急性傳播的hiv包膜標記物的制作方法

專利名稱：急性傳播的hiv包膜標記物的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及人類免疫缺陷性病毒(HIV)，具體而言，涉及在患者中誘導針對 HIV的免疫應答的方法及適用于所述方法的免疫原。本發明還涉及診斷試驗試劑盒和使用 其的方法。
背景技術：
對于HIV疫苗的開發來說，病毒多樣性仍然是最棘手的問題之一(Gaschen等， Science 296:2354(2002))。已經表明，當抗HIV-I包膜的抗體在感染前早就以高水平 存在并且該抗體對于攻擊免疫缺陷性病毒株具有特異性時，該抗體是保護性的(Mascola 等，Nat.Med. 6 :207-210(2000) ；Mascola 等，J. Virology 73:4009-4018(1999))。盡管慢 性HIV感染者中的病毒多樣性特別多種多樣，但HIV-I傳播后的病毒多樣性下降(Zhang 等，J. Virol. 67 33456-3356 (1993) ；Zhu 等，Science 261:1179-1181 (1993) ；Ritola 等，J.Virol. 78 :11208-11218(2004))。供體中的稀有變體可被選擇性地傳遞至受體 (Wolinsky 等，Science 255 1134-1137 (2000)) 在急性HIV感染中，與gag相比，HIV-I包膜的多樣性存在不成比例的更大丟失， 表明在傳播事件期間env介導的病毒選擇(Zhang等，J. Virol. 67 =33456-3356 (1993) ；Zhu 等，Science 261 1179-1181 (1993))。最近的數據表明，在急性HIV感染期間具有縮短的可 變環的中和敏感性env被選擇性傳播(Derdeyn等，Science 303 =2019-2022 (2004)) 還 表明在SIV急性感染期間B細胞的耗損阻止了對SIV感染的控制(Miller等，J. Virology, 2007年2月28日電子出版)。本發明至少部分源自疫苗設計標準的確認，如果該標準被執行，則可以產生有效 的抗HIV的疫苗。

發明內容
本發明主要涉及HIV。本發明的一個具體方面涉及一種誘導患者針對HIV的免疫 應答的方法，及適用于該方法的免疫原。本發明的另一個具體方面涉及診斷試驗試劑盒及 使用其的方法。根據下述說明，本發明的目的和優點將清楚明了。


圖1. 100次自展(bootstrap)的患者共有區的ML樹。
圖2. SGA-衍生的包膜克隆體。圖3.漢明距離(hamming distance)頻率的Z20直方圖。圖4.同質性患者1012。圖5.同質性患者700010058。圖6.異質性患者Z18。圖7.異質性患者SC33。圖8.異質性患者。圖9. 73例異質性患者。圖10. 27例患者具有復雜的多峰分布，約15%具有表明異質性感染的漢明距離。圖11. SGA衍生的功能性包膜克隆體。圖12.交互信息標記物每條垂線代表一個人，得到的序列數由高度表示。每個位 置處氨基酸的斷裂由顏色表示。11位在慢性情況下更易變，并且耐受P和N。圖13.信號肽的11位。圖 14. NNSSG_E_KMEKG。圖15A-15Z.急性傳播性標記物。
具體實施例方式本發明涉及包含本文所述的傳播性標記物的來自經傳播病毒的HIVEnv(尤其注 意下面的實施例)及使用其作為疫苗免疫原的方法。本發明還涉及用作診斷試驗的診斷靶 標的包含所述傳播性標記物的來自經傳播病毒的HIV Env0此外，本發明涉及整合到共有 Env中的HIV Env經傳播標記物(即，經傳播病毒序列標記物的氨基酸可以整合到另外的M 組共有或亞型共有Env的序列中)。此外，本發明涉及HIV的經傳播病毒共有Env(具有經 傳播的病毒標記物)及使用其作為免疫原的方法。另外，本發明涉及HIV的經傳播病毒共 有Env (具有經傳播的病毒標記物)及使用其作為測試用診斷靶標的方法。本發明至少部分源于對一系列HIV-I急性和早期傳播性患者進行的研究。將這些 患者的包膜序列與慢性感染患者的對照組進行比較。在傳播性病毒中已經發現傳播瓶頸， 在75%的患者中發現了一個病毒種類傳播的證據，在約15%的患者中發現了多種病毒株 傳播的證據(據信，Env中的經傳播標記物與傳播的病毒有關)。對體現經傳播病毒的特征 而非慢性HIV株特征的傳播株包膜標記物的確定已經開始。本文描述的是兩種初始傳播的 Env標記物及使用這些標記物和傳播的HIV-I株數據庫來設計有效的HIV-I包膜免疫原以 進行HIV-I疫苗開發的方法。預期滿足下列標準的疫苗可以有效抑制HIV的傳播1.誘導抗體的產生，所述抗體結合保留的功能性傳播的包膜三聚體抗原表位；2.通過B細胞群誘導抗體產生，所述B細胞群可以在數小時到數天內對感染作出 應答；3.在粘膜表面誘導抗體的產生；4.在傳播部位局部誘導高滴定度的抗體；和5.防止或限制大量凋亡或凋亡介導的免疫抑制。可以利用普通技術人員公知的方法化學合成并純化本發明的免疫原。還可以通過
4公知的重組DNA技術合成所述免疫原。編碼本發明免疫原的核酸可以用作例如DNA疫苗的 組分，其中所述編碼序列作為裸DNA施用或，例如，編碼免疫原的小基因(minigene)可以存 在于病毒載體中。編碼序列可以存在于，例如，復制型或非復制型腺病毒載體、腺相關病毒 載體、減毒的結核分枝桿菌載體、卡介苗(BCG)載體、牛痘或改良的牛痘安卡拉(MVA)載體、 另一種痘病毒載體、重組脊髓灰質炎和其他腸病毒載體、沙門氏菌屬細菌載體、志賀氏桿菌 屬細菌載體、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)載體、Semliki森林病毒載體或煙草花葉病毒載體 中。編碼序列還可以表達為具有例如活性啟動子(如CMV啟動子)的DNA質粒。還可以使 用其他活載體表達本發明的序列。可以通過向患者自身細胞導入編碼所述免疫原的核酸而 在這些細胞中誘導本發明的免疫原的表達，優選的是使用優化在人類細胞中的表達的密碼 子和啟動子。制備和使用DNA疫苗的方法的實例公開于，例如，美國專利第5，580，859號、 第 5，589，466 號和第 5，703，055 號。本發明包括這樣的組合物所述組合物包含在可藥用的遞送系統中的免疫有效量 的本發明的免疫原或編碼其的核酸序列。所述組合物可用于免疫缺陷性病毒感染的預防和 /或治療。可以利用佐劑(例如，明礬、AS021(來自GSK)oligo CpGs、MF59或Emulsigen)、 乳化劑、可藥用的載體或通常在疫苗組合物中提供的其他成分來配制本發明的組合物。最 佳制劑可以由本領域普通技術人員容易地設計，可包括用于速釋和/或緩釋的制劑，用于 全身性免疫的誘導和/或局部粘膜免疫的誘導(例如，所述制劑可以被設計成鼻內施用) 的制劑。本組合物可以通過任意方便的途徑施用，包括皮下、鼻內、直腸內、陰道內、口腔、肌 內或其他腸胃外或腸內途徑，或其組合。可以施用足以誘導免疫應答的量的免疫原，例如， 作為單次劑量或多劑量施用。最佳免疫接種程序表可以由普通技術人員容易地確定，并且 可以根據患者、組合物和追求的效果進行調整。本發明的組合物和施用方案的實例包括共有或嵌合gag基因和共有或嵌合nef基 因和共有或嵌合POl基因和具有經傳播標記物的共有Env或具有經傳播標記物的嵌合Env 或具有經傳播標記物的野生型經傳播病毒Env，表達為以下方式，例如，用于抗體的DNA初 免(prime)重組水泡性口炎病毒增強劑和重組包膜蛋白質增強劑，或DNA初免重組腺病毒 增強劑和包膜蛋白質增強劑，或，僅用于抗體誘導(只有重組包膜作為佐劑中的蛋白質) (參見美國申請第 10/572，638 號和 PCT/US2006/032907)。本發明設想直接使用本發明的免疫原和/或編碼其的核酸和/或表達為如上所述 的載體中的小基因的免疫原。例如，編碼免疫原的小基因可以用作初免劑(prime)和增強 劑。閱讀本文后將理解，可以使用完整的包膜基因或其部分(即，作為小基因)。就表 達的蛋白質而言，可以使用蛋白質亞單位。根據本發明，以下策略可在HIV疫苗設計中使用以實現針對HIV-I的保護性抗體 的誘導1.用HIV env構建體進行免疫，所述HIV env構建體源自包含下述實施例所列舉 的傳播標記物的野生型經傳播HIV-I株。2.將這些經傳播的標記物整合到從慢性HIV-I序列得到的共有HIV-I Env中，例 如 CONS (Liao 等，Virology 353 :268_282 (2006))，或更新的 M 組共有區、2003 年 CONT 或亞 型共有Env如CONA 2003,CONB 2003或CONC 2003。可以使用這些共有序列的較新的形式，它們源自LosAlamos HIV序列數據庫2003年后的序列。其他亞型共有基因也可使用，如源 自進化枝AE_01、AG重組體、G、F等的亞型共有基因。3.僅基于個體患者的共有序列來開發經傳播的分離erw共有區。這需要向經傳播 的HIV數據庫添加非B序列——這些序列由HIV AIDS疫苗免疫學中心生成。4.實施例中所述的任一Env的表達可能需要它們處于最天然的構象。因此，Env可 以表達為gpl40C(切割突變)F(融合結構域缺失)形式、gpl40C形式、病毒樣粒子的gpl60 形式(Sailaja等，Virology，2007年2月2日電子出版)，或利用gpl40s的C末端的GCN4 三聚基序(motif)的穩定三聚體(Pancera, J. Virol. 79 :9954_9969 (2005))。5.作為選擇，如果傳播標記物使Env具有穩定的中和表位，則包含穩定表位的Env 部分可以表達為亞單位并用于免疫。6.通過免疫系統的T細胞臂(T cell arm)進行的Env識別對于HIV疫苗設計非 常重要(Weaver等，J. Virol. 80 =6745-6756 (2006))。因此，具有這些標記物的野生型經傳 播Env或包含這些標記物的共有Env可以穩定某些T細胞表位的T細胞識別，并且對于T 細胞疫苗設計是有益的。7. T細胞識別遍及HIV基因組的免疫原性表位(Letvin等，Nat. Med. 9 861-866(2003))，因此將經傳播病毒的完整基因組序列加入傳播的HIV數據庫可促進具有 遍及HIV基因組的T細胞表位的完整HIV疫苗的設計，并使該設計成為可能。如上面指出的，本發明還涉及診斷靶標和診斷試驗。例如，可以通過哺乳動物細胞 的瞬時或穩定轉染來表達包含傳播病毒標記物的包膜(或它們可以表達為例如重組牛痘 病毒蛋白質)。該蛋白質可用于ELISA、Luminex珠試驗或其他診斷試驗以便在HIV感染的 最早階段檢測患者生物樣品中針對經傳播病毒的抗體。在下面的非限制性實施例中將更詳細地描述本發明的某些方面(還可參見2006 年12月22日提交的美國申請第10/572,638號和2006年8月23日提交的國際專利申請 第 PCT/US2006/032907 號)。實施例HIV-I經傳播病毒的包膜的表征對于設計有效的基于包膜的疫苗非常重要。已對 來自192例個體的4260B進化枝env序列進行了密碼子比對，高變序列或缺口大于100個 堿基的序列已經被刪除。這些序列被分成試驗組、驗證組和早期組。基于各組患者的共有 序列建立似然樹以尋找強勁的亞型B內進化枝某些樣品，尤其是來自美國和特立尼達島 的CHAVI樣品，在所述樹中具有明顯的地理譜系(圖1)。測試組包括26例Feibig II，沒有可檢測的HIV特異性免疫的急性樣品(Feibig 等，AIDS 17 :1871-1875(2003))，14 例 Feibig III，抗體陽性的急性 HIV 感染(AHI)樣品， 和40例匹配的慢性患者。第二組樣品用于驗證組也包括26例HIV特異性免疫前的Fiebig I-II AHI樣品，14例抗體陽性的Feibig III-IV AHI，和38例來自Los Alamos數據庫的B 進化枝慢性患者(Bailey 等，J. Virol. 80 =4758-4762 (2006)) 圖2顯示源自2例AHI患者的單基因組擴增包膜克隆體。每位患者產生大約40 個克隆體，它們顯示非常接近的同源性，在克隆體間只有少許氨基酸差異。為了模仿早期感染中的病毒進化，采用下列假設計算給定世代數的預期最大距 離，并對進化進行計算機模擬
■每一代每個細胞感染6個細胞■突變率是 μ = 3· 4Χ 1(Γ5■傳代時間是2天■漢明距離(HD)頻率遵循Poisson分布，λ = ΝβΧ μ，其中Νβ是序列長度(單位 是堿基)圖3-9顯示這些分析的結果。對于“同質性患者”來說，73/100的樣品可以與基于計算機模擬的模型良好匹配， 并與建立感染的單病毒相一致-漢明距離分布中觀察到的單峰-相對同質性-從MRA起的估算天數不超過基于Fiebig階段的感染后的估算天數但是，在急性 感染中發現“選擇性清除”的指示-許多樣品的估算的最近共同祖先(MRA)比感染后的估算時間更近· 19/21的階段IV-VI樣品的最近共同祖先(MRA) < 3周前· 6/11的階段III樣品的MRA < 2周前-一些樣品具有一系列相同序列，考慮到剩余的多樣性，這是出乎意料的。存在的問題是為什么考慮到Fiebig階段時，MRA的估算天數經常少于感染后的預 期天數。據信，存在兩種解釋。模型假設可能引起偏離，造成從MRA起的天數的持續低估， 或，選擇性清除可能是真實的，即，不同譜系的系列派生在急性感染期間可能是常見的，產 生自壓力例如病毒靶細胞特異性、新組織的浸潤或HIV特異性免疫應答前的先天免疫。考慮到樣品中觀察到的最大漢明距離，估算從共有祖先進化到獲得該水平的多樣 性需要多少天假設每代步驟(任意的)都具有10%的極端選擇和90%的中性漂變，和計算對Nb來說每代的預期漂變，范圍從2，500到3，500。對每位患者，估算獲得觀察到的多樣性需要的最少天數。如果該估算與Fiebig階 段不一致，則該病例是異質性感染的良好候選物，其中不止一種變體被傳播 15/100例。 圖10顯示利用這些方法的異質性感染。圖11顯示源自早期急性HIV感染患者的單基因組擴增功能性包膜克隆體，其可用 于疫苗開發。對該傳播的病毒數據集進行傳播病毒標記物的分析陽性關聯要求測試組中q < 0. 50，并且驗證組中ρ < 0. 05。對于初步分析，使用 兩種分析方法-氨基酸位置與急性(或急性+早期)序列及慢性序列狀況之間的交互信息，和-與急性或慢性傳播狀況有關的患者共有樹內的變化模式。對于交互信息分析(Korber等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :7176_7180 (1993)； Korber 等，AIDS Res. Human Retrovirol. 8 1549-1560 (1992))而言，計算每個位置的氨基 酸與急性或慢性分類之間的交互信息。使用Monte Carlo統計-對每位患者重新取樣用于替代，以便在開始前每位患者具有相同數目的序列，-通過10，000次隨機化對患者分類進行混洗，每次重新計算隨機數據的交互信
7息，和-對進化枝內的分類進行混洗，以至少部分說明親緣性(非獨立性)樣品。最后，確定q值以與應對多次測試。圖12、13顯示在HIV-IEnv的信號序列中利用 這些方法的經傳播Env，其還與HIV-I vpu基因重疊。如圖13所示，假設該傳播的標記物可 以影響HIV Env切割率，因此在經傳播病毒的表面提供更多的Env。作為選擇，該突變可以 改變 HIV-I 影響 Vpu 介導的 CD4 下調的能力(Butticaz 等，J. Virol. 1502-1505 (2007))。其次，僅利用每個人的共有序列進行最大似然樹分析，確定沿著擴展到慢性或急 性序列的樹的分枝是否存在特征性氨基酸變化(參見Bhattacharya等，Science 315 1583-1586 (2007) ο圖14顯示HIV-I Env的Vl區中的傳播標記物。假設該標記物可以影 響傳播的HIV病毒粒子的中和敏感性，并且可以影響HIV V3環用于結合至CCR5共受體的 暴露，因此使得傳播的HIV株更“適合”于傳播。另一種標記物在Cl區中發現，Cl區接近于認為gp41與gpl20結合的位置Εην gp 160中的ENVTE_N_FNMWK氨基酸NOpos 108。該序列在急性傳播的HIV中定位到N。該突 變可能影響gp41_gpl20相互作用的穩定性。這些分析的應用利用傳播的分離數據集可以進行的其他分析包括用于完整序列組而不僅僅是共有序列組的完全ML樹-校正的關聯分析 (Bhattacharya 等的改進，Science 315 1583-1586 (2007))；已知參與關鍵蛋白質_蛋白質相互作用的非鄰接氨基酸組合的分析CCR5 結合，gpl20/gp41 相互作用，和交叉反應性中和抗體結合位點；最接近蛋白質表面的氨基酸組合的分析；共變量分析以統計地考慮潛在的混合因素，諸如危險因素、地理位置、取樣年份； 和患者內研究以確定選擇的作用、多樣化和異質性相對同質性急性感染樣品的比 例、瓶頸的本質、和感染早期重組的影響。將上文引用的所有文獻和其他信息來源的全文引入本文作為參考。
權利要求
一種在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用足以影響所述誘導的量的包含傳播的HIV包膜(Env)序列標記物的免疫原。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述傳播的HIVEnv序列標記物存在于共有Env中。
3.如權利要求2所述的方法，其中，所述共有Env是M組共有Env。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述傳播的HIVEnv序列標記物影響HIV Env切割 率或改變HIV影響Vpu介導的⑶4下調的能力。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述傳播的HIVEnv序列標記物在HIV Env的信號 序列中。
6.如權利要求1所述的方法，其中，所述傳播的HIVEnv序列標記物在HIV-Env的Vl區。
7.如權利要求6所述的方法，其中，所述傳播的HIVEnv序列標記物影響傳播的HIV病 毒粒子的中和敏感性或HIV V3環用于結合至CCRS共受體的暴露。
8.如權利要求1所述的方法，其中，所述傳播的HIVEnv序列標記物在HIV Env的Cl區。
9.如權利要求8所述的方法，其中，所述傳播的HIVEnv序列標記物影響gp41-gpl20 相互作用的穩定性。
10.如權利要求1所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
11.一種組合物，所述組合物包含傳播的HIV Env序列標記物和載體的混合物。全文摘要
本發明主要涉及人類免疫缺陷性病毒(HIV)，具體而言，涉及在患者中誘導針對HIV的免疫應答的方法及適用于所述方法的免疫原。本發明還涉及診斷試驗試劑盒和使用其的方法。
文檔編號A61K39/21GK101969997SQ200880009784
公開日2011年2月9日 申請日期2008年3月27日 優先權日2007年3月27日
發明者喬治·肖, 坦莫伊·巴塔查里亞, 巴頓·F·海恩斯, 比阿特里斯·H·哈恩, 羅恩·斯萬斯特洛姆, 貝特·T·科貝爾, 雅納·S·格納納卡爾尼, 高峰 申請人:加利福尼亞大學董事會;杜克大學;Uab研究基金會;北卡羅來納大學查珀爾希爾分校