專利名稱：Pitman moore狂犬病病毒株對原代雞胚成纖維細胞培養物的適應方法
技術領域：
本發明涉及疫苗領域，尤其是，涉及將Pitman moore狂犬病病毒株(PM株)適應于純化的雞胚成纖維細胞培養物以用于生產改良且高度純化的疫苗。具體而言，該適應的PM狂犬病病毒株產生高病毒效價，并且按照每顆蛋的疫苗劑量計算能夠得到較高產量且具有高度免疫原性。
背景技術：
狂犬病是一種動物源性病毒疾病，可感染家養和野生動物。一旦出現該疾病癥狀，狂犬病對動物和人均是致死性的。然而，如果在暴露于病毒前或暴露于病毒后用狂犬病疫苗對個體進行免疫接種，并用消毒劑與抗狂犬病的抗體徹底清洗創口，該個體通常可得到良好的保護。人狂犬病疫苗由滅活或減毒的狂犬病疫苗制備，且自巴斯德時期至今已經過了成功的改良。由巴斯德研制的最初的狂犬病疫苗是基于神經組織的，且病毒通過干燥而滅活，但由于存在神經組織或髓磷脂(myelin)，該疫苗具有激活該病毒和發生過敏性反應的風險。Fuezalida等人引入了由新生小鼠腦制備的無髓磷脂疫苗(Vaccines第四版，第37章，Plotkin，Rupprecht and Koprowski)。
隨后，研制了用于狂犬病的鴨胚疫苗(DEV)。用于狂犬病的DEV由在胚胎化鴨蛋中繁殖的病毒而制備。其免疫原性比腦組織疫苗要差。因此，對于DEV而言，推薦每天接種14-23次，而且有時在嚴重暴露后，如此高的劑量也不能保護個體免受狂犬病侵襲。(Vaccines第四版，第37章，第1018頁，Plotkin，Rupprecht andKoprowski)。另一個與DEV相關的缺陷是它也含有髓磷脂相關蛋白，可引起副反應，因此后來被WHO禁用。因此，長久以來一直需要免疫原性較高并以低劑量且安全有效地應用的，既可用于初次免疫也可用于暴露后治療的狂犬病毒疫苗。這些疫苗還能夠大大降低接種后反應的次數和嚴重性。
由于組織/細胞培養疫苗的研制而滿足了這種需求。與前面所說的病毒的腦培養疫苗相比，細胞培養疫苗由于不存在神經組織，因此不僅更加安全而且更加有效。為了獲得較高的免疫原性和安全性，現在已經開發了幾種基于細胞培養的疫苗，如純化鴨胚疫苗(PDEV)、第一代疫苗如人二倍體細胞疫苗(Wiktor et al.，1964.J.Immunol.93353-366)and 2nd generation vaccines like Purified ChickEmbryo Cell Vaccine(PCECV)，Purified Vero Cell Rabies Vaccine，Rabies Vaccine Adsorbed(RVA)，and Primary Hamster Kidney CellVaccine(PHKCV)etc.(RefJIACM 2006；7(1)39-46)。
上述疫苗研制成功的技術進展包括使Pitman moore狂犬病病毒株適應于連續細胞系如Vero細胞(如，純化的Vero細胞狂犬病疫苗-AbhayrabTM&VerorabTM)和MRC-5人雙倍體培養細胞系[如印度的人雙倍體細胞疫苗(HDCV)-MIRV-HDC][RefJIACM 2006；7(1)39-46]或鴨胚中原位進行適應(如，純化的鴨胚疫苗-PEDV-Lyssavac N)。(RefLaboratory Techniques in Rabies；FourthEdition，Edi.by F.X.Meslin，M.M.Kaplan&H.Koprowski，WHOGeneva-1996)。
Vero和MRC-5細胞系都是連續細胞系，因此有必要檢測終產品中的細胞殘留DNA(Ref.歐洲藥典，2004)，因為其可能具有傳遞潛伏病毒和其他物質的風險。而且，即使采用PM株制備疫苗，通過Vero細胞得到的產量實際上也比較低。PDEV是一種混懸疫苗，因此該疫苗無法用于皮內(ID)應用。此外，該技術獲得的產量較低(每顆蛋1.8-2.2劑量)。處理時間也太長，需要88天。且市售PDEV疫苗采用防腐性硫柳汞，其可能與幼童自閉癥有關系(Refhttp://www.ncirs.usyd.edu.au/facts/f-thiomersal.html)。另外，生產PDEV的過程長而繁瑣，而且由于其產量低，因此不適于大規模生產。可以認為HDCV是金標準疫苗，但其太過昂貴。因此，需要提供一種改良的高免疫原性狂犬病疫苗，其能提供較高產量，而且利用基于細胞培養的技術，花費也不會那么昂貴。
US 4115195(Rudolph Barth et al.)描述了生產狂犬病疫苗的過程。其中教導了雞胚成纖維細胞以及其他培養的細胞株均可用來利用多種病毒來制備狂犬病疫苗，如VP11株、Pasteur株、PM株病毒或者包含Flury LEP株(低代株(low egg passage))或Flury HEP株(高代株(high egg passage))病毒的均質化雞胚物質。該專利還具體提供了利用狂犬病病毒固定株VP11、Flury HEP和Flury LEP感染雞胚成纖維細胞的實例。然而，該文獻未提及使Pitman moore株(Wistar株PM-HDCS、1503-3M)適應于原代鴨胚成纖維細胞或原代雞胚成纖維細胞。而且，該專利發明中應用的培養基是一種在US4115195中未闡明的獨特的組合培養基，其專為PM狂犬病病毒感染原代雞胚成纖維細胞而設計。
本發明已經出人意料地發現Pitman moore株能夠適應于原代雞成纖維細胞培養物。這種適應提供了一種大量制備狂犬病疫苗的方法，其產量高且生產時間短，易于成規模。因為該疫苗不是混懸液，因此除了肌內應用(IM)，所生產的疫苗還將適合于皮內應用。
根據本發明，通過使Pitman moore適應于原代雞成纖維細胞培養物而制備的狂犬病疫苗比基于多種其他連續細胞系的狂犬病疫苗更加有利，且更加易于成規模以進行大規模商業化疫苗生產。通過本發明所述方法生產的疫苗具有極高的產量、效力、安全性，而且當優選地利用PET TC轉瓶實施該方法時，該方法比已知用于制備狂犬病疫苗的多種其他方法更加經濟有效。
本發明者已經出人意料地發現，在合適的處理條件，如下文將詳細描述的，利用PET TC轉瓶，Pitman moore病毒可以在具有如其他文獻所述的獨特組合培養物的原代雞胚成纖維細胞培養物中嚴重感染。這些優選實施方式提供了具有高產量、較高效價和免疫原性的疫苗，這使得該疫苗相對而言比較經濟有效。
發明內容
本發明的主要目的是使Pitman moore狂犬病毒株適應于雞胚成纖維細胞培養基以獲得狂犬病疫苗。
在本發明的一種實施方式中，提供了一種利用用于抗狂犬病活性免疫的Pitman moore株來生產具免疫原性且高度純化的雞胚細胞疫苗PM(下文稱為PCECVPM)的方法。
本發明的另一種實施方式是開發一種利用較簡單的方法獲得高產量疫苗的獨特方法。
在本發明的另外一種實施方式中，提供了一種適合的培養基組合物，以獲得Pitman moore株狂犬病病毒進入雞胚成纖維細胞的高感染性。
本發明提供了一種將Pitman moore狂犬病病毒株適應于雞胚成纖維細胞培養物的方法。首先通過一次腦內傳代使原始Pitmanmoore狂犬病病毒株(Wistar株PM-HDCS，1503-3M)適應于小鼠，然后在鴨蛋中反復傳代，本發明人通過連續傳代進一步使其適應于鴨胚成纖維細胞，隨后通過利用適合的培養基以及其他適合的培養條件在原代雞胚成纖維細胞中進一步連續傳代以獲得狂犬病疫苗。
本發明的另一個方面提供了一種獨特的組合培養基，以實現使得Pitman moore狂犬病病毒株較高且較嚴重感染地進入純化雞胚成纖維細胞。
本發明的另一個方面中，提供了一種利用PM狂犬病病毒株的滅活的純化雞胚細胞狂犬病疫苗，具有較高純度和免疫原性。
圖1示出了第5天時，03PM/鴨/S.Pas.07在鴨培養物中的狂犬病特異性熒光。
圖2示出了第5天時，04PM/雞/S.Pas.09在雞胚培養物(CEC)中的狂犬病特異性熒光。
圖3示出了第3天時，04PM/雞/S.Pas.10在雞胚培養物(CEC)中的狂犬病特異性熒光。
圖4示出了第3天時，04PM/雞/S.Pas.11在雞胚培養物(CEC)中的狂犬病特異性熒光。
圖5示出了第3天時，04PM/雞/S.Pas.12在雞胚培養物(CEC)中的狂犬病特異性熒光。
圖6本發明的實驗疫苗與多種市售狂犬病疫苗的比較。
具體實施例方式 本發明涉及在原代雞/鴨成纖維細胞培養物中適應Pitmanmoore狂犬病病毒。所采用的蛋是SPF級雞蛋。SPF雞蛋和Pitmanmoore狂犬病病毒株是WHO批準用于制造用于人狂犬病疫苗的底物和病毒株。在一種優選實施方式中，利用PET TC轉瓶使PM狂犬病病毒株適應于轉動培養物中的雞成纖維細胞，與其他幾種技術相比，其可得到較高的產量。
首先通過一次腦內傳代使原始的Pitman moore株(Wistar株PM-HDCS，1503-3M)適應于小鼠，隨后通過反復傳代而適應于鴨蛋中。接下來，本發明人試圖開發一種使PM狂犬病病毒株適應于原代鴨胚成纖維細胞的方法，發現僅有部分細胞被感染(圖1)。經過幾次傳代，感染性未能增加至令人滿意的程度。
在例如US 4115195中已知足夠高的病毒效價是有效狂犬病疫苗的一個必要條件。因此，本發明人改變了其關注點，使病毒傳代在雞胚成纖維細胞培養物中進行。在幾次感染性和適應性試驗后，在雞胚細胞中獲得了滿意的病毒效價結果(圖2至圖5)。
下文將適應于鴨胚的原始“Wistar株PM-HDCS，1503-3M”稱為“主種子DE42/74Pas.12.12.11.1974”，其是用于生產PDEV疫苗的主種子。根據本發明所述，該“主種子DE42/74Pas.12.12.11.1974”狂犬病疫苗最初在鴨胚細胞中然后在原代雞胚成纖維細胞培養物中適應和繁殖，以生產用于狂犬病的細胞培養PCEC疫苗(PCECVPM)。
最初，本發明人試圖通過反復傳代將“主種子DE42/74Pas.12.12.11.1974”適應于原代鴨胚成纖維細胞。但是，因為原代鴨胚成纖維細胞不是PM狂犬病病毒的“天然”宿主，因此最初的實驗中本發明人不能得到任何感染，而且隨后的實驗中進一步優化也僅得到極少量感染。因此，對該方法進行了明顯的改進，將在原代鴨胚成纖維細胞中傳代改成了在適合的培養基和培養條件下在原代雞胚成纖維細胞中傳代。PM狂犬病病毒株傳代入原代雞胚成纖維細胞中是一種獨特而非常規的情形，在本領域中尚未見報道，因為這些細胞不是PM狂犬病病毒株的“天然”宿主，本領域中技術人員也不能將其延伸視為常規技術。
在本發明中，將所述“主種子DE42/74Pas.12.12.11.1974”適應于原代鴨胚成纖維細胞然后如下所述通過反復傳代適應于雞胚成纖維細胞
傳代過程中獲得的多株病毒按照下列通用格式進行命名“制備年份(例如“04”表示2004年)/Pitman moore株(PM)/在其中進行傳代的底物(鴨或雞)/連續傳代次數/培養日期”。
用作主種子或工作種子的已適應Pitman moore株通過用PM病毒(DE42/74Pas.12.12.11.1974)感染原代鴨胚成纖維細胞而得到，并于33-36℃進行7次傳代以使該病毒株適應于原代鴨胚成纖維細胞，從而得到“03PM/鴨/S.Pas.07；18.12.03”。對該“03PM/鴨/S.Pas.07；18.12.03”株進一步通過至少4次傳代而感染進入原代雞胚成纖維細胞中，得到主種子“04PM/雞/S.Pas.11；04.08.04”。人們可從主種子進行1-5次傳代來制備用于商業化疫苗生產的工作種子。按照上述方法制備的工作種子批號的一個實例命名為“04PM/雞/S.Pas.12；25.12.04”。
從主種子“04PM/雞/S.Pas.11；04.08.04”得到的病毒具有至少106.5TCID50％/ml的峰效價。
在雞胚細胞中進行連續傳代時，病毒效價成對數增加，表明該病毒具有穩定的表型特征。
在每次傳代時，均通過標記FITC的Ab結合物將培養物染色，并利用熒光顯微鏡檢測其感染性。得到用于感染性和培養的最佳和可重復性條件后，如在各種藥典中所描述的，最初通過熒光顯微鏡確認該結果，然后通過幾次體外以及體內檢測加以確認。
所述病毒的適應優選利用PET TC轉瓶或多層TC瓶來實施。
為了進行適當的適應，采用了幾種培養基及其成分的組合，下文借助實施例1進行描述。本發明進一步通過下列非限制性實施例進行闡釋，所述實施例均代表實施本發明的優選模式之一。應該理解，可以在本領域熟練技術人員掌握的范圍內進行若干非創造性的改進，并認為這些改進也包括在本發明的范圍內。
實施例1選擇用于病毒適應和處理優化的培養基 選擇下列培養基進行病毒適應和處理條件的優化。
●生產培養基1(PCM1) ●生產培養基2(PCM2) ●生產培養基(PCM) 上文提到的培養基包含以下成分
上述培養基進一步以適當濃度補充人血清白蛋白、水解明膠、碳酸氫鈉和抗生素溶液。
利用不同培養基進行實驗后，比較其形成細胞單層和病毒感染程度的有效性。
取9-11天的胚胎，并用胰蛋白酶依次處理10-10-20分鐘。將細胞離心除去胰蛋白酶并同樣地重懸浮于PCM1、PCM2和PCM中。在不同實驗中，將3種培養基中的細胞數量均調整為約1.7×106個細胞/ml。所有實驗中均采用1∶1200稀釋的“03PM/鴨/S.Pas.07”病毒。每次實驗的吸附時間均為90分鐘。將已感染細胞接種于Greiner TC瓶和PET轉瓶中。并將來自TC瓶/轉瓶的代表性感染細胞接種在24孔TC板內。將該TC瓶和轉瓶于34℃±1℃孵育5天。所述24孔板在3％CO2環境中于34℃±1℃孵育，并在第3天時用FITC結合物染色，檢測病毒感染程度，根據狂犬病特異性熒光分級為好(+)、很好(++)、極好(+++)或超好(++++)。
第4天或第5天，從每一組實驗收集細胞上清液作為第一次收獲物，并分別補充新鮮培養基。繼續孵育后，自第一次收集的第2天、第3天或第4天，從每一組采取第二次收獲物。檢測第一次收獲物和第二次收獲物的病毒效價和無菌度。
結果發現 ●通過狂犬病特異性免疫熒光評估，在24孔板中，在PCM1和PCM2中接種的細胞表現為差至好的感染，而在PCM中接種的細胞則表現為極好至超好的感染。
●與僅接種于PCM1和PCM2相比，用PCM接種的TC瓶/轉瓶表現出的效價為好。PCM1、PCM2和“PCM”中的效價值分別為105.6、105.8和107.7TCID50％。
根據上述不同實驗中的結果，選擇PCM培養基用于在原代雞胚成纖維細胞中進行適應，隨后的疫苗制備通過不同的處理條件并進一步選擇適合的TC轉瓶而進一步優化，所述處理條件在本領域技術人員的掌握范圍內。
用于制備主種子、工作種子和狂犬病疫苗生產的一般細胞培養步驟 用70-90％RH將雞蛋于35℃-37℃孵育8-11天。孵育后，透光檢查雞蛋以選擇存活且健康的胚胎。透光檢查后，在無菌條件下從每一個雞蛋取出胚胎，然后通過提拉法將頭和身體分離。隨后立即將頭丟棄，而將胚胎的身體部分投入瓶中，用無菌PBS清洗3至4次，并在35℃±2℃用預熱的胰蛋白酶處理10-40分鐘。
將胰蛋白酶處理過的細胞混懸液通過尼龍布進行過濾，隨后以1000至1500rpm的速度在低溫離心機中離心10至15分鐘。將細胞沉淀混懸于新鮮的生長培養基中，使細胞充分混合，并以相同的方式再次離心該細胞混懸液。將該細胞混懸液轉移到含上文所述培養基的無菌玻璃瓶中，并于35℃±2℃攪拌5-10分鐘。在20L的玻璃瓶中，利用培養基將最終的細胞數量調整為1.4-2.2×106/ml的范圍。
該細胞混懸液以預定的最佳主種子或工作種子病毒稀釋度進行接種，并于35±2℃緩慢攪拌下孵育90-120分鐘，以使病毒吸附于細胞。在吸附結束時，將感染的病毒混懸液分裝于PET TC轉瓶(300±50ml/TC轉瓶)或多層TC瓶如細胞工廠或細胞培養室(3000±500ml)或二者的組合。隨后于34.5℃±0.5℃孵育4-6天。在第4天或第5天，收集細胞上清液作為第一次收獲物，在第7或第8天實施第二次收集。各種病毒收獲物儲存于2℃-8℃。由于多次收集能得到更多具有良好效價的收獲物，因此使得本發明更加經濟有效。
混合的病毒收獲物通過在蔗糖密度梯度區帶離心機中以35000rpm超速離心而純化和濃縮。蔗糖濃度在約35-40％之間時，狂犬病病毒的結合最好，含有活性活狂犬病病毒的蔗糖梯度/區帶作為產品組分而收集。將來自不同混合收獲物的產品組分病毒濃縮物于-60℃以下儲存直至實施各種測試，如體外Ag分析、無菌度檢測和細菌內毒素檢測的結果已經比較清楚。
本發明還提供了一種滅活PM病毒以破壞其感染性而保留其抗原性的方法。將所述濃縮物于37℃解凍并于4±2℃冷卻。用疫苗穩定劑稀釋該濃縮物以獲得適當的抗原含量8.5IU/ml，樣品回收用于體外Ag分析，如ABT、ELISA和SRD檢測。測量該混合物的pH并用10％w/v已事先滅菌的NaOH溶液的pH調至8.0±1。然后，將有效量的用PBS 1∶100稀釋的β-丙內酯緩慢加入該混合物中，以達到1∶4000(0.025％)的終濃度，將容器中的內容物轉移到另一個已事先滅菌的滅活容器中。在持續攪拌下，于2-6℃與β-丙內酯一起孵育。需要至少48小時以充分滅活病毒感染性而不喪失病毒抗原性。為了大規模培養時使工藝簡化，優選于2-6℃進行PM病毒的滅活過程。
最后將滅活的混合物儲存于5℃±3℃直至在持續攪拌下進行進一步處理。用適合的穩定劑溶液稀釋該滅活的混合物，以將抗原值調為至少5IU/ml。混合過程中，將該混合物保持于5℃±3℃進行攪拌。裝瓶之前，攪拌該混合疫苗30分鐘。按照本領域中已知的方法進行冷凍干燥。所采用的疫苗穩定劑包含蔗糖、脫水明膠、人白蛋白和鈉鹽。疫苗制備成冷凍干燥型制劑，可用無菌注射用水進行重建。
利用雞成纖維細胞制備的疫苗的效價和免疫原性與已利用多種動物安全性、效力和血清轉化性研究進行評估的國際參考疫苗(International Reference Vaccine)(WHO 5th IRM)相同。此外，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證和比較最終產品的純度，類似于其他市售產品(圖6)。并且當儲存于2℃-8℃時該產品非常穩定。按照ICH的生物技術和生物學材料穩定性指南，在加速和應激溫度下其也能保持效力和其他關鍵參數。
實施例2將Pitman moore狂犬病病毒株適應于原代鴨胚成纖維細胞以及將從中獲得的病毒連續適應于原代雞胚成纖維細胞。
(A)首先通過1次腦內傳代將原始Pitman moore狂犬病病毒株(Wistar株PM-HDCS，1503-3M)在瑞士白化體小鼠(Swiss AlbinoMice)體內進行適應，隨后通過12次傳代在胚胎化鴨蛋中適應，將得到的病毒命名為DE 42/74 Pas.1212.11.1974。本發明利用該病毒進一步適應于原代鴨胚成纖維細胞以及隨后的雞胚成纖維細胞。
實驗利用11-12天的SPF鴨蛋而實施。按照已知的技術，將細胞數量設定為1.8×106個細胞/ml，利用補充1.5％人白蛋白的生產培養基1(PCM 1，如上文所述)制備細胞混懸液。將一份5ml上述命名為“DE 42/74Pas.1212.11.1974”的冷凍病毒在37℃解凍，并稀釋于細胞培養穩定劑中，用于感染鴨胚細胞混懸液。將感染的細胞混懸液裝入TC PET轉瓶中并于34℃孵育。感染后的第5天，從轉瓶采集收獲物并測試小鼠體內的病毒效價以及是否存在諸如細菌和真菌等的污染物。所收獲的這些病毒命名為“02PM/鴨/S Pas.01”。
同樣的，進一步在鴨胚細胞培養基中進行6次這樣的傳代，且每一次傳代后，均收集約7.0升的收獲物。每一次傳代后，均采集收獲物并測試小鼠體內的病毒效價以及是否存在諸如細菌和真菌等的污染物。將每一次傳代的收獲物均進一步分裝成5ml的等份，并如下命名。
在上述實驗過程中，初次傳代后，發現僅少量細胞感染且表現出狂犬病特異性熒光。從第4次傳代開始，病毒感染性逐漸并顯著增強。這可在下列圖表中示出
第7次傳代后，感染性幾乎恒定不變。嘗試了幾種備選方案但均未成功。出人意料的是，將病毒“03PM/鴨/S.Pas.0718.02.03”感染入雞胚成纖維細胞時，感染性顯著增強。根據該發現，如下文所述將該病毒株在雞胚成纖維細胞中進一步傳代以獲得所需的感染性和病毒效價。
(B)約9-11天(180個胚胎)的已受精SPF雞蛋用于該過程，并將頭部與身體部分分離，僅處理身體部分而將頭部丟棄。用磷酸緩沖鹽反復沖洗所收集的身體部分，隨后利用胰蛋白酶溶液消化處理胚胎。在PCM中制備細胞混懸液，并將細胞數量設定為1.6×106個細胞/ml。將一等份5ml的“03PM/鴨/S.Pas.07”在37℃解凍，并稀釋于穩定劑中。其用于感染該雞胚細胞混懸液。在緩慢攪拌下將該感染細胞混懸液于37℃孵育1.5小時。將該感染細胞分裝入轉瓶中以及多層TC瓶中，并于34℃孵育。在感染的第5天，從轉瓶和多層TC瓶采集約7升的收獲物，并以適當等份進行分裝，將這些分裝的等份中的若干個5ml等份用于檢測小鼠體內的病毒效價以及是否存在諸如細菌和真菌等的污染物。
將這些病毒收獲物命名為“04PM/雞/S.pas.08”。
隨后，在雞成纖維細胞中再進行3次病毒的連續傳代，每一次均采集部分收獲物，并以5ml的等份分裝，如上所述進行命名。對所有的代數均測試病毒效價以及是否存在細菌和真菌。
根據獲得的數據，將第4次傳代后得到的病毒命名為“04PM/雞/S Pas.1104.08.04”，具有107.7LD50％病毒效價/ml，本發明認為其可作為主種子病毒。該病毒再經過一次傳代得到工作種子病毒“04PM/雞/S Pas.1225.12.04”。
實施例3從工作種子制備疫苗 通過一個類似于上文步驟1(b)中所述的過程，在雞成纖維細胞中感染該種子病毒“04PM/雞/S Pas.1225.12.04”，在第4天或之后得到第一次收獲物，第一次收集之后的2-3天獲得第二次收獲物。混合的病毒收獲物通過在蔗糖密度梯度區帶離心機中以35000rpm超速離心而純化和濃縮。在蔗糖濃度為約35-40％之間時進行狂犬病病毒的結合，收集有活性的活狂犬病病毒作為產品組分。將來自不同混合收獲物的病毒濃縮物儲存于-60℃以下直至多個測試，如體外Ag分析、無菌度檢測和細菌內毒素檢測的結果已經比較清楚。
將所述濃縮物于37℃解凍并于4℃±2℃冷卻。用疫苗穩定劑稀釋該濃縮物以獲得適當的抗原含量8.5IU/ml，回收樣品用于體外Ag分析，如ABT、ELISA和SRD檢測。測量該混合物的pH并用10％w/v已事先滅菌的NaOH溶液將pH調至8.0±1。隨后利用已知技術加入適當濃度的B-丙內酯來滅活該混合物。
最后將滅活的混合物儲存于5℃±3℃同時持續攪拌，并用適合的穩定劑溶液稀釋，以將抗原值調為至≥5IU/ml，并將該混合物保持于5℃±3℃攪拌30分鐘。將該混合物裝入瓶中，并利用包含蔗糖、脫水明膠、人白蛋白和鈉鹽的疫苗穩定劑使其穩定化。疫苗制成可用的冷凍干燥型制劑，可用無菌注射用水進行重建。
該疫苗的免疫原性和效價如下進行檢測 實施例4小鼠體內的NIH效價檢測 小鼠體內的NIH效價檢測按照狂犬病實驗室技術(LaboratoryTechniques in Rabies，WHO’1996)第四版以及印度藥典來實施。
通過比較保護小鼠免受致死量腦內狂犬病毒侵襲所需的實驗疫苗劑量與給與相同保護所需的相應參考疫苗(WHO 5thIRM，16.0IU/安瓿)劑量來確定狂犬病疫苗的效價。
采用體重約12-15g的瑞士白化體小鼠。
將一種劑量的國際參考疫苗重建于2.0ml注射用水中，將其中的0.5ml與12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底混勻得到25倍稀釋液。
將來自至少每一批次(shelf)的本發明所述冷凍干燥的實驗疫苗中的一種劑量分別重建于1.0ml注射用水中，然后混合到一起。取出0.5ml與12ml PBS徹底混勻，以得到25倍稀釋液。
接下來，在PBS(pH 7.4)中制備國際標準和實驗疫苗的3-5倍稀釋液。如此選擇稀釋范圍是為了獲得包含足夠的中間稀釋度以保護50％研究用小鼠的疫苗，病毒的激發劑量為10-50LD50。稀釋度范圍1∶25、1∶125、1∶625、1∶3125對于兩種疫苗即標準以及實驗疫苗均能發揮有效作用。
首次免疫接種的過程中，通過腹膜內途徑對16只小鼠(8只雄性+8只雌性)注射0.5ml的每一種稀釋液，首次免疫接種7天后，進行第二次免疫接種，重復第一次免疫接種的步驟。
對已免疫小鼠的病毒激發(感染) 第一次免疫接后14天，所有小鼠均感染激發病毒標準(Challenge Virus Standard，CVS)的腦懸液；將劑量調整為10-50LD50。
實驗動物的觀察 觀察感染小鼠14天。注意到感染5天后出現小鼠死亡。
效價的計算 通過REED和MUENCH法進行計算效價。發現 ●所述測試和標準疫苗的ED50值均在給予實驗動物的最高與最低劑量之間。
●所述激發混懸液的效價表現為0.03ml包含10-50LD50，接受該強度混懸液的所有動物均應出現死亡。
顯著性水平(p＝0.95)的置信區間不低于所計算的效價的25％且不超過400％。
最終結果列表如下
從上述實驗可以得知，實驗疫苗的平均效價是5.43IU/劑。每一次檢測的95％置信區間均為所計算效價的25-400％。每一次檢測中應用的激發病毒劑量(CVD)均在10-50LD50之間。每一次檢測中應用的標準和測試疫苗的ED50均處于最高和最低稀釋度之間。因此，可得出結論認為，該疫苗具有免疫保護性，且NIH效價值遠高于所需要的最小劑量2.5IU/劑。
實施例5兔體內的血清轉化和激發研究 根據小鼠體內血清轉化/激發研究的陽性結果，設計了一種組合研究來確定兔體內的血清轉化和保護。采用體重約1.5-2.5kg的新西蘭白兔，每組包括5只雄兔和5只雌兔。
根據WHO 5th IRM，于2ml無菌注射用水中重建得到8IU/ml的濃度，作為參考疫苗。將本發明所述實驗疫苗重建于1ml無菌注射用水中。
第0天和第7天，對每一組中的所有兔子均肌內注射0.5ml每一種疫苗，觀察14天。第14天時，從每一只兔的耳緣靜脈無菌抽取2ml血液，并37℃孵育1小時使其凝血。將血液樣品以1500rpm離心10分鐘分離血清，并將血清無菌收集于事先滅菌的試管/冷凍管中。將樣品于56℃熱滅活30分鐘，并儲存于-60℃以用于進行進一步的效價測定。
通過RFFIT和MNT測定每一個樣品的抗體效價。接下來，全部兔均在靜脈麻醉(硫噴妥納)的情況下用30MLD50/0.3ml激發病毒標準(CVS-27)進行腦內激發，觀察兔14天，看是否出現狂犬病特異性癥狀和死亡情況。直至第5天的死亡可認為是非特異性死亡。
觀察 我們觀察到，任何一組中的兔均未表現出狂犬病特異性癥狀，也均未死亡。從表格可以推斷，測試疫苗的免疫原性類似于參考疫苗。
兔體內的血清轉化 組I參考狂犬病疫苗(WHO 5th IRM)
組II實驗測試疫苗(PCEC狂犬病疫苗)
推論 根據實驗測試疫苗(RFFIT和MNT分別測得的平均值為8.2和10.87)和參考疫苗(RFFIT和MNT分別測得的平均值為8.51和10.06)得到的抗體效價，可以推斷本發明所述實驗疫苗與參考疫苗的免疫原性相同。
因此，我們可以從激發后獲得的結果得到結論就免疫原性和效價而言，根據本發明所述方法制備的PCEC疫苗(實驗疫苗)與參考標準具有同等保護性。
實施例6本發明所述實驗疫苗與各種市售狂犬病疫苗的比較 利用已知標記物，實施SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析來檢測并比較實驗性狂犬病疫苗的蛋白結合與其他市售產品的蛋白結合。
從該研究觀察到(圖6)，當如同其他市售狂犬病疫苗一樣配制時，本發明所述病毒濃縮物表現出同樣的蛋白條帶。
在圖6中， 泳道1低分子量標記物； 泳道2本發明的API； 泳道3如其他市售PCEC狂犬病疫苗一樣配制的本發明API； 泳道4市售PCEC狂犬病疫苗； 泳道5基于Vero細胞系的市售狂犬病疫苗； 泳道6如其他市售Vero狂犬病疫苗一樣配制的本發明API。
權利要求
1.Pitman moore狂犬病病毒株對用于狂犬病疫苗的生產的原代雞成纖維細胞的適應方法。
2.根據權利要求1所述的適應方法，其中，所述方法包括以下步驟
a)在適合的培養基中，通過合適次數的傳代使Pitmanmoore狂犬病病毒株適應于原代鴨胚成纖維細胞培養物；
b)隨后，在適合的培養基中，通過合適次數的傳代使所述病毒適應于原代雞成纖維細胞培養物。
3.根據權利要求1所述的適應方法，其中，所述Pitman moore狂犬病病毒株是“DE 42/74 Pas.1212.11.1974”。
4.根據權利要求3所述的Pitman moore狂犬病病毒株，其是通過將Wistar株PM-HDCS，1053-3M在鴨蛋中傳代而獲得的。
5.根據權利要求2(a)所述的適應方法，其中，所述Pitman moore狂犬病病毒株首先通過至少7次傳代而適應于原代鴨胚成纖維細胞培養物。
6.根據權利要求2(b)所述的適應方法，其中，所述Pitman moore狂犬病病毒株通過至少4次傳代而適應于原代雞胚成纖維細胞培養物。
7.根據權利要求1和2所述的方法，其中，所采用的所述培養基是如說明書中所描述的PCM。
8.根據權利要求7中所述的方法，其中，所述培養基進一步包含人血清白蛋白、水解明膠、碳酸氫鈉和適合的抗生素溶液。
9.前述權利要求中任一項所述的適應方法，其中，所述細胞數量保持在1.4-2.2×106個細胞/ml的范圍內。
10.根據前述權利要求中任一項所述的適應方法，其中，所述適應在PET TC轉瓶或多層TC瓶中完成。
11.一種原代雞成纖維細胞，通過權利要求1中所述的方法用Pitman moore狂犬病病毒進行適應。
12.通過權利要求1和2所述的方法由在原代雞胚成纖維細胞中適應的Pitman moore株制備狂犬病疫苗的方法。
13.根據權利要求12所述的方法，包括以下步驟
-通過權利要求1和2所述的方法使Pitman moore狂犬病病毒株適應于原代雞胚成纖維細胞，以獲得主種子；
-通過進一步將所述主種子在原代雞胚成纖維細胞中傳代1-5次而制備工作種子；
-在PCEC培養基中，由所述工作種子生產病毒；
-濃縮并純化所述病毒；
-滅活所述病毒。
14.根據權利要求12所述的方法制備的狂犬病疫苗，其可進一步凍干。
15.一種狂犬病疫苗，包含根據權利要求12所述的方法制備的滅活Pitman moore病毒。
16.一種藥物組合物，包含根據權利要求12所述的方法制備的滅活狂犬病疫苗和適合的賦形劑。
17.一種免疫哺乳動物受試者的方法，包括將根據前述權利要求制備的疫苗給予所述哺乳動物受試者。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，所述疫苗在暴露于致病性狂犬病病毒之前給予。
19.根據權利要求17所述的方法，其中，所述疫苗在暴露于可引起狂犬病感染的動物咬傷之后給予。
20.根據權利要求17所述的方法，其中，所述受試者是人。
21.根據權利要求17所述的方法，其中，所述受試者是家養或野生動物。
22.根據權利要求12所述的方法制備的疫苗用于治療人和動物中的狂犬病的應用。
全文摘要
本發明涉及Pitman moore狂犬病病毒株對用于生產狂犬病疫苗的原代雞成纖維細胞的適應方法。
文檔編號A61K39/205GK101730544SQ200880023072
公開日2010年6月9日 申請日期2008年4月24日 優先權日2007年7月3日
發明者普拉迪普·馬詹拉勒·帕特爾, 潘卡杰·拉曼巴伊·帕特爾 申請人:卡迪拉保健有限公司