含有識別hlai類的抗體作為有效成分的化療藥物耐藥性癌癥的治療劑及其應用的制作方法

專利名稱：含有識別hlai類的抗體作為有效成分的化療藥物耐藥性癌癥的治療劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有識別HLA I類的抗體作為有效成分的化療藥物耐 藥性癌癥的治療劑及其應用。另外，還涉及治療化療藥物耐藥性癌癥 的方法，該方法包括對給藥對象給予識別HLAI類的抗體的工序。
背景技術：
HLA是在將外源抗原、細菌、病毒感染細胞等與異物識別、除去 的免疫反應中重要的分子。HLA分子的主要作用是將抗原肽呈遞給 CD8+T細胞，所述抗原肽是由在細胞中生產的8-10個殘基左右的氨基 酸形成的，HLA分子在由肽呈遞誘導的免疫應答和免疫耐受中有非常 重要的作用。HLA分為I類和II類，I類由包含al 3的3個區域(domain) 的45KD的a鏈和12KD的卩2微球蛋白(p2M)的異源二聚體形成，II 類由包含al、 a2的2個區域的30 34KD的a鏈和包含pl、 p2的2個 區域的26 29KD的p鏈的異源二聚體形成。而且，已知HLAI類(HLA-I)中存在HLA-A、 B、 C等(在以下中，將HLA-A也稱為"HLA I類 A(HLA國IA)，，)。
迄今為止，報道了，在淋巴細胞中以抗HLA I類A抗體連接的 (ligated with an anti-HLA class IA antibody)細月包增殖抑制效果和細胞， 死亡誘導效果，這表明HLA分子作為信號傳導分子的可能性。例如有 報道抗人HLA I類A的al區域的抗體B9.12.1、抗a2區域的抗體 W6/32、抗a3區域的抗體TP25.99和A1.4，對于活化淋巴細胞抑制細 胞增殖(非專利文獻1、2)。另有報道抗al區域的兩種抗體MoAb90、 YTH862對于活化淋巴細胞誘導凋亡(apoptosis)(非專利文獻2、 3、 4 )。 已知由這兩種抗體誘導的凋亡是胱天蛋白酶介導的反應(非專利文獻 4)。由此可以推測在淋巴細胞細胞中表達的HLA I類A也與凋亡
的信號傳導有關。
而且，有報道抗人HLAI類A的a3區域的抗體5H7(非專利文 獻5)、抗小鼠MHCI類的a2區域的抗體RE2 (非專利文獻6)，在活化淋巴細胞等中也誘導細胞死亡。
有報道將人骨髓瘤細胞免疫而得到的單克隆抗體2D7 (非專利文獻8 )也是識別HLA I類A的抗體，通過使該2D7低分子化(雙抗體化)，對人骨髓瘤細胞林在短時間內誘導劇烈的細胞死亡。另外，對小鼠免疫使人HLA I類A和人p2M共表達的細胞而得到的單克隆抗體C3B3 (專利文獻5)是識別HLA I類抗原的a2區域的抗體，通過與抗小鼠IgG抗體交聯，顯示出強細胞毒活性(cytotoxic activity),進而通過將該C3B3抗體變為低分子化抗體(C3B3雙抗體(diabody))，從而單獨的C3B3雙抗體(C3B3-DB)比單獨的2D7雙抗體也顯示出更強的抗腫瘤作用(專利文獻5)。
2D7雙抗體和C3B3雙抗體對各種人骨髓瘤細胞林以及活化淋巴細胞顯示出強的細胞死亡誘導活性，在對小鼠移植了骨髓瘤細胞林的多發性骨髓瘤模型小鼠中，也顯示出顯著的延長壽命的效果，由此作為骨髓瘤治療藥的開發正在進行(專利文獻l-5、非專利文獻7)。如果進一步發展這種利用HLA I類相關的細胞死亡誘導的治療，可以期待開發對骨髓瘤等有效性高的藥品。
作為對惡性腫瘤的化學療法中存在的問題，已知有在腫瘤細胞中誘導屬于ATP結合盒(ABC)轉運蛋白總科的MDR1(P糖蛋白，多抗藥性蛋白1, ATP結合盒亞科B成員1 (ABCB1))的表達。該MDR1表達與腫瘤細胞的藥物(化療藥物)抗藥性的獲得有關，成為之后化學療法效果減弱的主要原因。因此，對MDR1表達腫瘤，克服抗藥性之類的治療戰略的開發是^艮重要的課題。由于MDR1具有將細胞內的藥物向細胞外排出的作用，因此嘗試了使用ABC轉運蛋白抑制劑維拉帕米等來抑制其作用的療法，但還沒有確定臨床有效性。另一方面，有報道在MDR1表達腫瘤中HLAI類分子為高表達(非專利文獻9、 10)。
此外，本申請的發明相關的背景技術文獻信息如下所示。
專利文獻l: WO2004/033499
專利文獻2: WO2005/056603
專利文獻3: WO2005/100560
專利文獻4: WO2006/123724
專利文獻5: PCT/JP2007/063946
非專利文獻1: Fayen et al.， Int. Immunol. (1998) 10: 1347-1358非專利文獻2: Genestier et al.， Blood (1997) 90: 3629-3639非專利文獻3: Genestier et al" Blood (1997) 90: 726-735非專利文獻4: Genestier et al.， J. Biol. Chem. (1998) 273: 5060-5066非專利文獻5: Woodle et al.， J. Immunol. (1997) 158: 2156-2164非專利文獻6: Matsuoka et al.， J. Exp. Med. (1995) 181: 2007-2015非專利文獻7: Kimura， et al" Biochem. Biophys. Res. Commun.
(2004) 325: 1201-1209
非專利文獻8:岡達三三共生命科學財團研究報告集(1998) 12:
46-56
非專利文獻9: Neoplasma (2003) 50 (2): 91-96
非專利文獻10: Prados J. et al" Neoplasm (2006) 53 (3): 226-231
非專利文獻11: Journal of Internal Medicine (2000) 247: 521-53
發明內容
發明所要解決的問題
本發明鑒于上述情況而進行，其目的在于提供一種化療藥物耐藥性癌癥的治療劑，該治療劑含有識別HLA I類的抗體作為有效成分。另外，還提供一種治療化療藥物耐藥性癌癥的方法，該方法包括對給藥對象給予識別HLAI類的抗體的工序。
解決問題的方法
為了解決上述問題，本發明人等研究了作為C3B3抗體的低分子型抗體的C3B3雙抗體(C3B3-DB)對抗藥性腫瘤細胞的效果。
首先確認了 在化療藥物(長春新堿)耐藥性的血液肺瘤細胞林中，MDRl和HLA-IA (HLA I類A)蛋白質為高表達；以及將來源于血液腫瘤患者的腫瘤細胞在初診時和復發時進行比較，復發時MDR1和HLA-IA蛋白質為高表達。
繼而明確了該化療藥物耐藥性血液腫瘤細胞林中，由C3B3雙抗體產生的細胞毒活性與親本林相比在低濃度被誘導。另外明確了如果用C3B3雙抗體(0.1ng/mL)對化療藥物耐藥性血液腫瘤細胞林進行6小時前處理，與不進行前處理的情況相比，化療藥物(長春新堿)產生的細胞損傷增強。進而明確了如果用C3B3雙抗體(0.1jig/mL)對化療藥物耐藥性血液腫瘤細胞林進行前處理，則細胞表面上的MDR1蛋白質
6的表達在一部分細胞中降低，細胞中的藥物攝入量增加。
即，發現了對于HLAI類高表達的MDR1表達腫瘤細胞，C3B3雙抗體發揮抗腫瘤活性，以及具有克服抗藥性的作用，由此完成了本發明。
更加具體地，本發明提供以下的[1
[43]。所述的化療藥物耐藥性癌癥的治療劑，其特征在于，抗體是低分子化抗體。所述的化療藥物耐藥性癌癥的治療劑，其特征在于，與化療藥物并用。化療藥物的作用增強劑，其含有識別HLAI類的抗體作為有效成分。根據[5所述化療藥物的作用增強劑，其特征在于，抗體是低分子化抗體。根據[5]或6]所述的化療藥物的作用增強劑，其特征在于，與化療藥物并用。根據[5]~[7]中任一項所述的化療藥物的作用增強劑，其特征在于，用化療藥物治療的癌癥是化療藥物耐藥性癌癥。根據[8]所述的化療藥物的作用增強劑，其特征在于，化療藥物耐藥性癌癥是血液腫瘤。藥物組合物，其含有識別HLAI類的抗體作為有效成分，其特征在于，與化療藥物并用。根據[10或[11]所述的藥物組合物，其特征在于，抗體是低分子化抗體。根據[13所述的癌癥治療用藥物組合物，其特征在于，抗體是低分子化抗體。根據[10
[14]中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，用化療藥物治療的癌癥是化療藥物耐藥性癌癥。根據[15]所述的藥物組合物，其中化療藥物耐藥性癌癥是血液肺瘤。根據17]所述的方法，其特征在于，抗體是低分子化抗體。[19p艮據[17或[18所述的方法，其特征在于，與化療藥物并用。[201根據[17
[191中任一項所述的方法，其特征在于，化療藥物耐
藥性癌癥是血液肺瘤。增強化療藥物作用的方法，該方法包括對給藥對象給予識別
HLAI類的抗體的工序。所述的方法，其特征在于，抗體是低分子化抗體。[23根據[21或[22所述的方法，其特征在于，與化療藥物并用。[24根據[21
[23]中任一項所述的方法，其特征在于，用化療藥物
治療的癌癥是化療藥物耐藥性癌癥。根據[261所述的方法，其特征在于，抗體是低分子化抗體。[28根據[26]或[27所述的方法，其特征在于，癌癥是化療藥物耐
藥性癌癥。根據[30所述的用途，其特征在于，抗體是低分子化抗體。[32]根據[30]或[31]所述的用途，其特征在于，化療藥物耐藥性癌癥是血液腫瘤。所述的用途，其特征在于，抗體是低分子化抗體。35根據[33或[34所述的用途，其特征在于，通過化療藥物來治
療的癌癥是化療藥物耐藥性癌癥。根據[351所述的用途，其特征在于，化療藥物耐藥性癌癥是血
液肺瘤。根據[37所述的用途，其特征在于，抗體是低分子化抗體。[39]根據[37]或[38所述的用途，其特征在于，癌癥是化療藥物耐
藥性癌癥。識別HLA I類的抗體，其在用于增強化療藥物作用的方法中使用。等的微膠嚢)，或者制成膠體藥物傳遞系統(脂質體、白 蛋白微球、微乳、納米粒及納米膠嚢等)(參照"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980)。而且，還公知有 將藥物制成緩釋制劑的方法，可適用于本發明(Langer et al.， J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer， Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; 美國專利No. 3,773,919;歐洲專利申請公開(EP) No. 58，481; Sidman et al" Biopolymers (1983) 22: 547-556; EP 133,988)。
使用的制劑上容許的載體可以根據劑型從上述之中適當選擇或者 進行組合，但并不局限于此。
本發明還涉及治療化療藥物耐藥性癌癥的方法，該方法包括將識 別HLA I類的抗體對對象給藥的工序。另外，本發明還涉及誘導細胞 死亡的方法以及治療癌癥的方法，其特征在于將化療藥物與識別HLAI 類的抗體并用。
本發明中，"對象"是指給予本發明化療藥物耐藥性癌癥的治療劑 的生物體、該生物體體內的一部分。生物體沒有特別限定，包括動物 (例如，人、家畜動物種、野生動物)。對上述的"生物體體內的一部 分"沒有特別限定。
本發明中，"給藥"包括口服或胃腸外給藥。作為口服給藥，可以 列舉以口服制劑的形式給藥，作為口服制劑，可以選擇顆粒劑、散劑、
片劑、膠嚢劑、溶液劑、乳劑或混懸劑等劑型。作為胃腸外給藥，可以列舉以注射劑形式的給藥，作為注射劑，
可以列舉靜脈注射劑、皮下注射劑、肌肉注射劑或腹腔內注射劑等。 另外，可以通過使用基因治療的方法將包含要給予的寡核苷酸的基因 引入生物體，來達到本發明方法的效果。另外，也可以將本發明的藥 物在要進行處置的區域進行局部給藥。例如，通過手術中的局部注入、 導管的使用、或者通過本發明的編碼蛋白的DNA的定向基因送遞來進 行給藥。
對對象給予本發明的藥劑，可以一次給藥，也可以連續給藥。
另外，對從生物體摘出或排出的生物體的一部分進行給藥時，也 可以使本發明的藥劑與生物體的一部分"接觸"。
另外，本發明中"接觸，，根據生物體的狀態進行。例如，可以列舉 向生物體的一部分散布本藥劑、或者向生物體的一部分的破碎物添加 本藥劑等，但并不局限于這些方法。生物體的一部分為培養細胞時， 向該細胞的培養液添加本藥劑、或者將含有本發明寡核苷酸的DNA引 入到構成生物體的一部分的細胞中，由此也可以進行上述的"接觸"。
此外，本說明書中引用的全部背景技術文獻作為參照引入本說明 書中。
實施例
以下，通過實施例進一步具體地說明本發明，但本發明并不局限 于這些實施例。化療藥物(長春新堿)耐藥性血液腫瘤細胞林的建立 在長春新堿的存在下培養急性髓細胞白血病細胞林HL60 (American Type Culture Collection, Manassas, VA， USA)、 和伯基特淋 巴瘤細胞林BLTH(由德島大學廣瀨先生提供，Br. J. Cancer (1987) 56: 413-417),;彈到長春新堿抗藥性細月包林HL60-R和BLTH-R。腫瘤細胞林中mdrlmRNA和HLAI類表達量的確認 最初對HL60、 HL60-R、 BLTH和BLTH-R中mdrl mRNA表達， 使用RT-PCR進行確認；對細胞表面上的MDR1蛋白質及HLAI類蛋 白質表達，使用流式細胞術進行確認。
通過使用了特異性引物(5，-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG (序列號13)、 3，-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA (序列號14))的RT-PCR來研究這些細胞中的mdrl mRNA表達。作為對照，使用特異 性引物(5，畫ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA (序列號15) 、 3，-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG (序列號16))來研究卩2-微球蛋白mRNA 的表達。
通過使用了抗MDRl抗體(UIC國2， Chemicon, Temecula， CA， USA) 和FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體(Biosource, Camarillo， CA， USA)的流 式細胞術來研究細胞表面的MDRl表達。使用小鼠IgG(BD Biosciences, San Jose， CA， USA)作為對照抗體。
其結果，在作為親本林的HL60和BLTH中未發現mdrl mRNA 的表達，但在作為長春新堿抗藥性林的HL60-R和BLTH-R中發現了 mdrl mRNA的表達(

圖1 )。
另外，比較了這些細胞的細胞表面上的HLAI類表達強度。HLAI 類的表達4吏用Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)標記的 C3B3抗體通過流式細胞術進行測定。其結果表明，在任意長春新堿抗 藥性林中細胞表面上的HLAI類的表達增強(圖2)。
對急性髓細胞白血病患者的初診時和復發時得到的腫瘤細胞同樣 通過流式細J!包術進行解析，確i人肺瘤細胞表面上的MDRl和HLAI類 表達量。其結果可以確認，與初診時相比，復發時MDRl的表達被誘 導(圖3) ， HLAI類的表達也增強(圖4)。
[實施例3腫瘤細胞林中的C3B3-DB的細胞毒活性
首先，使用這些腫瘤細胞研究對C3B3-DB的敏感性。對于C3B3-DB 的抗腫瘤活性(細胞毒活性)，在各種濃度的C3B3-DB存在下培養這些 腫瘤細胞，之后通過使用了 WST-8 (Kishida Chemicals, Osaka)的細胞 增殖試驗來進行測定。
在C3B3-DB的存在下將這些細胞培養24小時，比較細胞的生存 率，之后在作為長春新堿抗藥性林的HL60-R和BLTH-R中，從更低 濃度的C3B3-DB誘導細胞損傷(圖5)。
進而，在C3B3-DB (0.1ng/mL)存在下或非存在下將這些細胞培養 6小時后，添加長春新堿，對是否克服(改善)化療藥物耐藥性腫瘤細胞 的抗藥性進行研究。在作為親本抹的HL60和BLTH中，有無C3B3-DB 的前處理幾乎不會影響誘導由長春新堿引起的濃度依存性細胞損傷， 以及C3B3-DB前處理引起的長春新堿的細胞毒活性的增強效果尚未明確。另一方面明確了，在HL60-R和BLTH-R中，通過C3B3-DB的前 處理增強了由長春新堿引起的細胞毒活性(圖6)。 [實施例4
為了明確C3B3-DB引起的克服藥物(化療藥物)抗藥性的機理， 對于將這些細胞用C3B3-DB (0.1fig/mL)處理6小時后的細胞表面上的 MDR1表達進行研究。明確了，用C3B3-DB處理后， 一部分細胞中 MDR1的表達降低(圖7)。而且，將這些細胞用C3B3-DB處理后， 在柔紅霉素(0.1ng/mL、明治制果、東京)的存在下進行培養，對細胞內 的柔紅霉素的攝入量進行比較。
具體;也，對于藥物的細月包內才聶入(累積相；accumulation phase), 通過以下方法評價在C3B3-DB存在下或非存在下培養2小時后，添 加柔紅霉素，培養30分鐘，將細胞洗凈后使用流式細胞術測定PE強 度。對于藥物的細胞內殘留(流出相；efflux phase),在上述方法之后進 一步培養30分鐘，同樣用流式細胞術進行評價。
其結果，親本林中在累積相和流出相中均攝入一定量的柔紅霉素， 未發現C3B3-DB的前處理帶來的影響。另一方面明確了，在長春新堿 抗藥性林中，在任意相中柔紅霉素的攝入量均顯著減少，但通過 C3B3-DB的前處理，攝入量顯著增加(圖8)。
由以上可以確認在抗藥性抹和來源于復發的急性髓細胞白血病 患者的肺瘤細胞中，細胞表面上的MDR1表達被誘導，同時HLAI類 的表達增強。作為HLAI類高表達的機理，考慮可能是由MDR1的轉 運功能引起的。
C3B3-DB，對高表達HLA I類的抗藥性腫瘤細胞，誘導由特異性 抗體單獨產生的細胞損傷。另外，與化療藥物的并用，使藥物引起的
細胞毒活性增強。其機理明確為C3B3-DB使這些細胞的MDR1的表 達降低，由此增強化療藥物的細胞內攝入量。
由以上結果可知，通過將C3B3-DB與化療藥物并用，可以克月良 MDR1表達腫瘤細力包的抗藥性。
工業適用性
根據本發明可提供含有識別HLA I類的抗體作為有效成分的化 療藥物耐藥性癌癥的治療劑；以及治療化療藥物耐藥性癌癥的方法，該方法包括對對象給予識別HLAI類的抗體的工序。
在對惡性腫瘤的化療中，對于作為使化療效果降低的主要原因的 MDR1表達腫瘤來說，使克服抗藥性之類的治療戰略的開發成為重要 的課題。利用本發明的治療劑，即使是具有抗藥性的MDR1表達腫瘤， 耙向HLA I類分子的免疫學治療方法也是可能的。
權利要求
1.化療藥物耐藥性癌癥的治療劑，其含有識別HLA I類的抗體作為有效成分。
2. 權利要求1所述的化療藥物耐藥性癌癥的治療劑，其特征在于， 抗體是低分子化抗體。
3. 權利要求1或2所述的化療藥物耐藥性癌癥的治療劑，其特征 在于，與化療藥物并用。
4. 權利要求1~3中任一項所述的化療藥物耐藥性癌癥的治療劑， 其特征在于，化療藥物耐藥性癌癥是血液肺瘤。
5. 化療藥物的作用增強劑，其含有識別HLAI類的抗體作為有效 成分。
6. 權利要求5所述的化療藥物的作用增強劑，其特征在于，抗體 是低分子化抗體。
7. 權利要求5或6所述的化療藥物的作用增強劑，其特征在于， 與化療藥物并用。
8. 權利要求5~7中任一項所述的化療藥物的作用增強劑，其特征 在于，用化療藥物治療的癌癥是化療藥物耐藥性癌癥。
9. 權利要求8所述的化療藥物的作用增強劑，其特征在于，化療 藥物耐藥性癌癥是血液腫瘤。
10. 含有識別HLA I類的抗體作為有效成分的藥物組合物，其特 征在于，與化療藥物并用。
11. 含有識別HLA I類的抗體作為有效成分的癌癥治療用藥物組 合物，其特征在于，與化療藥物并用。
12. 權利要求10或11所述的藥物組合物，其特征在于，抗體是低 分子化抗體。
13. 癌癥治療用藥物組合物，其含有化療藥物和識別HLA I類的 抗體作為有效成分。
14. 權利要求13所述的癌癥治療用藥物組合物，其特征在于，抗 體是低分子化抗體。
15. 權利要求10~14中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，用 化療藥物治療的癌癥是化療藥物耐藥性癌癥。
16. 權利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，化療藥物耐藥性癌癥是血液腫瘤。
17. 治療化療藥物耐藥性癌癥的方法，該方法包括對對象給予識別 HLAI類的抗體的工序。
18. 權利要求17所述的方法，其特征在于，抗體是低分子化抗體。
19. 權利要求17或18所述的方法，其特征在于，與化療藥物并用。
20. 權利要求17~19中任一項所述的方法，其特征在于，化療藥物 耐藥性癌癥是血液肺瘤。
21. 增強化療藥物作用的方法，該方法包括對對象給予識別HLAI 類的抗體的工序。
22. 權利要求21所述的方法，其特征在于，抗體是低分子化抗體。
23. 權利要求21或22所述的方法，其特征在于，與化療藥物并用。
24. 權利要求21 23中任一項所述的方法，其特征在于，用化療藥 物治療的癌癥是化療藥物耐藥性癌癥。
25. 權利要求24所述的方法，其特征在于，化療藥物耐藥性癌癥 是血液腫瘤。
全文摘要
本發明人等明確了在高表達MDR1和HLA I類A蛋白質的化療藥物耐藥性血液腫瘤細胞株中，與親本株相比，以低濃度誘導C3B3雙抗體帶來的細胞毒活性。另外明確了如果對該化療藥物耐藥性血液腫瘤細胞株進行C3B3雙抗體前處理，則化療藥物單獨引起的細胞損傷增強，細胞中的藥物攝入量增加。即，發現了對于高表達HLA I類的MDR1表達腫瘤細胞，C3B3雙抗體發揮抗腫瘤活性，并具有克服抗藥性的作用。
文檔編號A61P43/00GK101687034SQ200880015359
公開日2010年3月31日 申請日期2008年3月12日 優先權日2007年3月12日
發明者安倍正博, 尾崎修治, 松本俊夫 申請人:中外制藥株式會社