能夠降解淀粉樣β肽的融合蛋白的制作方法

專利名稱：能夠降解淀粉樣β肽的融合蛋白的制作方法
能夠降解淀粉樣P肽的融合蛋白
本發明涉及融合蛋白和它們在阿爾茨海默氏病患者的酶治療中
的用途。所述融合蛋白包括切割淀粉樣P ( AP)肽的成分、調節血漿 中的半衰期的另一種成分；以及任選地，連接前兩種成分的第三種成
背景技術：
本發明涉及通過將淀粉樣肽與特異性識別淀粉樣肽，并且通過降 解或修飾來滅活它們的酶反應，來預防淀粉樣斑塊形成和/或生長的方 法。本發明進一步涉及通過施用具有改善的催化活性和/或選擇性以及 血漿中延長的活性的優化的淀粉樣肽降解酶治療阿爾茨海默氏病的 方法。本發明還涉及醫學治療的領域，特別是涉及神經變性疾病的領 域，并提供了在患有神經變性疾病、特別是阿爾茨海默氏病的患者中 引發腦淀粉樣的清除機制的方法。此外，本發明涉及在引發這種機制 中有效的蛋白質和肽的用途。
本發明描述了 A(3肽降解分子如何通過附著調節血漿中的穩定性 和半衰期的分子來成為治療相關的試劑。本發明中描述的Ap肽降解 分子總的說來具有過短的血漿半衰期，不能用作有效的治療試劑。然 而，通過將這些降解分子與本發明中描述和例示的調節物分子組合， 產生了功能性試劑，通過施用這些優化的淀粉樣肽降解酶融合蛋白， 其可以有效地用于治療阿爾茨海默氏病。
神經變性疾病，特別是阿爾茨海默氏病(AD)對患者的生命具有 強烈的致虛弱(debilitating)影響。此外，這些疾病構成了巨大的健 康、社會和經濟負擔。AD是最常見的年齡相關的神經變性狀況，影 響了約10%的超過65歲的群體，以及最多達45%的超過85歲的群體 (Vickers等，尸rog"5^7Vewro6/o/og7 2000， 60:139-165 )。 當前， 這個數量在美國、歐洲和日本估計為1千2百萬。這種情況將不可避 免，隨著發達國家中老年人數量的人口統計的增加而惡化。患有AD
與異常纖維狀結構的出現和神經纖維纏結的形:同時發生。家族 的和單個發生的病例都共有作為常見的病理標志的細胞外、纖維狀卩_ 淀粉樣的腦中沉積，這被認為與神經元功能的損傷和神經元喪失相關
(Younkin S. G.，腸ro/. 37， 287-288， 1995; Selkoe, D. J.，淑, 399， A23-A31 ， 1999; Borchelt D. R.等，A^wrow 17, 1005-1013， 1996 )。
卩-淀粉樣沉積由幾種淀粉樣-P肽(Ap)組成；特別是A(342在淀粉樣 斑塊中逐漸地沉積。AD是進行性疾病，其與記憶形成的早期缺陷相 關并最終引起高級認知功能的完全侵蝕。AD的發病機理的特征是特 定的腦區域和神經細胞的亞群對變性過程的選擇性易損性。具體地， 顳葉區域和海馬在早期受影響，在疾病的發展期間更加嚴重。另一方 面，額皮層、枕骨皮層和小腦內的神經元基本上仍是完整的，并且被 保護免于神經變性 (Terry等，爿w"a/s o/ A^wra/ogy 1981 , 10:184-192 )。
遺傳學的證據表明，在許多而不是所有的引起家族性AD的遺傳 學狀況中產生提高量的Ap42 (Borchelt D. R.等，A^wro" 17， 1005-1013， 1996; DuffK.等，胸,383， 710-713， 1996; Scheuner D.等，A^. 2， 864-870， 1996; Citron M.等，A^wro&o/. 5， 107-116, 1998 )，指出淀粉樣形成的可能性可能是提高的APu產生 或降低的降解或這兩者引起的(Glabe，C.，淑.似ec/. 6， 133-134,2000)。 然而這些是早期發作的AD的實例，其可以歸因于APP、早老蛋白 (presenilin) -1和早老蛋白-2基因中的遺傳缺陷，晚期發作的單個發 生的AD的主要形式具有迄今未知的發病機理起源。然而，已經鑒定 了使個體傾向于發生AD的幾種風險因素，在它們之中最顯著的是栽 脂蛋白E( ApoE)的e4等位基因和半胱氨酸蛋白酶抑制物C(cystatin C)的B等位基因。神經變性病癥的晚期發作和復雜的發病機理構成 了對治療試劑開發的艱難的挑戰。
當前，對AD沒有治愈方法，也沒有以高檢出率死亡前診斷AD 的方法。然而，p-淀粉樣蛋白成為為降低它的形成(Vassar， R.等， S".e匿286， 735-41， 1999)，或活化加速它從腦中清除的機制而設 計的藥物開發的主要靶點。
然而，Schenk等人(Nature, vol. 400, 173-177, 1999; Arch. Neurol., vol.57, 934-936, 2000 )的第一實驗結果暗示了 AD的可能的新治療 策略。過量表達突變的人類APP (其中位置717的氨基酸是苯丙氨酸而不是正常的纈氨酸)的PDAPP轉基因小鼠以年齡和腦部區域依賴 性的方式逐漸發展出AD的許多神經病理標志。在AD型神經病理(在 6周齡)的發作之前或在更大的年齡(11個月)用Ap42免疫轉基因動 物，此時淀粉樣-P沉積和幾種隨后的神經病理變化被良好地證實。年 輕動物的免疫基本上防止了 p-淀粉樣斑塊形成、神經炎營養不良和星 形膠質增生的發生。更老的動物的治療同樣顯著地降低了這些AD樣
神經病理的程度和發展。顯示的是，A卩42免疫引起了抗A卩抗體的產
生，Af3免疫反應性單核細胞/小膠質細胞在殘存斑塊的區域中出現。 然而，主動免疫方法可能在人類受試者中產生嚴重的副作用和迄今未 知的并發癥。
Bard等人(Nature Medicine, Vol.6, Number 8, 916-919， 2000) 它們相對中度的血清水平，被動施用e的抗體能夠跨越血腦屏l^并:4入
中樞神經系統，修飾斑塊并誘導先存的淀粉樣的清除。然而，即使是 針對p-肽的被動免疫也可能在人類患者中引起不希望的副作用。
本發明涉及使用重組蛋白質來治療阿爾茨海默氏病患者。A卩肽
當多的工作集中于A|3肽的產生，直到最近，顯著地更少的關注;給 予這些肽的清除。細胞外的AP肽的去除看起來通過兩種一般機制進 行細胞的內在化和細胞外的降解。本發明描述了新的方法，其將補 充淀粉樣(3肽的天然的分解代謝過程。
DeMattos ( PNAS 98: 8850-8855. 2001 )描述了沉沒(sink)假說， 其聲稱A(3肽可以通過降低血漿中肽的濃度間接地從CNS中除去。他 們在血漿中使用了結合AP肽的抗體，從而從CNS中隔離Ap。因為 抗體阻止AP從血漿流入CNS,和/或由于血漿中游離A卩濃度的降低 改變了血漿和CNS之間的平衡，實現了這一點。與抗體不相關的淀 粉樣結合試劑也已經顯示了通過血漿中的結合在從CNS中除去淀粉 樣(3-肽方面是有效的。Matsuoka等人(J. Neuroscience, Vol. 23: 29-33, 2003 )呈現了利用兩種淀粉樣(3-肽結合試劑，凝溶膠蛋白(gelsolin) 和GM1的數據，其隔離血漿AP并從而降低或防止腦部淀粉樣變性。
除去或消除AP肽的另一種方法是使用降解酶，其將淀粉樣P肽 降解成沒有或具有更低毒理學效應的更小的片段，其更易于清除。A|3
7肽的這種酶消化還通過降低血漿中淀粉樣(3肽的游離濃度的沉沒假說 機制起作用。然而，還可能的是CNS和/或CSF中淀粉樣(3肽的直接 清除。這種方法將不僅降低A|3的游離濃度，還直接清除來自全長肽 的環境。這種方法是有益的，因為它將不會提高血漿中A|3的總(游 離的和結合的)濃度，如同在利用淀粉樣[3肽結合試劑如抗體時的情 況中所見的。文獻中描述了酶，它們在多個位點降解Ap肽，例如NEP (Leissring等，JBC. 278: 37314-37320， 2003 )。在多個位點的A卩 肽降解將產生容易從血流中清除的小片段。
附圖的簡要描述 附

圖1
淀粉樣P1-40肽(終濃度300nM )在緩沖液中被商售的中性溶酶 (2.4nig/ml)或Fc-中性溶酶融合蛋白(2.4fig/ml)降解。
附圖2
在豚鼠血漿中His-Fc-Nep (SPL061128 )和中性溶酶(R&D Systems)的A卩40降解。使用兩種濃度的His-Fc-Nep，在4小時后測 量A(340水平。商售的中性溶酶用作陽性對照，膦酰二肽用作中性溶 酶特異性抑制物。
附圖3
豚鼠血漿中 His-Fc-Nep (SPL061128 )和中性溶酶(R&D systems)的A卩42降解。使用兩種濃度的His-Fc-Nep， 4小時之后測 量AP42水平。商售的中性溶酶用作陽性對照，膦酰二肽用作中性溶 酶特異性抑制物。
附圖4
人血漿中His-Fc-Nep ( SPL061128 )和中性溶酶(R&D systems ) 的A(340降解。使用兩種濃度的His-Fc-Nep, 4小時后測量A(340水平。 商售的中性溶酶用作陽性對照，膦酰二肽用作中性溶酶特異性抑制物。附圖5
與商售的中性溶酶相比Fc-Nep融合蛋白的PK分布圖(隨著時間 的過去的血漿濃度)。小鼠施用1 mg/kg商售的中性溶酶，或l或5 mg/kg內部生產的Fc-Nep。
附圖6
與中性溶酶-Fc(Fc的C-末端融合物)相比較，細胞培養基中來 自Fc-中性溶酶(Fc的N-末端融合物)的表達的酶活性。說明 PCEP4GW-Nep-Fc : 從pCEP4質粒表達的中性溶酶-Fc ; PEAK10GW-Nep-Fc:從pEAK10質粒表達的中性溶酶-Fc; com.Nep: 陽性對照，商業上可獲得的中性溶酶；PCEP4GW-Fc-Nep:從pCEP4 質粒表達的Fc-中性溶酶；PEAK10GW-Fc-Nep:從pEAK10質粒表 達的Fc-中性溶酶。
附圖7
雌性APPSWE-tg小鼠血漿中在用Fc-Nep急性治療以及陽性對照、 y-分泌酶抑制物M550426的治療之后的可溶Ap40水平。
附圖8
雌性APPSWE-tg小鼠血漿中在用Fc-Nep急性治療以及陽性對照、 分泌酶抑制物M550426的治療之后的可溶AP42水平。
附圖9
與中性溶酶-Fc ( Fc的C-末端融合物)相比較，純化的蛋白質Fc-中性溶酶(Fc的N-末端融合物)的酶活性。
說明Nep-Fc:在中性溶酶的C-末端部分融合到Fc的中性溶酶； Fc-Nep:在中性溶酶的N-末端部分融合到Fc的中性溶酶。
附圖10
在雌性C57BL/6小鼠的血漿中用hFc-Nep急性治療以及用陽性對 照Y-分泌酶抑制物M550426治療之后的小鼠Ap40水平。
9附圖11
在對雌性C57BL6小鼠的hFc-Nep單次注射后不同時點的血漿中 A(340水平。百分比顯示了與栽體相比的降低。hFc-Nep的暴露在圖表 中每個治療柱條上顯示。用陽性對照Y分泌酶抑制物M550426治療的 效果以紅色顯示。LOQ線顯示了分析中的定量限。
附圖12
在對雌性APPswE轉基因小鼠的mFc-Nep單次注射后的不同時點 (從1.5直到336小時)血漿中平均A卩40 ( A)和A卩42 ( B)水平。 百分比顯示了與栽體相比的降低。表(C)顯示了相應組的血漿暴露。 用陽性對照Y分泌酶抑制物M550426治療的效果以紅色顯示。LOQ 柱條顯示了分析中的定量限。利用ANOVA模型中的雙側t-檢驗、時 間和劑量作為固定因素來分析數據(* p<0.05; ** pO,Ol以及*** pO.001和n.s,不顯著)。
附圖13
藥物動力學和藥效學圖表分別顯示了 A(340和A(342的血漿效力效 果，作為所有時點(1.5-336小時)栽體的百分比，以及相應的mFc-Nep 血漿暴露。相應圖表中的線顯示了預測的暴露和效果。
在C57BL/6小鼠中，mFc-Nep在所有時點(1.5、 168和336小時) 在5和25mg/kg下顯著地降低了血漿中小鼠A(340 (附圖14)。在168 和336小時時，分析了 5和25 mg/kg, A(340效果顯示是劑量依賴性 的。在2周后，25 mg/kg mFc-Nep的單次注射(336小時)，與栽體 相比，顯著地降低血漿中小鼠A(340水平73%。在這個時點的血漿暴 露是48jag/ml，從而mFc-Nep顯示了具有長的血漿半衰期。
附圖14
在mFc-Nep向雌性C57BL6小鼠的單次靜脈內注射之后的不同時 點(1.5、 168和336小時)血漿中的平均A|340水平。百分比顯示了 與栽體相比的降低。表右側顯示了相應組的血漿暴露。用陽性對照Y 分泌酶抑制物M550426治療的效果以紅色顯示。LOQ柱條顯示了分 析中的定量限。利用ANOVA模型中的雙側t-檢驗、時間和劑量作為
10固定因素來分析數據(* p<0.05; **p<0.01, *** pO.001和n.s.不顯 著).
附圖15
與內部生產的中性溶酶相比Fc-Nep融合蛋白的PK分布圖(隨著 時間的過去的血漿濃度)。向小鼠施用單次i.v.劑量的10或50 nmol 酶/kg體重中性溶酶(Nep )或Fc-Nep ( 1和5 mg/kg )。
附圖16
表格描述了通過人類或小鼠Fc-中性溶酶在人血漿或APPswe-tg小 鼠血漿中淀粉樣卩肽1-40或1-42的降解。降解的ECso ( nM)和最高 (lOOpg/mL)濃度的人類或小鼠Fc-中性溶酶下的降解。/。。結果基于 2-3個獨立實驗。

發明內容
本發明的目的是提供能夠降解A(3肽的融合蛋白。因而，本發明 提供了具有式M-A的融合蛋白，能夠在淀粉樣|3肽氨基酸序列中一 個或更多個切割位點降解所述淀粉樣(3肽，其中M是延長所述融合蛋 白的半衰期的蛋白質成分，A是切割淀粉樣p肽的蛋白質成分，其中 所述M蛋白質成分共價地連接到A蛋白質成分的N-末端部分。
在本發明的一個方面，提供了融合蛋白，其中A是蛋白酶。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中A是人類中性溶 酶(Neprilysin )。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中A是人類中性溶 酶，其中所述中性溶酶是細胞外的中性溶酶。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中A是細胞外的中 性溶酶，包含根據SEQIDNO: 1、 2、 3或4的任一個的氨基酸序列。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中A是胰島素降解
酶o
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中A是內皮素 (endothelin)轉化酶1
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中A是支架蛋白質。在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中M是抗體的Fc 部分。在這個方面的一個實施方式中，所述抗體是IgG抗體。在這個 方面的另一個實施方式中，所述抗體是IgG2抗體。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中M是來自IgG2 抗體的Fc部分，A是細胞外的中性溶酶。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，包含根據SEQIDNO: 11的氨基酸序列。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中M是來自IgG2 抗體的Fc部分，A是胰島素降解酶。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，包含根據SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中M是來自IgG2 抗體的Fc部分，A是內皮素轉化酶l。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，包含根據SEQIDNO: 13的氨基酸序列。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中M選自PEG化 和糖基化。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中M是HSA。 在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中M是HSA結合 結構域。
在本發明的另一個方面，，提供了融合蛋白，其中M是抗體結合結構域。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中M和A用接頭L 連接在一起。
在本發明的另一個方面，提供了融合蛋白，其中L選自肽和化學 接頭。
在本發明的另一個方面，提供了降低淀粉樣P肽濃度的方法，所 述方法包括施用根據本發明的融合蛋白。在這個方面的一個實施方式 中，在血漿中實現所述淀粉樣(3肽的降低。在這個方面的另一個實施 方式中，在CSF中實現所述淀粉樣|3肽的降低。在這個方面的又一個 實施方式中，在CNS中實現所述淀粉樣(5肽的降低。
在本發明的另一個方面，提供了能夠降解淀粉樣(3肽的藥物組合物，包括藥學上可接受量的根據本發明的融合蛋白和藥學上可接受的 栽體或賦形劑。
在本發明的另一個方面，提供了預防和/或治療狀況的方法，在所 述狀況中淀粉樣P肽的降解是有益的，包括向需要這樣的預防和/或治 療的哺乳動物，包括人類施用治療有效量的根據本發明的融合蛋白。
在本發明的另 一 個方面，提供了預防和/或治療阿爾茨海默氏病、 系統性淀粉樣變性或腦淀粉樣血管病的方法，包括向需要這樣的預防 和/或治療的哺乳動物，包括人類施用治療有效量的根據本發明的融合 蛋白。
在本發明的另 一個方面，提供了用于在醫學治療中的根據本發明 的融合蛋白。
在本發明的另一個方面，提供了本發明的融合蛋白在藥物的制造
中的用途，所述藥物用于預防和/或治療其中淀粉樣|3肽的降解是有益 的的狀況。
在本發明的另一個方面，提供了本發明的融合蛋白在藥物的制造 中的用途，所述藥物用于阿爾茨海默氏病，系統性淀粉樣變性或腦淀 粉樣血管病的預防和/或治療。在這個方面的一個實施方式中，所述藥 物降低淀粉樣(3肽濃度。在血漿、CSF和/或CNS中實現所述淀粉樣 (3肽的降低。
在整個說明書中使用的術語如下定義，除非在特定的情況中另外 限定了。
術語"調節物"是指防止降解和/或提高血漿半衰期、降低毒性、降 低免疫原性、或提高治療蛋白質的生物學活性的分子。示范性的調節 物包括Fc結構域以及線型聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚賴氨 酸、葡聚糖，等等)；支鏈的聚合物(參見，例如，美國專利NO. 4，289，872,美國專利NO. 5,229,490; W093/21259);脂質；膽固醇 基團(例如類固醇)；碳水化物或低聚糖；或結合補救受體(salvage receptor)的任何天然的或合成的蛋白質、多肽或肽。糖基化也是調節 物的實例，其通過融合蛋白的大小的提高可以延長血漿半衰期，主要 是由于清除機制方面的改變。調節物還可以包括人血清白蛋白(HSA) 結合成分，從而其延長融合蛋白的血漿半衰期。
術語"蛋白質"或"蛋白質成分"是指具有催化活性的分子，其通過在氨基酸序列中任何可能的位點蛋白水解切割來降解淀粉樣(3肽。蛋
化性抗體也可以用作蛋白質部分。蛋白質可以是來自任何物種(例如， 人類、猴、小鼠)的天然存在的變體，或利用合理設計或分子進化技 術設計的變體。蛋白質分子還可以是不同的多態性或剪接變體。蛋白
是，蛋白;可以是中性;i酶的改進的變體，其通過氨基酸替換在結構 中被修飾來獲得改進的性質，例如提高的活性、改進的針對淀粉樣p
長的活性。
術語"融合物"是指由調節物分子和蛋白質分子組成的分子。調節 物可以共價連接到蛋白質部分來產生融合蛋白。非共價的方法也可以 用于將蛋白質連接到調節物部分。
術語"降解(degrade) 、 (degrading)或(degradation)，，是指一 種起始分子被分成兩個或更多個分子的過程。更具體地，淀粉樣(3肽 (從氨基酸1 -43到更小的任何大小)被切割來產生與起始分子相比更 小的片段。切割可以通過肽鍵的水解作用或其他類型的反應來實現，
其將分子切割成更小的部分。
術語"天然Fc"是指包含產自完整抗體消化的非抗原結合片段的 序列的分子或序列，無論是單體還是多聚體形式。天然Fc的原始的 免疫球蛋白來源可以是人類來源，并且可以是任何免疫球蛋白，而 IgGl和1gG2是優選的。天然Fc's由通過共價(即，二硫鍵)和非共 價締合連接成二聚或多聚形式的單體多肽構成。天然Fc分子的單體 亞基之間分子間二硫鍵的數量取決于類(例如，IgG、 IgA、 IgE)或 亞類(例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgAl、 IgGA2) 乂人1到4個。天然 Fc的一個實例是產自IgG的木瓜蛋白酶消化的二疏鍵鍵合的二聚體 (參見Ellison等(1982 ) ， M/c/e!c ^c/心10:4071-9)。在此使 用的術語"天然Fc"對于單體、二聚體和多聚體形式是通用的。
術語"Fc變體"是指從天然Fc修飾但仍然包含補救受體FcRn的結 合位點的分子或序列。公開文獻WO 97/34631和WO 96/32478描述了 示范性的Fc變體，以及與補救受體的相互作用，通過引用合并在此。 因而，術語"Fc變體"包含從非人類天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被移除的位點，因為它們提供本發明的融合物 分子不需要的結構特征或生物學活性。因而，術語"Fc變體"包括缺少 一個或更多個天然Fc位點或殘基的分子或序列，所述位點或殘基影 響或涉及(1 ) 二硫鍵形成，(2)與選定宿主細胞的不相容性，(3) 在選定宿主細胞中表達時的N-末端異質性，(4)糖基化，(5)與補 體的相互作用，(6)結合除補救受體外的Fc受體，或(7)抗體依 賴性細胞的細胞毒性(ADCC) 。 Fc變體在下文中進一步詳細描述了 。
術語"Fc結構域"包含上文定義的天然Fc和Fc變體分子和序列。 對于Fc變體和天然Fc，術語"Fc結構域"包括單體或多聚體形式的分 子，不論是從完整抗體消化的還是通過其他方式產生的。
術語"藥理學活性"是指這樣描述的物質被測定具有影響醫藥參數 (例如，血壓、血細胞計數、膽固醇水平)或疾病狀態(例如，癌癥、 自體免疫病癥、癡呆)的活性。
術語"淀粉樣P肽"、"A卩肽"或"淀粉樣(3肽"是指與人類A卩A4蛋白
質[前體]中相應于序列中氨基酸672-714(氨基酸1-43 )的氨基酸序列(單
字母編碼)DAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIAT相
關的任何形式的肽。它還包括這個肽的任何較短的形式，例如1-38、
1_40和1-42，但不限于這些形式。此外，淀粉樣|3肽具有幾種天然存
在的形式。人類形式的淀粉樣(3肽被稱為Ap39、 AP40、 AP41、 A|342
和A(343。這些肽的序列和它們與APP前體的關系由Hardy等，TINS
20, 155-158 ( 1997 )的附圖1說明了 。例如，A卩42具有序列: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His國His-Gln-Lys-Leu-Val-
Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-
Val-Val-Ile-Ala-OH 。 A卩41、 A卩40和A卩39不同于A卩42在分別從C-末 端省略了 Ala、 Ala-lle和Ala-Ile-Val。 A卩43不同于A卩42在于C-末
端的蘇氨酸殘基的存在。總的說來，淀粉樣P肽是指涉及引起阿爾茨 海默氏病的斑塊形成的肽形式。
術語"半衰期"被定義為從血漿中去除融合蛋白的一半初始濃度所 需的時間。本發明描迷了調節血漿中的半衰期的途徑。這樣的修飾可 以產生具有改進的藥物動力學性質(例如，體內血清半衰期提高)的 融合蛋白。延長半衰期是指需要更長的時間來從血漿中除去或清除一 半的初始濃度的融合蛋白。藥物或化學化合物的半衰期是本領域明確定義的和已知的。
術語"連接"是指兩個或更多個部分之間共價的或可逆的連接。共 價連接可以是例如肽鍵、二硫鍵、碳-碳偶聯或任何類型的基于原子之 間的共價連接的連接。可逆的連接可以是例如生物素-鏈霉抗生物素蛋 白、抗體-抗原或被分類為本領域已知的可逆連接的連接。例如，當融 合蛋白的蛋白質部分和調節物部分以重組形式從同一質粒產生時，直
接獲得共價連接，因而連接是在DNA水平上設計的。
術語"共價連接"的是指之間共有電子的兩個原子之間的化學連 接。共價連接的鍵的實例有肽鍵、二疏鍵、碳-碳偶聯。融合蛋白可以 通過多肽鍵連接在一起，其中連接可以在產生融合蛋白時核糖體上的 翻譯加工期間實現。其他類型的共價連接的成分可以用PEG化試劑修 飾，所述PEG化試劑共價連接到蛋白質的氨基殘基(例如，賴氨酸) 上。例如，化學偶聯反應可以是酰化或將兩個成分連接成融合蛋白的 其他適合的偶聯反應。共價連接也可以是指調節物與蛋白質部分連接 在一起的兩個位點處接頭的連接。
術語"切割位點"是指肽序列中可以被蛋白質或酶切割的特定位置 /位點。切割通常通過連接兩個氨基酸的肽鍵的水解作用產生。切割也 可以利用單一的或組合的蛋白質或酶在相同肽的多個位點產生。切割
位點也可以是肽鍵以外的其他位點。本發明詳細描述了淀粉樣P肽的 切割。
術語"結合結構域"是指以治療相關的親和力結合淀粉樣p肽的分 子。這些分子以大于或等于約106、 107、 108、 109或101Q M"的結合 親和力結合淀粉樣P肽。典型的結合結構域是，但不限于，抗體(例 如，Fab、 scFv、單結構域，都包括CDR區域)、本發明中和文獻中 描述的支架蛋白、以及合成產生的具有對淀粉樣|3肽的親和力的分子。
術語"蛋白酶"是作用于肽鍵的水解作用的任何蛋白質分子。它包 括天然存在的蛋白水解酶，以及通過定點或隨機誘變或任何其他蛋白 質工程方法獲得的其變體，蛋白水解酶的任何片段，或包含前述蛋白 質之一的任何分子復合物或融合蛋白。蛋白酶可以是絲氨酸、半胱氨 酸、天冬氨酸或金屬蛋白酶。
術語"底物"或"肽底物"是指任何氨基酸組成、序列或長度、含有 可被蛋白酶催化水解的肽鍵的任何肽、寡肽或蛋白質分子。被水解的
16肽鍵稱為"切割位點"。底物內位置的編號根據Schlechter & Berger (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967 ) 157-162)介紹的系統 進行。鄰近切割位點的N-末端的氨基酸殘基被編號為Pl、 P2、 P3等 等，而鄰近切割位點C-末端的殘基被編號為Pl'、 P2'、 P3'，等等。本 發明的底物或肽底物是淀粉樣(3肽。
術語"特異性"是指蛋白質或蛋白酶有選擇地識別和水解某些肽底 物而其他保持不被切割的能力。特異性可以定性地和定量地表示。"定 性的特異性"是指在肽底物的某些位置處蛋白酶接受的氨基酸殘基的 種類。僅接受所有可能的肽底物的小部分的蛋白酶具有"高特異性"。 接受幾乎任何肽底物的蛋白酶具有"低特異性"。具有非常低特異性的 蛋白酶還被稱為"非特異性蛋白酶"。
術語"演化的(evolved)蛋白酶"描述了利用隨機PCR、 DNA改 組或在DNA/RNA水平上產生多樣性的其他類型的方法獲得的任何蛋 白酶。描述這些方法的文獻例如D,A. Drummond, B.L. Iverson， G. Georgiou and F.H. Arnold, Journal of Molecular Biology 350: 806—816 (2005 )和S. McQ and D.S， Tawfik， Biochemistry 44: 5444-5452 (2005 )。在產生的多樣性之中進行篩選和選擇的各種方法也在文獻 中描述了 (例如，Directed Enzyme Evolution: Screening and Selection Methods ( Methods in Molecular Biology ) Editors: Frances H Arnold and George Georgiou. Volume 230， 2003及其參考文獻)。各種策略可以 用于選擇性質如提高的穩定性、提高的活性、改善的選擇性、以及被 已知和未知抑制物降低的抑制作用。
術語"改進的蛋白酶"描述了如果需要、具有更高催化活性的任何 蛋白酶變體。然而，在某些情況下更低的催化活性可能是優選的。改 進的蛋白酶還可以指與原始蛋白酶相比，相較于另一種底物，更有效 地切割某種底物的變體。改進的是指更優選的性質，例如催化活性和 /或選擇性，來獲得更優化的藥物化合物。改進的蛋白酶還可以指具有 在例如血漿(體內或體外或兩者)中提高的穩定性的變體。改進的蛋 白酶還可以指具有在例如血漿(體內或體外或兩者)中降低的失活的 變體。降低的失活可以通過降低蛋白酶的蛋白水解降解而完成，這是 由于改變的氨基酸序列較不易于被切割。降低的蛋白水解降解還可以 通過用例如PEG化和/或糖基化修飾蛋白質表面來保護蛋白質免于切割而完成。降低的失活還可以通過降低已知或未知抑制物的蛋白酶抑 制作用而完成。未知的血漿抑制物的降低的抑制作用可以通過直接篩 選具有在血漿中蛋白酶活性的抑制作用降低的變體而完成。
術語"人類中性溶酶"是指任何天然形式的人類中性溶酶。這包括 人類群體中天然存在的所有剪接和多態性變體。本發明中描述了人類
中性溶酶的許多形式(SEQIDNO: l到4)。該術語還包括人類中性 溶酶的片段或延長的變體，以及人類中性溶酶的改進的變體，如"改 進的蛋白酶"中所描述的。
術語"支架蛋白質"描述了結合淀粉樣(3肽的任何蛋白質。支架蛋 白質的實例有淀粉酶抑肽(tendamistat) 、 affibody、 anticalin和錨蛋 白(ankyrin)。這些支架蛋白質一般被設計并基于剛性的核心結構， 以及可以被隨機化用于結合物的鑒定的部分、環、表面或腔。這些支
架蛋白質是文獻中很好地描述的。
本發明表明了使用優化的重組Ap降解酶通過降低A(3的腦水平抑 制淀粉樣斑塊形成的可能性。結果，淀粉樣斑塊相關的星形膠質增生 也將被降低。
在本發明的一個方面，治療化合物是完全人類來源的。融合蛋白 全部由人類蛋白質組成，其利用具有最低可能的免疫原性活性的接頭 來連接在一起。
相對于結合分子如抗體，利用降解酶的優點是
與結合方法相比，使用淀粉樣|3肽的酶的降解將直接除 去毒性效應，結合方法中淀粉樣p肽的濃度可能潛在地提高，如 果與淀粉樣卩肽復合的結合分子沒有被足夠快速地清除。如果淀 粉樣P肽濃度在外周提高這可能是特別有害的，。
淀粉樣P肽的催化降解將比結合更有效地除去肽。僅僅 催化量的降解酶是除去足夠淀粉樣P肽所必需的，而結合分子如 抗體為了治療效果需要化學計量的量。這將對治療處理所需的量 有很大影響。
如果結合分子是抗體并且穿越BBB容許結合斑塊中的淀 粉樣P肽，有害的潛在免疫學反應是有可能的。另一方面，催化 性的融合蛋白將不結合斑塊和利用Fc反應性，而僅僅降低淀粉 樣f3肽的游離濃度。因而，催化酶將僅降解淀粉樣P肽的游離庫。結合試劑如抗體可能潛在地進入CNS，并通過Fc活性溶解斑塊。 如果大量的淀粉樣p肽被釋放到斑塊的附近這可能是不利的，并 且它們對細胞是有毒的。
在A卩分解代謝中的一種重要的酶是中性溶酶，也稱為中性內肽 酶畫24.11或NEP。 Iwata等人(Nature Medicine, 6: 143-149， 2000) 顯示了， APM2肽通過由生物化學分析相似或相同于中性溶酶的NEP 介導的有限的蛋白水解作用經歷完全的降解。 一致地，NEP抑制物輸
注引起了腦中內源A(342的生物化學的和病理學的沉積。發現的是，這
種NEP催化的蛋白水解作用因而限制了 AP42分解代謝的速率。
NEP是涉及幾種生物學活性肽包括腦啡肽、速激肽、舒緩激肽、 內皮素和心房鈉尿肽的滅活的94kD， 二型膜結合Zn金屬肽酶。NEP 存在于CNS的肽能神經元中，它在腦中的表達以細胞特異性的方式 被調節(Roques B. P.等，尸/mrwflco/. / ev, 45， 87-146， 1993; Lu B.等， ￡^/7, A/e《181， 2271-2275， 1995; Lu B,等，^"". Mr.780, 156-163， 1996 )。雖然2型NEP轉錄產物不存在于CNS中，1型和 3型轉錄產物分別定位于神經元中和胼胝體的少突膠質細胞中(Li C. 等，丄5/o/. CTiew. 270， 5723-5728， 1995 )。蛋白酶和內肽酶的中性 溶酶家族包括NEP的結構上或功能上同源的成員，例如近來描述的 NEP II基因和它的同種型(Ouimet T.等，肌oc/iew. 'o; ^s. Co畫w". 271:565-570， 2000),其以與NEP互補的模式在CNS中表 達。這個家族的另一成員是NL-1 (中性溶酶樣1 )， 一種被NEP抑 制物膦酰二肽有效地抑制的可溶蛋白質(GhaddarG.等，丄 347: 419-429， 2000)。
還已經描述了已知分解代謝AP的其他酶。鋅金屬肽酶胰島素降 解酶(IDE, EC. 3.4.22.11 )將A(3mo和ApM2切割成看起來無害的產 物。IDE是真正的肽酶；它不水解蛋白質。該酶在體外切割有限數量 的肽，包括胰島素和胰島素相關肽、卩內啡肽和A卩肽。IDE被暗示是 生理學的Ap代謝酶之一 (W. Q. Qui等(1998 ) 5/o/. CViem. 273， 32730-32738 ) 。 Kurichkin和Goto ( I. V. Kurochkin and S. Gato ( 1994 ) 345， 33-37 )首先報道了胰島素降解酶可以水解A(3mo。這 個發現在兩個獨立的研究中被證實(W. Q. Qui等(1998 U S/o/. C/ie/n. 273, 32730-32738; and J， R. McDermott and A. M. Gibson ( 1997 )A^wrocAew./ 仏22， 49-56)。此外， 一種近來被鑒定為A卩降解酶的 金屬蛋白酶24.15 ( Yamin R.等，/ CTiew. 274, 18777-18784， 1999 )也不響應于A卩注射而改變。血管緊張肽轉化酶(ACE)， 一 種不相關的神經元Zn金屬內肽酶也被提及作為可能的A(3肽降解酶 (Barnes N. M.等，尸Aarm"co/. 200， 289-292,1991; Alvarez R. 等,《/. jVewro/. jVewroi^rg.尸57c/j/a^y 67, 733-736， 1999; Amouyel P.等， A^Uca乂 <SW. 903， 437-441， 2000),具有對A(3的未知的親和 力(McDermott J. R. and Gibson A. M,， A^歸cA亂22， 49-56, 1997 )。組織蛋白酶B ( CatB )也顯示了降解A卩肽(Neuron. 2006 Sep 21; 51 ( 6 ) :703-14 )。
來自中性溶酶的使用的序列可以是蛋白質的細胞外部分。細胞外 的部分被定義為被確定為膜區域之外的中性溶酶的部分。本發明還包 括中性溶酶的完整序列作為淀粉樣|3肽降解成分的用途。本發明還包 括中性溶酶的較小的片段，只要相對于淀粉樣(3肽的催化活性被保留。 本發明還包括中性溶酶的任何多態性變體和剪接變體。本發明還包括 中性溶酶的任何改進的變體。
本發明描述了新的和可選擇的策略來在它們形成淀粉樣斑塊之 前水解A(3肽，或至少防止現有斑塊的進一步發展。還可能的是通過 水解與游離A(3肽平衡的任何斑塊衍生的AP肽來除去現有的斑塊。
本發明的另一個實施方式涉及由以高親和力結合淀粉樣P肽的部 分組成的分子。這種親和力在結合結合親和力上低于微摩爾。對淀粉 樣P肽的結合親和力優選的在結合親和力上是處在納摩爾的。涉及與
一個或更
多個位點切割淀粉樣|3肽的活性成分。將都識別淀粉樣p肽的催化活 性部分與結合部分組合在一起的原因是，結合部分結合淀粉樣(3肽， 從而提高局部濃度(結合部分和催化部分)，結合到淀粉樣p肽的解 離的形式。某一些特異性地結合解離的形式而不結合聚集的形式。某 一些結合聚集和解離的形式。某些這樣的抗體結合淀粉樣(3肽的天然 存在的A(3短形式(即，共價地或以其他方式連接在一起)以被活性 部分切割，所述活性部分由于雙官能分子中工程化的連接而在局部附
過有或者沒有接頭成分的血漿半衰期調節物成分來介導。、 '在本發明的某些實施方式中，治療試劑包括特異性結合淀粉樣P 肽或淀粉樣斑塊的其他成分的融合蛋白。這樣的化合物可以是單克隆
的或多克隆的或任何其他淀粉樣(3肽結合試劑的部分。這些化合物以 大于或等于約106、 107、 108、 109或101Q M"的結合親和力結合淀粉 樣(3肽。這些結合成分優選的與淀粉樣卩肽降解成分連接。
本發明的一個方面涉及抗體的"Fc"結構域與融合蛋白中淀粉樣|3 肽降解成分的組合。抗體包含兩個功能上獨立的部分，稱為"Fab"的可 變區，其結合抗原，稱為"Fc"的恒定區，其涉及效應物功能如補體激 活和吞噬細胞的攻擊。Fc具有長血清半衰期，而Fab是短壽的(C叩on 等(1989) , Nature 337: 525-31 )。當與治療蛋白質構建在一起時， Fc結構域可以提供更長的半衰期，或包括這些功能如Fc受體結合、 蛋白A結合、補體固定和可能甚至胎盤的轉移。
根據本發明的優選的分子是Fc連接的淀粉樣p肽降解蛋白質， 例如NEP-相關蛋白質。
在標題為"Modified Peptides as Therapeutic Agents"( WO99/25044 ) 的公開文獻中詳細討論了通過與抗體的Fc結構域融合的蛋白質治療 試劑的有用的修飾。該公開文獻討論了連接到"栽體"例如PEG、葡聚 糖或Fc結構域。已經在文獻中描述了連接到Fc結構域的C-末端部分 作為可能的方法(Protein Eng. 1998 11:495-500)。這容許融合蛋白的 蛋白質部分上N-末端連接。本發明描述了利用這種策略獲得具有體內 效力的優化性質的融合蛋白的這種方法和有益效果。
IgG分子與特異于抗體的IgG類的三類Fc受體(FcR)相互作用， 即，FcyRI、 FcyRII和Fc丫RIII。在優選的實施方式中，融合蛋白的免 疫球蛋白(Ig)成分具有IgG的恒定區的至少一部分，其具有對FcyRI、 FcyRII或FcyRIII的至少一種的低結合親和力。在本發明的一個方面， Fc受體的融合蛋白的結合親和力通過使用重鏈同種型作為融合物配 偶體來降低，所述重鏈同種型具有對細胞上Fc受體的降低的結合親 和力。例如，人類IgGl和IgG3已經被報道以高親和力結合FcRyI， 而IgG4的結合性是十分之一，IgG2根本不結合。對于IgG與Fc受體 的結合的重要序列已經被報道位于CH2結構域中。因而，在優選的實 施方式中，具有增強的體內循環半衰期的、基于抗體的融合蛋白通過 將IgG2或IgG4的至少CH2結構域連接到第二非免疫球蛋白蛋白質來獲得。例如，在四種已知的IgG同種型中，IgGl(Cyl )和IgG3(Cy3) 已知以高親和力結合FcRyI，而IgG4 ( Cy4 )的結合親和力是十分之 一，IgG2 (Cy2)不結合FcR丫I。
在一個實施方式中，融合蛋白的Aj3肽降解成分是酶。術語"酶" 在此使用來描述蛋白質、其類似物、和其片段，其作為蛋白酶或肽酶 是有活性的。優選的，酶包括絲氨酸、天冬氨酸、金屬和半胱氨酸蛋 白酶。優選的，本發明的融合蛋白顯示酶的生物學活性。
在另一個實施方式中，免疫球蛋白結構域選自IgG的Fc結構域、 IgG的重鏈以及IgG的輕鏈。在另一個實施方式中，融合蛋白中抗體 的恒定區將是人類來源的，屬于來自免疫球蛋白的IgG類的免疫球蛋 白家族，特別是來自類IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4，優選的來自類IgG2 或IgG4。做為選擇還可能的是使用屬于來自其他哺乳動物的IgG類的 免疫球蛋白的恒定區，特別是來自嚙齒動物或靈長類；然而還可能的 是，根椐本發明的，使用免疫球蛋白類IgD、 IgM、 IgA或IgE的恒定 區。 一般地，存在于根據本發明的構建體中的抗體片段將包含Fc結 構域CH3或其部分，以及Fc結構域CH2的至少一個部分片段。做為 選擇，還可能的是設想根椐本發明的融合構建體，其含有CH3結構域 和絞鏈區作為成分(A)用于二聚化。
然而，還可能的是使用在天然狀態下發現的免疫球蛋白序列的衍 生物，特別是含有至少一個替換、缺失和/或插入的那些變體(在此組 合到術語"變體"下)。一般地，這樣的變體具有與天然序列的至少90%、 優選的至少95%、更優選的至少98%的序列同一性。在這種情境中特 別優選的變體是替換變體，其一般含有與相應的天然序列相比低于10 個、優選的低于5個、非常特別優選的低于3個的替換。注意的是以 下的替換可能性是優選的用Met、 Val、 Leu、 Ile、 Phe、 His或Tyr 替換Trp,或反之亦然；用Ser、 Thr、 Gly、 Val、 lie或Leu替換Ala， 或反之亦然；用Gln、 Asp或Asn替換Glu，或反之亦然；用Glu、 Gln 或Asn替換Asp，或反之亦然；用Lys替換Arg，或反之亦然；用Thr、 Ala、 Val或Cys替換Ser,或反之亦然；用His、 Phe或Trp替換Tyr, 或反之亦然；用其他19個天然氨基酸之一替換Gly或Pro,或反之亦 然。
可溶的受體-IgG融合蛋白是常見的免疫學試劑，它們的構建方法
22是本領域已知的(參見，例如美國專利NO. 5，225，538 )。功能性淀粉 樣卩肽降解結構域可以融合到來自免疫球蛋白類或亞類的免疫球蛋白 Fc結構域。屬于不同Ig類或亞類的抗體的Fc結構域可以活化各種二 級效應物功能。當Fc結構域被相關的Fc受體結合時發生活化。二級 效應物功能包括活化補體系統、跨越胎盤、以及結合各種微生物蛋白 質的能力。不同類和亞類的免疫球蛋白的性質在Roitt等， Immunology, p. 4.8 ( Mosby-Year Book Europe Ltd., 3d ed. 1993 )中 描述了。抗原結合IgGl、 IgG3和IgM抗體的Fc結構域可以活化補體 酶級聯。IgG2的Fc結構域看起來是較低效果的，IgG4、 IgA、 IgD和 IgE的Fc結構域在活化補體方面無效。因而人們可以根據它們相關的 二級效應物功能對于特定的免疫反應或用所述淀粉樣|3肽降解-Fc融 合蛋白治療的疾病是否是希望的來選擇Fc結構域。如果損害或殺傷 目標細胞是有益的，人們可以選擇特別活性的Fc結構域UgGl )來 制造淀粉樣p肽降解-Fc融合蛋白。做為選擇，如果希望的是產生不 觸發補體系統的淀粉樣(3肽降解-Fc融合物，可以選擇無活性的IgG4 Fc結構域。本發明描述了融合蛋白，其具有與Fc部分而不是直接結 合成分連接的催化成分。這意味著來自Fc的效果和活性將是有限的， 因為許多Fc效應是通過結合介導的。例如，補體激活取決于結合和 網絡的形成。
免疫球蛋白片段，根椐本發明的融合物構建體的C-末端一般地、 而不是必然地含有催化和調節部分之間的過渡區域，所述過渡區域可 以再含有接頭序列，該接頭序列優選的是肽序列。這種肽序列可以具
有1直到70個氨基酸之間的長度，在合適時甚至更多的氨基酸，優 選的10到50個氨基酸，特別優逸的12到30個氨基酸之間。過渡序 列的接頭區域可以側翼是另外的短肽序列，其可以例如，相應于DNA 限制性切割位點。分子生物學的熟練技術人員熟悉的任何限制性切割 位點可以用于這種連接中。適合的接頭序列優選的是人工序列，其含 有高數量的脯氨酸殘基(例如，在接頭區域中每兩個位置上)，除此 之外，優選的具有總體上的親水性特征。由至少30%脯氨酸殘基組成 的接頭序列是優選的。親水性特性可以優選的通過具有正電荷的至少 一種氨基酸，例如賴氨酸或精氨酸，或具有負電荷的例如天冬氨酸或 谷氨酸來實現。總的說來，因而接頭區域還優選地含有高數量的甘氨酸和/或脯氨酸殘基，以賦予所述接頭區域需要的柔性和/或剛性。
然而，天然的序列，例如位于細胞外、但直接作用細胞膜，即，
在細胞膜之前的，屬于NEP家族的配體的那些片段，也適合于用作接 頭，當適當時也在天然片段的替換、缺失或插入之后。這些片段優選 的是細胞外跨膜區域之后的50 AA，或這前50AA的子片段。然而， 偏愛的是在于與相應的天然人類序列具有至少85%序列同 一性的這 些片段，特別偏愛的是至少95%序列同一性，特別偏愛的是至少99% 序列同 一 性，以限制在根椐本發明的融合蛋白中的這些接頭區域的免 疫原性，并且不引發任何先天的體液防御反應。在本發明的情境中， 接頭區域應當優選的不具有任何免疫原性。
然而，作為對通過酰胺樣鍵連接到淀粉樣P肽降解成分和血漿半 衰期調節物成分的肽序列的替代，還可能的是使用具有非肽或偽肽 (pseudopeptide )特征的或基于非共價鍵的化合物。就此而論可以提 及的實例有，特別是，N-羥基琥珀酰亞胺酯和異雙功能接頭，例如 >1-琥珀酰亞胺基-3- ( 2-吡咬二疏代)丙酸酯(SPDP )或類似的交聯劑。
調節血漿半衰期的其他途徑是使用PEG化或提高分子量的其他 類型的修飾，例如糖基化。
如上所述，也可以使用聚合物調節物。附著作為調節物有用的化 學部分的各種方式是當前可獲得的，參見，例如，標題"N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods"的專利申請 W096/11953,通過引用完全合并在此。該PCT公開文獻公開了水溶 性聚合物對蛋白質的N-末端的選擇性附著，等等。
優選的聚合物調節物是聚乙二醇(PEG) 。 PEG基團可以是任何 方便的分子量，可以是線型或分支的。PEG的平均分子量優選的從約 2千道爾頓("kD")到約100 kDa，更優選的從約5 kDa到約50kDa， 最優選的從約5 kDa到約10 kDa。 PEG基團一般經由通過PEG部分 上的反應基團(例如，醛、氨基、硫醇或酯基)與化合物上的反應基 團(例如，醛、氨基或酯基)的酰化或還原性烷基化附著于本發明的 化合物。
蛋白質的PEG化的有用的策略由通過在溶液中形成共軛鍵來組 合蛋白質和PEG部分組成，其各自具有針對對方相互反應性的特定官 能度。蛋白質可以用常規的重組表達技術制備。蛋白質是在特定位點用合適的官能團"預先活化的"。在與PEG部分反應之前，純化前體并 完全表征。蛋白質與PEG的連接通常在水相中發生，可以通過反相分 析HPLC容易地監測。PEG化的蛋白質可以通過制備型HPLC容易地 純化，通過分析性HPLC、氨基酸分析和激光解吸質語法來表征。
多糖聚合物是可以用于蛋白質修飾的另 一種水溶性聚合物。葡聚 糖是多糖聚合物，由主要通過al-6鍵連接的葡萄糖的各個亞基組成。 葡聚糖本身可以以多種分子量范圍獲得，在約1 kD到約70 kD的分 子量中是易于獲得的。作為單獨的調節物或與其他調節物(例如，Fc) 組合，葡聚糖是本發明中使用的適合的水溶性聚合物，參見，例如 WO 96/1 1953和WO 96/05309。已經報道了共軛到治療性或診斷性免 疫球蛋白的葡聚糖的用途；參見，例如，歐洲專利公開EP 0 315 456, 通過引用合并在此。約l kD到約20 kD的葡聚糖是優選的，此時葡 聚糖用作根據本發明的栽體。
碳水化物(低聚糖)基團可以方便地附著到蛋白質中已知為糖基 化位點的位點。 一般地，O-連接的低聚糖被附著于絲氨酸(Ser)或蘇 氨酸(Thr)殘基，而N-連接的低聚糖附著于天冬酰胺(Asn)殘基， 此時它們是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X可以是除脯氨酸外 的任何氨基酸。X優選的是除脯氨酸外的19種天然存在的氨基酸之 一 。N-連接的和O-連接的低聚糖的結構和每種類型中發現的糖殘基是 不同的。通常在兩種中都發現的 一種類型的糖是N-乙酰神經氨酸(稱 為唾液酸)。唾液酸通常是N-連接的和O-連接的低聚糖的末端殘基， 憑借它的負電荷，可以為糖基化的化合物賦予酸性性質。這樣的位點 可以摻入本發明的化合物的接頭中，優選的在多肽化合物的重組生產 期間被細胞糖基化(例如，在哺乳動物細胞如CHO、 BHK、 COS中)。 然而，這些位點可以進一步通過本領域已知的合成或半合成操作被糖 基化。適合于糖基化的氨基酸可以摻入調節物和蛋白質部分中的特定 位點。用于工程化這些特定氨基酸的優選的技術是定點誘變或可比較 的方法。其他可能的修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰或蘇 氨酰殘基的羥基基團的磷酸化，Cys中硫原子的氧化，賴氨酸、精氨 酸和組氨酸側鏈的a-氨基的曱基化。Creighton, /Vo,ei7rr 5Vrw"w" 飾/ecw/e尸，eW^ ( W. H. Freeman & Co., San Francisco ) ， pp. 79-86 (1983 )。因而，淀粉樣p肽降解成分中的糖基化位點可以被工程化。例如，優選地在中性溶酶結構的表面上的殘基被修飾以容許糖基化。
中性溶酶的3D結構是已知的，可以用于選擇適合的氨基酸替換，用 于導入糖基化和PEG化位點。糖基化位點利用例如Asn-X-Ser/Thr序 列導入。對于PEG化，適合的表面暴露的氨基酸例如被替換為胱氨酸 殘基，用于PEG化成分的特異性和有效偶聯。
本發明的化合物也可以在DNA水平被改變。化合物的任何部分 的DNA序列可以改變成與選定宿主細胞更相容的密碼子。對于優選 的宿主細胞大腸桿菌(E.co//)，優化的密碼子是本領域已知的。密碼 子可以被替換以消除限制性位點，或包括沉默的限制性位點，其可以 幫助DNA在選定的宿主細胞中的加工。栽體、接頭和肽DNA序列可 以被修飾以包括任何上述序列改變。
接頭任何"接頭"基團是可選的。當存在時，它的化學結構不是 關鍵的，因為它主要充當間隔區。接頭優選的由通過肽鍵連接在一起 的氨基酸組成。因而，在優選的實施方式中，接頭由通過肽鍵連接的 1到20個氨基酸組成，其中所述氨基酸選自20種天然存在的氨基酸。 這些氨基酸的某些可以被糖基化，這是本領域技術人員很好地理解 的。在更優選的實施方式中，所述1到20個氨基酸選自甘氨酸、丙 氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。再更優選的，接頭大 部分由空間上無阻礙的氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸組成。因而，優選 的接頭是聚甘氨酸(特別是(Gly) 4、 (Giy) 5)、聚(Gly-Ala )和 聚丙氨基酸。
蛋白酶的定量的特異性在大的范圍上變動。存在著非常非特異性 的已知蛋白酶，例如木瓜蛋白酶，其切割含有苯丙氨酸、纈氨酸或亮 氨酸殘基的所有多肽，或胰蛋白酶，其切割含有精氨酸或賴氨酸殘基 的所有多肽。另一方面，存在著已知的高度特異性蛋白酶，例如組織 型纖溶酶原激活物(t-PA),其僅在單個特異性序列處切割纖溶酶原。 具有高度底物特異性的蛋白酶在活生物體中蛋白質功能的調節方面 起到重要作用。例如，多肽底物的特異性切割活化了前體蛋白質或鈍 化活性的蛋白質或酶，從而調節它們的功能。具有高度底物特異性的 幾種蛋白酶被用于醫藥應用中。通過特異性多肽底物的切割活化或鈍 化的藥物的實例有，t-PA在急性心肌梗塞中的應用，其活化纖溶酶原 來溶解纖維蛋白凝塊，或安克洛酶(Ancrod)在中風中的應用，其鈍
26化纖維蛋白原，從而降低血液粘度并增強它的輸送能力。t-PA是具有 人類血液調節中的必需活性的人類蛋白酶，安克洛酶是非人類蛋白 酶。它是從毒蛇紅口蝮蛇(JgA^&odo" Wiof/oWow")分離的，包含蛇 毒的主要成分。因而，存在著幾種具有治療可用性的非人類蛋白酶。 然而，它們的鑒定通常是高度偶然的。通過施用藥物治療疾病一般基 于所述藥物引發的分子機制，其活化或滅活患者身體中的特定蛋白質 功能，所述蛋白質是內源蛋白質或感染性微生物或病毒的蛋白質。雖 然化學藥物對這些耙點的作用仍然難以理解或預測，蛋白質藥物能夠 特異性識別數百萬其他蛋白質中的這些目標蛋白質。具有識別其他蛋
白質的固有可能性的蛋白質的突出的實例是抗體、受體和蛋白酶。雖 然存在著巨大數量的潛在目標蛋白質，當今僅非常少數的蛋白酶可用
于指向這些目標蛋白質。由于它們的蛋白質分解活性，蛋白酶特別適 合于蛋白質或肽目標的滅活。當僅考慮人類蛋白質時，潛在目標蛋白 質的數量仍是巨大的。估計人類基因組包含30,000到100，000個基因， 每一個編碼不同的蛋白質。這些蛋白質或肽的許多涉及人類疾病，因 而是潛在的藥物靶點。不大可能的是通過篩選天然分離物來找到具有 特定的定性特異性的蛋白酶。因而，需要優化已知蛋白酶或其它支架 蛋白質包括催化性抗體的催化選擇性。
用于已知特異性的蛋白酶的選擇系統是本領域已知的，例如，來 自Smith等，Proc. Natl. Acad. SciUSA， Vol. 88 ( 1991 )。作為舉例， 所述系統包含酵母轉錄因子GAL4作為可選擇標記，插入到GAL4中 的預定的和可切割的目標序列，以及TEV蛋白酶。切割將DNA結合 結構域從轉錄活化結構域上分離，因而使得轉錄因子無活性。產生的 細胞代謝半乳糖的表型失能可以通過量熱分析或通過在自殺底物2-脫氧半乳糖上選擇來檢測。
進一步的，選擇可以通過使用具有修飾的肽底物來進行，所述修 飾例如基于如ACC的基團的焚光部分，由Harris等人早先描述(US 2002/022243 )。
可以使用相同的或類似的方法來鑒定或產生本發明中描述的有 效的淀粉樣(3肽降解成分。工程化這種淀粉樣P肽降解成分的出發點 可以是具有對淀粉樣P肽的某些活性或根本沒有活性的酶。其他成分 可以是支架蛋白質，其中特異性區域被隨機化來具有針對淀粉樣卩肽的活性。在文獻中描述了各種支架蛋白質，其中支架結構的一個部分 是核心結構，其在相對固定的位置具有隨機化的部分來產生結合或活
性位點。具有針對淀粉樣(3肽的某些活性的酶可以是被描述降解淀粉 樣(3肽的天然的蛋白酶。例如，中性溶酶可以通過理論設計或更為隨 機的方法被工程化來變得作為淀粉樣|3肽降解成分更有效。
產生具有改變的序列特異性的蛋白水解酶的實驗室技術是原理 上已知的。它們可以通過它們的表達和選擇系統來分類。遺傳選擇是 指在生物體內產生蛋白酶或任何其他蛋白質，所述蛋白酶或任何其他 蛋白質能夠切割前體蛋白質，其轉而引起生產生物體的生長特性的改
性的^些。這種;i由Davis等人所報道(美國專利NO. 5258289)。 噬菌體系統的生產取決于噬菌體蛋白質的切割，其在存在蛋白水解 酶，或能夠切割噬菌體蛋白質的抗體的情況下被活化。選定的蛋白水 解酶、支架或抗體將具有切割氨基酸序列的能力，用于噬菌體生產的 活化。
解酶的系統。Iverson等人(WO 98/49286 )描述了用于在細胞的表面 上展示的膜結合蛋白酶的表達系統。實驗設計的關鍵元素是催化反應 必須在細胞表面進行，即，底物和產物必須與在表面上表達酶的細菌 保持相連。選擇系統的另一個實例是利用在細胞表面表達活性蛋白質 并且分選含有具有改善的性質的變體的細胞的FACS分選 (Varadarajan等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 102, 6855( 2005 ))。 它們顯示了對蛋白酶切割位點的特異性方面三百萬倍的改變。
使用自分泌性蛋白酶產生具有改變的序列特異性的蛋白水解酶 的系統也是已知的。Duff等人(WO 98/11237 )描述了自分泌蛋白酶 的表達系統。實驗設計的關鍵元素是通過膜結合前體分子的自我蛋白 水解加工，催化反應作用于蛋白酶本身，來從細胞膜將成熟蛋白酶釋 放到細胞外環境中。
Broad等人(WO 99/11801 )公開了適合于改變蛋白酶的特異性的 異源細胞系統。所述系統包含轉錄因子前體，其中所述轉錄因子與膜 錨定結構域經由蛋白酶切割位點連接。在蛋白酶切割位點處通過蛋白 酶的切割釋放所述轉錄因子，其轉而啟動相應啟動子控制下的目標基因表達。改變特異性的實驗設計由蛋白酶切割位點插入修飾的序列， 以及使蛋白酶經歷誘變組成。
根據本發明，任何蛋白質或肽可以直接使用或作為出發點來產生 適合的淀粉樣P肽降解成分。例如，根據本發明，任何蛋白酶可以用 作第一蛋白酶。優選的，使用人類來源的任何蛋白質或肽。如果使用 通常存在于人體中的天然蛋白質或肽，最小可能性的改變是優選的。 在某些方法中，具有不同的結合特異性和/或降解活性的兩種或更多融 合蛋白同時地施用，在這種情況下，施用的每種融合蛋白的劑量落入 所標明的范圍內。融合蛋白通常在多個時機施用。單次給藥之間的間 隔可以是，例如，每周、每月、每三個月或每年。間隔也可以是不規 則的，通過測量患者的血漿中融合蛋白的血液水平來指示。在某些方
法中，劑量被調節來實現1-1000 ng/ml的血漿融合蛋白濃度，在某些 方法中25-300 pg/ml。同樣在某些方法中，劑量被調節以實現 l-1000ng/ml的血漿融合蛋白濃度，在某些方法中25-300 ng/ml。做為 選擇，融合蛋白可以施用作為持續釋放制劑，在這種情況下需要較低 頻率的施用。劑量和頻率取決于患者中融合蛋白的半衰期而變化。一 般地，具有Fc部分的融合蛋白顯示了長半衰期。施用的劑量和頻率 可以取決于治療是預防性的還是治療性的來變化。在預防性的應用 中，在長期的時間段上以相對低頻率的間隔施用相對低的劑量。某些 患者在他們生命的剩余時間持續接受治療。在治療應用中，相對短間 隔的相對高劑量有時是需要的，直到疾病的進展被降低或終止，優選 的直到患者顯示了疾病的癥狀的部分或完全改善。此后，本專利可以 施用預防性的方案。預計的是，催化活性淀粉樣p肽降解融合蛋白可 以以比結合試劑例如抗體更低的劑量施用。
本發明的藥物組合物中的活性成分的實際的劑量水平可以變化， 以獲得活性成分的量，所述量對實現特定患者、組合物和施用方式的 希望的治療反應是有效的，而對于患者沒有毒性。選定的劑量水平將 取決于多種藥物動力學因素，包括采用的本發明的特定組合物或其 酯，鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時間、采用的特定化合物的排 出速率、治療的持續時間、與采用的特定組合物聯合使用的其他藥物、 化合物和/或材料、要治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、 一般健 康情況和先前的病史，以及醫藥領域中公知的類似因素。引用完全合并在此，它們顯 示了本發明之時的本領域的狀態，和/或提供了本發明的描述和實現。 公開文獻是指任何科學或專利的公開文獻，或以任何媒介形式可獲得 的任何其他信息，包括所有記錄的、電子的或打印的形式。以下參考
文獻通過引用完全合并在此Ausubel，等，ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y， ( 1987-2001 ); Sambrook, 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. ( 1989 ) ; Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. ( 1989); Colligan，等， eds,， Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001 ); Colligan等，Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY， N.Y., ( 1997-2001 )。
本發明的一個方面是修飾天然的野生型蛋白質以在降解淀粉樣P 肽方面變得更有選擇性的可能性。定點誘變可以用于在野生型序列中 引入/替換氨基酸。 一種方法是通過研究降解酶的活性位點來運用合理 的設計。將潛在地改變選擇性分布(與其他肽/蛋白質相比淀粉樣p 肽的降解)的氨基酸可以用其他氨基酸替換，可以在本領域已知的切 割分析中測試新的變體。優選的，與其他相關肽相比，具有對淀粉樣 (3肽的更高催化降解活性的變體是有用的。其他相關肽包括但不限于 腦啡肽、神經肽Y、 P物質、somastatin和膽嚢收縮素。
中性溶酶的三維結構是已知的(Oefner等(2000) J. Mol. Biol. 296:341-9; Sahli等(2005 ) Helv.Chim.Acta. 88:731 )。這種結構可 以指導在結構中引入改變的途徑，以及哪一部分是最有效來改變的， 以產生用于篩選或選擇的庫。中性溶酶的活性部位非常深地包埋在結 構中，表明該酶偏愛小的底物，如具有低于約5000 Da分子量的肽片 段。活性位點殘基包括N542、 H583、 H587、 E646和R717。靠近活 性位點的氨基酸殘基還包括V580、 F563、 F564、 M579、 F716、 1718、 F106、 1558、 F563、 F579、 V580、 H583、 V692、 W693和A543 ( Voisin 等(2004 ) JBC 279:46172-81 )。這些和其他殘基可以通過研究三維 結構的理論設計來改變，或在各種庫中隨機地改變來獲得中性溶酶的 改進的變體。
本發明的目的是提供方法和材料，其適合于開發神經變性疾病的治療以及這樣的疾病中的治療介入有用的化合物的鑒定。基于卩淀粉 樣蛋白可以通過優化的酶介導的機制清除的發現，本發明致力于提供 這樣的方法和材料，如在權利要求小節中列出的和下文中描述的。
本發明提供了預防和治療神經變性病癥的方法，包括向哺乳動 物的外周系統施用有效量的優化的酶活性化合物。特別是，所述酶活 性化合物是融合蛋白，其中一個部分具有酶活性，另一個部分調節血 漿中的半衰期。所述方法適合于預防和治療腦淀粉樣變性，例如阿爾 茨海默氏病。本發明還提供了不同的分析原理——生物化學的和特別 是細胞學的分析，用于測試優化的酶化合物，優選的篩選調節活性和 血漿半衰期的復數的化合物。在進一步的實施方式中，所述分析包括 在檢測所述酶活性之前添加中性溶酶家族成員的已知的抑制物。適合
的抑制物是例如膦酰二肽、thiorphan、 spinorphin或上述物質的功能 衍生物。
一般意義上，根據本發明的分析體內和體外地測量血漿中的酶活 性和半衰期。
在另一個方面，本發明提供了產生藥物的方法，包括步驟(i)鑒 定降解AP肽的化合物，優選的高度特異性并具有高Ap肽降解活性 的化合物，(ii)將這種A(3肽降解化合物連接到決定血漿中的半衰期 的調節化合物。
本發明的化合物可以利用重組DNA技術在轉化的宿主細胞中產 生。為了這樣做，制備編碼融合蛋白的重組DNA分子。制備這種DNA 分子的方法是本領域公知的。例如，編碼調節物和蛋白質的序列可以 利用適合的限制性內切酶從DNA上切下。做為選擇，DNA分子可以 利用化學合成技術，例如氨基磷酸酯方法來合成。同樣，可以使用這 些技術的組合。
本發明還包括能夠在合適的宿主中表達調節物、蛋白質或融合 物的栽體。所述栽體包含編碼所述調節物、蛋白質和/或融合物、可 操作地連接到合適的表達控制序列的DNA分子。在DNA分子被插入 栽體之前或之后產生這種可操作的連接的方法是公知的。表達控制 序列包括啟動子、活化子、增強子、操縱子、核糖體結合位點、起 始信號、終止信號、cap信號、多腺苷酸化信號、和涉及轉錄或翻譯 的控制的其他信號。產生的其上具有DNA分子的栽體被用于轉化合適的宿主。這種 轉化可以使用本領域公知的方法進行。在本發明的實踐中可以使用大 量可用的和公知的宿主細胞的任一種。特定宿主的選擇取決于本領域 公認的許多因素。這些包括，例如，與所選表達栽體的兼容性、DNA 分子編碼的融合物的毒性、轉化率、融合物回收的容易、表達特征、 生物安全性和成本。這些因素的平衡必須理解，不是所有的宿主可以 同樣有效地表達特定的DNA序列。在這些一般準則之內，有用的微 生物宿主包括培養中的細菌(例如，大腸桿菌屬(￡.co//^.))、酵 母(例如，酵母屬(5^cc/mrow7cw ))和其他真菌、昆蟲、植物、 哺乳動物(包括人類)細胞，或其他本領域已知的宿主。
然后，培養轉化的宿主并純化。宿主細胞可以在常規的發酵條件 下培養從而表達希望的化合物。這樣的發酵條件是本領域公知的。最 后，通過本領域公知的方法從培養物純化融合物。當使用Fc部分作 為調節物時， 一種優選的方法是使用蛋白A或類似的技術來純化融合 蛋白。調節物、蛋白質和融合物也可以通過合成方法制成。例如，可 以使用固相合成技術。適合的技術是本領域公知的，包括在Merrifield
(1973 ) ， C7i線尸o(y/ e/7"fi^， pp. 335-61 ( Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield( 1963 )， /.敘C/im. Soc. 85: 2149; Davis等(1985 ), ^/oc/ em. /"A 10: 394-414; Stewart and Young ( 1969 ) ， <So"W尸A(^e S聲/^/r，美國專利No. 3,941,763; Finn等(1976 ) ， 77ie /Vo/e/"s ( 3rd ed.) 2: 105-253;以及Erickson等(1976 ) ， /Vo&/"s
(3rd ed.) 2: 257-527中描述的那些。固相合成是制造單獨的肽或蛋 白質的優選的技術，因為它是產生小肽或蛋白質的最有成本效率的方 法。
一般地，本發明的化合物具有藥理學活性，其產自它們體內降解 淀粉樣(3肽的能力。這些化合物的活性可以通過本領域已知的分析來 測量。對于Fc-Nep化合物，在此處的實施例小節進一步描述了體內 分析。
一般地，本發明還提供了利用本發明化合物的藥物組合物的可能 性。這樣的藥物組合物可以是注射施用、或口服、肺部、鼻部、經皮 的或其他形式的施用。 一般地，本發明包括藥物組合物，其包含有效 量的本發明的化合物和藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳
32化劑、佐劑和/或栽體。這樣的組合物包括各種緩沖劑內容(例如，
Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH值和離子強度的稀釋劑；添加劑例 如洗滌劑和增溶劑(例如，Tween80、聚山梨酯80)、抗氧化劑(例 如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如，Thimersol、苯曱醇) 和填充物質(例如，乳糖、甘露醇)；所迷材料摻入到聚合化合物如 聚乳酸、聚乙醇酸等等的顆粒制品中，或摻入脂質體中。也可以使用 透明質酸，這可能具有促進循環中的維持持續時間的效果。這種組合 物可以影響當前蛋白質和衍生物的物理狀態、穩定性、體內釋放速率 和體內清除速率。參見，例^(口， Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. ( 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 ) 1435-1712 頁，通過引用將其合并在此。組合物可以以液態形式制備，或可以是 干粉，例如凍千形式。可植入的持續釋放制劑也是期待的，經皮制劑 也是期待的。這些施用選擇是本領域公知的。
治療上述狀況的方法中涉及的給藥方案可以由主治醫師確定，考 慮到改變藥物作用的各種因素，例如，患者的年齡、狀況、體重、性 別和膳食，任何感染的嚴重度，施用的時間和其他臨床因素。 一般地， 每天的方案應當在每公斤體重O.卜IOOO微克本發明化合物的范圍內， 優選的每公斤0.1-150微克。
本發明清楚地描述了淀粉樣p降解蛋白質可以以特定方式修飾來 維持顯著的降解活性并變得適合于體內使用。公開了支持本發明的實 驗證據。
在某些實施方式中，本發明提供了治療A卩相關病理的方法，例 如唐氏綜合征(Downs syndrome )和P-淀粉樣血管病，例如但不限于 腦淀粉樣血管病、系統性淀粉樣變性、遺傳腦出血、與認知損傷相關 的病癥，例如但不限于MCI ("中度認知損傷")、阿爾茨海默氏病、 失憶、與阿爾茨海默氏病相關的注意力缺陷癥狀、與疾病如阿爾茨海 默氏病相關的神經變性，或癡呆，包括混合的血管和變性起源的癡呆、 早老性癡呆、老年癡呆和與帕金森氏病相關的癡呆、漸進性的核上麻 痹或皮層基底變性，包括向哺乳動物(包括人類)施用治療有效量根 據本發明的融合蛋白。
實施例在此通過以下非限制性的實施例進 一 步描述本發明實施例1
蛋白質結構域的描述
中性溶酶的細胞外結構域被定義為氨基酸51-749 (排除第一曱疏氨酸)(SEQIDNO:卜4 )。存在著兩個多態性導致該結構域中鑒定的氨基酸差異，不同變體的氨基酸序列在SEQIDNO: 1-4中描述。
IDE(胰島素降解酶)是1018個氨基酸長度的蛋白質(SEQ ID NO:5)。描述了 IDE的剪接變體和多態性變體。在一種剪接變體中，一個外顯子被替換為同樣大小的另一個外顯子，其編碼類似于"wt"外顯子的肽序列(在SEQ ID NO: 6中描述)。這個變體已經被描述為在降解胰島素和A|3方面較低效率。在描述的IDE基因中存在著幾種多態性，其引起這個結構域中鑒定的氨基酸差異D947N、 E612K、 L298F和E408G (根據SEQ ID NO: 5的編號)。這些多態性的所有組合也是可能的。
ECE1 (內皮素轉化酶1)的細胞外結構域(SEQ ID NO: 7)是681氨基酸長度的蛋白質，定義為全長的膜結合ECE1蛋白質的氨基酸90-770。 ECE1基因含有幾種引起氨基酸差異的可能的多態性R665C、 W541R、 L494Q和T252L這些多態性的所有組合也是可能的。
中性溶酶、IDE和ECE1的細胞外結構域融合到人類IgG2 Fc結構域(包括絞鏈區)。信號序列(SEQIDNO: 8)被導入以允許蛋白質在表達期間分泌到培養基中。絞鏈區的序列在SEQIDNO: 9中顯示，IgG2 Fc結構域在SEQ ID NO: 10中顯示。具有相應于SEQ ID NO:1的人類中性溶酶變體、相應于SEQ IDNO:5的IDE以及相應于SEQID NO: 7的ECE1的完整融合蛋白(排除信號序列)在SEQ ID NO:H-13中描述。最終的融合蛋白(排除信號序列)具有預測分子量211kDa ( Fc-Nep作為二聚體)、294 kDa ( Fc-IDE作為二聚體)和206 kDa(Fc-ECEl作為二聚體)。
實施例2
構建編碼融合蛋白Fc-中性溶酶的基因的^L明合成地產生融合到編碼IgG2的Fc結構域的基因的、編碼中性溶酶的細胞外結構域的基因(GeneArt)。包括信號序列的完整基因(編碼Fc-中性溶酶)從GeneArt栽體(pCR-Script, pGA4或pUC-Kana )轉移到Gateway供體栽體。Gateway供體栽體被用于將完整基因導入幾個表達栽體中。通過使用Gateway系統，從供體栽體到表達栽體的轉移可以通過利用重組而不是限制性內切酶來進行。所研究的哺乳動物表達栽體主要是pCEP4 、 pEAK10、 pEF5/FRT/V5-DEST和pcDNA5/FRT/TO ( Gateway適應的)。所有這些是基于CMV啟動子(pCEP4 、 pEAK10和pcDNA5/FRT/TO )或 EF-la啟動子(pEF5/FRT/V5-DEST )的標準哺乳動物表達栽體。在所有克隆步驟之后基因被測序來證實DNA序列。
實施例3
構建編碼融合蛋白Fc-IDE和Fc-ECE1的基因的說明合成地產生融合到編碼IgG2的Fc結構域的基因的、編碼酶IDE和ECE1的基因。完整的基因(編碼包括信號序列的Fc-IDE和Fc-ECEl融合蛋白)從起始克隆栽體(pCR-Script、 pGA4或pUC-Kana )轉移到Gateway供體栽體。Gateway供體栽體被用于將完整基因導入幾個表達栽體中。所研究的哺乳動物表達栽體主要是pCEP4、 pEAK10、pEF5/FRT/V5-DEST和pcDNA5/FRT/TO ( Gateway適應的)。所有這些是基于CMV啟動子(pCEP4、pEAK10和pcDNA5/FRT/TO )或EF-la啟動子(pEF5/FRT/V5-DEST )的標準哺乳動物表達栽體。在所有克隆步驟之后基因被測序來證實DNA效率。
實施例4
中性溶酶的細胞外結構域和融合蛋白Fc-中性溶酶在HEK293細胞中的表達
蛋白質中性溶酶(僅細胞外結構域)和Fc-中性溶酶(Fc-Nep)在懸浮適應的哺乳動物細胞中短暫地表達。用于生產實驗的細胞系是來自 HEK293 的細胞系，包括HEK293S 、 HEK293S-T和HEK293S-EBNA細胞。測試了來自編碼感興趣蛋白質的質粒pCEP4和pEAK10的表達。用濃度范圍0.3-0.8pg/ml細胞懸液(終濃度)的質粒DNA在大約0.5-lxl(^的細胞密度下進行轉染。測試的轉染試劑是2(ig/ml細月包懸液(終濃度)的Polyethylenimine ( Polyscience)。表達在30 ml到1000 ml的細胞培養體積(搖動燒瓶)和5L到10L的Wave生物反應器中進行。表達繼之以在不同的天數從培養物上清液采集樣品，分析細胞密度、細胞生存力、蛋白質表達和酶活性。通過離心在4到14天后收獲細胞培養物。細胞培養基被用于蛋白質純化實驗。所有的質粒濃度和栽體都是成功的，得到不同的生產水平，一般在l-3mg/L的范圍內。
實施例5
融合蛋白Fc-IDE和FcECEl在HEK293細胞中的表達蛋白質Fc-IDE和Fc-ECE1在懸浮適應的哺乳動物細胞中短暫地表達。用于生產實驗的細胞系是來自HEK293的細胞系，包括HEK293S、 HEK293S-T和HEK293S-EBNA細胞。測試了來自編碼感興趣蛋白質的質粒pCEP4和pEAK10的表達。用濃度范圍0.3-0.8ng/ml細胞懸液(終濃度)的質粒DNA在大約0.5-^106的細胞密度下進行轉染。測試的轉染試劑是2ng/ml細胞懸液(終濃度)的Polyethylenimine(Polyscience )。表達在30 ml到1000 ml的細胞培養體積(搖動燒瓶)和5L到10L的Wave生物反應器中進行。表達繼之以在不同的天數從培養物上清液采集樣品，分析細胞密度、細胞生存力、蛋白質表達和酶活性。通過離心在4到14天后收獲細胞培養物。細胞培養基被用于蛋白質純化實驗。
實施例6
中性溶酶的細胞外結構域和融合蛋白Fc-中性溶酶在CHO-S細胞中的表達
蛋白質中性溶酶(僅細胞外結構域)和Fc-Nep在懸浮適應的哺乳動物細胞中穩定地表達。生產實驗中使用的宿主細胞是Flpln CHO細胞(Invitrogen)，其已經適應于懸浮生長。測試了從編碼感興趣蛋白質的質粒pcDNA5/FRT/TO-DEST30和pEF5/FRT/V5-DEST的表達。表達由CMV啟動子或EF1 cc啟動子驅動。轉染在F12培養基中利用約0.1ng/ml (終濃度)濃度的質粒DNA在大約lxl0"田胞/ml的細胞
36密度下進行。編碼重組酶的輔助質粒pOG44在0.8 )^g/ml的終濃度下共轉染。2jag/ml細月包懸液(終濃度)6勺Polyethylenimine ( Polyscience )用作轉染試劑。表達在搖動燒瓶中30 ml到1000 ml的細胞培養體積中進行。來自培養物上清液的樣品在不同的天數采集，分析細胞密度、細胞生存力、蛋白質表達和酶活性。通過離心在4到11天后收獲細胞培養物。最后，細胞培養基被用于蛋白質純化實驗。使用的兩種表達栽體在生產期望的蛋白質的方面都是成功的。生產水平一般在10-50 mg/L的范圍內。
實施例7
融合蛋白Fc-IDE和Fc-ECE1在CHO-S細胞中的表達蛋白質Fc-IDE和Fc-ECE1在懸浮適應的哺乳動物細胞中穩定地表達。生產實驗中使用的宿主細胞是FlpInCHO細胞(Invitrogen),其已經適應于懸浮生長。測試了從編碼感興趣蛋白質的質粒pcDNA5/FRT/TO-DEST30和pEF5/FRT/V5-DEST的表達。表達由CMV啟動子或EF1 oc啟動子驅動。轉染在F12培養基中利用約0.1pg/ml(終濃度)濃度的質粒DNA在大約lxl0M田胞/ml的細胞密度下進行。編碼重組酶的輔助質粒pOG44在0.8 ng/ml的終濃度下共轉染。2pg/ml纟田月包懸液(纟冬f農度)的Polyethylenimine ( Polyscience )用作專爭染^式齊'J 。表達在搖動燒瓶中30 ml到1000 ml的細胞培養體積中進行。來自培養物上清液的樣品在不同的天數采集，分析細胞密度、細胞生存力、蛋白質表達和酶活性。通過離心在4到11天后收獲細胞培養物。
實施例8
表達的Fc-中性溶酶蛋白質通過親和層析純化
進行。純化通過親和層析(蛋白A)進行，隨后是低pH值洗脫，在AKTA層析系統(Explorer或Purifier, GE Healthcare )上進行。XK26柱(GE Healthcare )中的rProtein A Sepharose FF ( GE Healthcare )用IO倍柱體積(CV )的PBS( 2.7 mM KC1,138 mM NaCl， 1.5 mM KH2P04,8 mM Na2HP04-7H20, pH 6.7-7.0, Invitrogen)平衡。具有表達的融合蛋白(Fc-中性溶酶)的細胞培養基施加到柱上。柱用20 CV PBS洗涂，之后結合的蛋白質用洗脫緩沖液(O.l M甘氨酸，pH3.0)洗脫。純化的部份立刻通過向lml洗脫的蛋白質中添加50pl的lMTris堿來中和。集中純化的部份，緩沖液利用PD10柱(GE Healthcare)交換成50 mM Tris-HCl、pH 7.5、 150 mM NaCl。純化的蛋白質在SDS-PAGE上分析，發現是大約90%純度。
實施例9
表達的Fc-IDE和Fc-ECE1通過親和層析純化
融合蛋白的純化利用來自哺乳動物細胞中的表達的細胞培養基進行。XK26柱(GE Healthcare)中的rProtein A Sepharose FF ( GEHealthcare )用10倍柱體積(CV )的PBS( 2.7 mM KC1， 138mMNaCl，1.5mMKH2P04， 8 mM Na2HP04-7H20， pH 6.7-7.0, Invitrogen )平衡。具有表達的融合蛋白(Fc-IDE或Fc-ECEl )的細胞培養基施加到柱上。柱用20 CV PBS洗滌，之后結合的蛋白質用洗脫緩沖液(0.1 M甘氨酸，pH3.0)洗脫。純化的部分立即通過向lml洗脫的蛋白質中添加50|iil 1MTris堿來中和。集中純化的部份，緩沖液利用PD10柱(GEHealthcare)交換成50 mM Tris-HCl、 pH7.5、 150mMNaCl。
實施例10
Fc-中性溶酶的表達的SDS-PAGE和Western印跡分析來自哺乳動物細胞中表達的細胞培養基利用Western印跡來分析。20 pi細胞培養基在包含樣品還原劑(Invitrogen)的4xLDS樣品緩沖液(Invitrogen)中稀釋。樣品加熱到95。C 5分鐘，加栽到SDS-PAGE凝膠上(4-12%梯度凝膠，10孑L (1mm) ， invitrogen)。MES緩沖液用作運行緩沖液。凝膠在200V電泳(run) 35分鐘。在30 V進行電印跡1小時，來將蛋白質轉移到PVDF膜上。膜在包括5% BSA的TBST ( TBS ( 20 mM Tris、 500 mM NaCl， pH 7.5 ( BioRad )加0.05% Tween-20)中封閉過夜，之后它們與30 pi —抗(生物素化的山羊抗人類中性溶酶抗體，50pg/ml (R&D Systems))在15 mLTBST中孵育。膜在室溫下孵育兩個小時，用TBST洗滌三次，與鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧化酶綴合物(GE Healthcare, 1:10 000稀釋(15ml TBST中1.5pl)孵育1小時。膜用TBST洗滌三次用水洗滌三說明書第35/56頁
次，之后利用ECL plus試劑(GE Healthcare)和ECL膠片(GE Healthcare )顯現。SDS-PAGE顯示了純化的蛋白質具有正確大小和大 約90%純度。Western印跡證實了中性溶酶結構域的身份。
實施例11
中性溶酶酶活性FRET分析
中性溶酶酶活性在焚光共振能量轉移(FRET)分析中測定。重組 人類中性溶酶(R & D Systems)、來自中性溶酶或Fc-中性溶酶生產 細胞(AZ S6dertaije )的培養基、或純化的中性溶酶或Fc-中性溶酶添 加到含有iO)tiM熒光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys
(Dnp) -OH (R&D Systems)的96孔平板中。對照的重組人類中性 溶酶的終濃度是0.1或0.25 pg/ml。 10 的中性溶酶抑制物膦酰二肽
(phosphoramidone ) ( BIOMOL )添加到一些孔中，以控制分析中信 號的特異性和證實特異性中性溶酶活性。在向反應孔添加所有的成分 之后，平板立即置入熒光板讀取器(Ascent)中，在激發340 nm和發 射405 nm處每分鐘記錄信號持續20分鐘。酶活性通過計算反應速度 一斜率系數-S ARFU/At來評估。為了比較商售的重組中性溶酶和Fc-中性溶酶融合蛋白的比活性，我們引入了比活性系數，其根據這個公 式計算比活性=斜率系數/分析中中性溶酶或Fc-中性溶酶單體的 pmol。
實施例12
IDE和CEC1酶活性FRET分析
酶活性在焚光共振能量轉移(FRET)分析中測定。沒有Fc結構 域的重組酶(商售的或內部生產的)、培養基(來自Fc-IDE或Fc-ECEl 生產細胞)或純化的蛋白質(Fc-IDE或Fc-ECEl )添加到含有lO^M 熒光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys( D叩)-OH( R&D Systems)的96孔平板中。在向孔添加所有的成分之后，平板立即置 入熒光板讀取器(Ascent)中，在激發340 nm和發射405 nm處每分 鐘記錄信號持續20分鐘。酶活性通過計算反應速度-斜率系數- S ARFU/At來評估。為了比較對照(商售的重組酶)的比活性，比活性 系數根據這個公式來計算比活性=斜率系數/分析中酶結構域的pmol。
實施例13
細胞培養上清液中中性溶酶和Fc-中性溶酶濃度的測定 細胞培養上清液中的中性溶酶濃度利用GyrosTM BioaffyTM CD微 實驗室方法和Gyrolab Workstation LIF設備(Gyros AB, Sweden )測 量。來自不同細胞培養物的樣品在標準稀釋劑(Gyros AB)中稀釋， 置入Thermo-Fas t 96孔PCR平板(Abgene， UK )中。單克隆小鼠 生物素化抗人類中性溶酶抗體(Serotec)用作捕獲試劑(終濃度0.05 mg/ml)，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標記的多克隆 山羊抗人類中性溶酶抗體(R&D systems)充當檢測抗體(終濃度 100nM)，用于中性溶酶濃度的測量。商售的重組中性溶酶(R&D systems)用作標準物，濃度范圍從10 ng/ml到10000ng/ml以構建標 準曲線。多克隆生物素化的抗人類中性溶酶抗體(R&Dsystems)用 作捕獲抗體，而用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標記的多 克隆山羊抗人類IgG抗體(Molecular Probes)用作檢測抗體用于Fc-中性溶酶構建體檢測。內部生產的和純化的Fc-中性溶酶融合蛋白充 當標準物，濃度范圍從10ng/ml到10000ng/ml。標準物、捕獲和檢測 抗體置于Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene )中。平板以及Gyrolab Bioaffy CD都放入Gyrolab Workstation LIF儀器，使用Gyrolab BioaffyTM軟件包版本1.8 ( Gyros AB )根椐廠家方案進行濃度測量。
實施例14
細胞培養上清液中IDE、 ECE1、 Fc-IDE和Fc-ECEl濃度的測量 細胞培養上清液中的蛋白質濃度利用Gyros BioaffyTM CD微實 驗室方法和Gyrolab Workstation LIF設備(Gyros AB, Sweden )測量。 來自不同細胞培養條件的樣品在標準稀釋劑(Gyros AB)中稀釋，置 入Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene, UK )中。生物素化的IDE 或ECEl特異性抗體用作捕荻試劑，Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes)標記的IDE或ECEl特異性抗體用作檢測抗體。商售的或內 部生產重組IDE和ECEl被用于構建標準曲線。當測量Fc-IDE或 Fc-ECEl濃度時，差別是用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標記的多克隆山羊抗人類IgG抗體(Molecular Probes )用作檢測抗體。 標準物、捕獲和檢測抗體置于Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene) 中。平板以及Gyrolab Bioaffy CD都放入Gyrolab Workstation LIF 儀器，使用Gyrolab BioaffyTM軟件包版本1.8 ( Gyros AB )根據廠家方
案進行濃度測量。
實施例15
在緩沖液中Fc-中性溶酶和中性溶酶對淀粉樣P肽的降解 這個實驗的目的是證實Fc-中性溶酶能夠降解淀粉樣pi-40肽。該 分析是在有或者沒有中性溶酶抑制物、存在中性溶酶(R&D Systems ) 或Fc-中性溶酶的情況下孵育后測量殘余的淀粉樣(31-40肽(Bachem) 濃度。含有淀粉樣pi-40肽(終濃度，300、 30或3 nM)和/或中性溶 酶(2.4pg/ml)和/或Fc-中性溶酶構建體(2.4pg/ml)和/或磷酰二肽 (10pM)的100 pl反應混合物在圓底96孔聚丙烯平板中在37°。孵育 2.5小時。在孵育之后，10 ^tl的反應混合物轉移到含有10 標準稀 釋劑(Gyros AB )的Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene ， UK ) 中。淀粉樣卩1-40濃度利用Gyrolab Workstation LIF系統測定。生物 素化的抗淀粉樣P抗體(6E10;終濃度50pg/ml; Signet)用作捕獲抗 體，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標記的多克隆抗人類 淀粉樣p抗體(44-348; Biosource)用作檢測抗體。淀粉樣pi-40肽 濃度測量使用Gyrolab BioaffyTM軟件包版本1.8 ( Gyros AB )根椐廠家 方案進行。中性溶酶的淀粉樣)31-40肽降解被計算為在存在中性溶酶 的情況下孵育后留下的淀粉樣P1-40肽、與不存在中性溶酶的情況下 的淀粉樣pi-40肽濃度相比較的百分比。
在2.4jag/ml的濃度下重組人類中性溶酶在37°C 2.5小時的孵育后 降解了 64%的淀粉樣|31-40肽(300 nM)。內部生產的Fc-中性溶酶 構建體在大約相同的濃度(2.4pg/ml)下降解50% (批次1)和42% (批次2 )的淀粉樣pl-40肽(300 nM )。在存在10 膦酰二肽的
情況下特異性中性溶酶活性幾乎完全地消除(附圖1)。這個實施例 顯示了 Fc-中性溶酶有效地降解淀粉樣卩l-40肽。
實施例16
41在緩沖液中IDE、 ECE1、 Fc-IDE和Fc-ECE1的淀粉樣卩肽降解 這個實驗的目的是證實Fc-IDE和Fc-ECEl能夠降解淀粉樣卩1-40 肽。該分析測量在存在酶(Fc-IDE或Fc-ECE1 )的情況下孵育后殘余 淀粉樣(31-40肽(Bachem)的濃度。含有淀粉樣(31-40肽(終濃度， 300、 30或3 nM ) 、 Fc-IDE或Fc-ECE1的100 pl反應混合物在37°C 孵育2.5小時。在孵育之后，10 pl的反應混合物轉移到含有10 標 準稀釋劑(Gyros AB )的Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene, UK ) 中。淀粉樣卩1-40濃度使用Gyrolab Workstation LIF系統測量。生物 素化的抗淀粉樣P抗體(6E10;終濃度5(Vg/ml; Signet)用作捕獲抗 體，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )標記的多克隆抗人類 淀粉樣(3抗體(44-348; Biosource )用作^r測抗體。中性溶酶的淀粉 樣pi-40肽降解被計算為在存在酶的情況下孵育之后留下的淀粉樣 pi-40肽、相比不存在酶的情況下的淀粉樣pi-40肽濃度的百分比。
實施例17
在豚鼠血漿中Fc-中性溶酶對淀粉樣(3肽l-40和淀粉樣(3肽1-42 的降解
中性溶酶對淀粉樣卩肽1-40 ( A卩40 )和淀粉樣|3肽1-42 ( A卩42 ) 的降解利用來自體重250-300g的雄性Dimkin Hartley豚鼠 (HBLidk6ping ka )的肝素化血漿來研究。通過心臟穿刺從麻醉的豚 鼠抽取血液。在采樣的20分鐘內，血液采集到預冷的肝素-血漿試管 中，在4°C 3000xg離心10分鐘。血漿樣品轉移到預冷的聚丙烯試管 中，立即在干水上冷凍，使用前保持在-70。C。實驗在來自七只豚鼠的 血漿庫上進行。His-Fc-Nep ( 6ng/ml或208ng/ml)或5 |ag/ml重組人 類中性溶酶(R&D systems )和相應的栽體(50 mM Tris-HCl、 150mM NaCl pH 7,5或25mM Tris-HCl、 0掘NaCl pH 8.0)在存在或缺少 10pM膦酰二肽(BIOMOL)的情況下與血漿的庫在37。C孵育0和4 小時。終濃度4.7mM的EDTA添加到試管中，之后A卩40和Ap42的 量利用獲自Biosource( A卩卜40)或Innogenetics( A(31-42 )的商售ELISA 試劑盒來分析。
與栽體相比較，在37。C用豚鼠血漿和6pg/ml或208pg/ml His-Fc-Nep的4小時離體(e;c-v/vo )孵育分別產生了 A(340的26%和51%的降低。與栽體相比，商售的人類重組中性溶酶(5 pg/ml)降解 了 AP40 49%。在添加10^M膦酰二肽之后A(340水平不受影響(附圖 2)。
當用208 |ng/ml His-Fc-Nep或5ng/ml中性溶酶(R&D systems ) 孵育時，與栽體相比，豚鼠血漿中的A|342水平降低超過57%。當與 208ng/ml的His-Fc-Nep組合時，A卩42的降低不受膦酰二肽的抑制。 低濃度的His-Fc-Nep沒有Ap42中的降解(附圖3 )。
實施例18
在人血漿中Fc-中性溶酶的淀粉樣卩肽l-40降解 在兩個不同的時間點在醫療中心(AstraZeneca )將來自八位個體 (5男性和3女性)的血液采集到預冷卻的肝素-血漿試管中。在采樣 的30分鐘內，血漿通過在4。C在2500xg離心20分鐘來制備。血漿樣 品轉移到預冷卻的聚丙烯試管，立即冷凍，在使用前保存在-70。C。 His-Fc-Nep ( 6pg/ml)或5^g/ml重組人類中性溶酶(R&D systems ) 和相應的栽體(50 mM Tris-HCl、150 mMNaCl pH7.5或25mM Tris-HCl 0.1 M NaCl pH 8.0)在存在或缺少10nM膦酰二肽的情況下 與血漿庫在37。C孵育0和4小時。終濃度4.7mM的EDTA添加到試 管中，之后使用獲自Biosource的商售的ELISA試劑盒分析Ap40的 量。與栽體相比在37。C孵育4小時之后，His-Fc-Nep ( 6(ig/ml)和商 售的人類重組中性溶酶(5pg/ml)分別降解A卩40 33%和70%。 A(340 水平在添加10pM膦酰二肽后不受影響(附圖4)。
實施例19
在豚鼠血漿中內部生產的Fc-N印的淀粉樣(3肽1-40和淀粉樣P 肽1-42的降解(體內研究)
進行豚鼠中的體內研究以測試內部生產的Fc-Nep的體內效力。 讀數是血漿AP水平和血漿藥物濃度。Y-分泌酶抑制物AZ10420130 (M550426 )被用作參考(血漿A|3水平降低的陽性對照)。
豚鼠(雄性Dunkin Hartley豚鼠，250-300 g )被稱重，i.v.施用單 劑量。目的是，劑量在結束時應得到O、 5和20pg/ml的血漿暴露。在 整個實驗期間進行動物健康狀態的觀察。在每個時點包括8只動物，每個時點具有其自身的栽體組。動物用異氟烷麻醉，通過心臟穿刺采
集血液。對關于血液樣品的信息，處理并分析Api-40或Api-42 (參 見實施例23)。所有血漿樣品將進行PK研究來測定藥物暴露(方法 描述參見實施例20)。
實施例20
Fc-Nep和僅中性溶酶的藥物動力學
開發Fc-Nep融合蛋白來改善中性溶酶藥物動力學實質，特別地 針對降低清除和改善半衰期。為了測試這一點，我們向小鼠i.v.施用 了 1 mg/kg商售的中性溶酶或1或5 mg/kg內部生產的Fc-Nep的單次 劑量。在給藥后設定的時間，在最后從尾部靜脈或通過心臟穿剌抽取 血液樣品。在采樣到含有EDTA的試管中時，將等分量置于冰上。通 過在采樣的15分鐘內離心來制備血漿(一般1500g 4°C IO分鐘)并 立即冷凍。對商售中性溶酶使用抗-Nep、或對Fc-Nep使用抗人類IgG 作為捕獲抗體，而兩種物質都通過抗Nep抗體檢測，通過免疫分析測 定Fc-Nep和中性溶酶的血漿濃度。使用軟件包(WinNonlin, Pharsight Corporation, USA )計算藥物動力學參數，在這個實施例實驗中，計 算的半衰期從對于N印的約5分鐘提高到對于Fc-Nep約20小時。結 果在附圖5中顯示。
實施例21
利用酶活性FRET分析在細胞培養基中中性溶酶-Fc和Fc-中性 溶酶的酶活性的比較
為了比較Fc的C-末端與中性溶酶的融合物和Fc的N-末端與中 性溶酶的融合物，根椐實施例4產生兩種蛋白質(Fc-中性溶酶和中性 溶酶-Fc)并如實施例8描述的純化。細胞培養基中蛋白質的酶活性在 熒光共振能量轉移(FRET)分析中測試。重組人類中性溶酶(R&D systems)、來自Fc-中性溶酶生產細胞的培養基、以及來自中性溶酶 -Fc生產細胞的培養基添加到含有 10 nM 熒光肽底物 V曙Mca-Arg曙Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys ( Dnp ) -OH ( R&D Systems ) 的96孔平板中。對照重組人類中性溶酶的終濃度是0,1或0.25pg/ml。 在向孔添加所有的成分之后，平板立即置入焚光板讀取器(Ascent)
44中，在激發340 nm和發射405 nm處每分鐘記錄信號持續20分鐘。 通過計算反應速度-斜率系數-SARFU/厶t來評估酶活性。為了比較商 售的重組中性溶酶、中性溶酶-Fc融合蛋白和Fc-中性溶酶融合蛋白的 比活性，我們引入了比活性系數，其根據這個公式計算比活性=斜 率系數/分析中中性溶酶或融合蛋白單體的pmol。結果(附圖6中所 示)顯示了 Nep-Fc的表達產生了非常低的比活性(對于用pCEP4栽 體表達為O.l，用pEAK 10栽體表達為0.55 ),但是Fc-Nep的表達產 生了高得多的比活性(用pCEP4栽體表達為13.4，用pEAK10栽體表 達為15.2)。
實施例22
利用酶活性FRET分析比較純化的中性溶酶-Fc和Fc-中性溶酶的 酶活性
為了比較Fc的C-末端與中性溶酶的融合物和Fc的N-末端與中 性溶酶的融合物，根據實施例4產生兩種蛋白質(Fc-中性溶酶和中性 溶酶-Fc)并如實施例8描述的純化。中性溶酶酶活性在熒光共振能量 轉移(FRET)分析中測定。重組人類中性溶酶(R&D systems)、 純化的中性溶酶-Fc蛋白質和純化的Fc-中性溶酶添加到含有10|iM熒 光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys ( Dnp ) -OH ( R&D Systems)的96孔平板中。在向孔添加所有的成分之后，平板立即置 入熒光板讀取器(Ascent)中，在激發340 nm和發射405 nm處每分 鐘記錄信號持續20分鐘。通過計算反應速度-斜率系數- S厶RFU/At 來評估酶活性。為了比較商售的重組中性溶酶、中性溶酶-Fc融合蛋 白和Fc-中性溶酶融合蛋白的比活性，我們引入了比活性系數，其根 據這個公式計算比活性=斜率系數/分析中中性溶酶或中性溶酶-Fc 單體的pmol。結果(附圖9中顯示)顯示了純化的融合蛋白Nep-Fc 的比活性是非常低的(0.001)，但是純化的融合蛋白Fc-Nep的比活 性高得多(14.1 )。
實施例23
在APPswE-轉基因小鼠中血漿中用Fc-中性溶酶對可溶的A卩水平 的處理這項研究的目的是評估在急性的靜脈內處理之后在雌性
APPSWE-tg小鼠的血漿中Fc-Nep的時間和劑量-反應效果。特定目的是 發現對血漿A(34o和A^2的效果。？分泌酶抑制物M-550426被包括作 為參考化合物。
25-31周齡雌性APPswE-轉基因小鼠(10只小鼠/組)以l或5mg/kg 單次靜脈內注射接受栽體或Fc-Nep。作為參考化合物，使用300 pmol/kg的Y-分泌酶抑制物M-550426,這些動物在3小時內處理(4 只小鼠)。空白組(4只未處理的小鼠)還被包括在研究中。在給藥 后1.5和3小時從栽體和化合物處理的動物采集血液。通過心臟穿剌 從麻醉的小鼠抽出血液到預冷卻的含EDTA的微試管中。離心之前， 血液樣品立即置于冰上。在采樣的20分鐘內，血漿通過在大約3000xg 在+4。C離心10分鐘來制備。在血液采集之后，小鼠被終結。血漿中 AP40和A卩42水平通過分別獲自Biosource和Innogenetics的商售 ELISA試劑盒來分析。
根椐實施例20中描述的操作，分析血漿中和制劑中Fc-Nep的濃 度。在來自未處理的動物的樣品(空白)和來自用M550426處理的動 物的樣品中，分析血漿的暴露。
結果
在APP面轉基因小鼠中在1或5 mg/kg i.v注射給藥之后1.5小時 而非給藥之后3小時的血漿中，與栽體相比，Fc-Nep顯著地降低可溶 的A卩40的水平大約20%( P<0,05 )。在1和5 mg/kg在1.5小時，Fc-Nep 的平均血漿暴露分別是9.8和33細/ml。 3小時后沒有見到A卩40的 顯著的變化，而1和5 mg/kg的Fc-Nep血漿暴露分別是7.6和 27.3|ig/ml。如所預計的，在用陽性對照，y-分泌酶抑制物M550426處 理后的血漿中觀察到A|340的降低的水平。在給藥后3小時M550426 的平均血漿暴露在接受300 pmol/kg的小鼠中是33.5 (附圖7)。
在用5 mg/kg Fc-Nep處理1.5小后血漿中的A(342水平與栽體相 比降低了約20% (P<0.05)。在1 mg/kg施用1.5小后沒有見到顯著 的變化。在3小時后任何劑量中沒有見到AP42的顯著的變化，而在 1和5 mg/kg的Fc-Nep血漿暴露分別是7.6和27.3ng/ml。在用陽性對 照，？分泌酶抑制物M550426處理后的血漿中》見察到AP42的降低的水平。在給藥后3小時M550426的平均血漿暴露在接受300 pmol/kg 的小鼠中是33.5nM (附圖8)。
實施例24
在C57BL/6小鼠的用hFc-Nep處理和對血漿中可溶的A(3水平的 影響(時間和劑量反應研究1.5和3小時)
這項研究的目的是評估在急性處理之后在雌性C57BL/6小鼠的 血漿中hFc-Nep的時間和劑量-反應效果。特定目的是找到對血漿A(340 的效果和將效果與血漿中hFc-Nep的暴露程度相關。？分泌酶抑制物 M-550426被包括作為陽性對照。
13周齡雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/組)以1或5 mg/kg單次 靜脈內注射接受栽體或hFc-Nep。在終止前3小時以300 pmol/kg 口服 地施用M-550426。空白組也被包括在研究中。在給藥后1.5和3小時 從栽體和化合物處理的動物采集血液。通過心臟穿刺從麻醉的小鼠抽 出血液到預冷卻的含EDTA的微試管中。離心之前，血液樣品立即置 于冰上。在采樣的20分鐘內通過在+4。C大約3000xg離心10分鐘制 備血漿。在血液采集之后，小鼠被終結。在整個實驗期間進行動物健 康狀態的觀察，顯示了沒有明顯的副作用。血漿中的小鼠A|340水平 通過獲自Biosource的商售ELISA試劑盒分析。根據實施例27中描述 的操作，分析血漿中和制劑中Fc-Nep的濃度。
結果
結果顯示了在C57BL/6小鼠中1.5和3小時后通過用hFc-Nep處 理小鼠AP40以劑量依賴性方式顯著地降低。在1.5小時之后，與栽 體相比，在1 mg/kg刑量見到A卩40的17。/。降低(p- 0.1638 )，在5mg/kg 劑量76%降低(pO.0001 )。在1.5小時1和5 mg/kg下hFc-Nep的 平均血漿暴露分別是14和89ng/ml。在3小時后，與栽體相比，在l mg/kg劑量A卩40被顯著降低36% ( p<0.005 )，在5mg/kg劑量降低 72%。在3小時在1和5 mg/kg下hFc-N印的平均血漿暴露分別是17 和78pg/ml。如所預計的，在用陽性對照，Y分泌酶抑制物M-550426 處理后在血漿中也觀察到AP40的降低的水平。在給藥后3小時 M-550426的平均血漿暴露在接受300 pmol/kg的小鼠中是42 pM (附圖10)。
實施例25
利用作為單劑量經由靜脈內注射給予C57BL/6小鼠的hFc-Nep的 時間-反應關系
這項研究的目的是評估在單劑量之后在雌性C57BL/6小鼠的血 漿中hFc-Nep的時間-反應關系。特定目的是發現hFc-Nep的降低效果 在血漿中保持多久，以及將效果與血漿中測試化合物暴露水平相關。 Y-分泌酶抑制物M-550426被包括作為陽性化合物。
20-12周齡雌性C57BL/6小鼠(8只小鼠/組)接受5 mg/kg的栽 體或hFc-Nep的單次靜脈內注射，在注射后不同的時點分析A(340 (1.5-168小時之間，即，直到1周)。y-分泌酶抑制物M-550426 口 服地給藥，動物被處理3小時。空白組也被包括在研究中。在整個實 驗期間進行動物健康狀態的觀察，顯示了沒有明顯的副作用。血液采 集、血漿加工和血漿中小鼠A(340水平的測量基本上如實施例27所描 述的。
結果
結果(附圖11)顯示，當作為對C57BL/6小鼠的單次靜脈內注 射，在hFc-Nep的1.5-168小時處理之后血漿AP40被顯著地降低。在 所有的時間點(1.5、 6、 12、 24、 36、 72和168小時)A卩40降低是 持續的(與栽體相比67-80%之間)。在1.5小時在5 mg/kg下hFc-Nep 的平均血漿暴露是87Mg/ml，在l周后(168小時)慢慢地降低到38pg/ml 的水平。這些數據顯示了在小鼠中Fc-Nep的半衰期是顯著地長的。 如所預計的，在用陽性對照，，分泌酶抑制物M550426處理后的血漿 中觀察到AP40的降低的水平。在給藥后3小時M-550426的平均血 漿暴露在接受300 |amol/kg的小鼠中是34 pM (附圖11 )。
實施例26
利用作為單劑量經由靜脈內注射給予APPSWE-tg小鼠和C57BL/6 的小鼠Fc-Nep的時間-反應關系
這項研究的目的是評估在單劑量之后在雌性APPSWE-tg小鼠和
48平相關。" 分泌酶抑制物M-550426被包括作為陽性化合物。21-23周齡雌性APP匿-tg小鼠和24周齡雌性C57BL/6小鼠(6 只小鼠/組)接受單次靜脈內注射的5或25 mg/kg的栽體或mFc-Nep， 在注射后不同時點分析A卩40 ( 1.5-336小時之間，即，直至2周)。 在終止之前3小時M-550426以300 pmol/kg 口服地施用。對于兩種小 鼠模型，包括了 APPSWE-tg和C57BL/6、陽性對照和空白組。對于 APPswE-tg小鼠包括了以下的組25 me/kg: 1.5、 72、 168和336小時； 5 mg/kg: 336小時(2周)。對于C57BL/6小鼠25 mg/kg: 168和 336小時；5 mg/kg: 1.5、 168和336小時。在整個實驗期間進行動物 健康狀態的觀察，顯示了沒有明顯的副作用。血液采集和血漿加工基 本上如實施例25描述的進行。C57BL6小鼠血漿中小鼠AP40水平的 分析如實施例25描述的進行。APPSWE-tg小鼠血漿中人類A|340和 A卩42水平的分析如實施例25中描述的進行(如在最后的APP-tg研究 中描述的)。結果在APPswE-轉基因小鼠中，在單次施用25mg/kg后，在所有時間 點，mFc-Nep顯著地降低血漿中的人AJ340和A(342(附圖12， a和b )。 在1.5小時之后，當與栽體相比時，AP40和AP42的A卩水平分別是 91%和87%，當暴露被降低時A(3水平逐漸地提高。在兩周(336小時) 后，與栽體相比，A(340和A(342的八(3水平分別是58%和44%。在兩 周后，在25 mg/ml mFc-Nep的單次靜脈內注射后的暴露從299pg/ml (1.5小時)降低到60pg/ml ( 336小時)(附圖12， c)。對于168 和336小時，使用了給予5 mg/kg的其他組的動物。如附圖12， a和 b中所示，對于A(340和Ap42兩者，在那些時間點A卩以劑量依賴性 方式降解。A(340和AP42的血漿效力效果與mFc-Nep的血漿暴露是反 相關的(附圖13)。這些結果表明，mFc-Nep的A卩降解效果對A卩40 比對AP42更大。在C57BL/6小鼠中，在所有時間點(1.5、 168和336小時)在5和25mg/kg下mFc-Nep顯著地降低血漿中的小鼠A卩40 (附圖14)。 在168和336小時，分析了 5和25 mg/kg兩者，Ap40效果顯示是劑 量依賴性的。在2周后，與栽體相比，25mg/kgmFc-Nep的單次注射 (336小時)顯著地降低血漿中小鼠A(340水平73%。這個時點的血 漿暴露是48ng/ml，因而mFc-Nep顯示了具有長血漿半衰期。實施例27Fc-Nep和內部生產的中性溶酶的藥物動力學利用Fc-Nepa和Nep的不同批次重復藥物動力學研究，獲得不同 的PK分布圖。最重要的是包括IgG的Fc部分的化合物的血漿半衰期 的顯著延長。開發Fc-Nep融合蛋白來改善中性溶酶藥物動力學實質，特別地 針對降低清除和改善半衰期。為了測試這一點，我們向小鼠i.v.施用 了單次的10或50 nmol酶/kg體重的中性溶酶(Nep )或Fc-N印(1 和5 mg/kg)。在設定的時間，在最后從尾部靜脈或通過心臟穿刺抽 取血液樣品。在采樣到含有EDTA的試管中時，將等分量置于冰上。 在采樣的15分鐘內通過離心制備血漿(一般1500g 4°C IO分鐘)并 立即冷凍。對Nep使用抗-N印、或對Fc-Nep 4吏用抗人類IgG作為捕 獲抗體，而兩種物質都通過抗Nep抗體^r測，通過免疫分析測定Nep 和Fc-Nep的血漿濃度。使用軟件包(WinNonlin, Pharsight Co卬oration， USA)計算藥物動力學參數，在這個實施例實驗中，計算的半衰期從 對于Nep的約1天提高到對于Fc-Nep的約2.5周。結果在附圖15中 示出。實施例28在人類和APPSWE-tg小鼠血漿中人類或小鼠Fc-中性溶酶的淀粉 樣|3肽1-40、 1-42的降解在三不同的時間點在醫療中心(AstraZeneca )將來自十二位個體 (6男性和6女性)的血液采集到預冷卻的肝素-血漿試管中。通過在 4。C在2500xg離心20分鐘制備血漿。采集血漿樣品并轉移到預先冷 卻的聚丙烯試管中，立即冷凍，在使用前-70。C保存。就在實驗前將來 自12位個體的血漿解凍并集中。血漿庫中的Api-40和1-42通過具有相應栽體(50mMTris-HCl， 150 mM NaCl pH 7.5 )的人類Fc-Nep或 小鼠Fc-Nep降解。使用以下終濃度的Fc-Nep構建體，100、 32、 10、 3.2、 1、 0.3、 0.1和0pg/ml，在室溫下在定軌搖動器上搖動進行降解 l小時。通過添加膦酰二肽(10 ^M終濃度)來停止酶反應。人血漿 庫中的淀粉樣(31-40的濃度利用ELISA試劑盒(Biosource; KHB3481 ) 根據廠家說明書測量。終濃度4.7 mM EDTA添加到試管，之后使用ELISA試劑盒 Innotest P-AmyloidM2 (I,genetics， lot# 177462, ref弁80177 )根據 廠家說明書分析AP42的濃度。與沒有Fc-N印處理的血漿相比，最高濃度(100pg/ml)的人類 Fc-Nep和小鼠Fc-Nep分別降解人血漿淀粉樣(31-40 66%和71%，分 別降解A卩1-42 28%和19。/。。人類Fc-Nep和小鼠Fc-Nep的降解的EC50 值對于人類Api-40分別是0.58piM和0.40|iiM,對于A(31-42分別是 0.25jliM和0.18pM。結果在附圖16中概述。采集自9只動物的小鼠血漿保存在-70。C。就在實驗前將血漿解凍 并集中。血漿庫中的A卩1-40和1-42由具有相應栽體(50 mM Tris-HCl， 150mMNaClpH7.5)的人類Fc-N印或小鼠Fc-Nep降解。使用以下 終濃度的Fc-Nep構建體，100、 32、 10、 3.2、 1、 0.3、 0.1和0pg/ml， 在室溫下在定軌搖動器上搖動進行降解1小時。酶反應通過添加膦酰 二肽(10 終濃度)來停止。在降解之后，在使用ELISA試劑盒(Biosource; KHB3481 )測量 tg-小鼠血漿庫中的淀粉樣(31-40的濃度之前，根據廠家說明書將血漿 樣品在標準稀釋劑緩沖液中稀釋2 0倍。在降解之后，終濃度4.7 mM EDTA添加到tg-小鼠血漿試管中， 血漿樣品在樣品稀釋劑中稀釋3倍，之后使用ELISA試劑盒Innotest P-AmyloidM2 ( Innogenetics， lot# 177462, re併80177 )根據廠家說明 書分析AP42的濃度。與沒有Fc-Nep處理的血漿相比，最高濃度(IOO fag/ml)的人類Fc-Nep和小鼠Fc-Nep分別降解人血漿淀粉樣pi-40 71% 和77%,分別降解A(3 1-42 34%和53%。人類Fc-Nep和小鼠Fc-N印 的降解的ECso值對于人類A|3l-40分別是0.47nM和0,34 ^M，對于 A|31-42分別是1.3pM和0,82(_tM。結果在附圖16中概述。SE(3 ID NO 1中性溶酶的細胞外結構域的氨基酸序列，形式lYDDGICKSSDCIKSAARLIQ畫DATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTE匿AVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDC PRLGLPSRDYYECTG1YKEACTAYVDFMISVARLIR卿RLPIDEN(5LALE顧KVMELEKE腦ATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMST雨SITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLGNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIC TLDDLTWMDAE丁KXRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFEN11QNLKFSQSKQLKXLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGLQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRJIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVWSEQ ID NO 2中性溶酶的細胞外結構域的氨基酸序列，形式2YDDGICKSSDCIKSAARUQ雇DATTEPCRDFFKYACGGWUCRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVL亂FVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQ10NNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVN1SITNEEDVVVYAPEYLTKLKP1LTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIGTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERJGYPDD1VSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQ1VFPAG1LQPPFFSAQQSNSLNYGG1GMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKJCNGEEKXLPGLDLNHKQLFF匿AQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVWSEQ ID NO 3
中性溶酶的細胞外結構域的氨基酸序列，形式3
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNF
DILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDI
YGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDD畫VNHVI
HIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIR卿RLPIDENQLALEMN
KVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMRLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEI
MSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRT
YKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNG廳ENAVGRLYVEAAFAGESKHV
VEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERJGYPDDIVSNDNKLNN
EYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGR
NQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDW
WTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAY
RAYQNYHCKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSP
GNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
SEQ ID NO 4
中性溶酶的細胞外結構域的氨基酸序列，形式4
YDDGICKSSDCIKSAARUQNMDATTEPCRDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNF
DILRDELEVVLKDVLQEPKTED1VAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDI
YGWPVATE麗EQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVI
HIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKJEACTAYVDFMISVARUR卿RLPIDENQLALEMN
KVMELEKEIANATAICPEDRNDPMLLYNKMRLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEI
MST雨SITNEEDVVVYAPEYLTiaKPILTKYSARDLONLMSWRFIMDLVSSLSRT
YKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHV
VEDLIAQIREVF1QTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERJGYPDDIVSNDNKLNN
EYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGR
NQIVFPAG1LQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDW
WTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAY
RAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSP
GNFRJIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
53SEQ ID NO 5
IDE (胰島素降解酶)的氨基酸序列
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITK
SPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEH
MLFLGTKKYPKENEYS()FLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQ
FFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTG
NKYTLETRPNQEG1DVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFS
EVENKNVPLPEFPEHPF卿HLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHY
LGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFI譜DLTEEGLLHVED
IILHMFQYIQKXRAEGPQEWYFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSK1AGILHYYP
LEEVLTAEYLLEEFRPDL固VLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYK
QEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTVMSK
LWFKQDDKJCKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAE
LAGLSYDLQNT1YGMYLSVKGYNDKQPILLKK11EKMATFE1DEKRFEIIKEAYMRS
LNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFPQLLSRL
HIEALLHGNITKQAALG1MQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFV
YQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQI1SEPCFNTLRTKEQLGYIVFS
GPRRANGIQSLRFHQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRR
LDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDA
PRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPL
FPLVKP訓FMAAKLSEQ ID NO 6
IDE (胰島素降解酶)的氨基酸序列(剪接變體) MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITK
SPEDKREYRGLELANGIKVLLISDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHM
LFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFF
LCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNK
YTLETRPNQEGIDV,LLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEV
ENKNVPLPEFPEHPF(JEEHLK(3LYKJVPIKDIRNLYVTFPIPDLC KYYKSNPGHYLG
HLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFHNVDLTEEGLLHVEDIIL
HMFQYIQKLRAEGPQGWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSK1AGILHYYPLE
EVLTAEYLLEEFRPDL麵VLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQE
AIPDEVIKKWQNADLNGKFKXPTKNEFIPTNFE1LPLEKEATPYPALIKDTAMSKLW
FKC DDKFFLPKACLNFEFFSRYIYADPLHCNMTYLFIRLLKDDLKEYTYAARLSGL
SYGIASGMNAILLSVKGYNDKQPILLKKJIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFR
AEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALL
HGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNE
VHNNCGIEIYYQTDMQSTSE麗FLELFCQHSEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRAN
GIQGLRF1IQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDFCPKK
LSAECAKYWGEI1SQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKJYKEMLAVDAPRRHKV
SVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV1CP
畫FMAAKL
SEQ ID NO 7
ECE1 (內皮素轉化酶1 )的氨基酸序列
QYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGW1KANPVPDGHSR
WGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEELRAKPLM
ELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNSNSNVIQV
DQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQMQQILD
FETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVEINESEPIV
VYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMI糊LVRKTSSFLDQRFQDADEKFMEVMYG
TKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKS1ATEIILEIKKAFEESLS
TLKWMDEETRKSAKEKADAIVNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPDLYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGILQAPFYT
RSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEAFKRQTE
CMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGE隱DNGGLKAAYRAYQNWVKKNGAEHSLP
TLGLTNT^LFFLGFAC VWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKEFSEHFR
CPPGSP訓PPHKCEVW
SE()IDN0 8
表達構建體中使用的信號肽的氨基酸序列METDTIXLWVLLXWVPGSTGD
SEQ ID NO 9
鉸鏈區域的氨基酸序列(來自IgG2)ERKCCVECPPCP
SEQ ID NO 10
Fc結構域的氨基酸序列(來自IgG2)
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKXTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 11
完整融合蛋白Fc-中性溶酶的氨基酸序列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQF
NWYVDGVEVKNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGKYDDGICKSSDC1KSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPE
TSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEP
LUCLLPDIYGWPVATE麗EQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVL亂FVGTDDKNSVNHVIHID(5PRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVD圖SVARLIR卿RLPIDEN
QLALE讓KVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFS
WLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDL()NLMSWRFIMD
LVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAF
AGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALA1KERIGYPDDIVS
NDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVN
AFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKD
GDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNG
GLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSI
KTDVHSPGNFRIIGTLC NSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
SE(5 ID NO 12
完整融合蛋白Fc-IDE的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ簡TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEKNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKMRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKJDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPF卿HLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFI雨DLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKJAGILHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTVMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLP
DRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQ
LGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQ
ALAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEM
LAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQ畫TEF
KRGLPLFPLVKP畫FMAAKL
SEQ ID NO 13
完整融合蛋白Fc-ECEl的氨基酸序列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVC F
NWYVDGVEVHNAKTKPREEGFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PAPIEKT1SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGKQYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGWIKANP
VPDGHSRWGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEE
LRAKPLMELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNS
NSNV1QVDQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQ
MQQILDFETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVE1
NESEPIVVYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMIWNLVRKTSSFLDQRFQDADEKF
MEVMYGTKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKS1ATE1ILEIKK
AFEESLSTLKWMDEETRKSAKEKADAIYNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPD
LYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGIL
C APFYTRSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEA
FKRQTECMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGENIADNGGLKAAYRAYQNWVKKNG
AEHSLPTLGLTNNQLFFLGFAQVWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKE
FSEHFRCPPGSPMNPPHKCEVWSEQ ID NO 14
完整鼠融合蛋白Fc-中性溶酶的氨基酸序列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVPRDCGCKPCICTVPPVSSVFIFPPKPKDVLTITLT
PKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFASTFRSVSELPIMHQD
WLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCM
ITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTF
TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKYDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDASVEPCTDF
FKYACGGWLKRNVIPETSSRYSNFDILRDELEVILKDVLQEPKTEDIVAVQKAKTL
YRSCINESAIDSRGGQPLLKLLPDIYGWPVASDNWDQTYGTSWTAEKSIAQLNSKY
GKKVLINFFVGTDDKNST卿IHFDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMIS
VARLIRQEQSLPIDENQLSLEMNKVMELEKEIANATTKPEDRNDPMLLYNKMTLA
KLQNNFSLEVNGKSFSWSNFTNEIMST雨NIQNEEEVWYAPEYLTKLKPILTKYS
PRDLC NLMSWRFIMDLVSSLSRNYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNG
剛ENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKKAEE
KALAHCERIGYPDDHSNENICLNMEYLELNYREDEYFENIIQNLICFSQSKQLKKLRE
KVDKX)EWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGH
EITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSANNFKDQSQCMVYQYGNFSWDLAGG
QHLNGINTLGENIADNGGIGQAYRAYQNYVKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFA
QVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFADAFHCRKNSYMNPERK
CRVW
SEQ ID NO 15
人類淀粉樣P肽1-38的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQICLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
SEG ID NO 16
人類淀粉樣(3肽1-39的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAHGLMVGGV
SEQ ID NO 17
人類淀粉樣(3肽1-40的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAnGLMVGGVVSEQ ID NO 18
人類淀粉樣P肽1-41的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVI
SEQ ID NO 19
人類淀粉樣|3肽1-42的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHH(3KLWFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
SEQ ID NO 20
人類淀粉樣(3肽1-43的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGUvTVGGWIAT
權利要求
1.一種具有式M-A的融合蛋白，能夠在淀粉樣β肽氨基酸序列中一個或更多個切割位點降解所述淀粉樣β肽，其中M是延長所述融合蛋白的半衰期的蛋白質成分，A是切割所述淀粉樣β肽的蛋白質成分，其中所述M蛋白質成分共價地連接到A蛋白質成分的N-末端部分。
2. 根據權利要求1的融合蛋白，其中A是蛋白酶。
3，根據權利要求2的融合蛋白，其中A是人類中性溶酶。
4. 根據權利要求3的融合蛋白，其中所述中性溶酶是細胞外的中 性溶酶。
5. 根據權利要求4的細胞外的中性溶酶，包含根據SEQIDNO: 1、 2、 3或4的任一個的氨基酸序列。
6. 根據權利要求2的融合蛋白，其中A是胰島素降解酶。
7. 根據權利要求2的融合蛋白，其中A是內皮素轉化酶1。
8. 根據權利要求1的融合蛋白，其中A是支架蛋白質。
9. 根據權利要求1到8的任一項的融合蛋白，其中M是抗體的 Fc部分。
10. 根據權利要求9的融合蛋白，其中所述抗體是IgG抗體。
11. 根據權利要求9的融合蛋白，其中所述抗體是IgG2抗體。
12. 根據權利要求1的融合蛋白，其中M是來自IgG2抗體的Fc 部分，并且A是細胞外的中性溶酶。
13. 根椐權利要求1的融合蛋白，包含根椐SEQIDNO: 11的氨 基酸序列。
14. 根據權利要求1的融合蛋白，其中M是來自IgG2抗體的Fc 部分，并且A是胰島素降解酶。
15. 根椐權利要求1的融合蛋白，包含根椐SEQIDNO: 12的氨基酸序列。
16. 根據權利要求1的融合蛋白，其中M是來自IgG2抗體的Fc 部分，A是內皮素轉化酶1。
17. 根椐權利要求1的融合蛋白，包含根據SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。
18. 根據權利要求1到8的任一項的融合蛋白，其中M選自PEG 化和糖基化。
19. 根據權利要求1到8的任一項的融合蛋白，其中M是HSA。
20. 根據權利要求1到8的任一項的融合蛋白，其中M是HSA 結合結構域。
21. 根據權利要求1到8的任一項的融合蛋白，其中M是抗體結 合結構域。
22. 根據權利要求1的融合蛋白，其中M和A通過接頭L連接 在一起。
23. 根據權利要求22的融合蛋白，其中L選自肽和化學接頭。
24. —種降低淀粉樣|3肽濃度的方法，所述方法包括施用根據權 利要求1到23的任一項的融合蛋白。
25. 根據權利要求24的方法，其中在血漿中實現淀粉樣P肽的降低。
26. 根椐權利要求24的方法，其中在CSF中實現淀粉樣|3肽的 降低。
27. 根據權利要求24的方法，其中在CNS中實現淀粉樣P肽的 降低。
28. —種能夠降解淀粉樣|3肽的藥物組合物，包括藥學上可接受 量的、根據權利要求1到23的任一項的融合蛋白以及藥學上可接受 的栽體或賦形劑。
29. —種預防和/或治療其中淀粉樣p肽的降解是有益的的狀況的 方法，包括向需要這種預防和/或治療的哺乳動物，包括人，施用治療 有效量的根據權利要求1到23的任一項的融合蛋白。
30. —種預防和/或治療阿爾茨海默氏病、系統性淀粉樣變性或腦 淀粉樣血管病的方法，包括向需要這樣的預防和/或治療的哺乳動物， 包括人類，施用治療有效量的根椐權利要求1到23的任一項的融合 蛋白。
31. 根據權利要求1到23的任一項的融合蛋白，其用于醫學治療。
32. 根據權利要求1到23的任一項的融合蛋白在制造藥物中的用 途，所述藥物用于其中淀粉樣P肽的降解是有益的的狀況的預防和/ 或治療。
33. 根據權利要求1到23的任一項的融合蛋白在制造藥物中的用 途，所述藥物用于阿爾茨海默氏病、系統性淀粉樣變性或腦淀粉樣血 管病的預防和/或治療。
34. 根據權利要求32或33的用途，其中所述藥物降低淀粉樣P 肽濃度。
35. 根據權利要求34的用途，其中在血漿中實現所述淀粉樣卩肽 的降低。
36. 根據權利要求34的用途，其中在CSF中實現所述淀粉樣p 肽的降低。
37. 根據權利要求34的用途，其中在CNS中實現所述淀粉樣(3 肽的降低。
全文摘要
本發明涉及融合蛋白和它們在阿爾茨海默氏病患者的酶治療中的用途。所述融合蛋白具有式M-A，能夠在淀粉樣β肽的氨基酸序列中一個或更多個切割位點降解淀粉樣β肽，其中M是延長融合蛋白的半衰期的蛋白質成分，并且A是切割淀粉樣β肽的蛋白質成分。
文檔編號A61K47/48GK101668545SQ200880010294
公開日2010年3月10日 申請日期2008年3月27日 優先權日2007年3月28日
發明者C·安德松, P·-O·弗雷斯克加德 申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司