是陽性對照。圖3.PIK4CA和PIK4CB的RTPCR。使用siRNA轉染Huh7復制子細胞72小時，分離mRNA并用Taqman進行RTPCR分析。結果歸一化為GAPDH轉染的細胞。A.PIK4CAsiRNA的轉染，使用PIK4CA引物的TaqmanRTPCR。B.PIK4CAsiRNA的轉染，使用PIK4CB引物的TaqmanRTPCR。C.PIK4CBsiRNA的轉染，4吏用PIK4CB引物的TaqmanRTPCR。D.PIK4CBsiRNA的轉染，使用PIK4CA引物的TaqmanRTPCR。GOI=目的基因。PIK4CAsp=PIK4CASmartPool;PIK4CBsp-PIK4CBSmartPool。圖4.A)由所示的靼向PIK4CAsiRNA(25nM)處理后的PIK4CA(淺條)或PIK4CB(黑條)的mRNA表達。B)通過所示的把向PIK4CBsiRNA(25nM)處理后的PIK4CA(淺條)或PIK4CB(黑條)的mRNA表達。圖5.蛋白質印跡結果顯示PI4KAsiRNA(行l-行3分別對應于表2中的PI4KA1;PIK4A2和PIK4A3)或PI4KBsiRNA(行4-行6分別對應于表1中的PI4KB1;PIK4B2和PIK4B3)處理后PI4KB、NS3或肌動蛋白(如所標示)的蛋白質表達水平。GAPDHsiRNA處理顯示為對照。圖6.草巴向PIK4CA和PIK4CB的shRNA序列。A)使用所示的shRNA構建體處理克隆A細胞的結果。淺條表示螢光素酶活性；黑條表示細胞生存力。所有結果都與對照GAPDH處理的細胞比較；B)使用所示的shRNA處理對PI4KA表達的影響(GFP歸一化的)；C)使用所示的shRNA處理對PI4KB表達的影響(GFP歸一化的)；D)蛋白質印跡結果顯示經耙向PI4KA的shRNA(行l-行5分別對應shAl-shA5)或靶向PI4KB的shRNA(行6-行10分別對應shBl-shB5)處理后PI4KB、NS3或肌動蛋白(如所標示)的蛋白質表達水平。GFPshRNA處理顯示為對照，所有結果獲取于經所示shRNA處理后96小時；E)蛋白質印跡測量shA2和shBl對蛋白質表達的影響，shRNA轉導后3周(GFP對照)。圖7.HCV復制的抑制(活病毒)。用所示的siRNA處理時，HCV復制的劑量依賴。細胞在HCV感染前用針對PIK4CA或PIK4CB的所示siRNA處理。A)25nM(灰條；)；1.5nM(白條)；0.1nM(黑條)。結果歸一化為GAPDHsiRNA處理時的HCV復制。海腎(Renilla)siRNA是陽性對照。B)在感染細胞中靶mRNA的表達。圖8.HCV復制的抑制(活病毒)。用所示的siRNA處理時，HCV復制的劑量依賴。細胞在HCV感染后用針對PIK4CA或PIK4CB的所示siRNA處理。A)用所示的siRNA(25nM)處理后24小時對病毒復制的影響。黑條一病毒螢光素酶(活性)；淺條一細胞生存力。結果歸一化為GAPDHsiRNA處理時的HCV復制。海腎siRNA是陽性對照。B)用所示的siRNA處理后HCV復制的時間依賴。黑(第一)條一24小時；淺(第二)條一48小時；白(第三)條一72小時；灰(第四)條一96小時。發明詳述本發明提供了治療與受正鏈RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰質炎病毒)感染相關的疾病這一問題的解決方案，所述解決方案通過降低這類病毒可復制的細胞中人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性j3多肽(PIK4CB;NM—002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA;NM—002650)的水平。本文z〉開了可通過^[吏用雙鏈核糖核酸(dsRNA)沉增殖，其中所述人宿主細胞基因PIK4CB和/或P1K4CA對正鏈RNA病毒的增殖是必需的。此外，本文首次公開了對這些dsRNA的所選化學修飾是高度優選的實施方案，所述實施方案提供了驚人的降低的毒性、降低的免疫原性、改善的藥學特性和其它益處。本發明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)、以及在細胞或哺乳動物中使用所述dsRNA抑制正鏈RNA病毒繁殖的組合物、藥物組合物和方法。本發明也提供了用于在哺乳動物中使用dsRNA治療由正鏈RNA病毒感染所14引起的病理學病癥和疾病的組合物和方法。本發明的dsRNA包含具有這樣的區域的RNA鏈(反義鏈)，所述區域長度低于30個核苷酸、通常長19-24個核苷酸、并且基本互補于人磷脂酰月幾醇4-激酶催化性p亞基多肽(PIK4CB;NM—002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA;NM—002650)的至少部分的基因產物(前mRNA或成熟mRNA)轉錄物。這些dsRNA的4吏用4吏得參與哺乳動物中正鏈RNA感染的復制和/或維持的基因的mRNA靶向降解或失活。使用基于細胞的測試法和動物測試法，本發明人證實，非常低劑量的這些dsRNA就可以特異并且有效地介導RNAi，導致復制和感染的顯著抑制。因此，包含這些dsRNA的本發明方法和組合物能用于治療由正鏈RNA病毒感染介導的病理過程。人磷脂酰肌醇4-激酶催化性p亞基多肽(PIK4CB;NMJ)02651;有時也稱為PI4KB;PIK4B;pi4K92;PI4K卩;PI4K-卩;PI4KIII卩),和人磷脂酰月幾醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA;NM—002650;有時也稱為PI4KA;PIK4A;pi4K230;FLJ16556;和PI4K-a)是磷脂酰肌醇4-激酶。在文獻中褲脂酰肌醇4-激酶備選地稱為PI4K、PI4-激酶或PIK4。除非文中指出特定選擇，本說明書可交換地使用這類術語。哺乳動物細胞中存在4種PI4K酶，所述PI4K酶分成兩類。第一類是從酵母到人都保守的III型PI4Ks，包括PIK4CA和PIK4CB。酵母直向同源物Stt4p和Piklp分別都是具有無重疊功能的必需基因。II型PI4Ks(PI4KlIa和PI4Kllp)區別于III類酶，也具有作為非必需基因的酵母同源物LSB6。PIK4CB是已最佳表征的哺乳動物基因，所述PIK4CB定位于高爾基體、在與小GTP酶腺苷二磷酸-核糖基化因子(ARF)形成的復合體中發揮功能、并且認為能調節高爾基體到質膜的分泌。已經表明，II類a和p酶參與高爾基體/反面高爾基體運輸。III類a同工型似乎在質膜和內質網而不是高爾基體中發揮作用。除了PI4Ks的亞細胞定位之夕卜，還有就是在各自區室中酶的獨特功能。PIK4CB參與磷脂酰肌醇4磷酸(Ptdlns4P)和磷脂酰肌醇4,5二磷酸(Ptdlns4，5P2)庫的產生，參與神經酰胺從內質網到高爾基體的調節性運輸，所述調節性運輸導致鞘磷脂的合成，并且通過維持允許AP-1結構體停靠的富含磷脂酰肌醇4磷酸(PI(4)P)結構域而參與高爾基體的結構完整性。PIK4CB的破壞造成高爾基復合體結構的改變，造成極化細胞的分泌缺陷，并抑制蛋白質轉運到質膜。II類和III類PI4Ka和p酶產生磷脂酰肌醇4磷酸(Ptdlns4-phosphate)，所述磷脂酰肌醇4磷酸是幾種調節性磷酸肌醇的前體。這些磷酸肌醇通過招募調節性蛋白質到有組織的信號復合體中來控制多種細胞信號和運輸過程。磷脂酰肌醇4磷酸[Ptdlns4P產生自磷脂酰肌醇(Ptdlns)，第一步是磷脂酰肌醇4，5二磷酸和磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(Ptdlns(3，4，5)P3)的形成。磷脂酰肌醇4,5二磷酸是磷脂酶C(PLC)酶類主要的底物，所述磷脂酰肌醇4,5二磷酸在磷脂酶C的作用下產生肌醇1，4，5-三磷酸[Ins(l，4，5)P3和參與〔32+信號傳導的二酰甘油(DAG)。磷脂酰肌醇4，5二磷酸也控制幾種類型的離子通道和酶類如磷脂酶D(PLD),并同連接膜至肌動蛋白細胞骨架蛋白3和5的蛋白質相互作用。通過I類磷脂酰肌醇3激酶的作用產生自磷脂酰肌醇4,5二磷酸的磷脂酰肌醇3,4,5三褲酸調節一系列的過程，例如調節細胞代謝和通過絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt調節抗凋亡途徑，并且也調控酪氨酸激酶例如Btk和用于小GTP結合蛋白質的鳥嘌呤交換因子。這些傳導信號的磷酸肌醇的產生依賴于其合成酶的活性和其前體供給這二者，因此，磷脂酰肌醇4激酶在細胞調節中發揮作用。認為依賴于人PIK4CB和PIK4CA來復制的正鏈RNA病毒包括I.小RNA病毒組(HAV、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒)、諾達病毒、豇豆花葉病毒屬、線蟲傳多面體病毒組、馬鈴薯Y病毒組、大麥花葉病毒組、南方菜豆花葉病毒組和黃癥病毒組(黃化病毒、黃矮病毒和巻葉病毒)。II.香石竹斑駁病毒組、番茄叢矮病毒組、香石竹環斑病毒組、痘病毒屬、披膜病毒、伊科病毒、登革病毒、丙型肝炎病毒、黃病毒屬。III.煙草花葉病毒組、煙草脆裂病毒組、大麥病毒組、tricornaviruses、甲病毒、風滲病毒16屬、真菌傳桿狀病毒組、戊型肝炎病毒、馬鈴薯x病毒組、香石竹潛病毒組、蕪菁黃花葉病毒組和蘋果褪綠葉斑病毒。下列詳細描述公開了如何制備和4吏用dsRNA以及含有dsRNA的組合物來抑制正鏈RNA病毒的表達，以及治療由正鏈RNA病毒感染引發的疾病和病癥例如肝臟疾病、肝功能衰竭、纖維樣變性、癌、肺疾病和它的并發癥的組合物和方法(下文進一步描述)。本發明的藥物組合物包含具有反義鏈的dsRNA和可藥用載體，其中所述的反義鏈包含長度低于30個核苷酸、通常長19-24個核苷酸、并且基本互補于PIK4CB和/或PIK4CA的至少部分RNA轉錄物的互補區域。本發明的一個實施方案采用在藥物制劑中組合的多于一種的任選地靶向PIK4CBRNA轉錄物和/或PIK4CARNA轉錄物的不同區段的dsRNA。因此，本發明的某些方面提供了包含本發明的dsRNA和可藥用載體的藥物組合物，提供了使用組合物來抑制PIK4CB和/或PIK4CA的表達的方法，和提供了使用藥物組合物來治療由正鏈RNA病毒感染引起的疾病的方法。定義為了方便，下文提供說明書、實施例和所附權利要求中使用的一些術的定義之間存在明顯差異，那么以本部分的定義為準。"G"、"C"、"A"和"U"各自通常分別代表含有鳥噪呤、胞嘧啶、腺噤呤和尿嘧咬作為堿基的核苷酸。然而，應當理解，術語"核糖核普酸"或"核苷酸"也指如下文進一步詳述的經修飾的核苷酸、或者替代的置換部分。技術人員熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以用其它部分進行置換而基本不會改變寡核苷酸的堿基配對特性，其中所述的寡核苷酸包含具有此種置換部分的核苷酸。例如，不作限制地，包含肌苷作為其堿基的核苷酸可以與含有腺嘌呤、胞嘧咬或尿嘧啶的核苷酸形成堿基對。因此，含有尿嘧咬、鳥17如肌苷的核苷酸替換。包含此類置換部分的序列為本發明的實施方案。如本文所用，"乾序列"指在PIK4CB的轉錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包括為初級轉錄產物的RNA加工產物的mRNA。如本文所用，術語"包含序列的鏈"指的是包含一連串核苷酸的寡核苷酸，其中所述的一連串核苷酸通過使用標準核苷酸命名法指代的序列進行描述。如本文所用，并且除非另外說明，否則術語"互補的"當用于相對于笫二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時，其指的是包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定條件下與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或者多核苷酸雜交、并形成雙鏈體結構的能力，這一點為技術人員所理解。此類條件可以是例如嚴格條件，其中所述的嚴格條件可以包括400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA50。C或70°C12-16小時，然后洗滌。也可以應用其它條件，例如在生物體內可能遇到的生理相關條件。技術人員能夠根據雜交核苷酸的最終應用來確定最適合兩個序列互補性測試的條件設置。這包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在全長的第一和第二核苷酸序列上的堿基配對。在本文，此類序列可以稱為彼此"完全互補的"。然而，在本文，當其中第一序列稱為與第二序列"基本互補的，，時，這兩個序列可以完全互補，或者它們于與其最終應用最相關的條件下保留雜交能力的同時，可以在雜交后形成一個或多個，但通常不多于4個、3個或2個錯配堿基對。然而，在將兩條寡核苷酸設計為在雜交后形成一個或多個單鏈突出時，根據互補性的測定，此類突出并不視為錯配。例如，包含一條長21個核苷酸的寡核苷酸和另一長23個核苷酸的寡核苷酸的dsRNA,其中較長的寡核苷酸包含與較短寡核苷酸完全互補的21個核苷酸的序列，對于本發明的目的，仍可以稱為"完全互補的"。如本文所用，"互補的"序列也可包括非Watson-Crick堿基對、和/或形成，只要所述序列實現其對雜交能力的上述需求。在本文，術語"互補的"、"完全互補的"和"基本互補的"可以用于dsRNA有義鏈和反義鏈之間、或者dsRNA反義鏈和革S序列之間的堿基配對，正如其在本文的用途所理解的。如本文所用，與信使RNA(mRNA)的"至少部分基本互補"的多核苷酸指的是與目的mRNA(例如PIK4CB的mRNA或PIK4CA的mRNA)的連續部分基本互補的多核苷酸。例如，如果寡核苷酸序列與編碼PIK4CB的mRNA的非間斷部分基本互補，那么寡核苷酸至少與部分PIK4CBmRNA互補。同樣地，如果寡核苷酸序列與編碼PIK4CA的mRNA的非間斷部分基本互補，那么寡核苷酸至少與部分PIK4CAmRNA互補。如本文所用，術語"雙鏈RNA"或"dsRNA"指的是具有包含兩條反向平行、并且基本互補(如上文定義)的核酸鏈的雙鏈體結構的核糖核酸分子復合體。形成雙鏈體結構的兩條鏈可以是一個較大RNA分子的不同部分，或者是分開的RNA分子。當為分開的RNA分子時，此類dsRNA在文獻中通常稱為siRNA("短干擾RNA")。當兩條鏈是一個較大分子的部分、并因此通過形成雙鏈體結構的一條鏈的3，末端和另一鏈的5，末端之間不間斷的一連串核苷酸連接，連接的RNA鏈稱為"發夾環"、"短發夾RNA"或"shRNA"。當兩條鏈不是通過形成雙鏈體結構的一條鏈的3，末端和另一鏈的5，末端之間不間斷的一連串核苷酸而共價連接時，連接結構稱為"接頭"。RNA鏈可以具有相同或不同數量的核苷酸。堿基對的最大數目為減去了雙鏈體結構中存在的任意突出的最短dsRNA鏈的核苷酸數目。除了雙鏈體結構外，dsRNA可以包含一個或多個核苷酸突出。此外，如本說明書所用，"dsRNA"可以包括對核糖核苷酸、核苷間鍵合、末端基團、帽以及綴合部分的化學修飾，其中包括在多個核苷酸處的實質修飾、并且包括本文公開或本領域已知的所有類型的修飾。為了本說明書和權利要求的目的，"dsRNA，，包含任何在siRNA類型的分子中使用的此類修飾。如本文所用，"核苷酸突出"指的是當dsRNA—條鏈的3'末端延伸至超出另一條鏈的5，末端時從dsRNA的雙鏈體結構突出的未配對的核苷酸，或者反之亦然。"平的"或"平端"表示在dsRNA的所述末端沒有不配對的核普酸，即沒有核普酸突出。"平末端的"dsRNA為在其全長上均是雙鏈的dsRNA,即在分子的兩末端都沒有核苷酸突出。應當清楚，在測定siRNA是否具有突出或者是否為平末端時，不考慮結合siRNA3，末端或5'末端連接的化學帽或者非核苷酸的化學部分。術語"反義鏈"指的是dsRNA的包括與靶序列基本互補的區域的鏈。該鏈也稱為"指導"序列，并用于在功能RISC復合物中指導該復合物對正確的mRNA進行切割。如本文所用，術語"互補的區域"指的是反義鏈上與序列例如本文定義的靼序列基本互補的區域。當互補區域與靶序列不完全互補時，最耐受在末端區域的錯配，并且如果存在的話，通常在末端區域或者例如在5，和/或3'末端的6、5、4、3或2個核苷酸內的區域中。由于"反義，，的使用與RNA復合物有關，所以"反義，，的使用不同于反義DNA化合物，其中所述的反義DNA化合物在核酸治療的相關領域中是不同的。如本文所用，術語"有義鏈"指的是dsRNA的包括與反義鏈的區域基本互補的區域的鏈。該鏈也稱為"反指導"序列，因為它含有與革巴序列相同的核苷酸序列，且因此特異地與指導序列結合。如本領域技術人員理解地，當談及dsRNA時，"向細胞中引入"表示促進細月包才聶取或吸收。dsRNA的吸收或4聶取可以通過自主擴散或主動的細胞過程、或者通過輔助性試劑或裝置來進行。這個術語的含義不限于體外的細胞，當細胞為活的生物體的部分時，dsRNA也可以"引入細胞"。在該情況中，向細胞的引入包括向生物體的遞送。例如，可以將dsRNA注射入組織部位或者全身施用來進行體內遞送。在體外向細胞的引入包括本領域已知的方法例如電穿孔法和脂質轉染法。在本文，只要術語"沉默，，和"抑制表達，，涉及PIK4CB或PIK4CA，那么其指的是在用靶向PIK4CB或PIK4CA的dsRNA處理的細胞中，至少部分抑制PIK4CB或PIK4CA的表達，這通過與正常(未處理)細胞比較，轉錄的或可得到的mRNA量的減少來顯示。該測量法可通過比較處理細胞(其可從進4亍了處理使PIK4CB或PIK4CA的表達受到抑制的笫一細胞或第一組細胞分離)中的mRNA水平來檢測，并且其中所述的mRNA量減少為和與第一細胞或第一組細胞基本相同、但未進行如此治療的第二細胞或第二組細胞(對照細胞)相比較的結果。抑制程度通常以下列方式表示(對照細胞中的mRNA)-(經處理細胞中的mRNA)柳。,。(對照細胞中的mRNA)0備選地，抑制程度可以以與基因轉錄功能相關的參數下降的方式來給出，其中所述的參數例如多肽的量、或者顯示特定表型例如特異地與PIK4CB或PIK4CA相關的激酶活性、或感染的易感性的細胞數目。在原則上，基因沉默可以在任何表達目的基因(組成型表達或者通過基因工程技術表達)的細胞中、并且可以通過任意合適的測試法來檢測。然而，當需要參考來確定特定dsRNA是否在一定程度上抑制PIK4CB或PIK4CA的表達、并因此包含于本發明時，下文實施例提供的測試法將用作此種參考。例如，在一些情況中，通過施用本發明的雙鏈RNA抑制至少大約20%、25%、35%或50%的PIK4CB或PIK4CA基因表達。在一些實施方案中，通過施用本發明的雙鏈寡核苷酸抑制至少大約60%、70%或80%的PIK4CB或PIK4CA基因。在一些實施方案中，通過施用本發明的雙鏈寡核苷酸抑制至少大約85%、卯％或95%的PIK4CB或PIK4CA基因。圖2中的結果顯示在HCV復制子測試法中每一受檢測的靶向PIK4CB(或PIK4CA)的dsRNA有效地減少了10%至90%的表達產物的相對水平。圖3中的結果顯示每一受檢測的耙向PIK4CB(或PIK4CA)的dsRNA有效地減少了細胞中10%至90%P1K4CB(或PIK4CA)mRNA水平。如在本文正鏈RNA病毒感染的上下文中所用，術語"治療"、"療法"等指的是緩解或者減緩正鏈RNA病毒感染介導的病理過程。該描述包括使用本發明的治療劑預防或防止正鏈RNA病毒感染、以及緩解正鏈RNA21病毒感染引發的癥狀或病癥。在本發明上下文中，在涉及下文所述的任何其它病癥(不同于正鏈RNA病毒感染介導的病理過程)的情況下，術語"治療"、"療法"等表示緩解或者減輕至少一種與所述疾病相關的癥狀、或者減慢或逆轉所述疾病的進程。如本文所用，短語"治療有效量"和"預防有效量"指的是在治療、預防或者管理由正鏈RNA病毒感染介導的病理過程或正鏈RNA病毒感染介導的病理過程的明顯癥狀中提供治療益處的數量。治療有效的特定量可以由普通醫生輕易確定，并且依賴于本領域公知的因素而不同，其中所述因素例如由正鏈RNA病毒感染介導的病理過程的類型、患者的病史和年齡、由正鏈RNA病毒感染介導的病理過程的階段、以及其它抗病理劑的施用。如本文所用，"藥物組合物"包含藥學有效量的dsRNA和可藥用載體。如本文所用，"藥學有效量"、"治療有效量"或者僅有"有效量"指的是有效產生預期的藥學效果、治療效果或者預防效果的dsRNA劑量。例如，如果當與疾病或病癥相關的可測量參數中存在至少25%的減少時就認為給定的臨床療法是有效的，那么治療這種疾病或病癥的藥物的治療有效量是使上述參數減少至少25%所需的量。術語"可藥用載體"指的是施用治療劑的栽體。此類載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、丙三醇、乙醇、和它們的組合。術語明確排除細胞培養基。對于經口施用的藥物，可藥用載體包括但不限于可藥用賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑。適當的惰性稀釋劑包括鈉和鈣的碳酸鹽、鈉和鈣的磷酸鹽、以及乳糖，而玉米淀粉和褐藻酸則是適當的崩解劑。粘合劑可以包括淀粉和明膠，而潤滑劑(如果存在的話)通常為硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果需要的話，片劑可以用例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料包衣來延遲在胃腸道的吸收。如本文所用，"經轉化的細胞"為引入了表達dsRNA分子的載體的細胞。雙鏈核糖核酸(dsRNA)22在一個實施方案中，本發明提供了在細胞或哺乳動物中抑制PIK4CB和/或PIK4CA表達的雙鏈核糖核酸分子(dsRNA)，且因此抑制正鏈RNA病毒復制或繁殖，其中所述的dsRNA包含反義鏈，所述反義鏈包含與在表達PIK4CB或PIK4CA時形成的至少部分mRNA互補的互補區域，并且其中互補區域在長度上低于30個核苷酸、通常長19-24個核苷酸，并且其中所述的dsRNA與表達所述PIK4CB或PIK4CA基因的細胞接觸后，至少10%、25%或40%抑制所述PIK4CB或PIK4CA基因表達。dsRNA包含兩條充分互補以便雜交形成雙鏈體結構的RNA鏈。dsRNA的一條鏈(反義鏈)包含與耙序列基本互補、并且通常完全互補的互補區域，所述耙序列來自PIK4CB或PIK4CA基因的基因產物的序列，另一條鏈(有義鏈)包含與反義鏈互補、以便兩條鏈在適當條件下結合時雜交并形成雙鏈體結構的區域。一般而言，雙鏈體結構長度在15-30個堿基對之間、更通常在18-25個堿基對之間、進一步更加通常地在19-24個堿基對之間、最通常地在19-21個堿基對之間。類似地，與靶序列互補的區域長度在15-30個核苷酸之間，更通常地在18-25個核苷酸之間，進一步更加通常地在19-24個核苷酸之間，最通常地在19-21個核苷酸之間。本發明的dsRNA可以是平末端的(如每一任何鏈中的核苷酸具有與其它鏈合適的堿基配對的核苷酸)，或也可包含一個或多個單鏈核苷酸突出(一般在3，末端)。dsRNA可以如下文進一步討論地通過本領域公知的標準方法來合成，其中所述的方法例如通過使用例如Biosearch，AppliedBiosystems，Inc.商品化的自動DNA合成儀。在特定的實施方案中，用于靶向P1K4CB的dsRNA包含選自表l的有義序列的鏈和選自表1的反義序列的第二序列。靶向PIK4CB靶序列的其它地方的備選試劑(如位于表l中鑒定的試劑的稍上游或下游)可以輕易地使用表l中所列的序列和側翼的mRNA或NCBI登錄號NM—002651中發現的基因組序列來確定。在特定的實施方案中，用于靶向PIK4CA的dsRNA包含選自表2的有義序列的鏈和選自表2的反義序列的第二序列。靶向PIK4CA靶序列的其它地方的備選試劑(如位于表2中鑒定的試劑的稍上游或下游)可以輕易地使用表2中所列的序列和側翼的mRNA或NCBI登錄號NM—002650下發現的基因組序列來確定。在進一步的實施方案中，dsRNA包含至少一個選自表1或表2提供的雙鏈序列的雙鏈序列。在其它實施方案中，治療劑可包含兩個或多個選自表1和/或表2的雙鏈序列。一般而言，每一dsRNA包含兩個寡核苷酸鏈，其中的一個寡核苷酸描述為表中的有義鏈，并且第二個寡核苷酸描述為同一表中的反義鏈。每張表都提供了每一優選的dsRNA的雙鏈體名稱。核苷酸堿基使用標準的核苷酸符號表示。表1耙向PIK4CB的雙鏈體siRNA(dsRNA)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表1靶向PIK4CB的雙鏈體siRNA(dsRNA)(續上頁)PIK4CB27UUGCCGAUCGCCMJCAGGGACTT26CCCUGMJGGCGAUCGGCAATT130PIK4CB28UGGAUCAUCUAGGCAACGGATTT27CCGUUGCCUAGAUGAUCCATT131PIK4CB29UUCCCAAAUGGACUGCAGUTGTT28ACUGCAGUCCAUUUGGGAATT132PIK4CB30UCCACUACUGUAUCUCCCATGTT29UGGGAGAUACAGUAGUGGATT133PIK4CB31UAGGAAGUAAUCGAGCAAGGATT30CUUGCUCGAUUACUUCCUATT134PIK4CB32AAGAAUCUCAUUCAAUUUCCATT31GAAMJUGAAUGAGAUUCUUTT135PIK4C已33UAGCUUGGUCCCACGGGAGTGTT32CUCCCGUGGGACCAAGCUATT136PIK4CB34UUGAACAUGUCGCCAUCCAGGTT33UGGAUGGCGACAUGUUCAATT137PIK4CB35UCAAGUCCUAAGUACCGAGAATT34CUCGGUACUUAGGACUUGATT138PIK4CB36AUGACUGACAGGAGCCGCCWTT35GGCGGCUCCUGUCAGUCAUTT139PIK4CB37UGUUCAUCCCUCUUAGUGGCTTT36CCACUAAGAGGGAUGAACATT140PIK4CB38UUGGAGUUGAGGACAACAGCCTT37CUGUUGUCCUCAACUCCAATT141PIK4CB39AAUAAGAGGAUGGCCUGUGGATT38CACAGGCCAUCCUCUUAUUTT142PIK4CB40UGAUCCGCCGUACUUUCUCCTTT39GAGAAAGUACGGCGGAUCATT143PIK4CB41AAUUCCACAUGGCUAGGCCAGTT40GGCCUAGCCAUGUGGAAUUTT144PIK4CB42AUCUGACUUAGAGCGCUGGTGTT41(XAGCGCUCUAAGUCAGAUTT145PIK4C已43CUCAGUGGUGUAACUGCCGTGTT42CGGCAGUUACACCACUGAGTT146PIK4CB44UCAGCUUAAAGGCUGACGUCTTT43ACGUCAGCCUUUAAGCUGATT147PIK4CB45AAGCCGUCAUAGAGUUUGGTGTT44CCAAACUCUAUGACGGCUUTT148PIK4CB46UCCGUGAUGACACUUAGCAGGTT45UGCUAAGUGUCAUCACGGATT149P1K4CB47UCGCCUM3GUCAUCCACCGACTT46CGGUGGAUGACAUAGGCGATT150PIK4CB48UGGAAGGCCCGCCCUUCUCAGTT47GAGAAGGGCGGGCCUUCCATT151PIK4C已49AACUGGGAGAUGUUGUCACAGTT48GUGACAACAUCUCCCAGUUTT152PIK4CB50UAGAGACUGCCACGCCUCCATTT49GGAGGCGUGGCAGUCUCUATT153PIK4CB51UUGACCACUGGUUCAAUCATGTT50UGAUUGAACCAGUGGUCAATT154PIK4CB52UUAGGGUUGCUGGCUGUUCGTTT51GAACAGCCAGCAACCCUAATT155PIK4CB53UCUGUGGUCAGCUUAAAGGCTTT52CCUUUAAGCUGACCACAGATT156PIK4CB54AUUMJCAMJACUCUCGGUGCTTT53CACCGAGAGUAUUGM3AMJTT157PIK4CB55UUGGUGAGGUACUGGAAGCCGTT54GCUUCCAGUACCUCACCAATT158P1K4CB56UGUMJGGCUUGAUCCAAAGGGTT55CUUUGGAUCAAGCCAUACATT159PIK4CB57UUGGAGUUAUACAGGUAUGAATT56CAUACCUGUAUAACUCCAATT鄉PIK4CB58UCGAGCUUCCAAGAAUCUCATTT57GAGAUUCUUGGAAGCUCGATT161PlK4C巳59AAAGUUAAUGCUCUGGCGGCATT58CCGCCAGAGCAUUAACUUUTT162PIK4CB60UAUCAGCCGAAAUCACAAGAATT59CUUGUGAUUUCGGCUGAUATT163P1K4CB61UUGUCAUAGUUGGGCACAGTGTT60CUGUGCCCAACUAUGACAATT164PIK4C已62UCCGUAGCUUGGUCCCACGGGTT61CGUGGGACCAAGCUACGGATT165PIK4CB63UGAGGUUUCGAAUGGUGCUGGTT62AGCACCAUUCGAAACCUCATT166PIK4CB64UUGUAUGGCUUGAUCCAAAGGTT63UUUGGAUCAAGCCAUACAATT167PIK4CB65UAAGUACCGAGAACCUACUCTTT64AGUAGGUUCUCGGUACUUATT168PIK4CB66UUUCCGAGCGGCAAUCAGCCCTT65GCUGAUUGCCGCUCGGAAATT■169PIK4CB67UGAGGUACUGGAAGCCGUCATTT66GACGGCUUCCAGUACCUCATT17025表1靶向PIK4CB的雙鏈體siRNA(dsRNA)(續上頁)PIK4CB68UCUCAGACAAGGGCCCUCUAGTT67AGAGGGCCCUUGUCUGAGATT171PIK4CB69UGUAGGCUUGUACUCCAGGCTTT68CCUGGAGUACAAGCCUACATT172PIK4CB70UUAAUGCUCUGGCGGCAACGGTT69GUUGCCGCCAGAGCAUUAATT173PIK4CB71GAAUUAUCAAUACUCUCGGTGTT70CCGAGAGUAUUGAUAAUUCTT174PIK4CB72UUCCACAUGGCUAGGCCAGTATT71CUGGCCUAGCCAUGUGGAATT175PIK4CB73UGAGGCAUCCGUUCAUACCTCTT72GGUAUGAACGGAUGCCUCATT176PIK4CB74UUGCUGGCUGUUCGUUUCAGGTT73UGAAACGAACAGCCAGCAATT177PIK4CB75AACAUGUCGCCAUCCAGGCCGTT74GCCUGGAUGGCGACAUGUUTT178PIK4CB76UGCUCCGGAGUAGUCAACCAATT75GGUUGACUACUCCGGAGCATT179PIK4CB77ACUGGUUCAAUCAUGCCACTATT76GUGGCAUGAUUGAACCAGUTT180P歸CB78DAGACCGCAUACUGCCA13CCATT77GAUGGCAGUAUGCGGUCUATT181PIK4CB79UGGAGUUGAGGACAACAGCCTTT78GCUGUUGUCCUCAACUCCATT182PIK4CB80UAGUUGGGCACAGUGCUGAAGTT79UCAGCACUGUGCCCAACUATT183PIK4CB81UCAAUACUCUCGGUGCUGGAGTT80CCAGCACCGAGAGUAUUGATT184PIK4CB82UACUCCGAAUUCGGUUCUCGGTT81GAGAACCGAAUUCGGAGUATT185PIK4CB83UUACCACAUGAUCCUUCGUGTTT82ACGAAGGAUCAUGUGGUAATT186PIK4CB84UGGCUAGGCCAGUACCCUCAGTT83GAGGGUACUGGCCUAGCCATT187PIK4CB85UUCUACGGACCUCGUACUCCGTT84GAGUACGAGGUCCGUAGAATT188PIK4CB86UGACAGGAGCCGCCAAUUGGGTT85CAAUUGGCGGCUCCUGUCMT189PIK4C已87UCAGACAAGGGCCCUCUAGGGTT86CUAGAGGGCCCUUGUCUGATT190PIK4CB88AUUGACCACUGGUUCAAUCATTT87GAUUGAACCAGUGGUCAAUTT191PIK4CB89UCCGGAGUAGUCAACCAAGTGTT88CUUGGUUGACUACUCCGGATT192PIK4C日90UCAUGGGUAAUACCACAUUCGTT89AAUGUGGUAUUACCCAUGATT193PIK4CB91UUCAAUCAUGCCACUAUCAGCTT90UGAUAGUGGCAUGAUUGAATT194PIK4CB92UCUAGGCAACGGAUCCJCACTGTT91GUGAGAUCCGUUGCCUAGATT195PIK4CB93UGAUCUGGGCAGGUGGAUCATTT92GAUCCACCUGCCCAGAUCATT196PIK4CB94UAUCAAUACUCUCGGUGCUGGTT93AGCACCGAGAGUAUUGAUATT197PIK4CB95AAUGCUCUGGCGGCAACGGTGTT94CCGUUGCCGCCAGAGCAUUTT198PIK4C已96UCCCACGGGAGUGUCGUUGAGTT95CAACGACACUCCCGUGGGATT199PIK4C已97UUUCUCAGACAAGGGCCCUCTTT96AGGGCCCUUGUCUGAGAAATT200PIK4CB98AUCUUCUGGGUCUCGUUUGAATT97CAAACGAGACCCAGAAGAUTT201PIK4C已99UCGUACUCCGAAUUCGGUUCTTT98AACCGAAUUCGGAGUACGATT202P1K4CB100UUUAGGGUUGCUGGCUGUUCGTT99AACAGCCAGCAACCCUAAATT203PIK4CB101CUCCUGUAGGAAGUAAUCGAGTT100CGAUUACUUCCUACAGGAGTT204PIK4CB102UGGUGAGGUACUGGAAGCCGTTT101GGCUUCCAGUACCUCACCATT205PIK4CB103UCMJCCACCGACCAGGCCUCATT102AGGCCUGGUCGGUGGAUGATT206PIK4CB104ACUCCGAMJUCGGUUCUCGGGTT103CGAGAACCGAAUUCGGAGUTT207PIK4C已105UCAGGUAGGGAGCC(JUGUCCTTT察GACAAGGCUCCCUACCUGATT20826表2靶向PIK4CA的雙鏈體siRNA(dsRNA)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表2靶向PIK4CA的雙鏈體siRNA(dsRNA)(續上頁)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>技術人員熟知包含20至23個之間、特別是21個堿基對的雙鏈體結構的dsRNA在誘導RNA干擾中特別有效(Elbashir等人，EMBO2001，20:6877-6888)。然而，其它人發現，更短或更長的dsRNA也有效。在上述實施方案中，通過在表1或表2中提供的寡核苷酸序列的性質，本發明的dsRNA可以包含至少一條長度最低為21nt的鏈。可以合理期望，包含表1或表2中的一個序列、僅在一個或兩個末端減去幾個核苷酸的較短dsRNA可以具有與上述dsRAN相比類似的效果。因此，本發明考慮了包含表l或表2的序列之一中的至少15、16、17、18、19、20或更多個連續核苷酸的部分序列的、并且在本文所述的FACS測試法或其它測試法中抑制PIK4CB或PIK4CA基因表達的能力比包含全序列的dsRNA的抑制作用低不超過5、10、15、20、25或30%的dsRNA。在表1或表2提供的靶序列中切割的其它dsRNA可以使用提供的參考序列和靶序列輕易生成。此外，在表1或表2中提供的RNAi試劑在PIK4CB或PIK4CAmRNA中確定了有用的位點，其對基于RNAi的切割敏感。如此地，本發明進一步包括靶向本發明試劑之一靶向的序列中的RNAi試劑。如本文所用，如果第二種RNAi試劑切割與第一種RNAi試劑反義鏈互補的mRNA內任意位置，那么第二種RNAi試劑就稱為耙向第一種RNAi試劑的序列。這種第二種試劑通常由表1或表2提供的序列之一的至少15個連續核苷酸組成，其中所述的核苷酸與源自靶基因中的所選序列鄰近區域的額外核苷酸序列偶聯。例如，SEQIDNO:5的最后15個核苷酸與PIK4CB基因的鄰近6個核苷酸組合來產生基于表1提供的序列之一的21個核苷酸的單鏈試劑。基于該單鏈，互補的有義鏈可輕易的產生。其可在與最初的SEQIDNO:5雙鏈體相同的敏感區域切割靶mRNA。基于表2提供的序列可以相同的方式來完成對PIK4CA的切割。本發明的dsRNA可以含有對靶序列的一個或多個錯配。在優選的實施方案中，本發明的dsRNA含有不超過3個的錯配。如果dsRNA的反義鏈含有對靶序列的錯配，那么錯配區域優選不定位在互補區域的中心。如果dsRNA的反義鏈含有對靶序列的錯配，那么錯配優選限制在任一末端30的5個核苷酸，例如互補區域的5，或3，末端的5、4、3、2或1個核苷酸。例如，對于與PIK4CB靶基因的區域互補的23個核苷酸的dsRNA鏈，dsRNA在中心的13個核苷酸內通常不含有任何錯配。本發明所述的方法可以用于測定包含對靶序列的錯配的dsRNA是否有效降低細胞中PIK4CB的表達。考慮具有錯配的dsRNA在抑制PIK4CB表達中的有效性是重要的，尤其是如果已知在PIK4CB中的特定互補區域在人群內具有多態性的序列差異。相同的分析可用于靶向PIK4CA的dsRNA。在一個實施方案中，dsRNA的至少一個末端具有l-4個、通常l個或2個核苷酸的單鏈核苷酸突出。具有至少一個核苷酸突出的dsRNA比它們平末端的dsRNA對應物具有出乎意料的高抑制特性。此外，僅存在一個核苷酸突出加強了dsRNA的干擾活性，而不影響其整體穩定性。已經證實，僅具有一個突出的dsRNA在體內、以及多種細胞、細胞培養基、血液和血清中尤其穩定和有效。一般而言，單鏈的突出定位在反義鏈的3，末端，或者備選地在有義鏈的3，末端。dsRNA也可以具有平末端，其通常定位在反義鏈的5，端。此類dsRNA具有改善的穩定性和抑制活性，因此允許以低劑量施用，即每天每千克受試者體重少于5mg。一般而言，dsRNA的反義鏈在3，端具有核苷酸突出。在另一實施方案中，用核苷硫代磷酸替代突出中的一個或多個核苷酸。在表l和表2中，RNA鏈的匹配對顯示出在3，末端具有兩個胸腺嘧啶核苷DNA核苷酸。闡述這種T-T基序是因為它是一種常用的趨向于增加siRNA的穩定性或其它所希望有的特性的基序。因此，T-T是本發明的一個合適實施方案。盡管如此，由本領域技術人員熟知的核苷酸的其它排列，任選地具有修飾的核苷間鍵合、化學修飾或保護帽可使用于siRNA鏈的3，末端。本領域技術人員知道此類修飾導致改善的功能等效分子，因為mRNA的耙序列保持不變，但是改變的突出的核苷酸可有利的影響其它藥物特性。又在另一實施方案中，對dsRNA進行化學修飾來增強穩定性或提供其它治療益處。本發明的核酸可以通過本領域已建立好的方法合成和/或修飾，其中所述的方法例如"Currentprotocolsinnucleicacidchemistry",Beaucage，S.L等人(編著)，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA中所述的方法，所述文獻在此處引入作為參考。化學修飾可以包括但不限于2，修飾、在寡核苷酸的糖或堿基的其它位點上的修飾、將非天然堿基引入寡核苷酸鏈、共價連接至配體或化學部分，和用備選鍵例如硫代磷酸酯替換核苷酸間磷酸酯鍵。可以采用多于一種的此類修飾。dsRNA兩條分開的鏈的化學連接可以通過多種眾所周知的技術來實現，例如通過引入共價鍵、離子鍵或氫鍵、疏水相互作用、范德華相互作用或者堆積相互作用、通過金屬離子配位、或者通過使用噤呤類似物。一般而言，可以用來修飾dsRNA的化學基團包括但不限于亞甲藍；雙官能基團，通常為二-(2-氯乙基)胺；N-乙酰基-N，-(對乙醛酰苯曱酰基)胱胺；4-硫尿嘧啶和補骨脂素。在一個實施方案中，接頭為六甘醇接頭。在這種情況中，dsRNA通過固相合成法產生，并才艮據標準方法(例如，Williams,D.J和K.B.Hall,Biochem.(1996)35:14665-14670)引入六甘醇接頭。在一個特定的實施方案中，反義鏈的5，端和有義鏈的3，端通過六甘醇接頭進行化學連接。在另一實施方案中，dsRNA至少一個核苷酸包含硫代磷酸酯基團或二硫代磷酸酯基團。dsRNA末端的化學鍵一般通過三鏈螺旋鍵形成。表1和表2提供了根據這些技術能夠被修飾的dsRNA序列的實例。又在另一實施方案中，可以修飾兩條單鏈中的一條或兩條鏈上的核苷酸來預防或抑制細胞酶活性的降解，其中所述的酶例如但不限于某些核酸酶。本領域已知抑制細胞酶降解核酸的活性的技術，其中包括但不限于2，-氨基修飾、2，-氨基糖修飾、2，-F糖修飾、2，-F修飾、2，-烷基糖修飾、不帶電的主鏈修飾、嗎啉基修飾、2'-0-甲基修飾和氨基磷酸酯(參見例如，Wagner,Nat.Med.(1995)1:1116-8)。因此，dsRNA上核苷酸的至少一個2，-羥基基團用化學基團、通常用2，-氨基或2，-曱基基團替代。并且，可以修飾至少一個核苦酸來形成鎖核苷酸。該鎖核苷酸含有連接核糖的2'-0和核糖的4，-C的亞甲基橋。含有鎖核苷酸的寡核苷酸在Koshkin，A.A等人，32Tetrahedron(1998)，54:3607-3630)和Obika，S等人，TetrahedronLett,(1998)，39:5401-5404)中進行了描述。將鎖核普酸引入寡核苷酸在一定程度上改善了對互補序列的親和性、并提高了解鏈溫度(Braasch，D.A和D.R.Corey，Chem.Biol.(2001)，8:1-7)。將配體綴合至dsRNA可以促進其細胞內的吸收、以及促進其革巴向于特定組織、或者促進其被特定類型的細胞攝取。在一些情況下，將疏水配體綴合至dsRNA來促進細胞膜的直接滲透。備選地，綴合至dsRNA的配體為用于受體介導的胞吞作用的底物。這些方法已經用于促進反義寡核苷酸、以及dsRNA試劑的細胞滲透。例如，已經將膽固醇綴合至多種反義寡核苷酸，從而產生比其未綴合的類似物實質上更有效的化合物。參見M.ManoharanAntisense&NucleicAcidDrugDevelopment2002，12，103。其它已綴合至寡核苷酸的親脂性化合物包括l-芘丁酸、1，3-二-0-(十六烷基)丙三醇和薄荷醇。用于受體介導的胞吞作用的配體的一個實例為葉酸。葉酸通過葉酸受體介導的胞吞作用進入細胞。帶有葉酸的dsRNA化合物通過葉酸受體介導的胞吞作用有效運輸入細胞。李及其合作者報導，將葉酸連接至寡核苷酸的3，-末端導致細胞內寡核苷酸的攝取增加8倍。Li，S.;Deshmukh，H.M.;Huang,LPharm.Res.1998,15,1540。其它已綴合至寡核苷酸的配體包括聚乙二醇、糖簇、交聯劑、卟啉綴合物和遞送肽。在某些情況下，陽離子配體與寡核苷酸的綴合導致對核酸酶改善的抗性。陽離子配體的代表實例為丙基銨和二甲基丙基銨。有趣的是，據報導，當陽離子配體散布在寡核苷酸中時，反義寡核苷酸保持其對mRNA的高結合親和力。參見M.ManoharanAntisense&NucleicAcidDrugDevelopment2002，12，103和其中的參考文獻。本發明配體綴合的dsRNA可以通過使用具懸垂的反應官能性的dsRNA,例如將連接分子連接于dsRNA上而獲得。這種反應性的寡核普酸可以直接與商品化的配體、合成為具有多種保護基團的配體、或者具有連接于其上的連接部分的配體反應。在一些優選的實施方案中，本發明的方法通過使用適當綴合了配體、并可能進一步連接至固相支持材料的核苷單體來促進配體綴合的dsRNA的合成。根據本發明方法的一些優選實施方案，此類任選連接至固相支持材料的配體-核苷綴合物通過所選的血清結合配體與定位在核苷或寡核苷酸5，位置的連接部分反應來制備。在一些情況下，具有連接至dsRNA3，-末端的芳烷基配體的dsRNA通過將單體結構單元通過長鏈氨烷基基團首先共價連接至可控多孔玻璃支持體來制備。然后，核苷酸通過標準的固相合成技術鍵合至與固相支持體綴合的單體結構單元。單體結構單元可以是與固相合成法兼容的核苷或者其它有機化合物。用于本發明綴合物中的dsRNA可以方便并且常井見地由眾所周知的固相合成技術來制備。此種合成的設備由一些賣主銷售，其中包括例如AppliedBiosystems(FosterCity，CA)的。額外地或備選地，可以采用本領域已知用于此種合成的任何其它方法。也已知使用類似技術來制備其它寡核普酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。關于特定修飾的寡核苷酸的合成的教導可以在下列美國專利中找到關于綴合多胺的寡核苷酸，見美國專利號5,138,045和5,218,105;關于用于制備具有手性磷鍵的寡核苷酸的單體，見美國專利號5,212,295;關于具經修飾主鏈的寡核苷酸，見美國專利號5,378,825和5,541,307;關于經修飾主鏈的寡核苷酸和其通過還原偶聯的制備，見美國專利號5,386,023;關于基于3-脫氮噤呤環系統的經修飾核酸堿基及其合成方法，見美國專利號5,457,191;關于基于N-2取代嘌呤的經修飾的核酸堿基，見美國專利號5,459,255;關于制備具有手性磷鍵的寡核苷酸的方法，見美國專利號5,521,302;關于肽核酸的美國專利號5,539,082;關于具有(5-內酰胺主鏈的寡核苷酸，見美國專利號5,554,746;關于合成寡核苷酸的方法和材料，見美國專利號5,571,902;關于具有烷硫基基團的核苷，見美國專利號5,578,718,其中所述的此類基團可以用作與連接在核苷的任何多個位置的其它部分的接頭；關于具有高手性純度的硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸，見美國專利號5，587，361和5,599,797;關于制備2'-0-烷基鳥苷和相關化合物的34方法，見美國專利號5,506,351，其中包括2,6-二氨基嘌呤化合物；關于具有N-2替代的嘌呤的寡核苷酸，見美國專利號5,587,469;關于具有3-脫氮嘌呤的寡核苷酸，見美國專利號5,587,470;關于綴合了4，-去甲基核苷類似物，見美國專利號5,223,168和5,608,046這兩者；關于經^"飾主鏈的寡核苷酸類似物，見美國專利號5,602,240和5,610,289;關于合成2，-氟代-寡核苷酸的方法，尤其見美國專利號6,262,241和5，459，255。其它有利的修飾示于US6670486、PCT公開號WO2003082255和WO2005021749中。在具連接有本發明序列特異性核苷的配體綴合的dsRNA和配體-分子中，寡核苷酸和寡核苷可以在適當DNA合成儀上利用標準核苷酸或核苷前體、或已經含有連接部分的核苷酸或核苷綴合物前體、已經含有配體分子的配體-核苷酸或核苷綴合物前體、或者含有結構單元的非核苷配體來組裝。當使用已含有連接部分的核苷酸-綴合物前體時，一般完成序列特異性連接的核苷的合成，并且隨后將配體分子與連接部分反應來形成配體綴合的寡核苷酸。含有多種分子例如類固醇、維生素、脂類和報告分子的寡核苷酸綴合物先前已有描述(參見Manoharan等人，PCT申請WO93/07883)。在一個優選的實施方案中，本發明的寡核苷酸或連接的核苷通過自動化合成儀使用來自配體-核苷綴合物的亞磷酰胺(phosphoramidite)、以及在寡核香酸合成中常規使用的商品化的標準亞磷酰胺和非標準亞磷酰胺合成。在寡核苷酸的核苷中摻入2'-0-甲基、2，-0-乙基、2，-0-丙基、2，-0-烯丙基、2，-0-氨烷基、2，-0-甲氧基乙氧基或2，-脫氧-2，-氟代基團可賦予寡核苷酸增強的治療特性，如增強的雜交動力學。進一步地，含有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸具有增強的核酸酶穩定性。因此，本發明官能化的連接的核苷可以通過包括硫代磷酸酯主鏈或包括2，-0-甲基、2，-0-乙基、2，-0-丙基、2，-0-氨烷基、2'-0-烯丙基、2，-0-甲氧基乙氧基或2，-脫氧-2，-氟代基團，或者包括這兩者來增強。本領域已知的一些寡核苷酸修飾的概括列表可以在例如PCT公開WO200370918中找到。基基團的官能化核苷序列使用DNA合成儀制備，并隨后與所選配體的活性酯衍生物反應。活性酯衍生物為本領域4支術人員所熟知。代表性的活性酯包括N-羥基琥珀酰亞胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。氨基基團與活性酯的反應生成寡核苷酸，其中所選配體通過連接基團連接至5M立置。5，-末端的氨基基團可以利用5，-氨基修飾物C6試劑制備。在一個實施方案中，配體分子可以通過使用配體-核苷亞磷酰胺而綴合于寡核苷酸的5，-位置，其中所述的配體直接或間接通過接頭連接于5，-羥基基團。此類配體-核苷亞磷酰胺通常用在自動化合成步驟的最后來提供在5，-末端具有配體的配體綴合的寡核苷酸。修飾的核苷間鍵或主鏈的實例包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和包括3，-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯的其它烷基膦酸酯、次膦酸酯、包括3，-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰基烷基膦酸酉旨(thio,lkylphosphoiiates)、硫羰基烷基磷酸三酉旨(thionoalkylphosphotriesters)和具有常規3，-5，鍵的硼烷磷酸酯(boranophosphates)、這些物質的2，-5，連接的類似物、以及那些具有相反極性、其中相鄰核苷單元對為3，-5，至5，-3，或者2，-5，至5，-2，連接的物質。也包括多種鹽、混合鹽和游離酸形式。涉及制備上述含有磷原子鍵的代表性美國專利包括但不限于美國專利號3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5，264，423、5,276,019、5，278，302、5，286，717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050和5,697,248，其中每一專利都在此處引入作為參考。其中不包括磷原子的修飾的核苷間鍵合或主鏈(即寡核苷)的實例具有由短鏈烷基或環烷基糖間鍵、混合的雜原子和烷基或環烷基糖間鍵合、或者一種或多種短鏈雜原子或雜環的糖間鍵合形成的主鏈。這些包括具有嗎啉基鍵(部分由核苷的糖部分形成)、珪氧烷主鏈、硫醚、亞砜和砜主鏈、氧基亞曱基氧基(formacetyl)和硫基亞甲基氧基(thioformacetyl)主鏈、亞甲基氧基亞甲基氧基和亞甲基硫基亞甲基氧基主鏈、含有鏈烯烴的主鏈；氨基磺酸酯主鏈、亞甲亞胺基和亞甲肼基主鏈、磺酸酯和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈、以及其它具有混合的N、O、S和CH2組分部分的主鏈。如在表1和表2中提及的，dT-dT對可添加到dsRNA的任何一條(或兩條)鏈的3，末端。在這些情況中添加的dT-dT對通常與靶序列不互補。添加這些可含有硫代磷酸酯(硫)核苷間鍵合的dT-dT對來增強穩定性。涉及制備上述寡核苷酸的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5，677，437和5,677,439,其中各專利都在此處引用作為參考。在一些情況中，寡核苷酸可以通過非配體基團修^飾。許多非配體分子綴合至寡核苷酸以增強寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取，并且在科學文獻中有進行此類綴合的方法。此類非配體部分包括脂類部分，例如膽固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989，86:6553)、膽酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett"1994,4:1053)、硫醚，例如己基-S畫三苯曱基硫醇(tritylthiol)(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad爭Sci.,1992，660:306;Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let"1993，3:2765)、硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.AcidsRes"1992，20:533)、脂肪族鏈，例如十二烷二醇或者十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBOJ.，1991，10:111;Kabanov等人，FEBSLett"1990，259:327;Svinarchuk等人，Biochimie，1993，75:49)、磷脂，例如二-十六烷基-夕卜消旋-丙三醇或者三乙基銨1,2-二-0-十六烷基-夕卜消旋-丙三醇-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,TetrahedronLett"1995，36:3651;Shea等，Nucl.AcidsRes.，19卯，3718:3777)、多胺或者聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides,1995，14:969)、或者金剛烷乙酸(Manoharan等人，TetrahedronLett"1995，36:3651)、棕櫚基部分(Mishra等人，Biochem.Biophys.Acta,l995，I264:229)、或者十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther"1996，277:923)。教導制備此類寡核苷酸綴合物的代表性美國專利已在上文列出。一般的綴合方案涉及合成在序列的一個或多個位置具有氨基接頭的寡核苷酸。隨后使用適當的偶聯劑或活化劑將氨基基團與綴合的分子反應。綴合反應可以用仍然綴合于固相支持體的寡核苷酸或者在切割寡核苷酸在溶液相之后進行。通過HPLC純化寡核苷酸綴合物通常提供純凈的綴合物。尤其優先使用膽固醇綴合物，因為該分子可以增加對肝細胞(正鏈RNA病毒如HCV感染的主要部位)的靶向。本公開描述了用于沉默PIK4CB表達、并因此阻止正鏈RNA病毒增殖和治療相關病癥的dsRNA的多種實施方案。雖然可以釆取多種形式來設計特定治療劑，但某些功能特征將從其它dsRNA組合物中區分出優選的dsRNA組合物。具體而言，檢測本領域技術人員可測定的所有特征例如好的血清穩定性、高效能、不誘導免疫反應、以及好的藥物樣行為來鑒定本發明優選的dsRNA。在一些情況中，并非所有這些功能方面都出現在優選的dsRNA組合物中。但本領域技術人員能夠優化這些變量以及其它變量來選擇本發明優選的化合物。本發明者們意識到了趨向于提供顯著改善的藥理學、免疫學和最終治療益處的化學修飾模式。研究這些模式以改善siRNA，但不考慮所選擇的靶序列。表3給出了優選用于表1或表2中列出的雙鏈體dsRNA的化學修飾模式。這些模式不是相互排斥的。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>F硫代磷酸酯鍵dT二脫氧胸腺嘧啶核苷2，OMe=RNA的2'-0-甲基修飾Py二嘧t定核苷酸Chol二膽固醇。"exo"指3，末端鍵，"endo，，意為核苷內部的鍵。uA或cA二指在UA或CARNA序列處，所述U或C受到所示的修飾。同樣情形應用于uG和uU。編碼RNAi試劑的栽體本發明的dsRNA也可以由細胞內的重組病毒載體在體內表達。本發明的重組病毒載體包含編碼本發明dsRNA的序列和用于表達dsRNA序列的任何適當啟動子。適當的啟動子包括例如U6或HIRNApolIII啟動子序列，以及巨細胞病毒啟動子。選擇其它適當的啟動子屬于本領域技術。本發明的重組病毒載體也可以包含在特定組織或者在特定胞內環境中用于表達dsRNA的可誘導或可調節的啟動子。使用重組病毒栽體體內向細胞遞送本發明的dsRNA將在下文進行更加詳細的討論。本發明的dsRNA可以由重組病毒載體表達為兩個分開的互補RNA分子，或者表達為具兩個互補區域的單個RNA分子。可以使用任何能夠接受待表達的dsRNA分子的編碼序列的病毒載體，例如衍生自腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、反轉錄病毒(例如慢病毒(LV)、彈狀病毒、鼠白血病病毒)、皰疹病毒等的載體。病毒載體的向性可以通過用其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原假型化載體、或者根據需要通過替換不同的病毒衣殼蛋白來進行修飾。例如，本發明的慢病毒載體可以用泡狀口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃伯拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白來假型化。可以通過將載體改造成表達不同衣殼蛋白血清型來將本發明的AAV載體制備成靶向不同細胞。例如，在血清型2基因組上表達血清型2衣殼的AAV載體稱為AAV2/2。可以將這種在AAV2/2載體中的血清型2衣殼基因替換成血清型5衣殼基因來產生AAV2/5載體。構建表達不同衣殼蛋白血清型的AAV栽體的技術為本領域中的才支術，參見，例如RabinowitzJE等人(2002)，JVirol76:791-801，其在此處以其整體引入作為參考。選擇適用于本發明的重組病毒載體、將表達dsRNA的核酸序列插入載體的方法、以及將病毒載體遞送至目的細胞的方法都為本領域技術。參見，例如DornburgR(1995),GeneTherap.2:301-310;EglitisMA(1988)，Biotechniques6:608-614;MillerAD(1990),HumGeneTherap.1:5-14;AndersonWF(1998)，Nature392:25-30和RubinsonDA等人，Nat.Genet.33:401-406，所述文獻在此處其整體引入作為參考。優選的病毒載體為衍生自AV和AAV的載體。在一個特別優選的實施方案中，本發明的dsRNA由包含例如U6或HIRNA啟動子、或者巨細胞病毒(CMV)啟動子的重組AAV載體表達為兩個分開的互補的單鏈RNA分子。表達本發明dsRNA的適當AV載體、構建重組AV載體的方法、以及將載體遞送入乾細胞的方法在XiaH等人(2002)，Nat.Biotech.20:1006-1010中進行了描述。表達本發明dsRNA的適當AAV載體、構建重組AV載體的方法、以及將載體遞送入乾細胞的方法在SamulskiR等人(1987)，丄Virol.61:3096-3101、FisherKJ等人(1996)，J.Virol,70:520-532、SamulskiR等人(1989)，J.Virol.63:3822-3826、美國專利號5，252，479、美國專利號5,139,941、國際專利申請號WO94/13788和國際專利申請號WO93/24641中進行了描述，所有文獻在此處以其整體引入作為參考。包含dsRNA的藥物組合物在一個實施方案中，本發明提供了包含如本文所述的dsRNA和可藥用載體的藥物組合物。在另一實施方案中，本發明包含dsRNA與另一活性主要成分的組合。包含dsRNA與活性主要成分的組合的藥物組合物用于治療與由正鏈RNA病毒感染介導的病理過程相關的疾病或病癥。將本發明的藥物組合物施用足夠抑制PIK4CB或PIK4CA基因的表達或活性的劑量。本發明者們已經確定，包含本發明dsRNA的組合物可以以令人驚訝的低劑量施用。每日每千克受試者體重施用5mg的dsRNA劑量足夠抑制或者阻止PIK4CB或PIK4CA基因。一般而言，組合中各dsRNA的適當劑量在每天每千克受試者體重0.01至5.0毫克的范圍，通常在每天每千克體重1微克至1毫克的范圍。藥物組合物可以每天施用一次，或者dsRNA可以在每天以適當間隔施用兩次、三次或者更多次的亞劑量、或者甚至通過控制釋放制劑連續注入或遞送。在那種情況中，每次亞劑量中含有的dsRNA必須相應地更小以便達到總的每日劑量。也可以混合劑量單位來遞送若干天，例如使用提供在若干天內持續釋放dsRNA的常規持續釋放制劑。在這個實施方案中，劑量單位含有相應的多個每日劑量。技術人員理解，一些因素會影響有效治療受試者所需的劑量和時間過程，其中包括但不限于疾病或病癥的嚴重性、以前的治療、受試者的整體健康和/或年齡、以及存在的其它疾病。此外，用治療有效量的組合物治療受試者包括單次治療或系列治療。對本發明包括的各個dsRNA的有效劑體內測試來進行，如本文其它地方所述。本發明者們認識到，由于多種原因，可能希望用兩種或多種dsRNA的組合來治療正鏈RNA病毒感染。一種dsRNA選自本發明的dsRNA，另一種dsRNA選自那些已知靶向正鏈RNA病毒自身的dsRNA。靶向HCV或HPV或其它正鏈RNA病毒的dsRNA可從現有技術的公開中鑒定。期望包含多于一種類型的dsRNA的本發明藥物組合物含有如本文所述的各dsRNA的劑量。dsRNA的組合可以在單個劑型的藥物組合物中一起提供。備選地，dsRNA的組合可以以分別的劑型提供，在這種情況下，所述分別的劑型可以同時或在不同時間施用，并且可能通過不同的方式。因此，本發明考慮了包含預期的本發明dsRNA組合的藥物組合物，并且其也考慮了旨在作為組合方案的一部分提供的單種dsRNA的藥物組合物。在后一種情況中，組合療法的發明因此為施用方法而非實體的組合物。在小鼠遺傳學的進展已經產生了大量研究多種人類疾病例如由HCV感染介導的病理過程的小鼠模型。此類模型用于體內測試dsRNA，以及用于確定治療有效量，和dsRNA的優選組合。可以使用任何方法來向含有感染了HCV的細胞的哺乳動物施用本發明的dsRNA。例如，施用可以是局部的(例如陰道的、經皮膚的等)、經口的或腸胃外的(例如，通過皮下、心室內、肌內或者腹膜內注射的，或者通過靜脈滴注)。施用可以是快速的(例如通過注射)，或者可以發生一段時間(例如通過緩慢輸注或者施用緩慢釋放制劑)。對于局部施用，可以將dsRNA分子制劑入組合物，所述組合物例如無菌和有菌的含水溶液、在常規溶劑例如醇中的非水溶液、或者在液態或固態油基質中的溶液。此類溶液也可以含有緩沖劑、稀釋劑和其它適當的添加劑。用于局部施用的組合物可以制劑成透皮貼劑、軟膏、洗劑、乳劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末的形式。凝膠劑和乳劑可以使用本領域已知的多聚物和透化劑來制備。對于腸胃外、鞘內或心室內的施用，可以將dsRNA分子制劑入組合物，例如無菌含水溶液，其也可以含有緩沖劑、稀釋劑和其它適當的添加42劑(例如穿透增強劑、載體化合物和其它可藥用栽體)。此外，可以使用非病毒方法向含有感染了正鏈RNA病毒的細胞的哺乳動物施用dsRNA，其中所述的方法例如美國專利號6，271，359中所述的生物學或非生物學方法。非生物學的遞送可以通過多種方法來實現，其中包括但不限于(l)加載具有本文提供的dsRNA酸性分子的脂質體，(2)復合dsRNA分子和脂類或脂質體以形成核酸-脂類或者核酸-脂質體復合體，或(3)提供基于治療遞送系統的多聚物、納米顆粒或納米乳劑。這些技術在其它文中一般是本領域熟知的。簡要描述如下。脂質體或脂類復合體可以包含通常用于體外轉染細胞的陽離子脂和中性脂。陽離子脂可以與負電荷的核酸復合來形成脂質體。陽離子脂質體的實例包括4旦不限于lipofectin、lipofectamine、lipofectace、DOTAP。形成脂質體的過程為本領域熟知。脂質體組合物可以例如由磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油或者二油酰磷脂酰乙醇胺形成。大量親脂試劑是商品化的，其中包括Lipofectin.RTM.(Invitrogen/LifeTechnologies,Carlsbad,Calif.)和Effectene.TM.(Qiagen，Valencia,Calif.)。此外，全身遞送方法可以使用商品化的陽離子脂例如DDAB或DOTAP來優化，其中所述的每種陽離子脂都可以與中性脂例如DOPE或膽固醇混合。在一些情況中，可以使用例如Templeton等人(NatureBiotechnology,15:647-652(1997))描述的那些脂質體。在一些實施方案中，劑量是完全包封入脂質體中的，例如在Morrissey等人，NatBiotechnol.2005年8月；23(8):1002-7.Epub2005年7月24日中描述的在SNALP中。也參見Wheder,J.J.等人，1999.GeneTher.6，271-281。在其它實施方案中，可以使用聚陽離子例如聚乙烯亞胺來完成體內和離體(exvivo)遞送(Boletta等人，J.AmSoc.Nephrol.7:1728(1996))。關于使用脂質體遞送核酸的額外信息可以在美國專利號6,271,359、PCT7>開WO96/40964和Morrissey,D等人，2005.NatBiotechnol.23(8):1002-7中找到。生物遞送可以通過多種方法實現，其中包括但不限于使用病毒載體。43例如，可以使用病毒載體(例如，腺病毒和皰滲病毒載體)將dsRNA遞送至皮膚細胞和宮頸細胞。可以使用標準的分子生物學技術將本文提供的一種或多種dsRNA引入到先前研發的用來向細胞遞送核酸的許多不同病毒載體之一。這些所得的載體可以用來通過例如感染將一種或多種dsRNA遞送至細胞。本發明的dsRNA可以制劑在可藥用載體或稀釋劑中。"可藥用載體"(本文也稱為"賦形劑")為可藥用溶劑、懸浮劑或者任何其它藥學惰性載體。可藥用載體可以是液態或固態的，并且可以用計劃的施用方法進行選擇來提供預期容積、一致性和其它適當的運輸和化學性質。一般的可藥用載體包括(通過舉例但不限于)水、鹽水溶液、粘合劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱基纖維素)、填充物(例如乳糖和其它糖類、明膠或者硫酸鈣)、潤滑劑(例如淀粉、聚乙二醇或者醋酸鈉)、崩解劑(例如淀粉或淀粉乙醇酸鈉)、以及濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)。此外，可以將靶向PIK4CB基因表達的dsRNA制劑入含有與其它分子(包括小分子治療劑)、分子結構或者核酸混合物混合、包被、綴合或者締合的dsRNA的組合物。例如，含有一種或者多種本發明的dsRNA試劑的組合物可以含有其它治療劑，例如抗炎藥物(例如，非留體抗炎藥和糖皮質激素)和抗病毒藥物(例如利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛維(acyclovir)和更昔洛韋(ganciclovir))。此類化合物的毒性和治療功效可以在細胞培養物或者實驗動物中通過標準藥物學方法測定，例如測定LD50(對群體的50%致死的量)和ED50(在50%群體中有效的量)。毒性作用和治療作用之間的劑量比率為治療指數，并且其可以表示為LD50/ED50的比率。優選顯示高治療指數的化合物。從細胞培養物測試和動物研究中獲得的數據可以用于人類用途的劑量范圍的制劑。本發明組合物的劑量通常在循環濃度的范圍內，其包括有極小或者沒有毒性的ED50。劑量可以在這個范圍內根據采用的劑型和使用的給藥途徑而變化。對于本發明方法中使用的任何化合物，治療有效量最初都可以用細胞培養物測試來評估。劑量可以在動物模型中配制來實現化合物或者根據需要的靶序列的多肽產物的循環血漿濃度范圍(例如，實現多肽濃度降低)，其中所述的濃度范圍包括在細胞培養物中測定的IC50(即達到癥狀最大抑制作用一半時受試化合物的濃度)。此類信息可以用來更加精確地測定在人中的有益劑量。在血漿中的水平可以例如通過高效液相色i普法測定。本發明的dsRNA除了如上文討論的單獨或者多種施用外，其可以與其它已知的有效治療由HCV感染介導的病理過程的藥劑聯合施用。在任何情況中，給藥醫師可以基于使用本領域已知或者如本文所述的標準功效測定，見察到的結果調整dsRNA的施用劑量和時間過程。dsRNA的聯合可以在體外和體內使用鑒定優選的單種dsRNA所采用的相同方法來測試。此類聯合可以完全基于生物信息學基礎進行選擇。備選地，可以基于按照本文所述的用于單種dsRNA試劑的方法進行的體外或體內評估來選擇此類聯合。測試dsRNA的聯合的優選測定法在以下實施例中的測定法中展示。治療由正鏈RNA病毒感染引發的疾病的方法本文所述的方法和組合物可以用于治療由正鏈RNA病毒感染(如HCV)引發的疾病和病癥，其中所述的疾病和病癥可能是臨床或亞臨床感染的結果。總的來說，治療由正鏈RNA病毒感染的方法包括給需要其的患者施用選擇性抑制磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)的活性的化合物。此類化合物可選自小分子、dsRNA、DNA的反義DNA、核酶、或編碼上述化合物的DNA載體。在肝臟中選擇PIK4CB和/或PIK4CA的小分子試劑對于治療正鏈RNA病毒感染的治療目的是相當有益的。此類疾病和病癥，本文有時稱為"由正鏈RNA病毒感染介導的病理過程"。HCV感染的主要肝病理結果是肝硬化和其并發癥，包括出血、肝功能不全和肝細胞癌。纖維樣變性是慢性炎癥的結果，所述慢性炎癥引起胞外基質組分的沉積作用，所述胞外基質組分使得肝的結構不正常，并且阻45斷了微循環和肝功能。隨著肝硬化發展和纖維樣組織聚集，接著就發生嚴重壞死炎癥作用并開始脂肪變性。脂肪變性導致肝外病理學，包括糖尿病、蛋白質營養不足、高血壓、細胞毒素、肥胖癥和缺氧癥。隨著纖維樣變性和脂肪變性變得嚴重時，肝臟將最終功能衰竭并需要肝臟移植。在本說明書中，"治療......的方法，，意指(以客觀或主觀的水平)治療、預防(預防性地針對)或降低一個或多個由該短語指定的疾病、失調或病癥的癥狀的方法。除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。雖然在本發明的實踐中或文描述了適當的方法和材料。本文提到的所有公開、專利申請、專利以及其它參考文獻都以其整體引入作為參考。在有爭議的情況下，以本說明書包括定義為準。此外，材料、方法和實施例僅用作說明，并不作為限制。實施例實施例1:dsRNA合成試劑來源當本文未特別給出試劑來源時，可以從任意分子生物學試劑供銷商處獲得應用于分子生物學的質量/純度標準的該試劑。siRNA合成單鏈RNA通過固相合成以l微摩爾的規模產生，其中使用Expedite8909合成儀(AppliedBiosystems,AppleraDeutschlandGmbH,Darmstadt,德國)和可控多孔玻璃(CPG，500A，ProligoBiochemieGmbH，Hamburg,德國)作為固相支持物。RNA和含有2'-0-曱基核苷酸的RNA分別采用相應的亞磷酰胺和2'-0-曱基亞磷酰胺通過固相合成產生(ProligoBiochemieGmbH,Hamburg,德國)。這些結構單元使用標準的核苷亞磷酰胺4匕學《列^口^口Currentprotocolsinnucleicacidchemistry,Beaucage，S.L.等人(編著)，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA,中所述而摻入寡核糖核苷酸鏈的序列中的選定位點。硫代磷酸酯鍵通過用Beaucage試劑(ChruachemLtd,Glasgow,UK)在乙腈(1%)中的溶液替換缺氧化劑溶液來引入。進一步的輔助試劑從MallinckrodtBaker(Griesheim，德國)獲得。粗制的寡核糖核苷酸的去保護和純化根據已建立的方法通過陰離子交換HPLC實施。產量和濃度通過使用分光光度計測定各RNA溶液在波長260nm處的UV^及收來確定(DU640B，BeckmanCoulterGmbH，Unterschleifiheim，德國)。雙鏈RNA通過在退火緩沖液(20mM磷酸鈉，pH6.8;100mM氯化鈉)中混合等摩爾的互補鏈溶液、在水浴中85-90°C加熱3分鐘、并在3-4小時的時間期間冷卻至室溫來產生。退火的RNA溶液儲存在-2(TC直至使用。為了合成3，-膽固醇-綴合的siRNA(本文稱為-Chol-3')，使用適當修飾的固體支持物來合成RNA。修飾的固體支持物如下制備2-氮雜丁烷-l,4-二羧酸二乙酯AA將4.7M氫氧化鈉水溶液(50mL)加入到經攪拌的冰冷的甘氨酸乙酯鹽酸鹽(32.19g，0.23mole)在水中的溶液(50mL)。然后，加入丙烯酸乙酯(23.1g,0.23摩爾)，并在室溫攪拌混合物直至通過TLC確^人反應完成。19小時之后，用二氯曱烷(3x100mL)分離溶液。有才幾層用無水碌^酸鈉干燥、并進行過濾和蒸發。蒸餾殘余物來提供AA(28.8g，61%)。3-{乙氧基羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基曱氧基羰基-氨基)-己酰基卜氨基}-丙酸乙酯AB<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>將Fmoc-6-氨基-己酸(9.12g，25.83mmol)溶解在二氯甲烷(50mL)中，并用冰冷卻。在0。C向溶液中加入二異丙基碳二亞胺(3.25g，3.99mL，25.83mmol)。然后加入氮雜丁烷-1，4-二羧酸二乙酯(5g，24.6mmol)和二曱氨基吡咬(0.305g，2.5mmol)。將溶液升溫至室溫，并進一步攪拌6小時。通過TLC確定反應完成。在真空下濃縮反應混合物，并加入乙酸乙酯沉淀二異丙基脲。過濾懸浮液。濾液用5%含水的鹽酸、5%的碳酸氫鈉和水洗滌。將合并的有機層用硫酸鈉千燥、并濃縮來產生粗產物，并通過柱層析(50%的EtOAC/己烷)純化來產生11.87g(88%)的AB。3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧基羰基甲基-氨基j-丙酸乙酯ACoAC在0°C將3-{乙氧基羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基曱氧基羰基氨基)-己酰基-氨基}-丙酸乙酯AB(11.5g，21.3mmol)溶解于20%在二曱基甲酰胺中的哌啶中。持續攪拌溶液l小時。在真空下濃縮反應混合物，并向殘余物添加水，并用乙酸乙酯提取產物。粗產物通過轉化成為其鹽酸鹽而進行純化。3-({6-17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7,8，9，10，11，12,13，14,15，16，17-十四氫-lH-環戊[aj菲-3-基氧基羰基氨基1-己酰基}乙氧基羰基甲基-氨基)-丙酸乙酯AD〇〇AD將3-(6-氨基-己酰基)-乙氧基羰基甲基-氨基卜丙酸乙酯AC的鹽酸鹽(4.7g，14.8mmol)溶解在在二氯曱烷中。將懸浮液在冰上冷卻至0°C。向懸浮液加入二異丙基乙胺(3.87g，5.2mL，30mmol)。向所得溶液加入氯甲酸48膽固醇酯(6.675g，14.8mmol)。攪拌反應混合物過夜。反應混合物用二氯曱烷稀釋、并用10%的鹽酸洗滌。產物通過快速層析純化(10.3^92%)。1-{6國[17-(1,5-二曱基-己基)-10，13曙二甲基-2，3,4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16,17-十四氫-111-環戊[3菲-3-基氧基羰基氨基-己酰基}-4-氧代-吡咯烷-3-甲酸乙酯AE<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula>將叔丁醇鉀(l.lg，9.8mmol)在30mL無水曱苯中淤漿化。混合物在水上冷卻至0°C,并伴隨攪拌在20分鐘內緩慢加入5g(6.6mmol)二酉旨AD。在加入期間溫度保持在5。C以下。繼續在0。C攪拌30分鐘，并加入lmL冰乙酸，隨后立即加入4g在40ml水中的NaH2P04'H20。所得混合物每次用100mL二氯甲烷提取，提取兩次，并且合并的有機提取物每次用10mL磷酸鹽緩沖液洗滌，洗滌兩次、干燥、并蒸發至干。將殘余物溶解在60mL甲苯中，冷卻至0。C，并用3份50mLpH9.5的冷碳酸鹽緩沖液提取。將含水的提取物用磷酸調整為pH3，并用5份40mL的氯仿提取，并合并，干燥和蒸發至干。殘余物通過柱色語用25%的乙酸乙酯/己烷純化來提供1.9gb-酮酯(b-ketoester)(39%)。菲-3-基氧基羰基氨基I-己酰基L吡咯烷-3-基)酯AH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>將化合物AG(1.0g，1.05mmol)與琥珀酐(0.150g，1.5mmol)和DMAP(0.073g,0.6mmol)混合，并在真空中40。C干燥過夜。將混合物溶解在無水的二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g，0.440mL，3.15mmol)，并在氬氣下室溫攪拌溶液16小時。然后將其用二氯甲烷(40mL)稀釋，并用水冷的含水檸檬酸(5wt%，30mL)和水(2x20mL)洗滌。將有機相用無水硫酸鈉干燥、并濃縮至干。殘余物原樣用于下一步。膽固醇衍生的CPGAI<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>將琥珀酸酯AH(0.254g，0.242mmol)溶解在二氯曱烷/乙腈(3:2，3mL)的混合物中。相繼向該溶液中加入在乙腈(1.25mL)中的DMAP(0.0296g，0.242mmol)和在乙腈/二氯乙烷(3:l，1.25mL)中的2,2，-二硫代-雙(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmol)。向所得溶液中加入在乙腈(0.6ml)中的三苯膦(0.064g，0.242mmol)。反應混合物變色為亮橙色。用手動振蕩器簡短攪拌溶液(5分鐘)。加入長鏈烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g，61mM)。攪拌懸浮液2小時。將CPG通過熱壓結的漏斗過濾，并相繼用乙腈、二氯曱烷和醚洗滌。用乙酸酐/吡啶封閉未反應的氨基。完成的CPG加載通過采用UV測試來測定(37mM/g)。除了對膽固醇基衍生物的氧化步驟用Beaucage試劑進行以在核酸寡聚物5，-端引入硫代磷酸酯鍵夕卜，帶有5，-12-十二烷酸二癸酰胺基(本文稱為"5，-C32-")或5'-膽固醇基衍生基團(本文稱為"5，-Chol-")的siRNA的合成如WO2004/065601中所述進行。實施例2:dsRNA表達栽體在本發明的另一方面，調節PIK4CB表達活性或PIK4CA表達活性的dsRNA分子由插入DNA或RNA栽體的轉錄單元表達(參見，例如Couture，A等人，TIG.(1996)，12:5-10;Skillern,A.等人，國際PCT公開號WO00/22113，Conrad,國際PCT公開號WO00/22114，和Conrad,美國專利號6,054,299)。這些轉基因可以作為線性構建體、環狀質粒、或者病毒載體引入，其可以摻入宿主基因組并作為整合入宿主基因組的轉基因遺傳。也可以將轉基因構建為允許其作為染色體外的質粒遺傳(Gassmann等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:1292)。dsRNA的各條鏈可以由在兩個分開的表達載體上的啟動子轉錄，并共轉染入靶細胞。備選地，dsRNA的每條分別的鏈可以通過都定位在同一表達質粒上的兩個啟動子轉錄。在一個優選的實施方案中，dsRNA表達為通過接頭多核苷酸序列連接的反向重復序列，如此以便dsRNA具有莖和環的結構。重組dsRNA表達栽體通常為DNA質粒或病毒載體。表達dsRNA的52病毒載體可以基于但不限于腺相關病毒(參見綜述Muzyczka等人，Curr.TopicsMicro.Immunol.(1992)158:97-129))、腺病毒(參見例如Berkner等人，BioTechniques(1998)6:616)，Rosenfeld等人(1991，Science252:431-434)，和Rosenfeld等人(1992)，Cell68:143-155))、或曱病毒、以及本領域已知的其它病毒構建。逆轉錄病毒已經用于在體外和/或體外將多種基因引入許多不同的細胞類型，其中包括上皮細胞(參見，例如Eglitis，等人，Science(1985)230:1395-1398;Danos和Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)85:6460-6464;Wilson等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3014-3018;Armentano等人，l朔，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6141-6145;Huber等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043;Ferry等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8377-8381;Chowdhury等人，1991，Science254:1802-1805;vanBeusechem.等人，1992,Proc.Nad.Acad.Sci.USA89:7640-19;Kay等人，1992，HumanGeneTherapy3:641-647;Dai等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10892-10895;Hwu等人，1993，丄Immunol.150:4104-4115;美國專利號4,868,116;美國專利號4,980,286;PCT申請WO89/07136;PCT申請WO89/02468;PCT申請WO89/05345;以及PCT申請WO92/07573)。能夠轉導和表達插入細胞基因組的基因的重組逆轉錄病毒載體可以通過將重組的逆轉錄病毒基因組轉染入適當的包裝細胞系例如PA317和Psi-CRIP來產生(Comette等人，1991,HumanGeneTherapy2:5-10;Cone等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6349)。重組的腺病毒載體可以用來感染易感宿主(例如大鼠、倉鼠、狗和黑猩猩)中大范圍的多種細胞和組織(Hsu等人，1992，J.InfectiousDisease,166:769),并且也具有不需要感染有絲分裂活性的細胞的優點。在本發明的DNA質粒或病毒載體中驅動dsRNA表達的啟動子可以是真核的RNA聚合酶I(例如核糖體RNA啟動子)、RNA聚合酶II(例如CMV早期啟動子或肌動蛋白啟動子或UlsnRNA啟動子)或者通常的RNA聚合53酶III啟動子(例如U6snRNA或7SKRNA啟動子)，或者原核啟動子，例如T7啟動子，條件是表達質粒也編碼由T7啟動子轉錄所需的T7RNA聚合酶。啟動子也可以指導轉基因表達至胰腺(參見例如用于胰腺的胰島素調節序歹'J(Bucchini等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2511-2515))。來精確調節，例如對某些生理調節劑例如循環的葡萄糖水平或激素敏感的調節序列(Docherty等人，1994，FASEBJ.8:20-24)。此類適合在細胞或哺乳素、孕酮、四環素、二聚作用的化學誘導劑、和異丙基-P-Dl-硫代吡喃半乳糖苷(EPTG)的調節。本領域技術人員能夠基于dsRNA轉基因的預期用途選擇適當的調節/啟動子序列。一般而言，能夠表達dsRNA分子的重組載體如下文所述進行遞送，并保持在靶細胞中。備選地，病毒栽體可以用來提供dsRNA分子的瞬時表達。此類載體可以根據需要反復施用。一旦表達，dsRNA就結合至耙RNA，并調節其功能或表達。dsRNA表達載體的遞送可以是全身的，例如通過靜脈內或肌內的施用，通過施用至自患者移出體外的靶細胞、并隨后將粑細胞重新引入患者，或者通過任意其它允許引入目的靶細胞的方法。表達dsRNA的DNA質粒一般以與陽離子脂質載體(例如Oligofectamine)或基于非陽離子脂類的載體(例如Transit-TKOTM)的復合體轉染入靶細胞。本發明也考慮了在一周或更長時間期間進行dsRNA介導的敲低的多次脂類轉染，靶向PIK4CB基因的不同區域。向宿主細胞中成功引入本發明的載體可以使用多種已知方法來監測。例如，瞬時轉染可以用報告基因作為信號，其中所述的報告基因例如熒光標記物，例如綠色熒光蛋白(GFP)。離體(exvivo)細胞的穩定轉染可以用提供經轉染細胞對特定環境因素(例如抗生素和藥物)的抗性例如潮霉素B抗性的標記物來確4呆。PIK4CB和PIK4CA特異的dsRNA分子也可以插入載體，并用作人類患者的基因治療載體。基因治療載體可以通過例如靜脈內注射、局部施用(參見美國專利5，328，470)或者通過立體定位(stereotactic)注射(參見，例如Chen等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057)來遞送至受試者。基因治療載體的藥物制品可以包括在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或者可以包含埋入了基因遞送運載體的緩慢釋放基質。備選地，當完整的基因遞送運載體能夠完全由重組細胞產生時，其中所述完整的基因遞送運載體例如逆轉錄病毒載體，藥物制品可以包括一種或多種產生基因遞送系統的細胞。實施例3:鑒定PIK4CB和PIK4CA為HCV感染的必需宿主革巴基于siRNA遞送系統的大規模轉染用于鑒定PIK4CB靶和PI4KCA革巴。以前對該系統的描述(BorawskiJ,LindemanA，BuxtonF,LabowM,GaitherLA.在384孔形式中優化小干擾RNA轉染的方法，JBiomolScreen.2007年6月；12(4):546-59.Epub2007年4月13日)在此處引用作為參考。在這種情況下，該系統使用經設計的HCV亞基因組復制子系統旨在鑒定對HCV復制必需的宿主蛋白質。使用激酶組(即，人類基因組的已知的激酶(Dharmacon(BoulderCO)))siRNA文庫篩選Huh7亞基因組復制子細胞系(由Lohmann,V.等人(1999)Science.285:110描述)。該HCV亞基因組復制子系統允許使用穩定轉染了修飾的HCV基因組(缺少結構蛋白質)的人類肝癌細胞(Huh7)來體外和體內研究HCV復制。HCV亞基因組復制子含有在新霉素選擇標記下的與螢光素酶報告基因順式的非結構蛋白基因。這種構建體設計用來體外穩定測量HCV復制子RNA水平和復制子活性。該研究的目的是使用siRNA篩選技術作為工具來鑒定新的在Huh7細胞中抑制亞基因組HCV復制子的宿主蛋白質。為此，篩選了一組779個靼向激酶組的siRNASmartPools,并發現和證實了HCV復制子的新的調節子。(SmartPool指以等摩爾濃度混合4種分別的siRNA，之后添加所述混合物到細胞)。確定了針對PIK4CB(磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽)或針對PIK4CA(磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽)的siRNA能高效地抑制來自病毒復制子的螢光素酶的聚集。這些數據證實這種細胞蛋白質可用作抑制HCV復制的藥物靶點。Huh7亞基因組復制子細胞系(本文也稱為克隆A細胞)的構建是基于HCV基因組的。全長HCV基因組圖解于圖1A中。該9.6kb基因組是具有4種結構蛋白質和6種非結構蛋白質的正單鏈RNA病毒。復制子的突出特征是有效的復制子活性所需的5'和3，非翻譯區。這種病毒能在體外復制，但需要特定的培養和i殳備才能產生感染病毒(ThomsonBJ，FinchRG.丙型肝炎病毒感染.ClinMicrobiolInfect.2005Feb;ll(2):86-94)。因此，將感染病毒改變以產生最小的病毒基因組，所述最小的病毒基因組能在不依賴產生感染顆粒的情況下體外復制。構建體顯示于圖IB中，HCV亞基因組復制子用于產生克隆A細胞(LohmannV,KornerF，KochJ，HerianU,TheilmannL，BartenschlagerR.，在肝癌細胞系中復制亞基因組的丙型肝炎病毒RNA，Science.1999年7月2日；285(5424):110-3)。在人類肝臟細胞中，這種病毒被高度優化以體外獲取HCV復制子活性。該病毒不能產生感染性病毒顆粒，但是能在細胞漿中自我復制，這使它易于進行細胞培養研究以及高通量篩選。結構蛋白基因已用新霉素抗性基因和用于測量復制子活性的螢火蟲螢光素酶報告基因替代。克隆Ar構建體由與亞基因組病毒相同的主鏈構成，但是已經移除了結構蛋白質(圖1C)。這種細胞系用于測試siRNA是否能非特異地抑制螢光素酶活性或表達。將針對779種系統發育相關激酶的siRNASmartPool轉染入克隆A(HCV亞基因組復制子)細胞中。針對pGL2螢光素酶的siRNA雙鏈體用作陽性對照以抑制螢光素酶活性。細胞轉染72小時，并使用Bright-Glo螢光素酶測定法來測量螢光素酶活性(BorawskiJ，LindemanA，BuxtonF，56LabowM，GaitherLA.在384孔形式中優化小干擾RNA轉染的方法，JBiomolScreen.2007年6月；12(4):546陽59.Epub2007年4月13日)。發現了幾種siRNA是螢光素酶活性的有效抑制劑，所述siRNA包括那些草巴向PIK4CB(NM—002651)和PIK4CA(NM—002650)的庫。實施例4:PIK4CB和PIK4CAsiRNA活性的確認和測定來自篩選的命中目標的siRNA(siRNAhits)的確認通過一系列的步驟來完成，所述步驟包括分析多個獨立的基因特異性siRNA，和將表型活性siRNA與mRNA敲低的效率相關聯。為了首先確認命中目標的siRNA的特異性，測試了多個序列獨立的siRNA的抑制螢光素酶活性的能力和不能影響細胞生存力這兩者。也在克隆Ar(如圖lc中與克隆A相似但缺少結構蛋白質)細胞中測試命中目標的siRNA以確認siRNA特異耙向復制子蛋白質和以復制子獨立方式不抑制螢光素酶活性(或表達)。接下來的步驟是表型和RTPCR確認。分析了4個針對PIK4CB的獨立siRNA和4個針對PIK4CA的獨立siRNA敲低復制子活性的能力、對細胞生存力的影響和敲低靶基因mRNA水平的能力。該實施例中4吏用的siRNA示于表1和表2中。圖2顯示在克隆A測定中耙向PIK4CB和PIK4CA的dsRNA的結果。測試dsRNA的結果表示為分別的雙鏈體PIK4CA1-PIK4CA4(柱1-4)、表示為PIK4CASmartPool(柱5)、表示為分別的雙鏈體PIK4CB1-PIK4CB4(柱6-9)或表示為PIK4CBSmartPool(柱10)。轉染細胞72個小時，并使用Bright-Glo螢光素酶測定法來測量螢光素酶活性(BorawskiJ，LindemanA,BuxtonF,LabowM，GaitherLA.在384孔形式中優化小干擾RNA轉染的方法.JBiomolScreen.2007年6月；12(4):546-59.Epub2007年4月13日)。結果相對于GAPDH(對照；柱11)來測量，使用每孔25nM的dsRNA、克隆A細胞進行測定；Bright-Glo活性測量在轉染后72小時進行。靼向GAPDH(柱ll)的dsRNA用作陰性對照和耙向pGL2(柱12)的dsRNA是陽性對照。圖2的結果顯示，相對于GAPDH而言，針對PIK4CB或PIK4CA的dsRNA能在克隆A細胞中降低至少20%和多達大約卯％的HCV復制子的表達(通過螢光素酶表達測量)。多種中間活性物得到了鑒定。其它數據證實，該測定法的dsRNA不阻礙細胞生存力，所述dsRNA也對克隆Ar測定法中的細胞不顯示出顯著的非特異性作用(數據沒有顯示)。圖3A和圖3B證實靼向PIK4CA的dsRNA對PIK4CA而非PIK4CB特異。圖3C和圖3D證實乾向PIK4CB的dsRNA對PIK4CB而非PIK4CA特異。使用實時PCR產生了圖3的結果。在該方法中，將轉染了siRNA的兩孔合并在一起，并使用RNeasy96試劑盒(Qiagen#74182)分離mRNA。將制備物用DNA酶I處理兩次、每次15分鐘。使用HighCapacitycDNAArchive試劑盒(AppliedBiosystems#4322171)產生cDNA，并使用OligodT25(SigmaGenosys)引發RNA。補充有MgCl2(Ambion弁9530g)的PCR緩沖液(RocheM699105)如下10nll0x緩沖液、0.55^11MMgCl2、50uMoligodT25、4^1lOOmMdNTPs、lpl20U/plRNasIn、5|ul50，Multiscribe、12.45|il水、和66plRNA,總體積為lOOpl。使用內部設計的引物、(SigmaGenosys)使用Sybergreen在AppliedBiosystems7900HT(AppliedBiosystems#4329001)中對cDNA進行定量，PIK4CA(匪002650)正向GCCCTGTCTGAAGTGAAGGT，SEQIDNo.:417反向CTTTTGCAGCACTCTGCATC，SEQIDNo.:418在1662處跨過在1690處的內含子3006bp;在1774處，反向跨過在1690處的內含子3006bp;使用內部設計的針對PIK4CB(NM—002651)的引物、(SigmaGenosys)使用Sybergreen在AppliedBiosystems7900HT(AppliedBiosystems#432卯01)中對PIK4CB進4亍測量正向ATGGACAAGGTGGTGCAGATSEQIDNo.:419反向CCTCAGTCATGCTCATGTGGSEQIDNo.:420在2334到2452處跨過在2374處的內含子981bp。圖3中，符號"sp"指術語SMARTpool。所述SMARTpool指在添加該混合物到細胞中前以等摩爾濃度混合4種分別的siRNA。在一個SMARTpool中，4種分別的siRNA以較低的相對濃度加入(即，50nM等摩爾濃度是SMARTpool中12.5nM的各分別的siRNA的濃度)。使用另一組針對PIK4CA(NM—002650，Dharmacon^D-006776)和PIK4CB(NM一002651，Dharmacon弁D-006777)的3種單獨雙鏈體來實現對靼的進一步確認。使用的siRNA如表1和表2中顯示。各siRNA重懸于siRNA緩沖液中(Dharmacon,#B-002000-UB-015)以達到20pM的儲備濃度。在96孔PCR板中，將2.5各儲備溶液稀釋到197.5Opti-Mem中以制備250nM工作液。將稀釋于10juLOpti-Mem的0.20Dharmafectl轉染試劑(Dharmacon,#T2001-03)加入96孔組織培養板(Costar，#3917)的各孔中。將10各siRNA工作液加入含有Dharmafectl的96孔板，并賻育20分鐘以允許復合物形成。孵育后，將80測定培養基中的6000個Huh7HCV亞基因組復制子細胞加入每孔。孵育細胞72小時，并測定螢光素酶活性和細胞存活能力(如此前對圖2的描述)。圖4中，依據廠商說明書使用Taqman基因表達測定法(TaqmanGeneExpressionAssay)(AppliedBiosystems)驗證各siRNA。長口前戶斤述,在96孔形式中，將siRNA轉染入Huh7HCV亞基因組復制子細胞。使用RNeasy96試劑盒(Qiagen，#74182)分離mRNA。將重復孔的mRNA合并在一起，并使用SprintPowerscriptPreprimed96PlateOligo(dt)(ClontechLaboratories,#639557)來產生cDNA。在384孔形式中，使用預混合的Taqman探針和來自AppliedBiosystems的引物((PIK4CA(NM—002650，AppliedBiosystems#Hs01021073ml);PIK4CB(NM—002651，AppliedBiosystems#Hs00356327—ml))來定量cDNA。向384孔PCR板中每孔加入4.8cDNA(AppliedBiosystems,#4309849)。向每孑L的cDNA中加入0.6^L針對目標基因(GOI)的Taqman探針、0.6pLp-肌動蛋白對照探針(AppliedBiosystems,#4310881E)和62xPCRMasterMix(AppliedBiosystems,#4304437)。在AppliedBiosystems7900HT實時PCR系統(AppliedBiosystems,#432卯01)中運行反應。在圖4A中，用PI4KAsiRNA轉染細胞，并使用PI4KARTPCRTaqman探針和PI4KBRTPCRTaqman探針這兩者來測量mRNA。在圖4B中，用PI4KBsiRNA轉染細胞，并使用PI4KARTPCRTaqman探針和PI4KBRTPCRTaqman探針這兩者來測量mRNA。如圖所示，所述siRNA特異地敲低了它們所指向的靶，并且沒有交叉反應和抑制其它PI4KmRNA轉錄物或對照(GAPDH)。實施例5:抑制宿主和病毒蛋白質的表達在圖5中，全細胞裂解物制備自轉染了siRNA的Huh7HCV亞基因組復制子細胞或僅制備自稚細胞。圖5中的結果使用的siRNA如表1和表2中那樣命名。在每10ml裂解液含一片蛋白酶混合抑制劑片(Roche,#04693116001)的放射免疫沉淀緩沖液(RIPA)(BostonBioproducts，#BP-115)中裂解細胞。裂解物#^居廠商說明書，使用BCA蛋白質測定法(PierceBiotechnology,#23227)進行定量。等量裂解物上樣于15%Tris-HCL凝膠(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA，#345-0019),并200V運行1小時。將凝膠轉移至硝酸纖維素膜(Bio-RadLaboratories,#162-0232)100V1小時。將膜在5%奶(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA，#162-0232)、TBS-0.1。/。吐溫(Bio-RadLaboratories,#170-6435，#161-0787)中封閉1小時。使用1:1000稀釋于封閉緩沖液中的針對PIK4CB的小鼠單克隆抗體(BDBiosciences,#611817)或針對HCV蛋白質NS3的小鼠單克隆抗體60(Virostat，#1828)和作為上樣對照的針對P-肌動蛋白的小鼠單克隆抗體(Sigma，St.Louis,MO，^A-5441)探測印跡1小時(針對PIK4CA的抗體未能獲得)。用TBS-0.1%吐溫(TBST)連續洗滌3次后，加入1:5000稀釋于封閉緩沖液中的針對小鼠IgG的HRP-綴合的二次抗體(Sigma，#A4416)1小時。將該膜在TBST中洗滌3次，并使用SuperSignalWestFemto化學發光底物(Pierce,#34096)來顯示免疫反應條帶。由于PI4KA抗體未能獲得，所以圖5中僅檢測了PI4KB蛋白質。圖5中的結果顯示，在Huh7細胞中，PI4KAsiRNA對PI4KB蛋白質水平沒有影響，但是PI4KBsiRNA切除了PI4KB蛋白質。各測試的siRNA也顯示出可測量的相對于對照而言的NS3(病毒)蛋白質產生的降低，因此確認對病毒復制能力的直接活性。使用與蛋白質敲低相關聯的這些siRNA降低mRNA水平暗示這些人類蛋白質是HCV復制必需的。實施例6:使用短發夾RNA(shRNA)進行確認在圖6中，訂購的耙向PIK4CA(NM—002650)和PIK4CB(NM—002651)的短發夾RNAs(shRNA)為5種單獨的SigmaMISSIONTMshRNA。耙向CD38(NM000732)、CD28(NM—006139)、CD29(NMJB3666)和GFP(U76561)的shRNA用作對抑制HCV復制的陰性對照(僅顯示GFP數據)。所有shRNA序列如人類文庫MISSIONtmTRC-Hsl.O.(人類)中的方式進行構建(MoffatJ.等人，針對人和小鼠基因的慢病毒RNAi文庫用于排列的病毒的高容量篩選，Cdl,124，1283-1298.2006.;Stewart,S.A.等人，在原代細胞中通過RNAi進行慢病毒遞送的穩定基因沉默，RNA，9,493-501(2003);ZuffereyR等人，體內繁殖減毒的慢病毒栽體達到有效的基因遞送，Nat.Biotechnol.15,871-85(1997).;ZuffereyR等人，用作安全和有效的體內基因遞送的自失活慢病毒載體，JVirol.,72，9873-80(1998))。該shRNA序列是與前述實驗報道的siRNA不同的獨立序列。表4顯示了對應于表達的RNA鏈的DNA序列。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>為了測試shRNA，將6000個Huh7HCV亞基因組復制子細胞鋪板于96孔組織培養板中。第二天，培養基用下述轉導培養基替代，所述轉導培養基含具有終濃度為8ug/ml的1，5-二曱基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(sigmaH9268)和終濃度為10mM的hepes(Invitrogen，#15630080)的測定培養基。將1shRNA病毒加入每孔，并將細胞在2100轉/分鐘室溫離心90分鐘。將細胞孵育24小時，并通過添加終濃度為2pg/ml的噤呤霉素(Sigma，#P9620)來選擇細胞。然后，將細胞最少孵育72小時，并測定表型、通過蛋白質印跡和RT-PCR進行分析或增殖用于長期敲低研究。在圖6A中，通過螢光素酶活性來測量HCV復制子表達，并歸一化為轉導細胞的GAPDHshRNA。使用PI4KATaqman探針(圖6B)或PI4KBTaqman探針(圖6C)的RTPCR來測量shRNA轉導后的Huh7細胞中的PI4KA和PI4KBmRNA水平。使用與實施例5中相似的那些蛋白質印跡方法來測定PI4KB蛋白質水平和NS3蛋白質水平。在shRNA轉導96小時后(圖6D)和3周時(圖6E)測量蛋白質水平。圖6A中的結果顯示涉及PI4KA或PI4KBshRNAs的shRNA能降低HCV復制子活性，所述結果通過螢光素酶活性測量并歸一化為GAPDHshRNA轉導細胞。圖6B顯示處理后PI4KAmRNA的相對水平。針對PI4KA的shRNA顯示出相當大程度的敲低，然而僅一個耙向PI4KB的shRNA對PI4KA水平具有影響(大概由于高拷貝數和與PI4KA的低交叉反應性)。圖6C顯示針對PI4KA的shRNA對PI4KBmRNA水平沒有影響，然而大多數耙向PI4KB的shRNA具有顯著的PI4KB的敲低。圖6D顯示處理后96小時，針對PI4KA或PI4KB的shRNA成功地降低了NS3病毒蛋白質產生(且PI4KAshRNA并不下調PI4KB蛋白質水平)。圖6E中的結果顯示病毒蛋白質產生的敲低可持續至少3周。總而言之，PI4KAmRNA降低和NS3蛋白質水平之間存在明顯的相關性，所述相關性表明細胞中的病毒載量受到了抑制。PI4KBmRNA和蛋白質降低和NS3蛋白質水平之間存在明顯的相關性，所述相關性表明細胞中的病毒載量受到了抑制。實施例7:活病毒感染前或感染后的處理在這個實施例中，通過使用針對PIK4CA或PIK4CB的s股NA處理HCV感染前細胞(圖7)或HCV感染后細胞(圖8)來達到HCV復制的有效抑制。這個實施例也證實了mRNA敲低的劑量依賴。就這個實驗而言，將針對PIK4CA和PIK4CB的siRNA(如表1和表2中所示的那樣)重懸于siRNA緩沖液(Dharmacon,#B-002000-UB-015)中至20pM的儲備濃度。在96孔PCR板(ABgene，#AB-1000)中，將3JUL各儲備溶液稀釋到197pLOpti-Mem中以制備300nM工作液。將siRNA在Optimem(InvitrogenCat#51985-034)中稀釋為10x儲液形式，并加入完全細胞培養基至25nM、1.5nM和O.lnM的終濃度。將0.20|uL的Dharmafectl轉染試劑(Dharmacon,#T2001-03)稀釋到10pLOpti-Mem中，并將其加入96孔組織培養板(Costar，#3917)的各孔中。將10各siRNA工作液加入含Dharmafectl的96孔板中，并孵育20分鐘以允許復合物的形成。孵育后，將在100jaL測定培養基中的10000個Huh7.5細胞加入每孔中。孵育細胞24小時，然后用含海腎報告基因的JFH-1感染性HCV基因型2病毒進行感染。針對海腎的siRNA用作抑制海腎螢光素酶的陽性對照。活病毒感染前轉染siRNA(圖7)或病毒感染63后轉染siRNA(圖8)顯示siRNA可阻斷HCV病毒的攝取和復制這兩者。收集一段時程的病毒上清來測量分泌自細胞的活病毒，這一點通過重新感染稚細胞的百分比來測定(圖8B)。Huh7細胞中敲低的mRNA百分比通過RTPCR來確定(圖7B)。我們使用了Huh7HCV復制子siRNA篩選，其中所述Huh7HCV復制子siRNA篩選鑒定了幾種新的宿主因子，所述宿主因子對最佳復制子驅動的螢光素酶活性是必需的。這種篩選用于證實所述發現。這種篩選不直接測量病毒復制，而是認為螢光素酶表達水平是直接由病毒復制子的拷貝數決定的。圖解于圖7和圖8中的實驗表明此處描述的活性siRNA確實導致病毒RNA產生的降低。根據SmartPool激酶組篩選，已鑒定PIK4CB和PIK4CA為HCV和其它正鏈RNA病毒復制所必需的宿主因子。多種獨立的靶向基因的siRNA可顯著地降低螢光素酶水平，而對復制子細胞的細胞生存力沒有影響。降低螢光素酶水平的siRNA也抑制各自靶基因的mRNA水平。因此，我們可以得出以下結論該研究中使用的siRNA是達到目標的，并通過降低它們的耙細胞基因來顯著地調節HCV復制。不期望被任何具體的作用機制束縛來解釋我們的發現，很明顯這些發現的意義是多重的。PIK4酶類是內質網和高爾基體區室中的磷脂酰肌醇4磷酸產生所需要的。磷脂酰肌醇4磷酸的產生對維持高爾基體完整性、自高爾基體和內質網膜芽出小泡和調節肌醇1，4，5三磷酸的產生是需要的，所述肌醇1，4，5三磷酸是產生自中間物肌醇4,5二磷酸的必需信號分子(GodiA,PertileP，MeyersR，MarraP，DiTullioG,IurisciC，LuiniA,CordaD,DeMatteisMA.ARF介導磷脂酰肌醇4羥基激酶|5的招募和在高爾基體復合體上刺激磷脂酰肌醇4,5二石粦酸的合成，NatCellBiol.1999年9月；l(5):280-7)。雖然本文中的發現不期望被任何具體的作用機制束繂，但是基于HCV復制復合物的定位，可能能夠將PIK4酶的活性與HCV復制聯系起來。如果復制復合物需要完整的高爾基體和內質網膜，那么破壞PIK4酶和磷脂酰肌醇4磷酸產生可能會阻斷合適的復制環境的形成。同時，已知PIK4酶調節神經酰胺和膽固醇通過高爾基體和內質網膜的運輸和輔助脂我的形成(TothB，BallaA，MaH，KnightZA，ShokatKM，BallaT.，磷脂酰肌醇4-激酶調節神經酰胺在內質網和高爾基體之間的運輸，JBiolChem.2006年11月24日；281(47):36369-77)。HCV復制復合物4艮可能需要脂膜筏來獲得其有效活性。如果PIK4敲低也干擾了膽固醇和神經酰胺運輸，那么其也可在抑制HCV復制中起作用(RidsdaleA，DenisM，GougeonPY，NgseeJK，PresleyJF，ZhaX，膽固醇對分泌性膜蛋白質的有效內質網到高爾基體運輸是需要的，MolBiolCell.2006年4月；17(4):1593-605.)。最后，已鑒定了許多含有PIP(4，5)特異的PH結構域的蛋白質，并且這類蛋白質的定位似乎受PIK4酶調節。因此，PIK4的作用可能也包括重新定向細胞蛋白質或病毒蛋白質至復制部位。總而言之，我們已鑒定PIK4CB和PIK4CA是HCV復制所需的人宿主因子酶類，以及耙向這些基因的dsRNA是治療HCV和其它正鏈病毒感染的合適治療靶。本領域技術人員熟悉除本公開具體給出的那些方法和組合物以外的方法和組合物，這使得他們能夠在后文所附的權利要求書的全部范圍內實踐本發明。權利要求1.用于在細胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PI4K的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的互補區域長度短于30個核苷酸，并且其中所述dsRNA與表達所述PI4K基因的細胞接觸后，抑制所述PI4K基因的表達。2.權利要求1所述的dsRNA,其中所述第二序列包含基本互補于編碼人磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)的至少部分mRNA的序列。3.4又利要求2所述的dsRNA，其中所述第一序列和所述第二序列選自表l。4.權利要求2所述的dsRNA,其中所述dsRNA包含至少一個經f務飾的核苷酸。5.權利要求3所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一個經纟務飾的核苷酸。6.權利要求4或5所述的dsRNA,其中所述經修飾的核苷酸選自2，-0-甲基修飾的核苷酸、包含5，-硫代磷酸酯基團的核苷酸、和連接至膽固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基的末端核苷酸。7.^L利要求4或5所述的dsRNA，其中所述經-f'務飾的核苷酸選自2，-脫氧-2，-氟修飾的核苷酸、2'-脫氧修飾的核苷酸、鎖核苷酸、脫堿基的核苷酸、2，-氨基修飾的核苷酸、2，-烷基修飾的核苷酸、嗎啉基核苷酸、包含氨基磷酸酯的核苷酸、和包含非天然堿基的核苷酸。8.權利要求4或5所述的dsRNA，其中所述第一序列選自表l，并且所述第二序列選自表l。9.權利要求1所述的dsRNA，其中所述反義鏈包含基本互補于編碼人磷脂酰月幾醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)的至少部分mRNA的序列。10.權利要求9所述的dsRNA,其中所述第一序列和所述第二序列選自表2。11.4又利要求9所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一個經4務飾的核苷酸。12.權利要求10所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一個經修飾的核苷酸。13.權利要求11或12所述的dsRNA，其中所述經修飾的核苷酸選自2，-0-甲基修飾的核苷酸、包含5，-硫代磷酸酯基團的核苷酸、和連接至膽固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基的末端核苷酸。14.權利要求11或12所述的dsRNA,其中所述經修飾的核苷酸選自2，-脫氧-2，-氟修飾的核苷酸、2，-脫氧修飾的核苷酸、鎖核苷酸、脫堿基的核苷酸、2，-氨基修飾的核苷酸、2，-烷基修飾的核苷酸、嗎啉基核苷酸、包含氨基磷酸酯的核苷酸、和包含非天然堿基的核苷酸。15.權利要求11或12所述的dsRNA，其中所述第一序列選自表2，并且所述第二序列選自表2。16.包含權利要求1或9所述dsRNA的細胞.17.用于在生物體中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)基因表達的藥物組合物，其包含dsRNA和可藥用載體，其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PIK4CB的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的互補區域長度短于30個核苷酸，并且其中所述的dsRNA與表達所述PIK4CB基因的細胞接觸后，至少10%抑制PIK4CB的表達。18.權利要求17所述的藥物組合物，其中所述dsRNA的所述第一序列選自表1，并且所述dsRNA的所述第二序列選自表1。19.權利要求18所述的藥物組合物，其中所述dsRNA包含至少一個經修飾的核苷酸。20.用于在生物體中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)基因表達的藥物組合物，其包含dsRNA和可藥用載體，其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PIK4CA的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的互補區域長度短于30個核苷酸，并且其中所述的dsRNA與表達所述PIK4CA基因的細胞接觸后，至少10%抑制PIK4CA的表達。21.4又利要求20所述的藥物組合物，其中所述dsRNA的所述第一序列選自表2并且所述dsRNA的所述第二序列選自表2。22.4又利要求22所述的藥物組合物，其中所述dsRNA包含至少一個經修飾的核苷酸。23.用于在細胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)基因表達的方法，所述方法包括(a)向細胞中引入雙鏈核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PIK4CB的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的互補區域長度短于30個核苷酸，并且其中所述的dsRNA與表達所述PIK4CB基因的細胞接觸后，至少40%抑制所述PIK4CB的表達；和(b)維持步驟(a)產生的細胞一段足夠的時間，以獲得PIK4CB基因的mRNA轉錄物的降解，從而在細胞中抑制PIK4CB基因的表達。24.用于在細胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CA)基因表達的方法，所述方法包括(a)向細胞中引入雙鏈核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PIK4CA的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的互補區域長度短于30個核苷酸，并且其中所述的dsRNA與表達所述PIK4CA基因的細胞接觸后，至少40%抑制所述PIK4CA的表達；和(b)維持步驟(a)產生的細胞一段足夠的時間，以獲得PIK4CA基因的mRNA轉錄物的降解，從而在細胞中抑制PIK4CA基因的表達。25.治療由正鏈RNA病毒感染介導的病理過程的方法，所述方法包括向需要此種治療、預防或管理的患者施用治療有效量或預防有效量的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述笫二序列包含基本互補于編碼磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的互補區域長度短于30個核苷酸，并且其中所述的dsRNA與表達PIK4CB基因的細胞接觸后，抑制PIK4CB的表達。26.權利要求25所述的方法，其中所述正鏈RNA病毒選自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)和登革病毒。27.治療由正鏈RNA病毒感染介導的病理過程的方法，所述方法包括向需要此種治療、預防或管理的患者施用治療有效量或預防有效量的dsRNA,其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼磷脂酰月幾醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的互補區域長度短于30個核普酸，并且其中所述的dsRNA與表達PIK4CA基因的細胞接觸后，抑制PIK4CB的表達。28.權利要求27所述的方法，其中所述正鏈RNA病毒選自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)和登革病毒。29.抑制磷脂酰肌醇4-激,化性p多肽(PIK4CB)基因在細胞中表達的載體，所述載體包含有效連接至編碼dsRNA的至少一條鏈的核普酸序列的調節序列，其中所述dsRNA的一條鏈基本互補于編碼PIK4CB的至少部分mRNA,并且其中所述dsRNA長度短于30個堿基對，并且其中所述dsRNA與表達PIK4CB基因的細胞接觸后，抑制PIK4CB的表達。30.包含權利要求29所述載體的細胞。31.抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)基因在細胞中表達的載體，所述載體包含有效連接至編碼dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列的調節序列，其中所述dsRNA的一條鏈基本互補于編碼PIK4CA的至少部分mRNA，并且其中所述dsRNA長度短于30個堿基對，并且其中所述dsRNA與表達PIK4CA基因的細胞接觸后，抑制PIK4CA的表達。32.包含權利要求31所述載體的細胞。33.用于在細胞中降低磷脂酰肌醇4-激酶催化性p多肽(PIK4CB)基因表達水平的雙鏈核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PIK4CB的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的dsRNA與表達PIK4CB基因的細胞接觸后，降低PIK4CB的表達水平。34.權利要求33所述的dsRNA,其中所述的接觸至少40%降低PIK4CB的表達水平。35.權利要求33所述的dsRNA，其中所述的接觸在體外以30nM或更低進行。36.用于降低生物體中PIK4CB的表達水平的藥物組合物，其包含權利要求33所述的dsRNA和可藥用載體。37.治療正鏈RNA病毒感染的方法，所述方法包括向需要此種治療的患者施用治療有效量的權利要求33所述的dsRNA。38.權利要求37所述的方法，其中所述正鏈RNA病毒選自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)和登革病毒。39.用于在細胞中降低磷脂酰月幾醇4-激酶催化性a多肽(PIK4CA)基因表達水平的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，并且其中有義鏈包含第一序列，且反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PIK4CA的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述的dsRNA與表達PIK4CA基因的細胞接觸后，降低PIK4CA的表達水平。40.權利要求39所述的dsRNA，其中所述的接觸至少40%降低PIK4CA的表達水平。41.沖又利要求39所述的dsRNA,其中所述的接觸在體外以30nM或更低進行。42.用于降低生物體中PIK4CA的表達水平的藥物組合物，其包含權利要求39所述的dsRNA和可藥用載體。43.治療正鏈RNA病毒感染的方法，所述方法包括向需要此種治療的患者施用治療有效量的權利要求39所述的dsRNA。44.權利要求43所述的方法，其中所述正鏈RNA病毒選自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)和登革病毒。45.dsRNA，其選自表1列出的那些dsRNA。46.包含權利要求45所述的dsRNA的藥物組合物。47.dsRNA，其選自表2列出的那些dsRNA。48.包含權利要求47所述的dsRNA的藥物組合物。49.包含多種dsRNA的藥物組合物，其中至少一種dsRNA選自表1列出的那些dsRNA，并且至少一種dsRNA選自那些具有下述反義鏈的dsRNA，其中所述反義鏈包含具有基本互補于編碼正鏈RNA病毒的至少部分mRNA的區域的核苷酸序列。50.權利要求49所述的藥物組合物，其中所述正鏈RNA病毒選自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)和登革病毒。51.權利要求49所述的藥物組合物，其中每一dsRNA包含至少一個經修飾的核苷酸。52.包含多種dsRNA的藥物組合物，其中至少一種dsRNA選自表2列出的那些dsRNA,并且至少一種dsRNA選自那些具有下述反義鏈的dsRNA，其中所述反義鏈包含具有基本互補于編碼正鏈RNA病毒的至少部分mRNA區域的核苷酸序列。53.斥又利要求52所述的藥物組合物，其中所述正鏈RNA病毒選自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒(HPV)和登革病毒。54.權利要求52所述的藥物組合物，其中每一dsRNA包含至少一個經修飾的核苷酸。55，藥物組合物，其包含a)至少一種選自表1和表2列出的那些dsRNA;和b)選自i)完全包封的脂質體；ii)脂類復合體；和iii)多聚體的遞送形式。56.權利要求55所述的藥物組合物，其中每一dsRNA包含至少一個經修飾的核苷酸。57.權利要求55所述的藥物組合物，所述藥物組合物進一步包含多種選自表1和表2列出的那些dsRNA。58.治療HCV感染的方法，所述方法包括向需要此種治療的患者施用治療有效量的^又利要求17、20或55所述的藥物組合物。59.治療由正鏈RNA病毒感染的方法，所述方法包括向需要它的患者施用選擇性抑制磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)的活性的化合物。60.權利要求59所述的方法，其中所述化合物選自dsRNA、DNA反義DNA、核酶或編碼上述的DNA載體。61.權利要求60所述的方法，其中所述化合物是dsRNA。62.權利要求61所述的方法，其中所述化合物是權利要求2或權利要求9所述的dsRNA。63.權利要求62所述的方法，其中所述化合物是具有選自SEQIDNo.l至SEQIDNo.416的SEQIDNO.的dsRNA。全文摘要本發明涉及靶向磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)的基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNAs)，尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB)或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA)的雙鏈核糖核酸(dsRNAs)，并涉及它們用于治療由正鏈RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)所致感染的用途。每一dsRNA包含具有這樣的核苷酸序列的反義鏈，所述核苷酸序列長度短于30個核苷酸、通常長19-25個核苷酸，并且基本互補于PIK4CB靶mRNA或PIK4CA靶mRNA的至少一部分。許多這樣的dsRNA可用于提供治療益處。本發明也涉及包含dsRNA和可藥用載體的藥物組合物，并且包括遞送形式如完全包封的脂質體或脂類復合體。文檔編號A61K31/713GK101688206SQ200880023497公開日2010年3月31日申請日期2008年7月4日優先權日2007年7月5日發明者J·博勞斯基,L·A·該賽,M·A·拉博申請人:諾瓦提斯公司