皮膚中活性物質的控制釋放的制作方法

專利名稱：皮膚中活性物質的控制釋放的制作方法
相關申請交叉參考
本專利申請是2005年7月27日提交的美國專利申請US11/191,181的部分繼續申請，是2005年11月7日提交的美國專利申請10/514,215的部分繼續申請，并根據35U.S.C.§365(c)的規定要求了于2003年5月15日提交的、并指定美國的國際申請PCT/US03/015600的優先權，該國際申請根據35U.S.C.§119(e)的規定要求了于2002年5月15日提交的美國臨時專利申請為60/378,042的優先權。根據35U.S.C.§119(e)的規定，本申請還要求了2007年1月31日提交的美國臨時專利申請60/887,553的優先權。所有以上五個申請的公開內容通過引用并入本文。
背景技術：
皮膚是發揮許多生理功能的復合膜，例如新陳代謝、合成、溫度調節和排泄。它的上層，即角質層，被認為是外源物質經皮滲透的主要屏障。
目前，存在幾類藥學產品，其靶向于皮膚或利用皮膚作為進入機體的港口。這些藥學產品包括透皮和局部藥物遞送系統(貼片)、凝膠、霜、軟膏、洗液，以及皮下移植和真皮接種。當與其他遞送途徑一起時，運輸至或穿過皮膚的不利因素主要是并非所有的藥物都是合適的候選物。
許多物理化學參數已被確定，例如分子疏水性、分子大小、以及與其他分子相互作用的能力(如影響擴散過程的氫鍵的形成)，和滲透速率的變化可發生在不同皮膚類型、患者、不同種族之間以及長幼之間。以可逆和無害方式克服皮膚對滲透的抗性和治療上有效的局部和透皮制劑設計，是目前主要的挑戰。
局部和透皮藥物遞送系統的發展已旨在通過無毒和無刺激方法克服人類皮膚顯著有效的屏障性質。研究人員已研究了大量化學和物理方法來克服皮膚強大的屏障功能，并且可分為被動或主動方法。增強皮膚滲透的主動方法包括的技術例如離子導入(電學方法)、使用微針(機械方法)、超聲、激光以及光學機械波。被動方法包括使用滲透增強劑、脂質體、或其他載體、前體藥物或代謝方法、藥物擴散驅動力的增強(熱動力學活性)和/或增加皮膚的滲透性。
為了在藥物的溶解性/分散性和穩定性方面獲得合適的性質(profile)，制劑的選擇也是非常重要的。最具功能性的制劑應能夠溶解疏水和親水物質，并同時增加吸收效率而不導致對皮膚顯著的損害。在局部遞送至皮膚中的另外一個挑戰是少數適當的藥物，其通常限于小的、適度親脂性且高度有效的藥物。通常，高度親脂性分子不能從主要由脂質組成的角質層良好地轉移至較多水相有活力的表皮，并且其結果通常是高度親脂性分子具有較差的可滲透性。
已發展了幾種用于改善皮膚遞送的方法，包括復合物理增強方法，例如離子導入、超聲導入和電穿孔，但是這些技術更適于親水、水溶物質。關于被動增強方法，過飽和的制劑或新型載體系統，例如微乳液、脂質體和膠態聚合的懸浮液，也已被研究作為針對更“傳統”化學滲透增強劑系統的可選替代物。已對少數生物可降解的、聚合物微粒子以及固體-脂納米粒子關于它們用于透皮藥物施用的潛能進行研究。但是高親脂性分子的經皮穿透仍存在問題，因此迫切需要合適的遞送載體。


發明內容
本發明滿足了上述需要，提供了一種局部組合物，其含有用于通過角質層局部遞送的活性化合物，所述活性化合物與具有A-B-A結構三嵌段共聚物的納米球絡合，其中每個A端基嵌段是水溶、親水和無毒的聚合物或低聚物；并且中間B嵌段是具有相同或不同重復單元的疏水的聚合物或低聚物，所述重復單元具有如所述通式的結構
其中X是

；Z是2和約100之間，包括2和約100在內；R1是CH＝CH或(CH2)n，其中n是0至18，包括0和18在內；R2選自氫及含有直至18個碳原子的直鏈和支鏈烷基、烷氧基、烷基芳基和烷氧基芳基；并且R選自鍵或含有直至18個碳原子的直鏈和支鏈烷基、烷氧基、烷基芳基和烷氧基芳基。
根據一個具體實施方式
，局部組合物進一步包括藥學上可接受的載體。所述藥學上可接受的載體可包括選自稀釋劑、增溶劑、潤滑劑、助懸劑、封裝材料、溶劑、增稠劑、分散劑、緩沖劑、抗氧化劑、防腐劑、碳水化合物、糖、螯合劑、糖醇、反離子和非離子表面活性劑的一種或多種成分。藥學上可接受的載體可以被配制為水分散液、乳液、霜、軟膏、凝膠狀或固體聚合物基質或多孔陶瓷基質。
活性化合物可以是親水的和疏水的。另外，活性化合物可以是局部或系統給藥的藥物。活性化合物的例子包括抗生素、抗菌劑、抗痤瘡劑、抗癌藥、非甾體抗炎劑(NSAIDS)、抗組胺劑、鎮咳劑、止癢劑、抗膽堿能劑、抗嘔吐和抗惡心劑、食欲抑制劑、中樞興奮劑、抗心律失常藥、β-腎上腺素阻斷劑、強心劑、抗高血壓劑、利尿劑、血管擴張劑、血管收縮劑、抗潰瘍劑、麻醉劑、抗抑郁劑、鎮靜劑和鎮痛劑、抗精神病劑、抗微生物劑、抗腫瘤劑、抗瘧劑、肌肉松弛劑和止瀉劑。
本發明的局部組合物還以個人護理產品的形式提供，例如洗發液、護發素、沐浴液、護膚液、除臭劑、止汗劑等等，其中活性化合物是洗發液、皮膚洗滌、頭發或皮膚護理活性成分或除臭劑或止汗劑活性成分。還提供了根據本發明的其他局部組合物用于局部施用至皮膚，其中活性化合物包括是防曬鞣劑、皮膚漂白和增亮劑、保濕劑或UV-A或UV-B吸收化合物。
本發明還提供化妝醫藥品局部組合物，其含有是化妝醫藥品成分的一種或多種活性化合物。化妝醫藥品成分的例子包括天然維生素、礦物質、天然油、植物化學品、酶、抗氧化劑、抗衰老劑、α-羥基酸、乙醇酸和水楊酸。
本發明還提供用于皮膚疾病或病癥的治療的局部組合物。根據本發明該實施方式的局部組合物含有一種或多種活性化合物用于疾病或病癥治療。用于皮膚疾病或病癥治療的活性化合物的例子包括治療劑，其用于治療寄生感染、真菌感染、細菌感染、病毒感染、丘疹鱗屑性疾病、色素性病癥、癌癥和皮膚藥物反應。
根據本發明的局部組合物可含有真皮穿透增強劑。真皮穿透增強劑的例子包括脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、萜、乙二醇和乙二醇酯、1，3-二氧戊環、含有至少12碳原子的大環酮、噁唑烷酮和噁唑烷酮衍生物、烷基-2-(N，N-二取代的氨基)-鏈烷酸酯、(N，N-二取代的氨基)-烷醇鏈烷酸及其混合物。
本發明還提供用于局部遞送活性化合物的方法。如一個具體實施方式
，提供了通過局部施用至患者的角質層，將活性化合物穿過角質層遞送至下表皮和真皮的局部方法，所述患者患有的疾病或病癥需要用本發明的局部組合物的有效量治療，其中所述局部組合物的活性化合物是有效治療所述患者的疾病或病癥。
如一個具體實施方式
，所述疾病或病癥是皮膚疾病或病癥，其選自寄生感染、真菌感染、細菌感染、病毒感染、丘疹鱗屑性疾病、色素性病癥、癌癥和皮膚藥物反應，并且所述活性化合物包括用于皮膚疾病或病癥的治療的一種或多種治療劑。
本發明的前述和其他目的、特征和優勢將結合附圖對如下優選實施方式的詳細描述中更加顯而易見。



圖1是聚乙二醇-嵌段-寡聚(DTO辛二酸)-Z)-嵌段-聚乙二醇(PEG-b-oligo(DTO-SA)-Z)-b-PEG)三嵌段共聚物、5-十二烷基氨基熒光素(dodecanoylaminofluorescein，DAF)、尼羅紅(Nile Red，NR)和姜黃素(Curcumin)的結構示意圖； 圖2是描述由動力光散射(積累量擬合)測量的溶質-納米球制劑大小分布的圖，其中(v)納米球-尼羅紅絡合物；(□)納米球-DAF絡合物；(v)納米球-姜黃素絡合物。插圖單獨納米球的大小分布； 圖3包括在水溶液中由PEG-b-oligo(DTO-SA)-Z)-b-PEG三嵌段共聚物制成的納米球的透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，TEM)圖像。其中，上圖負染色方法(2％乙酸雙氧鈾)；下圖Pt/C陰影方法； 圖4A-I是被動滲透24小時后獲得的橫截面熒光圖像。其中(A)PG-DAF；(B)NSP-DAF；(C)PG-姜黃素；(D)NSP-姜黃素；(E)PG-NR；(F)NSP-NR。被動滲透24小時后，NSP對于PG的穿透效果(PE±標準差，＊p＜0.01)。(v)PG和(□)NSP；(G)DAF；(H)姜黃素；(I)NR。EP角質層和有活力的表皮；SD淺表真皮；LD深層真皮； 圖5是冰凍切片皮膚(左)和H&E染色(右)示意圖；以及 圖6A-B是被動滲透1、3和6小時后獲得的橫截面圖像。(A)PG-NR；(B)NSP-NR。被動滲透1、3和6小時后NSP對于PG的穿透效果(PE±標準差，＊p＜0.01)。其中(v)PG-NR和(□)NSP-NR；EP角質層和有活力的表皮；SD淺表真皮；LD深層真皮。

具體實施例方式 本發明將美國公開號為2006/0013882專利申請公開的基于酪氨酸的ABA-型三嵌段共聚物納米球的應用延伸至用于被動皮膚滲透的活性化合物的遞送載體。
三嵌段共聚物源自水溶、親水和無毒的端基嵌段以及聚芳酯或聚碳酸酯的疏水中間嵌段。三嵌段共聚物具有A-B-A結構，其中每個A端基嵌段是水溶、親水和無毒的聚合物或低聚物，并且B中間嵌段是疏水的基于酪氨酸的聚碳酸酯或聚芳酯聚合物或低聚物。
三嵌段共聚物自發地自組裝形成生物相容性的、生物可降解的納米球，其用于甚至在極低濃度的藥物和其他活性物質的遞送。因此，提供組合物，其中用于通過角質層局部遞送的活性化合物與具有A-B-A結構三嵌段共聚物的納米球絡合，其中每個A端基嵌段是水溶、親水和無毒的；并且疏水中間B嵌段是疏水的，其具有如所述式(II)結構的相同或不同重復單元
其中X是

Z是2和約100之間，包括2和約100在內；R1是CH＝CH或(CH2)n，其中n是0至18，包括0和18在內；R2選自氫和含有直至18個碳原子的直鏈和支鏈烷基、烷氧基、烷基芳基和烷氧基芳基；并且R選自鍵或含有直至18個碳原子的直鏈和支鏈烷基、烷氧基、烷基芳基和烷氧基芳基。
本發明的共聚物是A-B-A型三嵌段共聚物。A端基嵌段是水溶、親水和無毒的，優選地選自聚(烯化氧)，并且疏水中間B嵌段是聚芳酯或聚碳酸酯。在優選的聚芳酯實施方式中，中間嵌段由源自酪氨酸的苯二酚和二酸共聚合成，并由基于酪氨酸的苯二酚的酚羥基與二酸的羧酸基之間的酯鍵連接在一起。在其他優選的實施方式中，聚碳酸酯中間嵌段由相同的二羥基單體共聚合成。
更優選的聚(烯化氧)端基嵌段是聚乙烯乙二醇、聚丙烯乙二醇、聚丁烯乙二醇、PluronicTM聚合物等等。聚乙烯乙二醇是優選的。
本發明的聚芳酯中間嵌段是通過根據美國專利US5,216,115所述的方法將二酸與苯二酚縮合而制備的，其中苯二酚化合物與脂肪族或芳香族二羧酸以碳二亞胺調節的直接聚酯化進行反應，使用4-(二甲基-氨基)-吡啶-對-甲苯磺酸(DPTS)作為催化劑。上面述及的美國專利5,216,115的公開內容通過引用并入本文。雙-二酸被選擇作為聚芳酯中間嵌段以使共聚物的每個末端A端基嵌段被連接。
苯二酚化合物是美國專利5,587,507和5,670,602的基于酪氨酸的苯二酚單體，這兩個專利的公開內容在此也通過引用并入本文。使用具有式III結構的基于酪氨酸的苯二酚單體制備聚芳酯
其中R1和R2與如上關于式II的描述相同。
優選的苯二酚單體是脫氨基酪氨酰-酪氨酸羧酸及其酯，其中R1是-CH2-CH2-，其被稱為DT酯。為了實現本發明的目的，乙基酯(R2＝乙基)被稱為DTE，芐基酯(R2＝芐基)稱為DTBn等等。兩項專利公開了制備這些單體的方法。為了本發明的目的，無脫氨基酪氨酰-酪氨酸的羧酸(R2＝氫)被稱為DT。聚芳酯二羧酸具有結構 HOOC-R-COOH 其中R與如上述通式II的描述相同，并且優選地含有直至12個碳原子。R是優選選擇的以使用作起始原料的二羧酸是重要的自然形成代謝物或高度生物相容性的化合物。因此，優選的式IV二羧酸包括被稱為Krebs循環的細胞呼吸途徑的中間體二羧酸。這些二羧酸包括α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸和草酰乙酸，其中R分別是-CH2-CH2-C(＝O)-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-CH2-CH(-OH)-和-CH2-C(＝O)-。
另一個自然形成的、優選的二羧酸是甜菜汁中發現的己二酸(R＝(-CH2-)4)。其他優選的生物相容性二羧酸包括草酸(無R)、丙二酸(R＝-CH2-)、戊二酸(R＝(CH2-)3、庚二酸(R＝(-CH2-)5)、辛二酸(R＝(-CH2-)6)和壬二酸(R＝(-CH2-)7)。換言之，合適的用于本發明的二羧酸是一類R表示(-CH2-)z的化合物，其中，其中z是0至12之間的整數，包括0和12在內。高度生物相容性芳香族二羧酸的優選種類是雙(對-羧基苯氧基)烷烴，例如雙(對-羧基苯氧基)丙烷。
用一鍋法使用非-官能化的聚(烯化氧)單烷基醚和寡聚(DTO辛二酸)的原位碳二亞胺耦聯合成聚芳酯三嵌段低聚物。以下是闡明PEG-寡聚-(DTO辛二酸)-PEG合成的總體設計的具體例子
本發明的聚碳酸酯中間嵌段可用聚合苯二酚的常規方法制備成相同，如美國專利US5,099,060所述，其公開內容在此通過引用并入本文。這些方法涉及在催化劑存在下，將氨基酸衍生的苯二酚化合物與光氣或光氣前驅體(例如雙光氣或三光氣)的反應，其包括美國專利號4,980,449所述的，其公開內容在此通過引用并入本文。適合的處理方法，相關催化劑和溶劑是本領域已知的，并在Schnell，Chemistry and Physics ofPolycarbonates(Interscience，New York 1964)中教導，所述教導通過引用并入本文。
無自由羧酸基與共聚單體的交叉反應從具有無側鏈的羧酸基的苯二酚來聚合具有無側鏈的羧酸基低聚物是不可能。因此，芐基酯二苯基單體例如DTBn的均聚物或共聚物可以通過選擇去除芐基，通過鈀的催化氫解法轉化成相應的自由羧酸均聚物和共聚物，所述的催化氫解方法是已由共同未決和共同所有的美國專利6,120,491公開。該專利的公開內容在此通過引用并入本文。催化氫解是非常必要的，因為低聚物骨架的不穩定性抑制了粗糙水解技術的應用。另一個方法，由共同未決和共同所有的美國專利申請US10/952,202公開，包括從水解不穩定的聚合物選擇去除叔-丁基酯基以形成新的聚合物組合物，其具有自由羧酸基來替代叔-丁基酯基。該申請的公開內容也通過引用并入。
三嵌段共聚物的分子量可通過限制反應時間或組分比率來控制。也可通過使用的碳二亞胺耦聯試劑的數量來控制分子量。
優選的聚芳酯具有約1,000和100,000g/mol之間的重均分子量，優選地為約3,000和50,000g/mol之間，并且更優選地為約10,000和25,000g/mol之間。分子量可通過凝膠滲透層析，相對于四氫呋喃中的聚苯乙烯標準而不進一步校正來計算。因此，三嵌段共聚物具有約2,500和130,000g/mol之間的重均分子量，優選地為約5,000和80,000g/mol之間，并且更優選地為約10,000和50,000g/mol之間。
根據本發明優選的聚碳酸酯具有重均分子量的范圍在約1,000和100,000g/mol之間，優選地為約3,000和50,000g/mol之間，并且更優選地為約10,000和25,000g/mol之間。分子量可通過凝膠滲透層析相對于四氫呋喃中的聚苯乙烯標準來計算，而不進一步校正。因此，三嵌段共聚物具有約2,500和130,000g/mol之間的重均分子量，優選地為約5,000和80,000g/mol之間，并且更優選地為約10,000和50,000g/mol之間。
三嵌段共聚物由水解降解至原始的起始材料，即，酪氨酸衍生的苯二酚、二羧酸以及水溶、親水和無毒低聚物端基嵌段。本發明的共聚物是高度親水的，其有利于納米球藥物遞送系統。但是，共聚物的親水∶疏水平衡可以幾種方式變化。苯二酚側鏈的酯可改變為增加疏水性的較長鏈酯基。增加A端基嵌段的分子量，例如通過增加聚(烯化氧)的烯烴基碳的數量也可增加疏水性。改變二羧酸也可改變親水∶疏水平衡。
本發明的三嵌段共聚物在稀釋水溶液中形成5-200nm范圍(直徑)的泡狀結構。優選的結構具有50和150nm之間的直徑。例如，聚(乙二醇)-嵌段-寡聚-(DTO辛二酸)-嵌段-聚(乙二醇)，即PEG-寡聚-(DTO辛二酸)-PEG三嵌段低聚物在稀釋水溶液中形成具有約100nm范圍直徑的泡狀結構。用常規技術，即光散射，確定泡的特征。
本發明的遞送系統適合于需要局部遞送的應用，以及需要系統遞送的情況。納米球可與或不與活性化合物絡合施用以提供治療效果。
術語“活性化合物”包括疏水和親水化合物。因此，三嵌段共聚物可用于形成納米球疏水藥物遞送系統。三嵌段共聚物的合成，其包含無細胞毒性和生物可降解的結構嵌段并由自組裝方法能夠形成納米球，對用于許多生物醫學應用是重要的，這些應用包括但不限于用作疏水藥物的載體。為了本發明的目的，疏水活性劑被定義為活性劑，例如藥物或其他生物活性材料，其具有相對于辛醇的log P＞0，其中P是分配系數。
目前已充分確定了兩性分子的自組裝依賴于潛在材料的幾個相關性質，即它的化學結構、構造或分子量。但是，假定自組裝驅動力主要由疏水相互作用控制，自組裝嵌段共聚物的設計固有地依賴于它的分子量以及疏水對親水的平衡。在稀釋水溶液中三嵌段共聚物的自組裝由簡單的逐滴添加誘導并且可以由超聲、高剪切混合、納米沉淀或乳化方法來促進。通過在納米球形成前在合適的溶劑中預先混合三嵌段和疏水產物或者通過在將被絡合的產物的溶液或懸浮液中形成納米球，絡合形成活性疏水產品。
本發明的納米球絡合物使用多種劑量形式被局部應用，其中劑量形式可任選地包括合適于局部劑量形式的一種或多種載體。本發明酪氨酸衍生聚合物自組裝納米球能夠滲透角質層并在人類皮膚層內分布。這些納米球能夠包封活性化合物例如疏水藥物，并且將它們遞送至表皮和真皮。因此，本發明還包括通過由本發明納米球包封的疏水或親水活性化合物的局部施用的方法將藥物穿過角質層遞送至表皮和真皮的方法。治療的組合物和方法用于獸類和人類藥物及其給藥，并且除人類患者外，也可被施用至哺乳動物和其他動物，例如鳥類、魚類、爬行類和兩棲類動物。
活性化合物在從納米球絡合物分離之前可以是無活性的，或它可保持在納米球內并以這種形式具有活性。例如，UV-A和UV-B吸收化合物，其在防曬乳(sun block)和防曬劑(sun screens)中用作活性成分，可保持與納米球絡合，并在它們應用的部位吸收有害UV輻射。
用于治療用途的可接受的局部藥學載體是藥學領域熟知的，并在例如，Remington′sPharmaceutical Science，Mac Publishing Co.，(A.R.Gennaro edt.1985)中描述。這些材料以應用的劑量和濃度對接受者是無毒的，并且包括稀釋劑、增溶劑、潤滑劑、助懸劑、封裝材料、溶劑、增稠劑、分散劑、緩沖劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽和其他有機酸鹽，抗氧化劑例如抗壞血酸，防腐劑，低分子量(小于約10個殘基)肽例如聚精氨酸，蛋白例如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白，親水聚合物例如聚(乙烯基吡咯烷酮)，氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸酸、天門冬酸或精氨酸，單糖、雙糖和其他碳水化合物其包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合劑例如EDTA，糖醇例如甘露醇或山梨醇，反離子例如鈉和/或非離子表面活性劑例如TweenTM、PluronicsTM或PEG。在一個實施方式中，用于通過角質層遞送至表皮和真皮的納米球絡合物包含在水分散液、乳液、霜、軟膏、凝膠狀或固體聚合物基質或多孔陶瓷基質中。
包封被遞送的疏水劑的納米球還可作為該試劑的儲存庫被分散在控制釋放裝置的低聚物基質中。宿主低聚物基質可以是水凝膠或其他可生物蝕解的低聚物。這些分散液應具有例如透皮藥物遞送裝置中活性劑儲存物的用途。
可使用或不使用用于皮膚遞送的物理和/或化學增強方法來遞送納米球絡合物。其中，合適的物理增強方法包括熱能、超聲其包括超聲透入和超聲導入、磁電泳、光化學波和激光燒蝕、無線電頻率能量、脈沖電場、電泳方法、離子導入、微切割的微管路、膜電穿孔、實心和空心微針、穿刺，穿孔、研磨、無針注射、吸引和拉伸。化學增強包括使用脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、萜、乙二醇和乙二醇酯、1，3-二氧戊環、含有至少12碳原子的大環酮、噁唑烷酮和噁唑烷酮衍生物、烷基-2-(N，N-二取代的氨基)-鏈烷酸酯、(N，N-二取代的氨基)-烷醇鏈烷酸、防曬酯及其混合物。更優選地，真皮穿透增強劑選自包括油酸、油醇、環十五酮(CPE-218TM)、失水山梨醇單油酸酯、甘油單油酸酯、丙烯乙二醇單月桂酸酯、聚乙烯乙二醇單月桂酸酯、2-正-壬基1，3-二氧戊環(SEPATM)、2-(N，N-二甲基氨基)-丙酸十二烷酯(DDAIP)或其鹽衍生物、2-乙基己基2-乙基己酸酯、異丙基肉豆蔻酸酯、二甲基異山梨醇酯、4-癸基噁唑烷-2-酮(SR 38TM，TCPI，Inc.)、3-甲基-4-癸基噁唑烷-2-酮、辛基二甲基-對-氨基苯甲酸、辛基對-甲氧基肉桂酸酯、辛基水楊酸的列表及其混合物。
遞送系統及其制備方法是特別適合使用活性化合物例如藥理學上的活性蛋白、大分子、肽、疫苗、核酸、其包括質粒、寡核苷酸和SiRNA等等，以及用其他親水和疏水小藥理學的活性分子和對比劑。適當的活性化合物包括，但不限于，合成的和天然的藥物、抗生素、抗菌劑、抗痤瘡劑、抗癌藥、非甾體抗炎劑(NSAIDS)、抗組胺劑、鎮咳劑、鎮咳劑、止癢劑、抗膽堿能劑、抗嘔吐和抗惡心劑、食欲抑制劑、中樞興奮劑、抗心律失常藥、β-腎上腺素阻斷劑、強心劑、抗高血壓劑、利尿劑、血管擴張劑、血管收縮劑、抗潰瘍劑、麻醉劑、抗抑郁劑、鎮靜劑和鎮痛劑、抗精神病劑、抗微生物劑、抗腫瘤劑抗瘧劑、肌肉松弛劑、止瀉劑、防曬鞣劑、皮膚漂白(或增亮)劑、化妝品、將藥物和化妝品性質組合的產品(“化妝醫藥品”)其包括天然維生素、礦物質、天然油、植物化學品、酶、抗氧化劑、抗衰老劑、角質層分離劑(α-羥基酸、乙醇酸和水楊酸)、和保濕劑、皮膚清潔劑、頭發清潔劑、除臭劑、洗發液、調節劑(conditioners)、著色劑、曬傷預防劑和治療方法，以及皮膚疾病包括寄生、真菌、細菌和病毒感染、丘疹鱗屑性疾病、色素性病癥、癌癥和對藥物的皮膚反應的治療的治療劑。
示例性活性化合物包括水楊酸、硫、乳酸、乙二醇、丙酮酸、尿素、間苯二酚、N-乙酰半胱氨酸、類維生素A例如視黃酸及其衍生物(例如，順式和反式)、抗生素和抗菌劑例如過氧化苯甲酰、吡啶酮乙醇胺鹽(octopirox)、紅霉素、四環素、三氯生、壬二酸及其衍生物、苯氧乙醇和苯氧丙醇、乙酸乙酯、克林霉素、甲氯環素、sebostats例如黃酮、羥基酸、膽汁鹽例如鯊膽甾醇硫酸鹽及其衍生物、脫氧膽酸鹽、膽酸鹽、丙酸NSAIDS其包括但不限于阿司匹林、對乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、苯噁洛芬、氟比洛芬、非諾洛芬、芬布芬、酮洛芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡布洛芬、奧沙普秦、普拉洛芬、咪洛芬、硫噁洛芬、舒洛芬、阿米洛芬、噻洛芬酸、氟洛芬、布氯酸、甾體抗炎藥物其包括氫化可的松及類似物、曲普利啶、苯海拉明、抗敏安、吡拉明、苯茚達明、異丙嗪、賽庚啶、阿扎他定、氯馬斯汀、卡比沙明、曲吡那敏、特非那丁、右氯苯那敏、溴苯那敏、氯環嗪、二苯拉林、非尼拉敏、苯托沙敏、右美沙芬、可待因、卡拉美芬、咳必清、甲安菲他明(methdilizine)、阿利馬嗪、東莨菪堿、阿托品、后馬托品、左旋多巴、雙環胺、莨菪堿、丙環定、苯海索、二乙異丙嗪、賽克利嗪、敏可靜、氯丙嗪、安其敏、胃復安、丙氯拉嗪、曲美芐胺、芐非他明、芬特明、氯苯丁胺、芬氟拉明、安非拉酮、苯甲曲秦、苯丙胺、甲基苯丙胺、右旋安非他命、哌甲酯、普萘洛爾、普魯卡因、吡二丙胺、奎尼丁、恩卡胺、flecanaide、美西律和托卡胺、3S-羥基-10，11-雙氫奎尼丁、3R-羥基-10，11-雙氫奎尼丁、3R-羥基-O-乙酰基-10，11-雙氫奎尼丁、3S-羥基-O-乙酰基-10，11-雙氫奎尼丁、特別是3S-羥基-10，11-雙氫奎尼丁、美托洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾、拉貝洛爾、噻嗎洛爾、酒石酸美多洛爾、醋丁洛爾鹽酸鹽、倍他洛爾鹽酸鹽、鹽酸柳胺芐心定、馬來酸噻嗎洛爾、米力農鹽、氨力農、多巴酚丁胺、14-氨基類固醇衍生物、依那普利鹽、可樂定、肼屈嗪、米諾地爾(其也是頭發生長刺激藥物)、胍那決爾、胍乙啶、維拉帕米、美加明、甲基多巴乙酯、帕吉林、酚芐明、哌唑嗪、阿米洛利、氫氯噻嗪、地爾硫卓(diltazem)、胺碘酮、苯氧丙酚胺、芐丙酚胺、妥拉蘇林、維拉帕米、雙氫麥角胺、麥角胺、二甲麥角新堿、雷尼替丁、西咪替丁、利多卡因、布比卡因、氯普魯卡因、狄布卡因、依替卡因、甲哌卡因、丁卡因、達克羅寧、海克卡因、普魯卡因、可卡因、氯胺酮、普莫卡因、苯酚、丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、去甲替林、普羅替林(丙氮環庚烯)、多慮平、馬普替林、苯乙肼、反苯環丙胺、曲唑酮、三甲丙咪嗪、甲氨二氮卓、貝那替秦、苯喹胺、氟西泮、安他樂、洛沙平、丙嗪、氯普噻噸、氟奮乃靜、氟哌啶醇、嗎茚酮、甲硫達嗪、三氟拉嗪、β-內酰胺藥物、喹諾酮藥物、環丙沙星、氟哌酸、四環素、紅霉素、丁胺卡那霉素、三氯生、多西環素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、土霉素、克林霉素、乙胺丁醇、甲硝噠唑、噴他脒、慶大霉素、卡那霉素、林可霉素(lineomycin)、甲烯土霉素、烏洛托品、米諾環素、新霉素、奈替米星、巴龍霉素、鏈霉素、妥布霉素、咪康唑、阿馬諾嗪、鹽酸四環素、依托紅霉素、紅霉素硬脂酸(鹽)、硫酸阿米卡星、鹽酸多西環素、硫酸卷曲霉素、葡萄糖酸洗必太、鹽酸洗必太、鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸克林霉素、鹽酸乙胺丁醇、鹽酸甲硝唑、鹽酸噴他瞇、硫酸雙生霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸林可霉素、鹽酸甲烯土霉素、烏洛托品馬尿酸鹽、孟德立酸烏洛托品、鹽酸二甲胺四環素、硫酸新霉素、硫酸奈替米星、硫酸巴龍霉素、硫酸鏈霉素、硫酸妥布霉素、鹽酸咪康唑、鹽酸阿馬諾嗪、硫酸阿馬諾嗪、三氯生、羥甲辛吡酮、對氯間二甲酚、制霉菌素、托萘酯、克霉唑、博萊霉素、柔紅霉素、阿霉素、氮芥、甲基芐肼、米帕林、他莫昔芬、長春堿、長春新堿、氯喹、羥氯喹伯氨喹、奎寧、桂麻黃堿、環苯扎珠、黃酮哌酯、鄰甲苯海拉明、罌粟堿、甲苯凡林、異達維林、利托君、地芬諾酯(dephenoxylate)、丹曲林、阿珠莫林、洛哌丁胺、二羥基丙酮、吲哚衍生物和類似物、對苯二酚、抗壞血酸、曲酸、偏亞硫酸氫鹽鈉。
合適用本發明的納米球絡合物治療的病癥包括但不限于系統疾病，例如，腸病性肢端皮炎、肢痛癥、急性發熱性嗜中性皮膚病、淀粉樣變性病、血管性水腫、環形紅斑、抗磷脂綜合征、銀中毒、白塞病(Behcet disease)、生物素反應皮膚病、鈣化防御、胡蘿卜素血癥、凍瘡、氯痤瘡、結締組織疾病、克羅恩病、冷球蛋白血癥(cryoglobulinaemia)、庫欣綜合征、皮膚惡性腫瘤標志、惡性萎縮性丘疹病(Degos病)、皰疹樣皮炎、皮肌炎、糖尿病、糖尿病足潰瘍、唐氏綜合征、藥疹、愛-唐綜合征(Ehler Danlos syndrome)、嗜酸性筋膜炎、多形性紅斑、結節性紅斑、紅細胞生成性原卟啉病、面紅、胰高血糖素瘤、戈林綜合征(Gorlin syndrome)、移植物抗宿主病、環狀肉芽腫、血色病、組織細胞增多癥、高嗜酸性粒細胞綜合征、色素失禁癥、缺鐵性貧血、皮膚瘙癢、工作綜合征、夸休可爾癥(Kwashiorkoar)、LEOPARD綜合征、網狀青斑、紅斑狼瘡、萊姆病、馬凡綜合征(Marfan syndrome)、肥大細胞增多癥、更年期、局限性硬皮病、黏蛋白病、粘液瘤綜合征、類脂質漸進性壞死、壞死松解性游走性紅斑、脂膜炎、PAPA綜合征、光敏性、結節性多動脈炎、妊娠的多形性出疹、遲發性皮膚卟啉癥、脛前黏液水腫、結節性癢疹、普洛提斯綜合癥(Proteus syndrome)、瘙癢、彈性假黃瘤、壞疽性膿皮病、賴特綜合征(Reiter syndrome)、網狀紅斑黏蛋白病、類風濕關節炎、SAPHO綜合征、結節病、硬皮病(局部)、硬腫癥、硬化性黏液水腫、壞血病、Sezary綜合征、干燥綜合征(Sjogrensyndrome)、移植受者的皮膚癌、氣孔皮膚問題、sweet疾病、系統硬化癥、休止期脫發、甲狀腺疾病、中毒性表皮壞死松解癥、結節性硬化癥、蕁麻疹、血管炎、韋格納肉芽腫病、Wells綜合征、Wilson病、黃色瘤、著色性干皮病、損傷、腫瘤和癌癥、痤瘡/濾泡疾病、濕疹、皮炎和過敏、皰病、免疫學病癥、有鱗性皮膚疾病、糜爛及潰瘍、血管皮膚問題、色素沉著問題、瘙癢(疥瘡)、外用劑的反應、光化性角化病、皮膚老化、血管角化瘤、血管肉瘤、皮膚再生不良、非典型纖維黃瘤、非典型痣、基底細胞癌、Bazex綜合癥(肢端角化癥)、Bazex綜合癥(濾泡皮膚萎縮-基底細胞癌)、Becker痣、胎記、藍痣、Bowen’s病(非生殖器)、陰莖Bowen’s病、外陰Bowen’s病、褐色斑和雀斑、凍瘡、結節性軟骨皮炎(chondrodermatitis nodularis)、透明細胞棘皮瘤、黑頭粉刺痣(comedone naevus)、先天性黑色素細胞痣、雞眼和胼胝、皮膚B細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、皮膚纖維瘤(組織細胞瘤)、隆突性皮膚纖維肉瘤、表皮痣、表皮狀囊腫、發疹性角化棘皮瘤、乳房外Paget病、播散性淺表性光線性汗孔角化病、增值性紅斑Gorlin’s綜合征、Grzybowski綜合征、血管瘤、暈痣(halo moles)、嬰兒指/趾纖維瘤(infantile digital fibroma)、炎癥線性疣狀表皮痣、幼年黃色肉芽腫、Kaposi肉瘤、瘢痕疙瘩和增生性瘢痕、角化棘皮瘤、雀斑樣痣、單純雀斑樣痣、苔蘚樣角化病、線性汗孔角化病、脂肪瘤、黑色素瘤、Merkel細胞癌、轉移、Meyerson痣、胎塊、胎斑(Mongolianspot)、局限性硬皮病(局部硬皮病、硬斑病)、粘膜(黏液)囊腫、蕈樣肉芽腫、痣、Ota & Ito痣(naev)(痣，nevi)、類脂質漸進性壞死、神經纖維瘤、Paget病、陰莖上皮瘤樣病變、毛母質瘤、化膿性肉芽腫、皮脂腺囊腫、皮脂腺增生、皮脂腺痣、脂溢性角化病、Sezary綜合征、皮膚癌、皮膚癌轉移、皮贅(skin tags)、日光(老年)粉刺、日光性角化病、Spitz痣、鱗狀細胞癌、鱗狀細胞乳頭狀瘤、多發性脂囊瘤、汗管瘤、毛發上皮瘤、毛囊瘤(trichofolliculomas)、小棘狀毛壅癥(trichostasis spinulosa)、外陰上皮內瘤樣病變、外陰癌黃色肉芽腫、濕疹、皮炎、過敏癥、過敏性接觸性皮炎、血管性水腫、過敏性皮炎(異位性濕疹)、過敏性皮炎、過敏性皮炎并發癥、自身濕疹化、慢性光化性皮炎、乳痂、皮炎、皰疹樣皮炎、皮膚劃紋癥、盤狀濕疹、皮膚干燥、塵螨、出汗障礙、濕疹、裂紋濕疹、剝脫性角質松解癥、固定性藥疹、引力性濕疹、手部皮炎、擦爛紅斑、刺激性接觸性皮炎、青少年足底皮膚病、單純性苔蘚、線狀苔蘚、尿布皮炎、硬幣形皮炎(nummular dermatitis)、外耳道炎、丘疹性蕁麻疹、斑貼試驗、口周皮炎、光接觸皮炎、光敏性、光敏性皮炎、光測試、糠疹、多形性日光疹、妊娠多形性出疹、汗皰疹、結節性癢疹、肛門瘙癢、外陰瘙癢、脂溢性皮炎(Seborrhoeic皮炎)、蕁麻疹、冬季疥瘡、皰病、皰疹樣皮炎、Hailey-Hailey病(家族性良性天皰瘡病)、大皰性類天皰瘡、瘢痕性類天皰瘡、獲得性大皰性表皮松解癥、大皰性表皮松解癥、線性IgA皮膚病、副腫瘤性天皰瘡、妊娠性類天皰瘡、落葉型天皰瘡、尋常性天皰瘡、起泡皮膚感染、禽痘(水痘)、丹毒、手足口病、單純皰疹、帶狀皰疹(herpes zoster)(shingles，帶狀皰疹)、膿皰瘡、疥瘡、葡萄球菌燙傷皮膚綜合征、濕疹、出汗障礙(汗皰疹)、盤狀(硬幣形)濕疹、植物皮炎(plant dermatitis)、免疫病癥、皰病、結締組織疾病、皮炎、影響頭發指甲以及出汗的病癥、扁平苔癬、扁平苔癬硬化、牛皮癬、鱗狀皮膚疾病、獲得性角化病、光化性(陽光)角化病、BCC(淺表)、Bowen’s病(原位鱗狀細胞癌)、慢性淺表鱗狀皮膚病(副銀屑病)、裂足跟、乳痂、皮膚T細胞淋巴瘤、Darier病、皮炎(濕疹)、火棉膠樣嬰兒、融合性網狀乳頭瘤病、彌漫性遺傳性角化癥、播散性淺表光線性汗孔角化病、皮膚干燥、紅癬、脫落性角質層分離、焦點性遺傳性角化病、真菌感染、Grover′s病、魚鱗病、青少年足底皮膚病、角皮癥、Kyrle疾病、線狀苔蘚、紅斑狼瘡、Netherton綜合征、掌跖角化病、糙皮病、白色糠疹、苔蘚樣糠疹、玫瑰糠疹、圓形糠疹、毛發紅糠疹、花斑糠疹、牛皮癬、點狀皮膚角化癥、Reiter綜合征、Seborrhoeic皮炎、角層下膿皰病(Sneddon Wilkinson病)、癬感染、糜爛和潰瘍、外傷、血瘀/靜脈曲張/靜脈潰瘍、褥瘡、高血壓腿部潰瘍、動脈硬化潰瘍、神經性潰瘍如糖尿病、潰爛皮膚癌(BCC、SCC、惡性黑色素瘤)、脂膜炎、血管炎潰瘍、皮膚結節性多動脈炎、壞疽性膿皮病、Wegener肉芽腫、免疫抑制的細菌、病毒或真菌感染、蕈樣肉芽腫、蜘蛛咬傷、非典型分枝桿菌感染、生殖器感染、遲發性皮膚卟啉病、紅細胞生成性原卟啉病、通常的傷口、耳輪結節性軟骨皮炎、糜爛性膿皰性皮膚病、口瘡性潰瘍(口腔及生殖器)、皮膚再生不良、血管皮膚問題、匐行性血管瘤、血管肉瘤、共濟失調毛細血管擴張癥、泛紅、毛細管炎、色素性紫癜、Schamberg病、毛細血管、畸形(鮮紅斑痣、鮭肉色斑)、皮膚血管炎、大理石樣皮膚、持久性隆起性紅斑、紅斑性肢痛癥、特發性毛細血管擴張、血管瘤(haemangioma)(血管瘤、草莓胎記)、遺傳性出血性毛細血管擴張癥、Kaposi肉瘤、淋巴水腫、皮膚異色病(Poikiloderma of Civatte)、結節性多動脈炎、紫癜、化膿性肉芽腫、酒渣鼻、類固醇酒渣鼻、持久性發疹性斑狀毛細管擴張、蕁麻疹性血管炎、靜脈畸形(包括血管球瘤)、血管炎和色素沉著的問題。
治療上有效的劑量可由體內或體外方法測定。對于本發明的每個具體化合物，可進行個別測定以測定所需的最適劑量。治療上有效的劑量的范圍應自然地受施用途徑、治療客體和患者條件的影響。對于各種合適的施用途徑，必須用藥理學已知的方法個別測定每個活性化合物的吸收效率。因此，對臨床醫學家來說，滴定劑量并修飾所需要的施用途徑以獲得最適治療效果是必要的。有效的劑量水平——即獲得所期望效果必需的劑量水平——的測定應在本領域技術人員的范圍內。典型地，化合物的應用以較低劑量水平著手，逐漸增加劑量水平，直到獲得所期望的效果。本發明的活性化合物從制劑的釋放速率在本領域普通技術路徑內變化，以測定優勢分布，其依賴于將用于治療的治療條件。
常用劑量可以在約0.001mg/kg至約1000mg/kg的范圍，優選地約0.01mg/kg至約100mg/kg，并且更優選地約0.10mg/kg至約20mg/kg。有利地，本發明的化合物可以是一天幾次施用，并且其他劑量用法也是可用的。
本發明的納米球-藥物絡合物可以在合適于藥物活性保存的條件下以及保持共聚物的完整性，其包括凍干法制備，并通常合適于保存在環境或冷卻的溫度。滅菌可用常規方法容易實現。
本文以下所述的下列非限制實施例說明了本發明的某些方面。所有的分數和百分比都是按重量計，除非另有說明，并且所有溫度都是攝氏度。
實施例 實施例1聚合物和納米球-溶質制劑的制備 化學品二氯甲烷(HPLC級)、甲醇(HPLC級)、2-丙醇和最佳切割溫度化合物(optimalcutting temperature compound，OCT)購自Fisher Scientific公司，(Pittsburgh，PA)。辛二酸(SA)、4-二甲基氨基吡啶-對-甲苯硫酸鹽(DMPTS)、姜黃素、丙烯乙二醇(PG)、聚(乙二醇)單甲醚(Mw 5000)和Dulbecco′s磷酸緩沖鹽(PBS，pH 7.4)購自Aldrich化學試劑公司(Milwaukee，WI)；二異丙基碳二亞胺(DIPC)購自Tanabe Chemicals公司(San Diego，CA)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺)和THF(四氫呋喃)獲自Merck公司(EMScience，Darmstadt，Germany)，以及二甲基亞砜(DMSO)獲自Merck公司和Sigma公司；DAF(5-十二烷基氨基熒光素)和NR(尼羅紅)獲自Molecular Probes公司(Eugene，OR)；所有試劑以獲得時狀態直接使用。
聚合物制備和表征用一鍋法在20℃使用原位碳二亞胺將PEG和oligo(DTO-SA)耦聯合成三嵌段共聚物，如公開號US2006/0013882的美國專利申請所述，所述內容通過引用并入本文。共聚物的化學結構和純度由1H NMR確定(d6-DMSO，Varian Unity 300分光光度計，Palo Alto，CA)。使用凝膠滲透層析測定分子量(Mn和Mw)，GPC(PL-凝膠柱，孔徑大小為105和104A，Perkin-Elmer公司，Shelton，CT；Waters 410示差折光檢測器，流速為1mL/min THF和聚苯乙烯標準作為Mw標準。基于酪氨酸的三嵌段共聚物的主要化學結構如圖1所述。
納米球-溶質制劑的制備含有或不含有溶質化合物的納米球絡合物通過將60mg的三嵌段共聚物與在600μL DMF中的600μg DAF或姜黃素或尼羅紅組合來制備。伴隨持續攪拌將這些溶液逐滴添加至14.4mL去離子水。為了去除直徑大于220nm的粒子，產生的混濁的水分散液通過0.22μm PVDF注射器濾器(Millipore公司，Bedford，MA)過濾，并且濾液用于所有后續表征。
我們對純化的納米球進行下述處理通過0.22μm濾器過濾自組裝的納米球-溶質懸浮液；通過以65000rpm(290000xg)對12.25mL納米球溶液在25℃超速離心3小時分離過濾懸浮液(Beckman L8-70M超速離心機，Beckman Coulter公司，Fullerton，CA)，隨后去除上清液；然后，沉淀的納米球用水洗滌兩次，并且在25℃下的1mL水中輕微攪拌重懸。然后，通過添加水，將重懸沉淀的體積增加至3mL，并且最終，將溶液再次過濾除菌(0.22μm)。
實施例2納米球-溶質制劑的表征 尺寸，尺寸分布和形態納米球的水動力直徑由動力光散射獲得，其動力光散射在q＝90°、1＝523nm和T＝298K條件下且使用積累量擬合分析(Lexel氬離子激光(Fremont，CA)；Brookhaven Instruments goniometer and correlator BI-2030；Holtsville，NY)。
納米球的形態使用透射電子顯微鏡(TEM)測定。對于負染色實驗，將一滴納米球分散液置于Formvar預包被的格子(grid)1分鐘。過量的樣品用濾紙輕柔吸取來去除，并且將一滴染色溶液(2％乙酸雙氧鈾)與樣品接觸1分鐘。然后，通過將格子邊緣接觸至濾紙楔的邊緣，小心去除過量染料。對于Pt/C陰影方法實驗，將一滴納米球涂覆在Formvar/碳覆蓋的微柵銅網上約1分鐘。用濾紙的撕片輕柔吸取網格來去除過量的流體。將網格風干并用2.5nm Pt/C(30°)使用高真空冷凍蝕刻裝置BAF 300(Balzers公司，Elgin，IL)遮蔽(shadow)。在JEM 100CX型號透射電子顯微鏡(JEOL有限公司，Peabody，MA)上拍攝電子顯微照片。
納米球-溶質絡合物的粒徑分布顯示于圖2。不同溶質不存在(插圖)或存在的情況下制備的納米球的水動力直徑具有相對窄的大小分布，平均為為55nm，其表明納米球制備中溶質的存在和溶質疏水性均不對納米球尺寸有顯著影響。圖3顯示使用2％乙酸雙氧鈾染色的負染色和Pt/C陰影方法獲得的透射電子顯微照片。這些圖像表示納米球的球形形態，但是它們的粒徑分布結果顯示大于光散射分析觀察的結果，其直徑為30至200nm的范圍。這種差異可歸因于在制備用于電子顯微鏡的樣本中的干燥，其可導致納米球的收縮和/或結塊。假定經表皮的親水途徑的平均寬度是依次為0.4(水蒸發途徑)至約100nm(intercorneocyte空間)，相對較小尺寸的酪氨酸衍生的納米球應使它們容易地沿皮膚上的表面皺紋穿透至角質層。
溶質結合效率研究并確證靈敏、特異且可再生的HPLC方法用于定量測定共聚物系統中的DAF、尼羅紅和姜黃素。用高效液相層析(HPLC)分析溶質濃度，使用Wasters2695HPLC系統，配置UV/vis檢測器(Wasters 2487，Dual 1Absorbance檢測器)。在25℃使用RP-C 18柱(Perkin-Elmer Brownlee Analytical C-18柱，33mm x 4.6mm)獲得層析分離。流動相是水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)以35/65(v/v)、40/60(v/v)和57/43(v/v)的比率的混合物分別用于DAF、NR和姜黃素分析。以1mL/min流速遞送流動相。UV/vis檢測器設定為270、550和390nm分別用于DAF、NR和姜黃素的分析。對于所有溶質以濃度1至50μg/mL的范圍制備標準校正樣品。校正曲線顯示了約三級強度濃度范圍的線性行為。檢測限制基于噪音比率3的信號評價，并且對于DAF為0.07μg/mL，對于NR為0.04μg/mL以及對于姜黃素為0.02μg/mL。質量控制樣品的日內和日間的精密度和準確度的測定比校正曲線的范圍優于10％。另外，通過將在分析只含有納米球的對照劑(placebo)上清液中得到的結果與那些溶質中所有標準溶液的分析得到的結果進行比較來測定特異性，并且沒有觀察到來自納米球的干擾。
為了測定溶質結合效率，取出純化的納米球-溶質絡合物懸浮液的預定部分并冷凍干燥，并且在完全溶解與萃取溶劑后，將干燥剩余物準確稱重。在含有DAF或姜黃素的納米球的情況下，將低壓凍干的絡合物溶解于5mL的甲醇(萃取溶劑)并劇烈渦旋1小時。在NSP-NR的情況下，通過將低壓凍干的絡合物溶于乙醇，萃取染料。由納米球進行的溶質絡合作用由下列比值表征 結合效率(％)＝納米球中藥物質量/給料中的藥物質量 通過在室溫攪拌在丙烯乙二醇PG中的過量分子24小時來制備在PG中每個溶質的溶液。通過0.22μm PVDF注射器濾器(Millipore公司，Bedford，MA)過濾樣品，并且將濾液用于所有后續表征和實驗。對于被動滲透實驗，通過隨后用PG對PG-溶質溶液的稀釋或用PBS對NSP-溶質制劑的稀釋獲得在PG和NSP(納米球)中所有溶質的相等濃度(使用RP-HPLC確定)。
實施例3皮膚滲透測試 使用親脂性模式染料并應用圖像分析，我們研究了這些納米球克服經皮穿透屏障的潛能。選擇的熒光團(圖1)是DAF和NR，其之前已用于觀察在皮膚中微胞和脂質體分布。姜黃素的選擇基于它的固有熒光和在對黑素瘤的治療組合中所推薦的潛能(proposedpotential)。無論溶質疏水性和溶質分子量程度均可得到所有溶質與納米球65％的結合效率。納米球溶液中溶質最終濃度DAF為180μg/mL、姜黃素為190μg/mL和NR為200μg/mL；因此，約0.02％的納米球-溶質制劑或PG-溶質溶液用于穿透研究，提供足夠強的可被熒光顯微鏡檢測到的信號。
人類皮膚經皮刀切割的、源自高加索女性尸體腹部的全部厚度(約500μm)的人類皮膚獲自AlloSource公司(Englewood，CO)并儲存在-80℃。僅在每個實驗之前，皮膚才允許解凍至室溫，然后立刻用于體外運輸研究。
運輸研究全部厚度人類皮膚塊置于Franz擴散池上(PermeGear公司，Bethlehem，PA)，其顯示出0.64cm2的擴散表面面積。受體區室充滿0.155M的磷酸鹽緩沖劑(pH7.4，5.1mL)，其以600rpm攪拌。每個受體區室內的流體的溫度通過使用溫度調節水泵(Haake DC 10，Karlsruhe，Germany)維持在37±0.5℃，其中水泵是利用圍繞在每個主要小室的套封的循環水來進行。在這些條件下，皮膚表面的溫度為32±0.5℃。為了促進膜的水合，初始時將皮膚留在Franz擴散池1小時。
這一階段后，將0.3mL合適的制劑的溶質(在NSP或PG中)置于每個皮膚樣品表面上，對于NR滲透實驗進行1、3、6和24小時以及對于DAF和姜黃素滲透研究進行24小時。在所有實驗中，每個Franz擴散池的取樣口的供體區室用按教導的

層覆蓋，并且全部裝置用鋁箔加頂以防止染料漂白。每個滲透實驗進行六次重復或四次重復(在時間-依賴實驗的情況)。
在滲透實驗的最后，從皮膚表面去除過量的制劑，從擴散池分離皮膚部分，并用PBS洗滌三次，并用金佰利無塵紙(Kimwipes)輕輕擦干。將皮膚于-20℃下冷凍，從處理區域切出0.2×0.5cm塊，然后包埋于最佳切割溫度化合物(OCT包埋劑)。低溫保持器(Leica低溫保持器CM 3050S，Wetzlar，Germany)用于制備皮膚表面完全皮膚的縱切片。可獲得九至十二個厚度為20μm縱切片，并在-4℃下儲存直到用顯微鏡分析。
皮膚吸收體外被動滲透實驗，其包括將NSP-溶質制劑和/或PG-溶質溶液局部施用至人類尸體皮膚24小時，顯示在受體區室中溶質的量低于檢測限。在該項研究中，通過納米球遞送對所有測試染料缺乏可檢測到的滲透表明基于酪氨酸的納米球不能促進穿過人類皮膚的運輸。類似的結果在以前使用PLGA熒光微粒子中報道，其在皮膚層中清晰可見，但不能到達擴散池的受體區室。因此該結果與以往報道顆粒藥物載體的使用顯示出提高藥物在皮膚中的滯留而不增加運輸的研究一致。
熒光顯微鏡將皮膚切片用于熒光和相差顯微鏡，使用配置了UV光源和用于熒光測量的濾器的Olympus CK40顯微鏡。使用Olympus Microsuite TM B35V程序實現圖像的獲取及分析。激發和發射波長對于DAF和姜黃素分別為485和520nm，對于NR(尼羅紅)分別為546和585nm。設定相機積分時間為500ms來記錄圖像。將相同參數用于所有樣品的取像并且對背景熒光無校正。使用圖像處理軟件(ImageJ，vl.36，NIH)來記錄熒光產量，像素亮度值的積分(任意單位，arbitrary units，ABU)給出相應染料的情況。
用PBS處理和/或單獨用基于酪氨酸的納米球處理的皮膚的圖像未顯示任何明顯熒光信號(結果未顯示)。圖4描述局部應用DAF、姜黃素和NR 24小時后縱切的人類皮膚的熒光顯微鏡圖像的代表性例子。在顯影定性地顯示與PG相比，在皮膚層∶酪氨酸衍生納米球中最顯著的熒光染色趨勢，其被明顯增強了染料的滲透。這些差異比NSP-NR的情況更明顯(圖4，E與F)。
另外，所用載體的性質影響角質層中染料的分布。通過PG遞送的所有染料在該層所觀察到的強烈熒光歸因于該載體的高粘度，因此，在實驗最后，水洗不能從皮膚頂部去除過量的PG制劑。另外，已表明增加的溶劑粘度具有降低皮膚滲透性和溶質擴散的能力。染料穿透至皮膚的定量分析通過計算從皮膚切片的熒光測量的像素強度獲得。如圖5所示，對表皮(EP；由角質層和生長表皮層(viable epidermis)組成)、淺表真皮(SD)和深層真皮(LD)進行圖像分析。淺表真皮被定義為表皮以下測量約100μm的區域，以及深層真皮是淺表真皮以下真皮的其余部分。
冰凍切片皮膚組織學使用制造商提供的蘇木精和曙紅(H&E)染色方法的改進來檢測由冷凍切片獲得的皮膚切片的組織學。簡言之，將皮膚切片在蒸餾水中水合1分鐘，然后用Gill 2蘇木精(Sigma公司，St.Louis，MO)染色4分鐘。通過在蒸餾水中洗滌載玻片三次來洗去過量染料，每次1分鐘，然后添加Scott′s溶液(0.1％碳酸氫鈉)洗滌2分鐘。在蒸餾水中短暫清洗后，將皮膚切片在酸化曙紅Y(Sigma公司，St.Louis，MO)中復染3分鐘。然后，使用依次用95％、80％和70％的乙醇將載玻片脫水，每次1分鐘。在三次更換二甲苯每次1分鐘的清洗后，將含有皮膚切片的載玻片固定在Paramount固定液中，并干燥過夜并用顯微鏡分析。
使用皮膚切片的H&E染色(圖5)來確定上述層用于進行染料穿透的定量分析。在皮膚不同層DAF、姜黃素和NR的熒光強度以任意單位(ABU)表示并顯示于圖4(G-I)。
施用24小時后，皮膚不同層的DAF和姜黃素的穿透顯示出非常相似的模式，其中來自PG-染色的表皮熒光(DAF和姜黃素的PE值分別為30.3±1.2和31.6±2.5)明顯高于NSP-染色制劑(DAF和姜黃素的PE值分別為15.3±0.8和14.5±0.2，p＜0.01)。淺表和深層真皮的染色分布對于DAF和姜黃素未有明顯不同((p＞0.01)，無論它們如何被遞送(圖4)。觀察到的低于預期的由NSP遞送的DAF和姜黃素熒光，特別是在SD和LD中的熒光，可歸因于納米球的熒光淬滅效應。
但是，在NR的條件下，熒光分布顯示出完全不同的模式(圖4(E、F、I))。當使用納米球施用時，在EP、SD和LD中的尼羅紅濃度明顯高于那些使用PG遞送的，其分別為在SD和LD中增加約四倍和三倍。次要但明顯的NSP-NR穿透增加還出現于EP中，對PG和納米球的PE值分別為48.6±1.3和59.4±2.5。
有趣的是，在PG中所有染料的滲透經過EP延伸至真皮，其中對于DAF和姜黃素減少量為兩倍半，并且對于NR減少量約五倍(圖4(G-I))。另一方面，納米球的PE產生對DAF和姜黃素的從EP至LD的染色穿透增加，而對于NR，來自NSP-染色制劑的熒光強度從EP至LD顯示2.5倍降低。由于納米球導致的DAF和姜黃素熒光的可能淬滅，我們猜想在EP和SD皮層中NSP-DAF和NSP-姜黃素的某些熒光強度被掩蓋。因此，在該項研究中，我們認為用NR得到的結果比描述納米球遞送潛能更準確。圖6一般性地支持了通過納米球遞送的所有疏水溶質的皮膚滲透效率等于或高于用PG遞送這一事實。
另一方面，施用NSP和PG后，獲得染色滲透的時間依賴的比較(圖6)。施用各自樣品1小時后(圖6，A-1和B-1)，對于用PG-NR和NSP-NR處理的皮膚，在EP中檢測到熒光強度的明顯差異；而對于二者在皮膚下層(SD & LD)中未見染色分布差異。在對照樣品(PG)中測量的PE值在EP中為45.9以及在SD和LD中為13.3，與在EP中26.6以及在SD和LD中18.9的對比表明在第一次過程中，納米球擴散至皮膚下層比PG高出約60％(圖6)。這表明酪氨酸衍生的納米球不但能將疏水化合物遞送至皮膚，而且可在更短的時間獲得治療劑量。6小時后(圖6，A-6和B-6)在兩種制劑中NR的應用，在皮膚所有層中均觀察到增加的熒光強度；而且，對于NSP-NR，熒光還持續至更大的深度。PE值對于PG-NR在SD和LD中分別為13.9±1.1和13.7±0.9，對于NSP-NR在SD和LD中分別為34.4±4.0和21±1.1。這些數值轉化為在SD中NSP-NR擴散約增加40％，與在LD中增加約10％比較。
納米球-姜黃素制劑的體外評價自由的和納米球-姜黃素絡合物的生物活性使用人類黑素瘤B16細胞測定。將自由姜黃素(在DMSO中)和純化的納米球-姜黃素制劑的連續稀釋物也添加至B16細胞，并且將細胞在37℃/5％CO2條件下生長。生長三天后，根據制造商所述條件，用MTS分析(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay；Promega公司，Madison，WI)間接測定50％細胞生長抑制所需濃度(LC50)。純化的納米球與自由姜黃素的LC50比較提供了納米球對姜黃素活性的效果說明。
前述實施例和優選實施方式的描述應理解為說明而不是限制由權利要求限定的本發明。應易于理解的是，可使用如上所述的特征的眾多變化和組合而不偏離如權利要求所述的本發明。這些變化不能認為是偏離本發明的精神和范圍，并且所有這些修改意圖是包括在如下權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種局部組合物，其包括用于通過角質層局部遞送的活性化合物，其中所述活性化合物與具有A-B-A結構三嵌段共聚物的納米球絡合，其中每個A端基嵌段是水溶、親水和無毒的聚合物或低聚物；以及所述中間B嵌段是具有相同或不同重復單元的疏水聚合物或低聚物，所述重復單元具有如下通式的結構
其中X是
或
Z是2和約100之間，包括2和約100在內；R1是CH＝CH或(CH2)n，其中n是0至18，包括0和18在內；R2選自氫及含有直至18個碳原子的直鏈和支鏈烷基、烷氧基、烷基芳基和烷氧基芳基；并且R選自鍵或含有直至18個碳原子的直鏈和支鏈烷基、烷氧基、烷基芳基和烷氧基芳基。
2.根據權利要求1所述的局部組合物，其進一步包括藥學上可接受的載體。
3.根據權利要求2所述的局部組合物，其中所述藥學上可接受的載體包括一種或多種成分，其選自稀釋劑、增溶劑、潤滑劑、助懸劑、封裝材料、溶劑、增稠劑、分散劑、緩沖劑、抗氧化劑、防腐劑、碳水化合物、糖、螯合劑、糖醇、反離子和非離子表面活性劑。
4.根據權利要求3所述的局部組合物，其中所述藥學上可接受的載體被配制為水分散液、乳液、霜、軟膏、凝膠狀或固體聚合物基質或多孔陶瓷基質。
5.根據權利要求1所述的局部組合物，其中所述活性化合物是親水的。
6.根據權利要求1所述的局部組合物，其中所述活性化合物是疏水的。
7.根據權利要求1所述的局部組合物，其中所述活性化合物是系統給藥藥物。
8.根據權利要求1所述的局部組合物，其中所述活性化合物是局部給藥藥物。
9.根據權利要求1所述的局部組合物，其中所述活性化合物包括至少一種化合物選自抗生素、抗菌劑、抗痤瘡劑、抗癌藥、非甾體抗炎劑(NSAIDS)、抗組胺劑、鎮咳劑、鎮咳劑、止癢劑、抗膽堿能劑、抗嘔吐和抗惡心劑、食欲抑制劑、中樞興奮劑、抗心律失常藥、β-腎上腺素阻斷劑、強心劑、抗高血壓劑、利尿劑、血管擴張劑、血管收縮劑、抗潰瘍劑、麻醉劑、抗抑郁劑、鎮靜劑和鎮痛劑、抗精神病劑、抗微生物劑、抗腫瘤劑、抗瘧劑、肌肉松弛劑和止瀉劑。
10.根據權利要求1所述的局部組合物，其中所述活性化合物包括至少一種化合物選自防曬鞣劑、皮膚漂白和增亮劑、保濕劑、除臭劑和止汗劑活性物質以及UV-A和UV-B吸收化合物。
11.一種洗發液或護發素，其包括根據權利要求1所述的局部組合物。
12.根據權利要求1所述的局部組合物，其中所述活性化合物包括一種或多種化妝醫藥品成分，其選自天然維生素、礦物質、天然油、植物化學品、酶、抗氧化劑、抗衰老劑、α-羥基酸、乙醇酸和水楊酸。
13.根據權利要求1所述的局部組合物，其中所述活性化合物包括一種或多種治療劑用于治療皮膚疾病或病癥，所述皮膚疾病或病癥選自寄生感染、真菌感染、細菌感染、病毒感染、丘疹鱗屑性疾病、色素性病癥、癌癥和皮膚藥物反應。
14.根據權利要求1所述的局部組合物，其進一步包括真皮穿透增強劑。
15.根據權利要求14所述的局部組合物，其中所述真皮穿透增強劑選自脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、萜、乙二醇和乙二醇酯、1，3-二氧戊環、含有至少12碳原子的大環酮、噁唑烷酮和噁唑烷酮衍生物、烷基-2-(N，N-二取代的氨基)-鏈烷酸酯、(N，N-二取代的氨基)-烷醇鏈烷酸及其混合物。
16.根據權利要求15所述的局部組合物，其中所述真皮穿透增強劑選自油酸、油醇、環十五酮(CPE-218TM)、失水山梨醇單油酸酯、甘油單油酸酯、丙烯乙二醇單月桂酸酯、聚乙烯乙二醇單月桂酸酯、2-正-壬基1，3-二氧戊環(SEPATM)、2-(N，N-二甲基-氨基)-丙酸十二烷酯(DDAIP)或其鹽衍生物、2-乙基己基2-乙基己酸酯、異丙基肉豆蔻酸酯、異山梨醇酐二甲醚、4-癸基噁唑烷-2-酮(SR 38TM，TCPI，Inc.)、3-甲基-4-癸基噁唑烷-2-酮、辛基二甲基-對氨基苯甲酸、辛基對甲氧基肉桂酸酯、辛基水楊酸及其混合物。
17.一種通過將角質層活性化合物遞送至下表皮和真皮的局部方法，其包括局部施用至患者的角質層，所述患者患有的疾病或病癥需要用根據權利要求1所述的局部組合物的有效量治療，其中所述局部組合物的活性化合物有效治療所述患者的疾病或病癥。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述活性化合物包括至少一種化合物選自抗生素、抗菌劑、抗痤瘡劑、抗癌藥、非甾體抗炎劑(NSAIDS)、抗組胺劑、鎮咳劑、鎮咳劑、止癢劑、抗膽堿能劑、抗嘔吐和抗惡心劑、食欲抑制劑、中樞興奮劑、抗心律失常藥、β-腎上腺素阻斷劑、強心劑、抗高血壓劑、利尿劑、血管擴張劑、血管收縮劑、抗潰瘍劑、麻醉劑、抗抑郁劑、鎮靜劑和鎮痛劑、抗精神病劑、抗微生物劑、抗腫瘤劑、抗瘧劑、肌肉松弛劑和止瀉劑。
19.根據權利要求17所述的方法，其中所述疾病或病癥是皮膚疾病或病癥，其選自寄生感染、真菌感染、細菌感染、病毒感染、丘疹鱗屑性疾病、色素性病癥、癌癥和皮膚藥物反應，并且所述活性化合物包括一種或多種治療劑用于所述皮膚疾病或病癥的治療。
20.根據權利要求17所述的方法，其中所述活性化合物是系統遞送。
21.根據權利要求17所述的方法，其中所述活性化合物是局部遞送。
22.根據權利要求17所述的方法，其中所述局部組合物進一步包括藥學上可接受的載體。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述藥學上可接受的載體包括選自稀釋劑、增溶劑、潤滑劑、助懸劑、封裝材料、溶劑、增稠劑、分散劑、緩沖劑、抗氧化劑、防腐劑、碳水化合物、糖、螯合劑、糖醇、反離子和非離子表面活性劑的一種或多種成分。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述藥學上可接受的載體被配制為水分散液、乳液、霜、軟膏、凝膠狀或固體聚合物基質或多孔陶瓷基質。
25.根據權利要求17所述的方法，其中所述局部組合物進一步包括真皮穿透增強劑。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述真皮穿透增強劑選自脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、萜、乙二醇和乙二醇酯、1，3-二氧戊環、含有至少12碳原子的大環酮、噁唑烷酮和噁唑烷酮衍生物、烷基-2-(N，N-二取代的氨基)-鏈烷酸酯、(N，N-二取代的氨基)-烷醇鏈烷酸及其混合物。
27.根據權利要求17所述的方法，其中所述方法進一步包括結合物理方法應用所述局部組合物用于皮膚遞送的增強。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述物理增強方法選自熱能方法、超聲方法、磁電泳方法、光化學波方法和激光燒蝕方法、無線電頻率能量方法、脈沖電場方法，電泳方法、離子導入方法、微切割的微管路方法、膜電穿孔方法、實心和空心微針方法、穿刺方法、穿孔方法、研磨方法、無針注射方法、吸引方法和拉伸法。
29.一種用于局部涂敷的水凝膠，其由權利要求1所述的局部組合物組成。
30.一種透皮藥物遞送裝置，其包括活性化合物儲存，其由權利要求29所述的水凝膠組成。
31.根據權利要求30所述的透皮藥物遞送裝置，其中所述水凝膠進一步包括真皮穿透增強劑。
32.根據權利要求17所述的方法，其中所述局部組合物是以水凝膠的形式。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述水凝膠是所述透皮藥物遞送裝置的活性化合物儲存。
34.根據權利要求32或33所述的方法，其中所述水凝膠進一步包括真皮穿透增強劑。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述真皮穿透增強劑選自脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、萜、乙二醇和乙二醇酯、1，3-二氧戊環、含有至少12碳原子的大環酮、噁唑烷酮和噁唑烷酮衍生物、烷基-2-(N，N-二取代的氨基)-鏈烷酸酯、(N，N-二取代的氨基)-烷醇鏈烷酸及其混合物。
全文摘要
本發明提供局部組合物，其中用于通過角質層局部遞送的活性化合物與具有A-B-A結構三嵌段共聚物的納米球絡合，其中每個A端基嵌段是水溶、親水和無毒的聚合物或低聚物；并且疏水中間B嵌段是具有相同或不同重復單元疏水聚合物或低聚物，所述重復單元具有如式(I)的結構，其中X是-C-R-C-或-C-；Z是2和約100之間，包括2和約100在內；R1是CH＝CH或(CH2)n，其中n是0至18，包括0和18在內；R2選自氫以及含有直至18個碳原子的直鏈和支鏈烷基、烷氧基、烷基芳基和烷氧基芳基；并且R選自鍵或含有直至18個碳原子的直鏈和支鏈烷基、烷氧基、烷基芳基和烷氧基芳基。
文檔編號A61K9/14GK101668512SQ200880009732
公開日2010年3月10日 申請日期2008年1月31日 優先權日2007年1月31日
發明者約阿希姆·B·寇恩, 波采娜·米史耐克, 戴維·德沃爾, 拉瑞薩·希海特, 帕拉富拉·錢桌拉, 普瑞亞·貝茲嘉 申請人:新澤西魯特格斯州立大學