專利名稱：：富組蛋白的環狀類似物的應用方法和組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及富組蛋白的環狀類似物，以及涉及它們在新組合物和治療方法中的應用。
背景技術：
：真菌和細菌感染是不斷上升的健康風險，有證據顯示在全世界7個主要市場中有900萬患者患有這些感染。有風險的患者包括經歷外科手術的患者、白血病和HIV/AIDS患者和由于癌癥、外科手術或器官移植而導致免疫低下的患者。這部分地是由于微生物中的抗生素耐受性發展的結果。因此，對于殺菌劑特別是殺真菌和殺細菌劑的需要在不斷增長并且未能滿足，這昭示了開發對人類具有高效的無毒殺真菌劑的市場機遇。發明說明富組蛋白的環狀類似物已經被確定可單獨或與其他殺菌劑結合用于治療人類的微生物感染。所述環狀類似物比目前使用的殺菌劑效力更強而且毒性更低。此外，包括所述環狀類似物與其他殺菌劑的組合物具有協同作用，表現出比預期更強的活性。因此，本發明的一個方面提供一種治療人類的微生物感染的方法，包括對所述人類給予治療有效量的富組蛋白的環狀類似物。本發明的另一方面提供一種治療人類的微生物感染的殺菌組合物，包括與可藥用的載體結合的富組蛋白的環狀類似物。本發明的又一方面提供一種治療微生物感染的組合物，包括富組蛋白的環狀類似物和第二種殺菌劑。本發明的其他方面提供試劑盒和制品。試劑盒包括富組蛋白的環狀類似物以及對應方法如使用說明。一種依照本發明的制品包括其內部是包含富組蛋白的環狀類似物的殺菌組合物的包裝。所述包裝上貼有標簽以指示所述組合物適于治療人類的微生物感染。本發明的另一方面提供一種治療哺乳動物中微生物感染的方法，包括對所述哺乳動物給予殺菌劑與靶向于微生物線粒體的栽體分子。本發明的另一方面包括一種抑制微生物菌絲體生長的方法，包括使富組蛋白的環狀類似物與微生物接觸。本發明的又一方面提供一種治療哺乳動物中微生物感染的方法，包括對所述哺乳動物給予治療有效量的富組蛋白的環狀類似物，所述富組蛋白環狀類似物靶向于選自下列的一種蛋白微管相關蛋白(YTM1)、隔蛋白(septin)(CDC3)、紡錘體動態控制蛋白(SLK19)、G蛋白功能調控蛋白(CRP1)、HSP70家族成員(SSA2)、烯醇酶I(ENOl)、HSP成員(SSE1)、26S蛋白酶體亞基(RPT5)、HSP卯、線粒體HSP蛋白(SSC1)、ATP酶復合物的P1亞基(ATP2)、線粒體烏頭酸酶/水合酶(AC01)和微粒體ATP酶(CDC48)、RAV1、HSP60、二氫硫辛酰胺脫氬酶(LPD1)、60S核糖體亞基蛋白L3(RPL3)和絲氨酰-tRNA合成酶(SESl)。本發明的另一方面提供一種篩選候選殺菌化合物的方法。該方法包括以下步驟1)使候選化合物接觸至少一種選自以下蛋白的靶標微管相關蛋白(YTM1)、隔蛋白(CDC3)、紡錘體動態控制蛋白(SLK19)、G蛋白功能調控蛋白(CRP1)、HSP70家族成員(SSA2)、烯醇酶I(ENOl)、HSP成員(SSE1)、26S蛋白酶體亞基(RPT5)、HSP卯、線粒體HSP蛋白(SSC1)、ATP酶復合物的P1亞基(ATP2)、線粒體烏頭酸酶/水合酶(AC01)和微粒體ATP酶(CDC48)、RAV1、HSP60、二氬硫辛酰胺脫氳酶(LPD1)、60S核糖體亞基蛋白L3(RPL3)和絲氨酰-tRNA合成酶(SESl);和2)檢測所述化合物是否與所述靶標之一締合或相互作用，其中與靶標的相互作用表明所述化合物可具有殺菌活性。通過以下詳述、權利要求和附圖會對本發明的上述和其他方面、特性以及優點更加清楚。圖1示出了若干富組蛋白的M^列；圖2圖示了溫度對富組蛋白的環狀類似物的影響(A)以及5jiM和50HM劑量的所述環狀類似物的活性(B)。圖3圖示了與酮康唑的毒性相比，富組蛋白的環狀類似物對人類原代培養細胞無毒性；和圖4是說明與富組蛋白的環狀類似物締合的微生物蛋白的種類的餅具體實施例方式本發明提供了用于治療人類的微生物感染的方法和組合物，包括給予富組蛋白的環狀類似物或者其變體或衍生物。可用于本發明組合物的方法的富組蛋白環狀類似物在美國專利No.6，555，650中和Brewer,etal.(2002)Biochemistry41:5526-5536中被描述和表征，這兩篇文獻都以引用的方式整體納入本文中。通常，本文所用的術語"富組蛋白的環狀類似物"是指由任何其長度適于穩定環化的富組蛋白或者其衍生物或變體構成的具有殺菌活性的環狀類似物，包括例如圖1所列的富組蛋白l(H-l)到富組蛋白12(H-12)，特別是富組蛋白H-l到富組蛋白H-6，更特別地是H-1、H-3和H-5。用于富組蛋白的術語"變體"是指大部分序列與富組蛋白具有同源性的分子，如至少約60%的同源性，優選至少約80%的同源性，和更優選至少約90-95%的同源性。合適的變體的實例包括這樣的富組蛋白，即其中將賴氨酸、谷氨酸或半胱氨酸殘基引入所述富組蛋白以置換一個或多個現有氨基酸殘基，從而得到更易于環化形成環狀富組蛋白類似物。本文用于富組蛋白的術語"衍生物"是指在活性位點上(例如游離的氣基或a基團或者其他支鏈基團上)含有一種或多種修飾的富組蛋白分子。可進行這些修飾以賦予所述富組蛋白類似物所需的性質，例如增加的穩定性或提高的細胞吸收。一種符合本發明的環狀富組蛋白類似物在本文中稱為DB2121，其氨基酸序列為RHHCYKRKFHEKHHCHRGY(SEQIDNO:1)。美國專利No.6，555，650描述了這種環狀組蛋白類似物的制備，通常包括肽合成的標準方法，然后在需要的地方進行氮基酸置換以利于環化。然后，如本領域技術人員能理解的和如美國專利No.6,555,650中所描述的那樣，將線性富組蛋白肽在適于環化的條件下環化，此過程依賴參與所述環化反應的氨基酸殘基。根據本發明的方法，富組蛋白的環狀類似物已被確定可用于治療微生物感染，包括例如細菌感染和真菌感染。因此，本發明的富組蛋白的環狀類似物可用于治療由下列微生物導致的人類細菌感染鏈球菌屬(Streptococcus),葡萄球菌屬(Staphylococcus)、博德特氏菌屬(BordeteUa)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium),奈瑟氏菌屬(Neisseria)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線菌類(Actinomycetes)、鏈霉菌屬(Streptomycetes)、諾卡菌屬(Nocardia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弗朗西斯氏菌屬(Fancisella)、巴斯德氏菌屬(Pasturella)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、不動細菌屬(Acinetobacter)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、李斯特氏桿菌屬(Listeria)、莢膜菌屬(Calymmatobacterium)、布魯氏菌屬(Brucella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、密螺旋體屬(Treponema),埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、克雷白氏桿菌(Kleibsiella)、弧菌屬(Vibrio)、變形桿菌屬(Proteus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、包柔氏螺旋體菌(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(L印tospira)、螺旋狀菌屬(Spirillum)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、志賀氏菌屬(Shigella)、軍團桿菌屬(Legionella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、立克次氏體(Rickettsia)、衣原體(Chlamydia)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)和支原體(Mycoplasma);還包括但不限于A群鏈球菌、B群鏈球菌、C群鏈球菌、D群鏈球菌、G群鏈球菌、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、酉良腺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、無鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、糞鏈球菌(Streptococcusfaecium)、堅忍鏈球菌(Streptococcusdurans)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrheae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiptheriae)、陰道加德納菌(Gardnerellavaginalis)、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、潰瘍分枝桿菌(Mycobacteriumulcerans)、麻風分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)、以色列放線菌(Actinomycesisraelii)、單核細胞增多性李氏菌(Listeriamonocytogenes)、百日咳桿菌(Bordetellapertusis)、齒J百日咳桿菌(Bordatellaparapertusis)、支氣管敗血性博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae),埃及嗜血桿菌(Haemophilusaegyptius)、葛'J流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)、杜克雷嗜血桿菌(Haemophilusducreyi)、博德特氏菌(Bordetella)、傷寒桿菌(Salmonellatyphi)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)、肺炎克雷白軒菌(Kleibsiellapneumoniae)、粘質沙雷氏菌(Serratiamarcessens)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenterii)、痢疾桿菌(Shigellaflexneri)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、拉熱弗郎西絲氏菌(Franscisellatularensis)、流產布魯氏菌(Brucellaabortis)、炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破傷風桿菌(Clostridiumtetani)、肉毒桿菌(Clostridiumbotulinum)、梅毒螺旋體(Treponemapallidum)、立克次氏體(Rickettsiarickettsii)、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)或沙目艮衣原體(Chlamydiatrachomitis)。人類中由細菌感染引起的疾病的非限制性實例包括中耳炎(otitismedia)、結膜炎(conjunctivitis)、肺炎(pneumonia)、菌血癥(bacteremia)、腦膜炎(meningitis)、鼻竇炎(sinusitis)、腺胸(pleuralempyema)和心內膜炎(endocarditis)以及如腦脊液感染的腦膜炎(meningitis)。所述富組蛋白的環狀類似物也可用于治療由例如下列真菌引起的人類真菌感染隱球菌屬(Cryptococcusspp.)、念珠菌屬(Candidaspp.)、曲霉屬(Aspergillusspp.)、組織胞漿菌屬(Histoplasmaspp.)、球孢子菌屬(Coccidioidesspp.)、葛'J球孢子菌屬(Paracoccidioidesspp.)、芽生菌屬(Blastomycesspp.)、鐮刀菌屬(Fusariumspp.)、抱子絲菌屬(Sporothrixspp.)、毛抱子菌屬(Trichosporonspp.)、球擬酵母屬(Torulopsisspp.)、根霉屬(Rhizopusspp.)、假阿利什菌屬(Pseudallescheriaspp.)、皮膚褲菌屬(Dermatophytesspp.)、擬青霉屬(Paeciliomycesspp.)、交鏈孢屬(Alternariaspp.)、彎孢菌屬(Curvulariaspp.)、夕卜瓶霉屬(Exophialaspp,)、萬吉拉菌屬(Wangiellaspp.)、青霉菌屬(Penicilliumspp.)、酵母屬(Saccharomycesspp.)、暗色真菌(Dematiaceousfungi)和卡氏肺嚢蟲(Pneumocystiscarinii)。由真菌感染引起的疾病的非限制性實例包括隱球菌性腦膜炎(cryptococcalmeningitis),腳褲(athlete，sfoot)、酵母感染、霉菌和霉病相關疾病、鵝口疾(thmsh)、組織胞漿菌病(histoplasmosis)、釀母菌病(blastomycosis)、曱褲(onychomyosis)和褲感染，如頭癬(Tineacapitis)、花斑褲(Tineaversicolor)和足褲(Tineapedis)。對人類給予治療有效量的富組蛋白環狀類似物以治療微生物感染。本文所用的術語"治療有效的"劑量是指對治療給定微生物感染有效而不導致不可接受的有害副作用的劑量。術語"給予"是指任何合適的向接受者提供所述環狀富組蛋白藥劑的方式，所述方式倚賴如下所述的所用的給藥形式。例如，如下文所詳述的，所述藥劑可通過口服、注射、經黏膜和局部方式給予。術語"治療"是指對引起感染的微生物的至少部分抑制，所述抑制可使所述感染的一種或多種癥狀改善。因此，本方法的治療有效劑量為每公斤體重0.01ng到約10g,優選地為每公斤約1ng到約0.1g，更優選地為每公斤約100ng到約10mg。然而，如本領域技術人員可理解的，所述富組蛋白的環狀類似物的治療有效劑量會根據被治療患者的癥狀、年齡和體重，要治療或預防的感染的性質和嚴重程度以及給藥途徑而變化。本發明的富組蛋白類似物可單次或分次給藥。在人類的微生物感染的治療中，可單獨或者以與可藥用的佐劑或載體結合的組合物的形式給予所述富組蛋白的環狀類似物。表述"可藥用的"是指在藥學領域的應用是可接受的，即沒有不可接受的毒性或其他不適于對人給藥的的性質。可藥用的佐劑的實例包括但不限于稀釋劑、賦形劑等。可參考"Remington's:TheScienceandPracticeofPharmacy",21stEd.，LippincottWilliams&Wilkins，2005作為一般藥物制劑的指南。佐劑的選擇依賴于擬采用的給予所述組合物的方式。在本發明的一個實施方案中，將所述化合物配制成用于通過輸注或者皮下或靜脈注射給藥，并因此以無菌和無熱原的并任選地被緩沖或等滲的水溶液形式使用。因此，所述化合物可在蒸餾水中或更優選地在鹽水、磷酸緩沖鹽水或5%葡萄糖溶液中被給藥。制備用于通過片劑、膠嚢、糖錠、水或非水液體中的溶液或懸浮液、水包油或油包水乳液、酏劑或糖漿來口服的組合物，使用的佐劑包括糖類例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物包括羥曱基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；西黃蓍膠粉；麥芽；明膠；滑石粉；硬脂酸；硬脂酸鎂；硫酸釣；植物油如花生油、棉籽油、芝麻油、橄攬油和玉米油；多元醇如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；瓊脂；海藻酸；水；等滲鹽水和磷酸緩沖溶液。也可存在潤濕劑、潤滑劑例如十二烷基琉酸鈉、穩定劑、制錠劑、崩解劑、抗氧化劑、防腐劑、著色劑和調味劑。在另一個實施方案中，所述環狀類似物可被配制為用于局部涂敷的霜劑、洗劑或軟膏。對于這種局部涂敷，所述環狀類似物與一種合適的基質如甘油三酯基質結合。這些霜劑、洗劑和軟骨還可包含表面活性劑和其他化妝品添加劑例如柔膚水等以及香水。也可使用合適的推進劑佐劑制備用于例如鼻腔給藥的氣霧制劑。本發明組合物也可作為丸劑、藥糖劑或貼劑給藥。還包括粘膜給藥的組合物，包括口服、鼻內、直腸或陰道給藥以治療影響這些區域的感染。這些組合物通常包括一種或多種合適的非刺激性賦形劑或載體，包括例如可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟、水楊酸鹽或其他合適的載體。不管所述組合物是如何被給藥的，中二、，"、、''，"因此，在優選地具有殺菌性質的組合物中可包括本發明的富組蛋白的環狀類似物，所述組合物例如治療上述特定感染的藥物；其他衛生保健產品如外傷處理、滴眼劑、牙膏、漱口水或漱口劑、肥皂、沐浴液、香波、潤膚液；以及美容產品如粉底或其他化妝品。在本發明的另一方面，可對需要微生物感染治療的哺乳動物結合給予所述富組蛋白的環狀類似物與另一種活性成分，例如第二種殺菌劑如一種殺真菌劑或殺細菌劑。可在本發明的組合物和方法中用作第二種殺菌劑的殺細菌劑包括但不限于頭孢菌素類抗菌素(c印halosporins)包括第一代頭孢菌素如頭孢羥氨千(Cefadroxil)、頭孢唑啉(Cefazolin)、頭孢氨節(Cephalexin),頭孢嚷汾(Cephalothin)、頭孢吡碌"Cephapirin)和頭孢拉定(Cephradine);第二代頭孢菌素如頭孢克洛(Cefaclor)、頭孢孟多(Cefamandol)、頭孢尼西(Cefonicid)、頭孢替坦(Cefotetan)、頭孢西丁(Cefoxitin),頭孢丙烯(Cefprozil)、頭孢美唑(Ceftmetazole)、頭孢吹辛(Cefuroxime)、頭孢吹辛酉旨(Cefuroximeaxetil)和氯碳頭孢(Loracarbef);第三代頭孢菌素如頭孢地尼(Cefdinir)、頭孢布烯(Ceftibuten)、頭孢妥侖(Cefditoren)、頭孢他美(Cefetamet)、頭孢泊將(Ce印odoxime)、頭孢丙烯(Cefprozil)、頭孢呔辛(酯)(Cefuroxime(axetil))、頭孢吹辛(鈉)(Cefuroxime(sodium))、頭孢派酮(Cefoperazone)、頭孢克肝(Cefixime)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢泊將酯(Cefpodoximeproxetil)、頭孢他咬(Ceftazidime)、頭孢唑將(Ceftizoxime)和頭孢曲松(Ceftizoxime);和第四代頭孢菌素如頭孢吡將(Cefepime);喹諾酮類(quinolones)和氟全諾酮類(fluoroquinolonesands)如西諾沙星(Cinoxacin)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、依諾沙星(Enoxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、p米莫特(Grepafloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、萘咬酸(Nalidixicacid)、諾氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、曲訐戈沙星(Trovafloxacin)、惡會酸(Oxolinicacid)、氟會諾酮類吉米沙星(Gemifloxacin)，和甲氟哌酸(Perfloxacin);青霉素類(penicillins)如阿莫西林(Amoxicillin)、氨節青霉素(Ampicillin)、巴氨西林(Bacampicillin)、卡茚西林(CarbenicillinIndanyl)、美洛西林(Mezlocillin)、派拉西林(Piperacillin)和替卡西林(Ticarcillin);青霉素/P內酰胺酶抑制劑如阿莫西林克拉維酸(Amoxicillin-ClavulanicAcid)、氨卡西林/舒巴坦(Ampicillin-Sulbactam)、氨芐青霉(Benzylpenicillin)、鄰氯青霉素(Cloxacillin)、雙氯西林(Dicloxacillin)、甲氧苯青霉素(Methicillin)、苯曱異惡唑青霉素(Oxacillin)、青霉素G(千星(Benzathine)、鉀、普魯卡因)、青霉素V、哌拉西林(Piperacillin)+他唑巴坦(Tazobactam)、替卡西林+克拉維酸和萘夫西林；碳青霉烯類(carbapenems)如亞胺培南西司他丁(Imipenem-Cilastatin)及美羅培南(Meropenem);單酰胺菌素(monobactam)如氨曲南(Aztreonam);大環內酯類(macrolides)和林可胺類(lincosamines)如阿奇霉素(Azithromycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、克林霉素(Clindamycin)、地紅霉素(Dirithromycin)、紅霉素(Erythromycin)、林可霉素(Lincomycin)和醋竹桃霉素(Troleandomycin);糖肽類如替考拉寧(Teicoplanin)和萬古霉素(Vancomycin);利福平類(rifampins)如利福布丁(Rifabutin)、利福平(Rifampin)和利福噴丁(Rifapentine);噁喳烷酮類(oxazolidonones)如利奈哇酮(Linezolid);四環素類(tetracyclines)如美環素(Demeclocycline)、強力霉素(Doxycycline)、曱烯土霉素(Methacycline)、二曱胺四環素(Minocycline)、土霉素(Oxytetracycline)、四環素和金霉素(Chlortetracycline);氨基糖苷類如丁胺卡那霉素(Amikacin)、慶大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、新霉素(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、鏈霉素(Streptomycin)、妥布霉素(Tobramycin)和巴龍(Paromomycin);鏈P曰菌素類(streptogramin)如(Quinopristin)+達福普汀(Dalfopristin);磺胺類藥如(Mafenide)、銀磺胺嘧啶(SilverSulfadiazine),磺胺醋酰(Sulfacetamide)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺曱基異惡唑(Sulfamethoxazole)、柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、硫代異惡唑(Sulfisoxazole)、曱氧千氨嘧咬(Trime也oprim)-磺胺甲基異惡喳(Sulfamethoxazole)和磺胺曱噢二唑(Sulfame也izole);以及其他抗生素如軒菌肽(Bacitracin)、氯霉素(Chloramphenicol)、腸粘菌素(Colistemetate)、磷霉素(Fosfomycin)、異煙肼(Isoniazid)、烏洛托品(Methenamine)、滅滴靈(Metronidazol)、莫匹羅星(Mupirocin)、吹喃妥因(Nitrofurantoin)、吹喃西林(Nitrofurazone)、新生霉素(Novobiocin),多粘菌素B(PolymyxinB)、大觀霉素(Spectinomycin)、甲氧千氨嘧啶(Trimethoprim)、粘桿菌素(Colistin)、絲氨酸(Cycloserine)、巻曲霉素(Capreomycin)、吡喚酰胺(Pyrazinamide)、對氛基水楊酸(Para-aminosalicyclicacid)和號乙紅霉素(Erythromycinethylsuccinate)+碌胺異惡喳(sulfisoxazole)。可在本發明的組合物和方法中用作第二種殺菌劑的殺真菌劑的實例包括但不限于唑類(azoles)如氟康唑(fluconazoles)、伏立康唑(voriconazoles)、克霉峻(clotrimazoles)、伊曲康峻(itraconazoles)、酮康喳(ketoconazoles)、咪康唑(miconazoles)、ER30346、SCH56592;多烯類如兩性霉素(amphotericinB)、制霉菌素(nystatins)或者其脂質體及其脂質形式如Abelcet、AmBisome和Amphocil;噤呤或嘧咬核苷酸酶抑制劑如氟胞嘧咬(flucytosines);或多氧菌素(polyoxin)如尼柯霉素(nikkomycinss)，特別是尼柯霉素Z或其他幾丁質抑制劑、延伸因子抑制劑如糞殼菌素(sordarin)及其類似物、甘露聚糖酶抑制劑如predamycin、殺菌/通透性誘導(BPI)的蛋白質產品如XMP,97或XMP.127。所述環狀富組蛋白抑制劑和第二種殺菌劑在感染的治療中可單獨或結合給予哺乳動物。本文所用的術語"哺乳動物"包括人類和非人哺乳動物。此夕卜，所述富組蛋白的環狀類似物可與第二種殺菌劑結合得到一種有效的殺菌組合物。所述組合物還可包括可藥用的佐劑以有利于以上述選定的劑型給藥。如本領域技術人員可理解的，富組蛋白環狀類似物與第二種殺菌劑結合的量要隨著所用的富組蛋白環狀類似物以及所用的第二種殺菌劑而變動。通常，每種的量都是一一通過合適的試驗確定的一一適于對哺乳動物給藥而無毒性及其他不可接受的作用的量。因此，所述組合物中環狀富組蛋白的劑量可為每公斤體重0.01ng到約10g，而第二種殺菌劑的劑量為由具體試劑確定的合適劑量。在一個優選實施方案中，富組蛋白環狀類似物與另一種殺菌劑的結合得到一種這樣的組合物，即所述組合物所產生的殺菌活性大于其預期的殺菌作用，即大于所述結合的預期的累加作用，因此是一種具有協同效應的組合物。因此；所述結合組合物中所述環狀富組蛋白和第二種殺菌劑每種的劑量都有益地小于單獨使用所述環狀富組蛋白和第二種殺菌劑時的通常給藥劑量。這對降低使用殺菌劑的全強度劑量時可能存在的毒性和其他不良作用都是特別理想的。本發明的另一方面提供一種包括殺菌組合物的試劑盒,所述組合物包括與可藥用的佐劑或載體結合的富組蛋白環狀類似物，以及順應性手段，例如其用于治療人類中微生物感染的應用說明。所述說明還可包括建議使用劑量的指示。這種試劑盒也可包括任何有利于所述組合物的正確給藥的其他順應性手段。這些順應性手段可包括補充說明、配藥方法等。或者，還提供了一種包括其中含有所述殺菌組合物的包裝的制品。在此情況下，所述包裝的標簽至少指明所述組合物適于治療人類的微生物感染，并還可指明建議劑量和其他使用條件。依照本發明的前述方面，所述試劑盒和產用用品還可包括與所述富組蛋白環狀類似物結合或單獨存在的第二種殺菌組合物。本發明的另一方面提供用作殺菌試劑的化合物的篩選方法，所述方法基于以下認定，即某些微生物蛋白是富組蛋白的環狀類似物的靶標。這些蛋白包括微管相關蛋白(YTM1)、隔蛋白(CDC3)、紡錘體動態控制蛋白(SLK19)、G蛋白功能調控蛋白(CRP1)、HSP70家族成員(SSA2)、烯醇酶I(ENOl)、HSP成員(SSE1)、26S蛋白酶體亞基(RPT5)、HSP卯、線粒體HSP蛋白(SSC1)、ATP酶復合物的^1亞基(ATP2)、線粒體烏頭酸酶/水合酶(ACOl)和微粒體ATP酶(CDC48)、RAV1、HSP60、二氫硫辛酰胺脫氫酶(LPD1)、60S核糖體亞基蛋白L3(RPL3)和絲氨酰-tRNA合成酶(SES1)。這些蛋白中的某些在念珠菌基因組數據庫(http:〃www.candidagenome.org)中的系統化名稱如下YTM1國orfl9.4815、cdc3畫orfl9.1055、SLK19-orfl9.6763、CRP1-orfl9.4784、SSA2-orfl9.1065、ENOl-orfl9.395、SSE1-orfl9.2435、SSC1-orfl9.1896、ATP2-orfl9.5653、ACOl-orfl9.6385和CDC48-orf19.2340。篩選候選殺菌劑的方法包括將所述候選化合物與一種或多種所述靶標蛋白直接或在整個細胞環境中一起孵育，并測定所述候選化合物是否以例如包括經由共價、靜電、疏水、芳香、離子和極性締合作用，通過氫的供給和接受力而與所述靶標蛋白締合。候選化合物與靶標蛋白的締合的確物細胞抑制研究的候選化合物。或者，如本領域技術人員可理解的，可用合適的測定法確定所述候選化合物是否調節所述靶標蛋白的活性。所述候選化合物通過抑制或激活調節靶標蛋白的確定指示所述候選化合物可具有殺菌活性，并因此應當進行進一步研究。盡管適于篩選的候選殺菌劑可為任何選定化合物，然而富組蛋白環狀類似物特別適于以上述方式進行篩選。對前述富組蛋白環狀類似物的靶標蛋白的識別也提供了另一種治療哺乳動物中微生物感染的方法。所述方法包括給予與靶向于選自以下的蛋白的載體結合的殺菌劑微管相關蛋白(YTM1)、隔蛋白(CDC3)、紡錘體動態控制蛋白(SLK19)、G蛋白功能調控蛋白(CRP1)、HSP70家族成員(SSA2)、烯醇酶I(ENOl)、HSP成員(SSE1)、26S蛋白酶體亞基(RPT5)、HSP90、線粒體HSP蛋白(SSC1)、ATP酶復合物的P1亞基(ATP2)、線粒體烏頭酸酶/水合酶(AC01)和微粒體ATP酶(CDC48)、RAV1、HSP60、二氳硫辛酰胺脫氬酶(LPD1)、ATP酶復合物的P1亞基(ATP2)、60S核糖體亞基蛋白L3(RPL3)和絲氨酰-tRNA合成酶(SESl)。盡管所述栽體分子可為任何適于與一種或多種所述靶標蛋白締合的分子，然而富組蛋白的環狀類似物特別適于這一目的。本領域的技術人員將認識到或者可通過使用不超過常規的實驗確定本文所述的具體實施方案的許多等價方式。盡管已經討論了本發明的具體實施方案，然而上面說明是為了闡釋而非限制。本領域技術人員可在閱讀本說明書的基礎上清楚地理解本發明的許多變化方案。本發明的全部范圍應依照本權利要求及其全部等價范圍，以及本說明書與這些變化方案而確定。后面的權利要求意欲包括這些等價方式。以下具體實施例是為了描述本發明的實施方案，而不應被認為是限制。實施例實施例1:DB2121抗真菌和細菌的活性。在多種真菌和細菌生物體中測量了所述環狀類似物DB2121抑制細胞生長的效果并將所述結果與若干已知的抗真菌化合物如酮康唑比較(表1)。DB2121在真菌或酵母菌抹中的MIC比富組蛋白H5或以前開發的專利類似物P-113強至少100倍。發現DB2121抑制革蘭氏陽性桿菌枯草芽孢桿菌(^1"7/附《|6似/)的能力比富組蛋白H5強約40倍。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>1)115=富組蛋白H5，KETO-酮康唑，FLU-氟康唑，ERTA喊曲康唑，AMP-b-兩性霉素b，P113(以前的Demegen產品)，MK^最小抑制濃度2)所有孵育均是在10mMNaCl/50mMMOPSm，pH7.2中在37X:下進行1小時。然后取等分試樣加入YPD肉湯中以測定在30t:(真菌)或37X:(細菌)下生長24小時后的MIC3)臨床念珠菌分離林為取自HIV感染患者的口腔擦拭物或血液培養物(AST97)實施例2:與另一種殺菌劑結合的活性在與上面的實施例1所述相似的細胞抑制研究中，DB2121在與其他殺菌劑(包括酮康唑、依曲康唑和氟康唑)結合使用時也顯示可殺死白色念珠菌菌林。通常，將白色念珠菌的對數生長培養物在含有20mM的Tris-Cl、卩117.2和20111]>1~3(:1的溶液中洗滌2次，然后懸浮在此溶液中。然后將多種濃度的環狀富組蛋白類似物和氟康唑、依曲康唑或酮康唑立即加入此培養物中并在37"C下劇烈振蕩1小時。取等分試樣以1:100的稀釋度加入在24孔盤中預熱的YPD培養基中。將所述盤在37X:培養箱中孵育24小時以監測生長，并確定每種化合物單獨作為對照和結合使用的最小抑制濃度。表2指出在使用富組蛋白環狀類似物和所述三種測試殺菌化合物之一的結合治療中，富組蛋白環狀類似物的濃度最多可降4氐12倍并且所需的另一殺菌化合物也較單獨給藥時為少。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>a)指環狀富組蛋白類似物b)指氟康唑、酮康唑或伊曲康唑對于這些具體結合，所述環狀富組蛋白類似物和第二殺菌劑的合適的工作范圍如下i)環狀富組蛋白類似物的量等于或大于0.37nM，酮康唑的量等于或大于0.078jiMii)環狀富組蛋白類似物的量等于或大于0.37jiM，氟康唑的量等于或大于8.15jiMiii)環狀富組蛋白類似物的量等于或大于0.37jiM,伊曲康唑的量等于或大于0.059fiM實施例3:微生物菌絲體生長的抑制根據標準方法培養白色念珠菌(SC5314)真菌。ii7v對數期后，將所述真菌細胞重懸浮于10mM磷酸鈉中并在A)50jiM酮康唑、(B)載體、(C)50jiM富組蛋白H5或(D)50jiMDB2121的存在下在37X:下培育1小時。取所述混合物的等分試樣加入含有10%FBS的YPD中并在37t:下培養。在多個時間點，用相差顯微鏡在40倍放大倍數下對所述細胞成像。所述實驗進行至少三次。當白色念珠菌用DB2121預先孵育過時，可觀察到對菌絲體生長的明顯抑制。此外，DB2121對抑制菌絲誘導之前和之后的菌絲體生長都有效(數據未顯示)。連續稀釋表明在DB2121的存在下菌絲體生長比對照和其他處理(如接觸酮康唑或富組蛋白H5)降低約500-1000倍。實施例4:用DB2121的抑制條件根據標準方法培養白色念珠菌(SC5314)真菌。i^對數期后，將所述真菌細胞重懸浮于10mM磷酸鈉中并檢測DB2121肽在多種條件下抗白色念珠菌的效果。將DB2121加入所述真菌細胞中并在4X:或37C下振蕩孵育1.5小時。在一個獨立實驗中，在37"C下用5或50pMDB2121(f.c.)孵育白色念珠菌共1.5小時。在特定時間點，取樣以檢測細胞存活率。在相關組的實驗中，將(1)載體或(2，3)丹磺酰化DB2121在上述指定條件下引入白色念珠菌中。接觸后，用SYTOXGreen試劑將所述真菌細胞反染色以監測細胞存活率。所述實驗進行至少三次，結果相似。誤差條代表標準差。DB2121的活性被測定為溫度依賴的，特別地在生理溫度下活性更強(圖2A),并且在某種濃度(例如50pM)下在少至5分鐘的接觸時間內迅速作用以殺死念珠菌(圖2B)。實施例5:DB2121的毒性還在人類細胞中進行了DB2121的毒性研究。依照Minetal.2004.NatBiotechnol22:717-23中所述的方法，4吏用原代人類新生兒包皮上皮細胞檢測DB2121的毒性，所述文獻的內容以引用的方式納入本文中。簡言之，當所述細胞處于對數生長期時，將(A)50jiMDB2121、B)50卩M富組蛋白H5、(C)50juM酮康唑或(D)DMSO加入所述培養基中。在加入化合物18和36小時后，用相差顯微鏡在20倍的放大倍數下對所述包皮上皮細胞成像。(E)圖像分析后，立即通過SDS-PAGE凝膠提取、分離蛋白，進行蛋白質印跡并檢測磷酸化和非磷酸化的ERK1、2以監測所述包皮角化細胞的增殖。所述實驗重復三次。前述處理之后，除用酮康唑處理以外，人類原代細胞顯示形態學正常。酮康唑對哺乳動物細胞的毒性是已知的。然后研究這些表型是否在上分子水平有所反映。將所述原代細胞裂解并監測一種稱為磷酸化ERK1、2的增殖標記。與對照相比，在用酮康唑處理的細胞中可觀察到ERK1，2活化的明顯抑制。相反，與對照相比，在用DB2121處理的細胞中活化的ERK1，2未被抑制。兩種研究都表明DB2121在50nM的工作(例如殺菌)濃度下對人類原代細胞是無毒的。為測定DB2121的無毒性濃度，將多種濃度的DB2121和作為對照的50pM的酮康唑或DMSO分別加入原代人類包皮上皮細胞培養物中。在加入0、36和72小時后，從培養亞中取出所述上皮細胞并測定存活細胞數。所述試驗重復三次。在第72小時時，用相差顯微鏡在20倍放大倍數下對與各種化合物接觸的包皮上皮細胞成像。為進行細胞計數，用臺盼藍拒染法將所述上皮細胞染色以監測細胞存活率。這些結果顯示DB2121在原代培養細胞中具有極低的毒性和比酮康唑良好的毒性特征(圖3)。此夕卜，當通過皿內途徑注射時，小鼠能夠耐受15mg/kg的DB2121。當對成年大鼠進行靜脈內注射時，最高達且包括1.5mg/kg的濃度是無害的。實施例6:DB2121的體外靼標通過使用熒光標記的DB2121共聚焦顯微術測得DB2121確實進入白色念珠菌(SC5314)并且其特異地定位在所述生物體的線粒體中(通過對酵母特異的熒光探針測得)。在一個為闡明DB2121的作用方式的研究中，用標準方法將白色念珠菌在液體培養基中培養至OD600值為約0.40-0.80。在此時收獲細胞并收集全部細胞提取物。使等量的蛋白通過含有純化的GST或GST-DB2121的谷胱甘肽-瓊脂糖柱。充分洗滌該柱并用游離谷胱甘肽梯度洗脫所結合的蛋白。收集洗脫成分并通過12%SDS-PAGE凝膠分開這些級分中的蛋白。將所述凝膠染色。為識別目的蛋白，將所述蛋白提取、干燥并溶解于0.2%的甲酸中。然后在Micromass上用LC/MS/MS分析從每條蛋白帶獲得的肽。圖4顯示了在白色念珠菌中識別的蛋白的分類的餅狀圖。在白色念珠菌(SC5314)中識別的DB2121蛋白靶標為微管相關蛋白(YTM1)、隔蛋白(CDC3)、紡錘體動態控制蛋白(SLK19)、G蛋白功能調控蛋白(CRP1)、HSP70家族成員(SSA2)、烯醇酶I(ENOl)、HSP成員(SSE1)、26S蛋白酶體亞基(RPT5)、HSP90、線粒體HSP蛋白(SSC1)、ATP酶復合物的p1亞基(ATP2)、線粒體烏頭酸酶/水合酶(AC01)和微粒體ATP酶(CDC48)、RAV1、HSP60、二氬硫辛酰胺脫氬酶(LPD1)、60S核糖體亞基蛋白L3(RPL3)和絲氨酰-tRNA合成酶(SESl)。通常，上面所列的蛋白屬于不同的功能組與形態發生/細胞周期/細胞紡錘體/胞質分裂有關的蛋白、與線粒體有關的蛋白、與細胞應激和代謝有關的蛋白和與翻譯調控有關的蛋白。這些數據與從共焦顯微術獲得的數據很好地吻合。實施例7-DB2121的穩定性質譜測定顯示DB2121環狀類似物可在人類唾液中可體外穩定至少72小時。將所述環狀類似物在1jiM濃度和37"C下在人類唾液中體外孵育。在從0到72小時的多個時間點，取l.Ojul的等分試樣直接注射到MicromassQuattroMicro質鐠儀中。收集總計3分鐘的數據。然后用MassLynx4.0Analysis軟件處理所述數據。以活性形式存在的環狀類似物的預期平均質量為2557.93。顯示環狀富組蛋白類似物在人類唾液中可存在至少72小時的孵育。對應于環狀富組蛋白類似物的在約1質量單位的可接受誤差范圍內的峰值為在0小時2556.95、在24小時2557.65和在72小時2557.10。權利要求1.一種治療人類的微生物感染的方法，包括對所述人類給予治療有效量的富組蛋白環狀類似物。2.權利要求1的方法，其中所述富組蛋白環狀類似物是富組蛋白H5的環狀類似物。3.權利要求1的方法，其中所述環狀類似物是用富組蛋白制備的，其中所述富組蛋白的至少一個M酸被選自谷氨酸、賴氨酸、半胱氨酸和其他含巰基氨基酸的氨基酸置換以使得所述富組蛋白環化。4.權利要求2的方法，其中所述環狀類似物的序列為RHHCYKRKFHEKHHCHRGY(SEQIDNO.1)。5.權利要求l的方法，其中所述微生物感染是細菌感染。6.權利要求l的方法，其中所述微生物感染是真菌感染。7.權利要求l的方法，還包括給予有效劑量的第二種殺菌劑。8.權利要求7的方法，其中所述殺菌劑選自殺真菌劑和殺細菌劑。9.權利要求7的方法，其中所述殺菌劑是一種唑類化合物。10.權利要求9的方法，其中所述唑類化合物選自氟康唑、伏立康唑、克霉唑、伊曲康喳、酮康喳和咪康喳。11.一種適于治療由微生物感染引起的人類疾病的殺菌組合物，包括富組蛋白的環狀類似物和至少一種可藥用的載體。12.權利要求ll定義的組合物，其中所述感染選自細菌感染和真菌感染。13.權利要求ll定義的組合物，還包括第二種殺菌劑。14.權利要求13的組合物，其中所述殺菌劑是一種唑類化合物。15.根據權利要求14的方法，其中所述唑類化合物選自氟康唑、伏立康唑、克霉唑、伊曲康哇、酮康唑和咪康唑。16.權利要求ll定義的組合物，其中所述富組蛋白的環狀類似物選自Hl、H3和H5的環狀類似物。17.權利要求16定義的組合物，其中所述環狀類似物是富組蛋白H5的環狀類似物。18.權利要求17定義的組合物，其中所述環狀類似物的序列為RHHCYKRKFHEKHHCHRGY(SEQIDNO.1)。19.一種殺菌組合物，包括富組蛋白的環狀類似物與第二種殺菌劑。20.權利要求19定義的組合物，其中所述富組蛋白環狀類似物選自Hl、H3和H5的環狀類似物。21.權利要求20定義的組合物，其中所述環狀類似物是富組蛋白H5的環狀類似物。22.權利要求21定義的組合物，其中所述環狀類似物的序列為RHHCYKRKFHEKHHCHRGY(SEQIDNO.1)。23.權利要求16定義的組合物，其中所述殺菌劑是一種唑類化合物。24.權利要求23定義的組合物，其中所述唑類化合物選自氟康唑、伏立康唑、克霉唑、伊曲康喳、酮康唑和咪康喳。25.—種制品，包括其中裝有一種包含富組蛋白的環狀類似物的殺菌組合物的包裝，所述包裝的標簽指明所述組合物適于治療人類的微生物感染。26.—種治療哺乳動物的微生物感染的方法，包括對所述哺乳動物給予哺乳動物殺菌劑與耙向于微生物線粒體的載體分子。27.權利要求26定義的方法，其中所述載體分子是富組蛋白的環狀類似物。28.權利要求27定義的方法，其中所述環狀類似物是富組蛋白Hl、H3和H5之一的環狀類似物。29.權利要求28定義的方法，其中所述環狀類似物是H5的類似物。30.權利要求29定義的方法，其中所述環狀類似物的序列為RHHCTKRKFHEKHHCHRGYo31.—種抑制哺乳動物中微生物菌絲體生長的方法，包括對所述哺乳動物給予富組蛋白的環狀類似物。32.—種治療哺乳動物的微生物感染的方法，包括對所述哺乳動物給予靶向于選自下列的一種蛋白的富組蛋白的環狀類似物微管相關蛋白(YTM1)、隔蛋白(CDC3)、紡錘體動態控制蛋白(SLK19)、G蛋白功能調控蛋白(CRP1)、HSP70家族成員(SSA2)、烯醇酶I(ENOl)、HSP成員(SSE1)、26S蛋白酶體亞基(RPT5)、HSP卯、線粒體HSP蛋白(SSC1)、ATP酶復合物的P1亞基(ATP2)、線粒體烏頭酸酶/水合酶(AC01)和微粒體ATP酶(CDC48)、RAV1、HSP60、二氫硫辛酰胺脫氫酶(LPD1)、60S核糖體亞基蛋白L3(RPL3)和絲氨酰-tRNA合成酶(SES1)。33.—種篩選候選殺菌化合物的方法，包括以下步驟(a)使候選化合物接觸至少一種靶標蛋白，所述耙標蛋白選自微管相關蛋白(YTM1)、隔蛋白(CDC3)、紡錘體動態控制蛋白(SLK19)、G蛋白功能調控蛋白(CRP1)、HSP70家族成員(SSA2)、烯醇酶I(ENOl)、HSP成員(SSE1)、線粒體HSP蛋白(SSC1)、ATP酶復合物的p1亞基(ATP2)、線粒體烏頭酸酶/水合酶(AC01)和微粒體ATP酶(CDC48);和(b)檢測所述化合物是否與所述乾標蛋白締合，其中檢測到所述化合物和所述靶標蛋白之間的締合指示所述化合物可具有殺菌活性。34.權利要求33定義的方法，其中所述候選化合物是富組蛋白的環狀類似物。35.—種試劑盒，包括含富組蛋白的環狀類似物的組合物和治療人類感染的使用說明。全文摘要本發明提供一種用富組蛋白的環狀類似物治療細菌和真菌疾病的新組合物和治療方法。有益地，所述富組蛋白的環狀類似物比目前使用的殺菌劑效力更強但毒性更低。此外，還公開了包括所述環狀類似物與其他殺菌劑如唑類化合物的組合物。文檔編號A61K31/4164GK101678073SQ200880019486公開日2010年3月24日申請日期2008年5月5日優先權日2007年5月5日發明者D·P·布魯爾,G·A·拉約爾,G·J·A·維爾克申請人:西安大略大學