專利名稱：：供在高溫下使用的蛋白質配方的制作方法
技術領域：
：本發明涉及供在高溫下長期使用的骨形態發生蛋白液體配方。更具體地講，本發明涉及包含rh⑶F-5、海藻糖和一種或多種生物相容性賦形劑的液體配方，以提供在最高達37°C的溫度下穩定30天或更長時間的配方。
背景技術：
：⑶F-5是骨形態發生蛋白(BMP)的一個成員，BMP是蛋白質的TGF-β超家族的一個亞類。⑶F-5包括幾種變體(variant)和突變體(mutant)，包括最初由Lee(美國專利No5，801，014)從小鼠分離得到的mGDF-5在內。其他變體包括MP52(W095/04819)，為GDF-5的人形式，也稱h⑶F-5和LAP-4(Triantfilou等人，NatureImmunology2，338-345(2001))；還有CDMP-I，為h⑶F-5的等位基因蛋白變體(TO96/14335)；還有rh⑶F-5，為在細菌中制備的重組人形式(EP0955313)；還有rh⑶F_5_Ala83，為rh⑶F-5的單聚變體；還有BMP-14，為h⑶F-5/CDMP-1樣蛋白的總稱，還有Radotermin，為世界衛生組織指定的國際名稱；還有HMWMP52，為MP52的高分子量蛋白變體；還有C465A，為其中負責分子間交聯的半胱氨酸殘基被丙氨酸置換的單聚版本；還有其他的活性單氨基酸置換突變體，包括N445T、L441P、R438L和R438K在內。出于本申請的目的，術語“⑶F-5”意在包括蛋白質的所有變體和突變體，rhGDF-5是具有119個氨基酸的示例性成員。BMP家族的所有成員享有包括羧基末端活性結構域在內的共同結構特征，和享有高度保守形式的半胱氨酸殘基，這些殘基產生3個分子內二硫鍵和一個分子間二硫鍵。活性形式可為單個家族成員的二硫鍵鍵合同型二聚體，或者為兩個不同成員的異型(Massague^A,AnnualReviewofCellBiology6:957(1990)；Sampath等人，JournalofBiologicalChemistry265:13198(1990)；Celeste等人，PNAS87:9843-47(1990)；美國專利No.5，011，691和美國專利No.5，266，683)。蛋白質的正確折疊和這些二硫鍵的形成對于生物功能執行是必需的，錯折疊會導致出現失活的聚集體和被切割的片段。一般蛋白質的降解和穩定化在文獻中有很好的描述，而諸如葡聚糖、乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖和海藻糖的賦形劑作為冷凍保護劑和滲透壓調節劑的用途也有很好的記載(參見例如Arakawa等人，AdvancedDrugDeliveryReviews,46,307-326(2001)>ffang等人，InternationalJournalofPharmaceutics185,129-188(1999)對蛋白質穩定性的綜述，和Crowe等人，Cryobiology43，89-105(2001)對海藻糖的綜述)。賦形劑保護⑶F-5的凍干配方的用途在以下文獻中也有描述USPAP20040132653(Ichikawa等人)、USPAP20060286171(Zhou等人)和美國專利申請系列號60/870，032(Garigapati等人)。凍干是一種常用的工藝，它包括對樣品進行冷凍干燥以除去水分，產生固體餅狀物以便保藏，該固體餅狀物在使用時可進行復水。對于諸如GDF-5的蛋白質，冷凍、干燥和復水都代表著對蛋白質的結構和完整性的單獨傷害和挑戰。Flaa等人在美國專利No6，165，981中描述了海藻糖在配方中作為增量劑使肌鈣蛋白的溶液穩定化的用途。用海藻糖使抗體穩定化也已得到描述，如Lam等人在美國專利No.6，171，586和6，991，790中描述。這些蛋白質與⑶F-5共享的結構相似性極少，對其他蛋白質成功的配方未必可預知能否用于使GDF-5穩定化。相反，在高溫下(如在室溫下，或者甚至在體溫下)長時間穩定的GDF-5液體溶液的制備，提出了另外一套與凍干和重構中所遇到的冷凍、干燥和復水(rehydrating)的挑戰截然不同的挑戰。不再存在由水分的除去，賦形劑的結晶以及蛋白質鏈、它們的氫鍵和二硫鍵還有它們的三級結構的局部微環境的變化所致的對蛋白質結構的生化傷害，相反，攻擊是來自于熱力學運動的增力Π。這導致蛋白質的氨基酸氧化、脫酰胺、水解和切割的速度的增加成為主要的失活機制，從而產生小片段和失活的母體分子，所觀察到的聚集數量比凍干工藝要少。反相高效液相色譜法(rp-HPLC)和尺寸排阻色譜法(SEC)似乎是比其他方法(如電泳)更可靠的蛋白質純度和穩定性的指示方法。因此，為了在室溫或室溫以上針對液體溶液使諸如⑶F-5的蛋白質穩定化所需的策略和化學，可能要求不同于凍干所要求的配方。GDF-5在溶液中在2至8°C下長時間是不穩定的，因此通常在-60至-80°C的溫度下保藏。⑶F-5在中性pH下不可溶，通常是在酸性溶液中增溶，這因此增加了酸水解的潛在可能性。鑒于上述的制備供在高溫下長期保藏和使用的穩定⑶F-5液體配方的局限性和復雜性，需要新的和有效的配方。
發明內容本發明是液體蛋白質配方。所述配方包含BMP、至少50%w/v海藻糖溶液和至少一種選自氨基酸、三烷基銨鹽、熱休克蛋白、甜菜堿、牛磺酸、棉子糖、肌醇和天冬氨酸鉀的附加的賦形劑，所述賦形劑的量足以使BMP穩定化，這由在最高達37°C的溫度下保藏至少30天時主色譜峰保留至少80%得到證明。在另一個實施例中，本發明是使BMP溶液穩定化的方法，所述BMP溶液包含BMP、至少50%w/v海藻糖溶液和至少一種選自氨基酸、三烷基銨鹽、熱休克蛋白、甜菜堿、牛磺酸、棉子糖、肌醇和天冬氨酸鉀的附加的賦形劑。本發明的蛋白質配方可用于所有需要保藏和使用骨形態發生蛋白的應用中。骨形態發生蛋白在室溫或體溫下的保藏和使用，代表著這些配方的有用應用。表1匯總顯示了不同的受試配方和結果。表1-配方和數據的匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1顯示配方編號18、19、21、23和37在371下30天和60天后通過印-朋^測得的以及在37°C下30天后通過SEC測得的穩定性的比較。圖2顯示配方編號18在37°C下30天后通過rp-HPLC測得的穩定性。主峰顯示蛋白質的保存率為94%，不存在額外的峰。圖3顯示配方編號37在37°C下30天后通過rp-HPLC測得的穩定性。主峰顯示蛋白質的保存率為93%，不存在額外的峰。圖4顯示配方編號35在37°C下30天后通過rp-HPLC測得的穩定性。主峰顯示蛋白質的保存率為59%，存在著額外的峰，表明有降解。圖5顯示配方編號21在37°C下60天后通過rp-HPLC測得的穩定性。主峰顯示蛋白質的保存率為91%，不存在額外的峰。圖6顯示配方編號29在37°C下60天后通過rp-HPLC測得的穩定性。主峰顯示蛋白質的保存率為53%，存在著額外的峰，表明有降解。圖7顯示配方編號12在37°C下12天后通過SEC測得的穩定性。主峰顯示蛋白質的保存率為82%，存在著小的額外的峰，表明有輕微降解。圖8顯示配方編號18在37°C下30天后通過SEC測得的穩定性。主峰顯示蛋白質的保存率為98%，不存在額外的峰。圖9顯示含有單獨60%w/v海藻糖的⑶F-5樣品在37°C下14天后通過rp-HPLC測得的穩定性。主峰顯示蛋白質的保存率為75%，存在著額外的峰，表明有降解。圖10顯示⑶F-5參考標準(沒有配方)的色譜圖。圖11顯示剛制備的⑶F-5標準溶液、剛制備的配方編號18溶液和暴露于37°C達60天后的配方編號18溶液的活性之間的相關性。各曲線的比較相似性證實了蛋白質的活性得到保持。具體實施例方式可用于本發明的骨形態發生蛋白包括但不限于BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP12和BMP-14，以及它們的所有變體和突變體。優選的BMP是rh⑶F-5，也稱MP52。這里我們提供了幾種配方，它們可用作能使BMP分子在水溶液中高溫下長時間穩定的組合物。出于本發明的目的，術語“室溫”和“環境溫度”理解為可互換，意指普通辦公室或實驗室的溫度，為大約18至25°C之間的溫度；術語“體溫”意指人的正常體溫，為大約37°C的溫度；術語“冷凍溫度”意指大約2至8°C之間的溫度；術語“凍結溫度”意指大約-4°C至-20°C之間的溫度。BMP的穩定性已通過各種分析方法如rp-HPLC和SEC來顯示，并不依賴于測定BMP分子的化學純度從而測定配方的性能的模糊生物測定法。出于本發明的目的，術語“穩定性”和“純度”可互換，意在描述rp-HPLC或SEC色譜法對BMP的表征，是指主峰的曲線下面積，作為母體分子的保存率的量度。還進行了生物測定，以將BMP的穩定性與生物活性相關聯(參見圖11)。本發明的配方包括BMP、至少50%w/v海藻糖酸性溶液和至少一種選自氨基酸、三烷基銨鹽、熱休克蛋白、甜菜堿、牛磺酸、棉子糖、肌醇和天冬氨酸鉀的附加的賦形劑。海藻糖是公知的能使在溶液中和在凍干配方中的蛋白質穩定的賦形劑，但它本身不足以使體溫下的GDF-5液體溶液長期穩定。其證明是，相比于圖10所示的標準色譜圖，如圖9所示在370C的溫度下保藏14天后，rp-HPLC色譜圖中主峰減低并出現額外的峰。已報道海藻糖的溶解度為68·9g/100gH2O(Higashiyama，PureApp1.Chem.74,1263-1269(2002))。我們使用了50%和60%w/v的海藻糖溶液，研究了幾種賦形劑和它們的組合，以尋找能提供穩定的液體BMP溶液的配方，使得由在最高達37°C的溫度下保藏30天或更長時間后rp-HPLC或SEC色譜圖中的主峰證明，蛋白質純度保留至少80%。經過大量的實驗，我們發現賦形劑的某些組合在達到這個目標方面是有價值的。我們還嘗試提高不同配方的PH，以使蛋白質發生酸水解和切割的潛在可能性減至最低。期望的pH范圍為約2.5至約7.0，更優選約4.0至約6.0。較低的pH值往往導致較高的蛋白質酸水解速度，而較高的PH值往往造成蛋白質不溶解。優選鹽酸，因為它具有生物相容性，且優選的量為0.5至約3毫摩爾濃度，不過最高達約10毫摩爾濃度HCl的更高的量也是可接受的。對本領域普通技術人員顯而易見的是，其他生物相容性的酸也可用于本發明的配方。除了海藻糖外，還試驗了不同濃度的氧化三甲銨二水合物(TMAO)，大體上發現對蛋白質的穩定性具有有害作用。添加0.1%w/v的ΤΜΑ0，主峰保留86%，可以接受，但隨著TMAO濃度的增加，導致蛋白質穩定性下降(配方1-4)。在比較β-丙氨酸含量均為0.5%w/v的配方15和17時發現，添加0.1%w/vTMAO使蛋白質穩定性從89%降低到了84%。在包含棉子糖和肌醇的其他配方中，TMA0的添加也似乎對蛋白質穩定性具有有害作用。3%棉子糖和肌醇的配方具有令人滿意的性能，然而隨著TMA0添加量的增加，對蛋白質穩定性的有害作用也增加(參見配方10-13)。熱休克蛋白是本領域熟知的，其能夠使一些生物系統對熱應激穩定(參見例如Nakamoto等人，CellMolLifeSci.Feb；64(3):294_306(2007))。在含60%海藻糖的⑶F-5溶液中，以0.1%和0.2%w/v的水平試驗了熱休克蛋白70，得出可接受的結果，主峰分別保留92%和91%。三甲銨鹽酸鹽(TMA)是一種公知的賦形劑，將其以不同的濃度在幾個配方中與海藻糖一起進行試驗，另外還與丙氨酸一起進行試驗。除了具有50%海藻糖溶液的配方36外，TMA在所有配方中都得出令人滿意的結果。由于TMA有強烈的令人不快的氣味，研究了三乙銨鹽酸鹽(TEA)作為TMA的合適替代品的潛在可能性。直接比較配方18和21得知，TEA事實上是TMA的合適替代品，能很好地使蛋白質穩定化，如圖2和5所證明。事實上，圖5顯示在所有受試的配方中，含TEA的配方21提供了最佳的總體長期性能，在37°C下60天后主峰保留91%。甜菜堿是任何具有帶正電的陽離子官能團(如銨離子或膦離子)且具有帶負電的官能團(如羧基)的中性化學化合物。這些化合物作為兩性離子存在，在生物系統中充當有機滲壓劑，是有用的賦形劑。在歷史上，在糖用甜菜中發現了化合物三甲基甘氨酸后，甜菜堿這個術語就專用于這個化合物。三甲基甘氨酸鹽酸鹽是本發明的示例性甜菜堿，在幾種配方中以0.5%w/v水平與海藻糖和其他賦形劑在一起時，顯示出可接受的性能(參見配方23、24、28和32)。已知氨基酸能提供緩沖能力，設想將它們用作本發明的賦形劑。合適的氨基酸的實例包括但不限于丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸的異構體，作為可用作緩沖劑的示例性氨基酸。各種氨基酸可單獨使用或者組合使用以提供緩沖能力。在幾種配方中將丙氨酸作為氨基酸緩沖劑進行了試驗，大體上發現具有有益性質。對于含海藻糖和丙氨酸的配方，丙氨酸濃度為0.25%直至2%w/v(配方14、15和34)得出可接受的結果，但在和5%溶液(配方33和35)中沒有得到可接受的結果。配方19包括0.5%0-丙氨酸和0.牛磺酸，得出優異的結果，在37°C下30天后rp-HPLC和SEC均顯示穩定性在90%以上，且60天后穩定性達88%。配方23包括0.5%甜菜堿、1%TEA和分別0.5%的L-脯氨酸和天冬氨酸鉀，在37°C下30天后得出優異的結果，穩定性在90%以上，但在60天后穩定性為78%。其他采用L-脯氨酸和天冬氨酸鉀、得出可接受的結果的配方包括配方24和28，在37°C下30天后穩定性分別為82%和83%。為確認rp-HPLC主峰所表示的蛋白質穩定性與GDF-5蛋白的生物活性之間的相關性，將配方18暴露于37°C達60天，與標準的GDF-5蛋白質溶液進行比較，并與在時間0時的該配方進行比較。⑶F-5的生物活性是用不同濃度的⑶F-5在骨髓基質細胞系W-20-17上進行測量。由比色測定法測出，增加⑶F-5的量，W-20-17中的堿性磷酸酶(ALP)就增加。在圖11中，將配方18在時間0時和在37°C下60天后的ALP生物測定結果與剛制備的無賦形劑的標準GDF-5溶液進行比較。所有三條曲線都顯示相似的形狀，表明該配方并不降低在時間0時的活性，且該配方在37°C下60天后還提供活性蛋白質。在一個實施例中，本發明包括這樣的配方，其包含至少50%w/v海藻糖酸性溶液、8BMP和以約0.至約5%w/v的濃度存在的三烷基銨鹽。在優選的實施例中，三烷基銨鹽可以是三甲基銨鹽酸鹽、三乙基銨鹽酸鹽或者它們的組合，不過本領域技術人員會認識，對所述烷基基團、所述鹽或者同時對所述烷基基團和所述鹽的次要置換或修飾，也認為是本發明的等同物。在另一個實施例中，配方包含至少50%w/v海藻糖酸性溶液、BMP和至少一種以約0.25%至約5%w/v的量存在的氨基酸。在一個優選的實施例中，所述至少一種氨基酸是3-丙氨酸，以約0.5%w/v的量存在。在另一個實施例中，所述至少一種氨基酸是甘氨酸和丙氨酸的組合，各自以約0.至約2.5%w/v的量存在。在一個優選的實施例中，丙氨酸以約0.25%的量存在，甘氨酸以約0.25%w/v的量存在。在另一個實施例中，所述氨基酸是L-甘氨酸、L-脯氨酸和L-丙氨酸的組合，各自以約0.至約2.5%w/v的量存在。在另一個實施例中，配方包含至少50%w/v海藻糖酸性溶液、BMP和以約0.1%至約0.2%w/v的量存在的熱休克蛋白。在一個優選的實施例中，熱休克蛋白是熱休克蛋白-70，以約0.1%w/v的量存在。在另一個實施例中，配方包含至少50%w/v海藻糖酸性溶液、BMP、以約0.25%至約5%w/v的量存在的0-丙氨酸和以約0.01%至約w/v的量存在的牛磺酸。在一個優選的實施例中，0“丙氨酸以約0.5%w/v的量存在，牛磺酸以約0.1%w/v的量存在。在另一個實施例中，配方包含至少50%w/v海藻糖酸性溶液、BMP、以約0.25%至約5%w/v的量存在的丙氨酸和以約0.至約5%w/v的量存在的三烷基銨鹽。在一個優選的實施例中，0_丙氨酸以約0.5%w/v的量存在，三烷基銨鹽是三乙基銨鹽酸鹽，以約0.w/v的量存在。在另一個實施例中，配方包含至少50%w/v海藻糖酸性溶液、BMP、以約至約5%w/v的量存在的棉子糖和以約0.至約3%w/v的量存在的肌醇。在一個優選的實施例中，棉子糖以約3%w/v的量存在，肌醇以約w/v的量存在。在另一個實施例中，配方包含至少50%w/v海藻糖酸性溶液、BMP、以約0.25%至約5%w/v的量存在的0-丙氨酸、以約0.至約5%w/v的量存在的三乙基銨鹽酸鹽、以約0.1至約3%w/v的量存在的L-脯氨酸和以約0.1至約3%w/v的量存在的天冬氨酸鉀。在一個優選的實施例中，丙氨酸以約0.5%w/v的量存在、三乙基銨鹽酸鹽以約w/v的量存在，L-脯氨酸以約0.5%w/v的量存在，天冬氨酸鉀以約0.5%w/v的量存在。以下實例說明本發明各個實施例和優點中的一些，但是本領域技術人員會認識，可不偏離本發明的范圍和目的，作出其他類似的實施例。實例實例1海藻糖60%w/v本體溶液的制備小心稱取165.78g的海藻糖二水合物(分子量378.34)，轉移到250mL大小的清潔容量瓶中，向瓶中慢慢加入lmmolHC1，正好到刻度線下方。通過振搖將混合物充分混合，并在60°C溫水中溫熱。通過加入更多的lmmolHC1和讓所有的晶體完全溶解，使體積達到250mL；然后將所得溶液濾過0.2um濾器。此溶液用于各配方的制備。對于配方32和36，按類似的方式用50%海藻糖溶液制備50%w/v溶液。實例2本發明組合物的制備的一個非限制性實例如下(配方19)小心稱取165.78g的海藻糖二水合物(分子量378.34)，轉移到清潔的250mL容量瓶中，向瓶中慢慢加入lmmolHC1，正好到刻度線下方，以產生60%w/v溶液。通過振搖將混合物充分混合，并在60°C溫水中溫熱。通過加入更多的lmmolHC1和確保所有的海藻糖晶體完全溶解，使體積達到刻度；然后將所得溶液濾過0.22ym濾器。向10mL的60%海藻糖溶液加入51mg的3-丙氨酸和10mg的牛磺酸。將混合物漩動，加入lOOOug(lmg)的rh⑶F-5(于溶液中)。紫外檢測配方的蛋白質濃度，確保達到所需的濃度，按需加入溶劑或蛋白質加以調整。實例3:在一個優選的實施例中，如下制備本發明的配方(配方21)小心稱取165.78g的海藻糖二水合物(分子量378.34)，轉移到250mL大小的清潔容量瓶中，向瓶中慢慢加入lmmolHC1，正好到刻度線下方，以產生60%w/v溶液。通過振搖將混合物充分混合，并在60°C溫水中溫熱。通過加入更多的lmmolHC1和確保所有的海藻糖晶體完全溶解，使體積達到刻度；然后將所得溶液濾過0.22ym濾器。向10mL的60%海藻糖溶液加入50mg的0-丙氨酸和10mg的三乙胺鹽酸鹽(TEA)。將混合物漩動，加入lOOOug(lmg)的rhGDF-5(于溶液中)。紫外檢測配方的蛋白質濃度，確保達到所需的濃度，按需加入溶劑或蛋白質加以調整。實例4:在一個優選的實施例中，如下制備本發明的配方(配方32)小心稱取55.27g的海藻糖二水合物(分子量378.34)，轉移到100mL大小的清潔容量瓶中，向瓶中慢慢加入lmmolHC1，正好到刻度線下方，以產生50%w/v溶液。通過振搖將混合物充分混合，并在60°C溫水中溫熱。通過加入更多的lmmolHC1和確保所有的海藻糖晶體完全溶解，使體積達到刻度；然后將所得溶液濾過0.22ym濾器。向10mL的50%海藻糖溶液加入50mg的甜菜堿。將混合物漩動，加入lOOOug(lmg)的rh⑶F-5(于溶液中)。紫外檢測配方的蛋白質濃度，確保達到所需的濃度，按需加入溶劑或蛋白質加以調整。所用的材料和設備1.1海藻糖二水合物，Ferro-Pfanstiehl#T-104-1-MC1.2甘氨酸，超純級，J.T.Baker#4059-001.30-丙氨酸，99%，々1(11^(^#2397201.412MHC1,EMScience#HX0603P/5(濃縮儲備試劑)1.5氧化三甲胺二水合物(TMA0)，Sigma#T05141.6三甲銨鹽酸鹽(TMA)，98%，Aldrich#T727611.7三乙銨鹽酸鹽(TEA)，Fluka#903501.8牛磺酸，99%，Sigma#T06251.9甜菜堿，Sigma#B35011.10肌醇，99%Sigma-Aldrich#151251.llD_(+)_棉子糖，五水合物，98%，Sigma#R02501.12HSP70,Sigma-Aldrich#H7283-1MG1.13過濾組件，250mL,0.22微米膜，Nalgene#568-00201.14滅菌的250mL方型PETG培養基瓶，Nalgene#2019-02501.15紫外可見分光光度計，Beckman-CoulterDU800,ID#4942031.16rh⑶F-5使用前在2-8°C下解凍1.17注射用水，Baxter#2B03061.18rp-HPLC:Waters型號2596，Vydac218TP52,C18柱，用0.15%(v/v)TFA水溶液+0.15%(v/v)TFA乙腈溶液洗脫，流速0.3mL/min。在214nm處監測洗脫峰。1.19SEC:ffaters型號2596，T0S0HBioscience,目錄號08540，用0.1%(v/v)TFA和45%(v/v)乙腈水溶液洗脫，流速0.5mL/min。在280nm處監測蛋白質峰。表1所列的配方按與以上實例中描述的方法類似的方式制備。對各配方評估它們使rhGDF-5蛋白質分子在高溫下長時間穩定的能力，這種能力由rp-HPLC表征，在一些選定樣品中還由SEC表征。權利要求組合物，包含GDF-5酸性溶液、60％w/v海藻糖和至少一種選自氨基酸、三烷基銨鹽、熱休克蛋白、甜菜堿、牛磺酸、棉子糖、肌醇和天冬氨酸鉀的附加的賦形劑。2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述氨基酸選自丙氨酸、L-甘氨酸和L-脯氨酸。3.根據權利要求2所述的組合物，其中所述氨基酸由以約0.25%至約5%w/v的量存在的丙氨酸構成。4.根據權利要求3所述的組合物，其中所述0-丙氨酸以約0.5%w/v的量存在。5.根據權利要求1所述的組合物，其中所述至少一種附加的賦形劑由以約0.至約3%w/v的量存在的三烷基銨鹽構成。6.根據權利要求5所述的組合物，其中所述三烷基銨鹽是三乙基銨鹽酸鹽。7.根據權利要求1所述的組合物，其中所述至少一種附加的賦形劑由以約0.25%至約5%w/v的量存在的氨基酸和以約0.至約3%w/v的量存在的三烷基銨鹽構成。8.根據權利要求7所述的組合物，其中所述至少一種附加的賦形劑由以約0.5%w/v的量存在的0“丙氨酸和以約0.1%w/v的量存在的三乙基銨鹽酸鹽構成。9.根據權利要求1所述的組合物，其中所述熱休克蛋白是以約0.至約0.2%w/v的量存在的HSP70。10.根據權利要求1所述的組合物，其中所述至少一種附加的賦形劑由以約0.5%w/v的量存在的0“丙氨酸和以約0.1%w/v的量存在的牛磺酸構成。11.根據權利要求1所述的組合物，其中所述附加的賦形劑是以約0.5%w/v的量存在的甜菜堿。12.使GDF-5溶液穩定化的方法，所述方法包括提供GDF-5酸性溶液，加入一定量的海藻糖以提供海藻糖的60%w/v溶液，以及加入至少一種選自氨基酸、三烷基銨鹽、熱休克蛋白、甜菜堿、牛磺酸、棉子糖、肌醇和天冬氨酸鉀的附加的賦形劑，其中由通過色譜法得出的蛋白質主峰保持率為至少80%證明，所述⑶F-5溶液在最高達37°C的溫度下穩定至少30天。全文摘要本發明提供了供在高溫下長時間使用的骨形態發生蛋白液體配方。更具體地講，本發明涉及包含rhGDF-5、海藻糖和一種或多種能使得蛋白質在最高達體溫的溫度下穩定至少30分鐘的生物相容性賦形劑的液體配方。文檔編號A61K38/18GK101801404SQ200880022741公開日2010年8月11日申請日期2008年6月24日優先權日2007年6月29日發明者J·羅佩斯,V·加里加帕蒂,蘇東靈申請人:先進科技及再生醫學有限責任公司