專利名稱：證明cd44表面表達的細胞的細胞毒性介導的制作方法
技術領域：
本發明涉及分離和產生減輕癌性疾病的抗體(CDMAB )和這些 CDMAB單獨地或與一或多種CDMAB/化療試劑組合用于治療和診斷過 程中的用途。本發明進一步地涉及利用本發明的CDMAB的結合測定法。
背景技術：
癌癥中的CD44:針對人白血細胞的單克隆抗體的制備導致了CD44抗 原的發現； 一種表達在廣泛的正常組織和所有類型的造血細胞上單鏈透明 質酸(HA )結合糖蛋白。其起初與淋巴細胞的激活和歸巢(homing)相 關。當前，其推定的生理學作用還包括炎癥基因的激活、細胞周期的調節、 細胞增殖的誘導、分化和發育的誘導、細胞骨架重組和細胞遷移以及細胞 存活/抵抗凋亡的誘導。
在人體中，單基因拷貝的cD44位于染色體11的短臂，11P13上。該 基因包含19個外顯子；前5個是恒定的，隨后的9個是可變的，緊接的 3個是恒定的，且最后的2個是可變的。差異剪接可以造成超過1000種 不同的同種型。然而，目前僅己識別了數十種天然存在的變體。
CD44標準糖蛋白由N-末端胞外(包括20個氨基酸的前導序列和近 膜區(85個氨基酸))結構域(270個氨基酸)、跨膜區(21個氨基酸) 和胞質尾(72個氨基酸)組成。胞外區還在N-末端包含連接部分。該區 域有92個氨基酸的長度且顯示出與其它HA結合連接蛋白的同源性。在 小鼠型和人型CD44之間存在高同源性。蛋白的變體形式被插入外顯子5 的羧基末端且在表達時位于胞外。
CD44的血清可溶形式也天然地存在且能夠由終止密碼子(在可變區 內)或蛋白水解活性產生。通過各種刺激包括TNF-a對細胞的激活造成 cD44受體的釋放(shedding)。在腫瘤細胞中也觀察到受體的釋放且該釋
5放可導致CD44在人血清中的濃度增加多達10倍。CD44的高血清濃度 暗示著惡性腫瘤(卵巢癌除外)。
CD44的標準形式以大約37kD的分子量存在。翻譯后修飾將分子量 增加至80-90kD 。這些修飾包括氨基末端胞外結構域在天冬酰胺殘基上的 N-連接糖基化、在胞外結構域的羧基末端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上的O-連接糖基化以及糖胺聚糖添加。剪接變體的大小可以在80-250kD范圍內。
HA， 一種哺乳動物中位于胞外基質(ECM )上的多糖，被認為是主 要的CD44配體。然而，也己經發現CD44與諸如膠原、纖連蛋白、層粘 連蛋白等蛋白結合。在HA結合和糖基化之間似乎存在關聯。無活性的 CD44 (不結合HA )具有最高的糖基化水平，有活性的CD44 (結合 HA )糖基化水平最低而可誘導的CD44 (除非被細胞因子、單克隆抗體、 生長因子等激活，否則不與HA結合或很微弱地與HA結合)的糖基化水 平在活性和無活性形式之間。
CD44通過信號轉導通路能夠介導其的一些功能，這些通路依賴于細 胞、刺激以及環境的相互作用。這樣的一些通路包括NFKB信號傳導級聯 (涉及炎癥反應)、Ras-MAPK信號轉導通路(涉及細胞周期和增殖的激 活)、Rho蛋白家族(涉及細胞骨架重組和細胞遷移)以及PI3-K相關信 號傳導通路(涉及細胞存活)。上述所有的功能與腫瘤疾病的發生和發展 密切相關。CD44也被暗示通過各種另外的機理在癌癥中發生作用。這些 機理包括CD44細胞表面存在的細胞表面蛋白聚糖將生長因子、趨化因子 和細胞因子呈遞給參與惡性腫瘤中的受體。同樣的，在CD44-HA復合物 內化后通過溶酶體透明質酸酶進行的HA的胞內降解可以潛在地增加了 腫瘤入侵和通過ECM誘導血管發生的可能性。此外，己經顯示存活或凋 亡信號的傳遞通過標準的或可變的CD44受體發生。CD44也被暗示參與 細胞分化和遷移。這些機理中的很多，如果不是全部，是環境和細胞依賴 性的且若干機理引起了不同的發現。因此，在得出任何結論之前需要更多 的研究。
為了證實CD44在癌癥中潛在的功能作用，進行了CD44的表達研究 以確定受體的差異性表達是否與疾病的進程相關。然而，在大部分腫瘤類 型中觀察到不一致的現象，且這可能是由于研究人員之間在試劑、技術、
6病理學評分和細胞類型上的差異的混和造成的。腎細胞癌和非霍奇金氏
(non-Hodgkin's )淋巴瘤似乎是例外，因為具有CD44高表達腫瘤的患 者一致地比其低或無CD44表達的副本患者存活時間短。
由于其與癌癥的關聯，CD44己經成為發展抗癌治療的靶點。關于腫 瘤進程需要CD44的標準還是變體形式仍然存在爭論。兩種觀點都有體內 動物數據支持，且同樣的，這可能取決于腫瘤類型甚至細胞類型。不同的 治療手段己包括可溶CD44蛋白、乙酰透明質酸合酶cDNA、透明質酸酶 的注射，反義CD44和CD44特異性抗體的使用。各種手段己經實現了一 定程度的成功由此為抗CD44癌癥治療提供了支持。
實驗中己經產生了變體和標準CD44的特異性單克隆抗體，但絕大部 分這些抗體除了與它們識別的CD44類型特異性地結合外，沒有固有的生 物學活性。然而，存在某些抗體具有體外活性或體內活性，但通常沒有兼 具這兩種活性。己經顯示一些抗CD44抗體介導細胞事件。例如，針對人 紅血球呂泰羅(Lutheran)抗原CD44標準型的鼠科抗體A3D8顯示出增 強CD2(9-1抗體)禾QCD3(OKT3抗體)介導的T細胞激活；另一種抗 CD44抗體具有相似的效應。A3D8也誘導IL-1從單核細胞的釋放和IL-2 從T淋巴細胞的釋放。有趣的是，A3D8與藥物如柔紅霉素、米托蒽醌和 依托泊苷聯合使用通過消除第二信使神經酰胺的產生而抑制了 HL60和 NB4AML細胞中的凋亡誘導。沒有固有活性且針對CD44的相似表位的 J173抗體不抑制藥物誘導的凋亡。針對CD44的85-1 IOKD和200 KD形 式的NIH44-1抗體通過一種通路增強了 T細胞的增殖，作者推斷該通路 為CD44的交聯或聚集。綜上所述，沒有證據說明諸如這些的抗體適合作 為癌癥治療使用，因為它們不針對癌癥(例如激活淋巴細胞)，誘導細胞 增殖，或者在與細胞毒性試劑一同使用時抑制癌細胞的藥物誘導死亡。
已描述了一些抗CD44抗體，這些抗體證實了體內的抗腫瘤效應。抗 體1.1AsML， 一種針對CD44的v6變體的小鼠IgGl抗體，己經顯示減 少了大鼠胰腺癌BSp73ASML的淋巴結和肺轉移。治療后的動物的存活隨 之提高。該抗體僅當在淋巴結定植(colonization )之前給藥有效，且據 推斷其干擾淋巴結中的細胞增殖。在體外，該抗體對腫瘤細胞沒有直接的 細胞毒性，且該抗體沒有提高補體介導細胞毒性、或免疫效應細胞功能。沒有描述該抗體針對人細胞的應用。
Breyer等記述了一種可商購的抗CD44s抗體在破壞原位植入的大鼠 成膠質細胞瘤的進程中的應用。將大鼠成膠質細胞瘤細胞系C6植入額葉， 一周后通過腦內注射用抗體對大鼠進行3次治療。治療后的大鼠與緩沖液 或同種型對照治療后的大鼠相比，證實了降低的腫瘤生長以及更高的體 重。在體外，該抗體能夠抑制細胞對由胞外基質成分包被的蓋玻片的粘附， 但對細胞沒有直接的細胞毒性效應。沒有針對人細胞測試該抗體。
進行了比較抗CD44抗體(IM陽7.8,1)和抗CD44vlO抗體(K926)功 效的研究。將表達兩種CD44同種型的高度轉移的鼠科黑素瘤系B16F10 靜脈內植入小鼠。兩天后，在研究期間每三天給予抗體。兩種抗體在肺轉 移的數量上均造成了大于50 %的顯著降低；在兩種抗體的功效之間沒有 顯著的差別。該抗體在體外不影響增殖，且作者Zawadzki等推測腫瘤生 長的抑制是因為抗體阻斷了CD44和其配體的相互作用。在使用IM-7.8.1 的另一研究中，Zahalka等證實了該抗體及其F(ab')2片段能夠阻斷小鼠T 細胞淋巴瘤LB對淋巴結的浸潤。這賦予了小鼠顯著的存活益處。 Wallach-Dayan等顯示用CD44v4-v10轉染不會自發形成腫瘤的LB-TRs鼠 科淋巴瘤導致其具有形成腫瘤的能力。IM-7.8.1的施用和同種型對照抗體 相比降低了植入的轉染細胞的腫瘤尺寸。這些研究沒有一個證實了人體對 該抗體的利用。
GKW. A3，小鼠的IgG2a，對人CD44具有特異性且在SCID小鼠中 防止人黑素瘤異種移植物的形成和轉移。將該抗體與轉移性人細胞系 SMMU-2混和并隨后皮下注射。治療在隨后的3周內持續。4周后，相 比于未治療動物的100%, 10只小鼠中僅l只在注射部位形成了腫瘤。該 抗體的F(ab')2片段證實了對腫瘤形成相同的抑制，提示該作用機理不依賴 于補體或抗體依賴性細胞毒性。如果在第一次抗體注射前一周注射腫瘤細 胞，則80 %的動物在原始位點形成腫瘤。然而，注意到存活時間仍然顯 著增長了。盡管延遲的抗體施用對原發性腫瘤的形成沒有效應，但是其完 全阻止在未治療動物中出現的向肺、腎、腎上腺、肝和腹膜的轉移。在體 外，該抗體對細胞系沒有任何直接的細胞毒性也不干擾SMMU-2細胞的 增殖，且似乎通過影響轉移或生長對腫瘤的形成具有其主要的效應。該抗體的一個顯著的特征是其識別CD44的所有同種型，這提示其在治療應用
中有限的可能性。
Strobd等記述了抗CD44抗體(克隆515 )在小鼠異種移植模型中抑制人卵巢癌細胞腹膜移植的應用。在抗CD44抗體或對照抗體的存在下，將人卵巢細胞系36M2腹腔內植入小鼠，且在隨后的20天中進行治療。5周后，在抗體治療組的腹膜腔中有顯著更少的節結(nodules )。來自抗CD44和對照治療組的節結具有相同的尺寸，這提示一旦細胞被植入，抗體對腫瘤的生長沒有效應。當細胞皮下植入時，對腫瘤生長也沒有效應，意味著該抗體本身沒有抗增殖或細胞毒性效應。此外，抗體在體外對細胞生長沒有效應。
VFF-18，也稱作BIWA 1，是對CD44的v6變體具有高度親和性的抗體，其對該多肽的360 — 370區域具有特異性。在對12名患者進行的1期臨床試驗中，該抗體己被用作"m锝標記的綴合物。在患有頭部和頸部鱗狀細胞癌的患者中對該抗體的安全性及其靶向潛能進行了測試。在注射后40小時，注射劑量的14 %被腫瘤吸收，且在其它器官包括腎、脾和骨髓中具有最少的積聚。高度選擇性的腫瘤結合提示該抗體在放射免疫療法中的作用，盡管該抗體異常高的親和力阻止其滲透到腫瘤更深層中。進一步限制BIWA1應用的是鼠科抗體的免疫原性(12名患者中的ll名產生了人抗小鼠抗體(HAMA))、遍及腫瘤的不均勻積聚以及抗體-可溶性CD44復合物的形成。WO 02/094879公開了 VFF-18的人源化形式，將其設計用于克服HAMA反應，命名為BIWA4。據發現，BIWA4和親本VFF18抗體相比，具有顯著更低的抗原結合親和力。意外的是，較低親和力的BIWA4抗體比較高親和力的BIWA 8人源化的VFF-18抗體具有更高的腫瘤吸收特征。在33名患者的l期臨床試驗中對"m锝標記的和186錸標記的BIWA4抗體進行評價，以確定^Re-標記的BIWA4情形中的安全性、耐受能力、腫瘤積聚和最大耐受劑量。""Tc標記的BIWA4中似乎存在腫瘤相關的吸收。針對^Re-標記的BIWA4的所有劑量沒有觀察到腫瘤的應答，盡管一些具有穩定的病情；劑量限制毒性發生在60mCi/m2。存在50-65%的不良事件發生率，33名患者中的12位被認為發生了嚴重的不良事件(血小板減少、白血球減少以及發熱)，且其中6名均接受186Re-標記BIWA4治療的患者在治療期間死亡或因為疾病惡化隨后死亡。2名患者產生了人抗人抗體(HAHA)。在20名患者中進行了 ^Re-標記BIWA4的1期劑量遞增試驗。觀察到口腔粘膜炎和劑量限制的血小板減少和白血球減少； 一名患者產生了 HAHA反應。在以60mCi/n^的最高劑量治療的5名患者中觀察到穩定的病情。盡管在獲得功效的安全性和耐受能力上被認為可以接受，這些研究相比于臨床研究中其它非放射性同位素綴合的生物學治療具有更高的不良事件發生率。美國專利申請US 2003/0103985公開了在腫瘤治療中使用的與美登木素生物堿(maytansinoid)綴合的VFF-18人源化形式，命名為BIWIl。人源化VFF18抗體BIWA4，在與一毒素綴合時，即BIWIl，被發現在人外陰表皮狀癌、咽喉鱗狀細胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有顯著的抗腫瘤效應。未綴合的形式BIWA4沒有抗腫瘤效應，且綴合形式BIWI 1沒有在人體中安全性或功效的證據。
Mab U36通過UM-SCC-22B人下咽骨癌細胞免疫和癌及組織特異性選擇產生的鼠科單克隆IgGl抗體。通過cDNA克隆和序列分析進行的抗原表征將角質形成細胞特異性CD44剪接變體表元(epican )的v6結構域確定為Mab U36的靶標。免疫組織化學研究顯示該表位局限于細胞膜上。此外，Mab U36對94 %的頭部和頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)發生了強標記，且在這些腫瘤中細胞染色不均勻。10名患者的99mTc標記的Mab U36研究顯示該抗體針對HNSCC癌癥的選擇性積聚(2天內20.4+/-12.4%注射的劑量/1^);沒有報告副作用，但2名患者產生了HAMA。在放射性碘標記的鼠科MabU36的研究中，在18名患者中有3例HAMA以及HNSCC的選擇性均勻吸收。為了降低MabU36的抗原性以及降低HAMA的發生率，構建了嵌合抗體。嵌合或原始的鼠科MabU36均沒有ADCC活性。沒有關于Mab U36天然功能活性的證據。^Re標記的嵌合Mab U36用于確定Mab U36作為治療試劑的應用。在該1期劑量遞增試驗中，13名患者接受了"mTc標記的嵌合Mab U36的嘗試劑量和隨后的^Re標記嵌合Mab U36。沒有急性不良事件的報道但在治療后觀察到3名患者中的2名有劑量限制髓毒性(1.5GBq/m2)，且l名接受最大耐受劑量(1.0GBq/m2)治療的患者血小板減少。盡管對腫瘤尺寸有一些效應，但是這些效應沒有滿足關于針對治療的客觀響應的標準。186Re標記嵌合
10Mab U36的進一步的研究采用使用粒細胞集落形成刺激因子刺激的全血回輸的策略將最大耐受活性加倍至2.8 Gy。在對患有頭部和頸部各種腫瘤的9名患者的該研究中，3名因為藥物相關貧血需要輸血。其它毒性包括3級髓毒性和2級粘膜炎。盡管在5名患者中獲得了3-5個月的穩定病情，但是沒有報告客觀的腫瘤響應。因此，可以看出盡管Mab U36是高度特異性抗體，但是其要求放射免疫綴合物以實現抗癌效應的缺點因為其與獲得臨床效應相關的治療相關聯的毒性而限制了其有效性。
總之，己經顯示，CD44v6 ( I,IASML)和CD44vl0 (K926)單克隆抗體分別在用轉移型胰腺腺癌注射的大鼠或在用惡性黑素瘤注射的小鼠中降低了轉移活性。另一種抗CD44v6抗體((VFF-18及其衍生物)，僅在與美登木素生物堿或放射性同位素綴合時，顯示出具有抗腫瘤作用。抗標準CD44單克隆抗體也己經顯示抑制大鼠成膠質細胞瘤的腦內進程(抗CD44)、小鼠T細胞淋巴瘤的淋巴結侵入(IM-7.8.1)以及抑制人卵巢癌細胞在裸鼠中的移植(克隆515 )、小鼠黑素瘤細胞系的肺轉移(IM-7.8.1)以及人黑素瘤細胞系在SCID小鼠中的轉移(GKW.A3)。放射性同位素綴合的MabU36抗CD44v6抗體及其衍生物在伴隨著顯著毒性的臨床試驗中具有抗腫瘤活性。盡管這些結果是鼓舞人心的且支持將抗CD44單克隆抗體發展成為潛在的癌癥治療法，它們說明了對人體癌癥有限的效應、安全性或適用性。
因此，如果分離出一種抗體組合物，該組合物介導癌細胞的細胞毒性，作為其與所述細胞上的CD44細胞表面表達相互吸引的功能，將會實現有價值的診斷和治療方式。 -
作為癌癥治療的單克隆抗體患有癌癥的每個個體都是獨特的，并且患有與其它癌癥不同的癌癥，正如個人的身份一樣。除此之外，目前的治療法以相同的方法治療患有同種類型的癌癥、處于相同的階段的所有患者。這些患者中至少有30%將在一線治療中失敗，由此導致以后幾輪的治療和治療失敗、轉移、以及最終死亡的增加的可能性。較好的治療方法應該是對于特定的個體量身定制的治療法。目前本身適于量身定制的唯一的治療法是手術。化療和放射治療不能對患者進行量身定做，并且手術本身
ii在大部分情形中不足以產生治愈。
隨著單克隆抗體的出現，由于每種抗體可以針對單個表位，則開發量身定制的治療法的方法的可能性變得更加現實。此外，產生針對獨特限定特定個體的腫瘤的表位群的抗體組合也是可能的。
己經認識到在癌癥細胞和正常細胞之間的顯著不同是在于癌癥細胞包含對轉化的細胞特異的抗原，科學團體長期認為單克隆抗體可以設計成通過特異性與這些癌癥抗原結合而特異性靶向轉化的細胞；因此產生這樣
的信心單克隆抗體可以作為"魔力子彈(Magic Bullets)"來消除癌細胞。然而，現在廣泛認識到，沒有任何一種單個的單克隆抗體可以在所有癌癥情形中起作用，并且單克隆抗體可以被配置為一類作為靶向癌癥治療。己經表明按照本文公開的發明的教導分離的單克隆抗體以有益于患者的方式改善癌性疾病過程，例如通過減少腫瘤負荷的方式，并且在本文中應該不同地稱為減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)或"抗癌"抗體。
目前，癌癥患者通常具有很少的治療選擇。對癌癥治療法的管理方法已經在全球存活和發病率中產生了改善。然而，對于特定的個體，這些改善的統計學沒有與他們個人情況的改善必然相關。
因此，如果采用能夠使執業者獨立于處于同一團體中的其他患者而治療每種腫瘤的方法，這將允許產生僅使治療適合該名個體的獨特方法。這樣的治療療程將理想地增加治愈率，并且產生更好的結果，由此滿足長期渴望的需要。
歷史上，多克隆抗體的應用已經進行了應用，在治療人類癌癥中具有有限的成功。己經使用人血漿治療淋巴瘤和白血病，但是存在很少延長的好轉或反應。此外，與化療相比，缺少再現性，并且沒有任何其它的益處。實體瘤諸如乳腺癌、黑素瘤和腎細胞癌也己經使用人血液、黑猩猩血清、人血漿和馬血清進行治療，具有相對不可預知的和無效的結果。
對于實體瘤，己經存在單克隆抗體的許多臨床試驗。在20世紀80年代，對于人乳腺癌存在至少4種臨床試驗，其使用針對特異抗原的或基于組織選擇性的抗體，在至少47名患者中僅產生一名響應者。直到1998年才出現使用人源化的抗Her2/neu杭體(Herc印tin⑧)與順鉑組合的成功的臨床試驗。在該試驗中，評估37名患者的響應，其中約四分之一具有部分響應率，另外四分之一具有較小或穩定的疾病發展。在所述響應者中對發
展的中值時間是8.4個月，中值響應持續5.3個月。
Herceptin⑧在1998年首次核準與Taxol⑧組合用于一線應用。臨床研 究結果顯示，與僅接受Taxol⑧的組(3.0個月)相比，對于接受抗體治療 加Taxo,的那些的疾病發展的中值時間(6.9個月)增加。在中值存活中 也存在稍微的增加；對于Herceptin⑧加Taxol⑧治療組相對于單獨的Taxol 治療組為22個月相對于18個月。另夕卜，與單獨的Taxo傾相比較，在抗體 加Taxol⑧組合組中，在完全(8%相對于2%)和部分響應者(34%相對于 15。/。)的數量中存在增加。然而，與單獨的Taxo,治療相比較，用Herc印tin⑧ 和Taxol⑧治療導致更高的心臟中毒的發生(分別為13%相對于1%)。此 外，Herceptin⑧治療法只對過量表達(通過免疫組化(IHC)分析確定)人表 皮生長因子受體2 (Her2/neu)的患者有效，在患有轉移乳腺癌的患者的大 約25%中有效；所述人表皮生長因子受體2是一種受體，其目前具有未知 的功能或生物學重要的配體。因此，對于患有乳腺癌的患者仍然存在大量 未滿足的需求。即使可以受益于Herceptin⑧治療的那些仍然需要化療，并 且因此仍然必須處理，至少在某種程度上，這種治療的副作用。
研究結腸直腸癌的臨床試驗包括針對糖蛋白和糖脂靶點的抗體。抗體 如17-1A,其對于腺癌具有某種特異性，已經在六十多名患者中進行了 2 期臨床試驗，僅有1名患者具有部分響應。在其它試驗中，在使用額外的 環磷酰胺的方案中，使用17-1A在52名患者中僅產生1例完全響應和2 例較小的響應。迄今為止，17-1A的III期臨床試驗尚末表現出作為III期 結腸癌的輔助治療的提高的功效。最初核準用于成像的人源化鼠單克隆抗 體的應用也沒有產生腫瘤衰減。
僅在最近，使用單克隆抗體的直腸結腸癌臨床研究產生了一些積極的 結果。在2004年，ERBITUX⑧核準用于患有表達EGFR的轉移結腸直腸 癌的患者的二線治療，所述患者對基于伊立替康的化療不起反應 (refractory)。來自兩組(two-arm) II期臨床研究和單組研究的結果表明， ERBITUX⑧與伊立替康組合分別具有23%和15%的響應率，疾病發展的中 值時間分別為4.1個月和6.5個月。來自同一兩組II期臨床研究和另一單 組研究的結果表明，僅用ERBITUX⑧治療分別導致11%和9%的響應率，
13疾病發展的中值時間分別為1.5個月和4.2個月。
因此，在瑞士和美國，ERBITUX⑧與伊立替康組合治療，并且在美國， 單獨的ERBITUX⑧治療，已經被核準作為在一線伊立替康治療中失敗的結 腸癌患者的二線治療。因此，如同Herceptin⑧，在瑞士只核準治療作為單 克隆抗體和化療的組合。另外，在瑞士和美國只核準治療作為二級治療用 于患者。此外，在2004年，AVASTIN⑧被核準與靜脈內基于5-氟尿嘧啶 的化療組合用作轉移性結腸直腸癌的一線治療。III期臨床研究結果表現出 與僅用5-氟尿嘧啶治療的患者相比，用AVASTIN⑧加5-氟尿嘧啶治療的患 者的中值存活延長(分別為20個月相對于16個月)。然而，同樣如同 Herceptin⑧和ERBITUX ,治療僅被核準作為單克隆抗體和化療的組合。
對于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌還繼續存在極差 的結果。對于非小細胞肺癌的最有希望的最近的結果來自II期臨床試驗， 其中治療包括與殺細胞藥多柔比星綴合的單克隆抗體(SGN-15; dox-BR96, 抗-唾液酸(sialyl)-LeX)，其與化療藥TAXOTERE⑧組合。TAXOTERE⑧是 唯一一種FDA核準的化療藥，用于肺癌的二線治療。原始數據顯示與單 獨的TAXOTERE⑧相比提高的整體存活時間。在本研究征募的62名患者 中，三分之二接受SGN-15與TAXOTERE⑧組合，而其余三分之一接受單 獨的TAXOTERE 。對于接受SGN-15與TAXOTERE⑧組合的患者，中值 整體存活時間是7.3個月，而與之比較的接受單獨的TAXOTERE⑧的患者 是5.9個月。對于接受SNG-15加TAXOTERE⑧的患考的整體存活時間為 1年和18個月的分別為29%和18%，而與之比較的對于接受單獨的 TAXOTERE⑧的患者分別為24%和8%。計劃了進一步的臨床試驗。
臨床前，對于黑素瘤使用單克隆抗體已經存在一些有限的成功。這些 抗體中很少已經達到臨床試驗階段，并且迄今為止沒有一種已經被核準或 在III期臨床試驗中表現出有利的結果。
治療疾病的新藥的發現受到在30,000種己知的基因產物中缺少相關 靶點的鑒定的阻礙，所述30,000種已知的基因可能有助于疾病的發病機 理。在腫瘤學研究中，潛在的藥物靶點通常僅由它們在腫瘤細胞中過量表 達的事實來選擇。然后篩選這樣鑒定的靶點與多種化合物的相互作用。在 潛在的抗體治療的情形中，這些候選化合物通常衍生于根據Kohler和Milstein所述的基本原理(1975，自然(Nature) , 256, 495-497, Kohler和 Milstein)的單克隆抗體產生的常規方法。從用抗原(例如，全細胞，細胞 級分，純化的抗原)免疫的小鼠收集脾細胞，并且與無限增殖的雜交瘤配 偶體融合。篩選所得到的雜交瘤，并且針對最親和性地與所述靶點結合的 抗體的分泌進行選擇。針對癌細胞的許多治療和診斷抗體，包括Herceptin⑧ 和RITUXIMAB，已經使用這些方法產生，并且基于它們的親和性進行選 擇。這種方法中的缺點是兩方面的。首先，對治療或診斷抗體結合選擇適 當的耙點受到關于組織特異性致癌過程的極少的知識以及用于鑒定這些 靶點的所得到的過于單純化的方法的限制，所述過于單純化的方法如通過 過量表達進行選擇。第二，與受體以最大的親和力結合的藥物分子通常具 有起始或抑制信號的最大可能性的假設可能不總是這種情形。
除了對于乳腺癌和結腸癌的治療的一些進展之外，但是有效抗體治療 的鑒定和開發，不管是作為單一藥劑還是共同治療，對于所有類型的癌癥 尚是不充足的。
現有專利
美國專利號5,750,102公開這樣一種方法，其中來自患者腫瘤的細胞 用MHC基因轉染，所述MHC基因可能克隆至來自該患者的細胞或組織。 然后，使用這些轉染的細胞對該患者進行預防接種。
美國專利號4,861,581公開這樣一種方法，所述方法包括下列步驟 獲得單克隆抗體，所述單克隆抗體對哺乳動物的腫瘤細胞和正常細胞的內 部細胞成分是特異性的，但是對外部成分不是特異性的；標記所述單克隆 抗體，使所標記的抗體與已經接受治療的哺乳動物組織接觸以殺死腫瘤細 胞；并且通過測量所標記的抗體與退化的腫瘤細胞的內部細胞成分的結合 而確定治療的功效。在制備針對人細胞內抗原的抗體時，專利權所有人認 為惡性細胞代表這樣的抗原的便利的來源。
美國專利號5,171,665提供一種新型抗體以及其生產方法。具體地， 該專利教導形成這樣的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有與人腫瘤相關的 蛋白質抗原例如結腸和肺的那些強結合而與正常細胞以弱得多的程度結 合的性質。
15美國專利號5,484,596提供一種癌癥治療方法，所述方法包括從人癌 癥患者手術摘除腫瘤組織，處理所述腫瘤組織以獲得腫瘤細胞，輻射所述 腫瘤細胞以成為存活的但非致瘤性的，并且使用這些細胞制備用于患者的 疫苗，所述疫苗能夠抑制原發瘤的復發而且同時抑制轉移。該專利教導開 發與腫瘤細胞的表面抗原反應的單克隆抗體。如第4欄，第45行及以后 所述的，專利權所有人在開發人腫瘤形成的表達單克隆抗體的活性特異性 免疫治療中使用自生的腫瘤細胞。
美國專利號5,693,763教導一種糖蛋白抗原，其是人癌癥特有的，并 且不依賴于起源的上皮組織。
美國專利號5,783,186涉及在表達Her2的細胞中誘導程序性細胞死亡 的抗-Her2抗體，產生所述抗體的雜交瘤細胞系，使用所述抗體治療癌癥 的方法和包括所述抗體的藥物組合物。
美國專利號5,849,876描述了用于產生針對黏蛋白抗原的單克隆抗體 的雜交瘤細胞系，所述黏蛋白抗原由腫瘤和非腫瘤組織來源純化。
美國專利號5,869,268涉及產生人淋巴細胞的方法，所述人淋巴細胞 產生對需要的抗原特異性的抗體，產生單克隆抗體的方法，以及由所述方 法產生的單克隆抗體。該專利特別涉及有效用于癌癥診斷和治療的抗-HD 人單克隆抗體的生產。
美國專利號5,869,045涉及與人癌癥細胞反應的抗體、抗體片段、抗 體綴合物和單鏈免疫毒素。這些抗體作用的機制是雙重的，原因在于分子 與在人癌癥表面上存在的細胞膜抗原反應，并且此外，原因在于所述抗體 具有在癌癥細胞內部內在化的能力，隨后結合，使它們特別有效用于形成 抗體-藥物和抗體-毒素綴合物。在它們的未修飾形式中，所述抗體還在特
定的濃度表現出細胞毒性特征。
美國專利號5,780,033公開自體抗體用于腫瘤治療和預防的應用。然 而，這種抗體是來自年老的哺乳動物的抗核自體抗體。在這種情形中，認 為該自體抗體是在免疫系統中發現的一種自然抗體類型。因為該自體抗體 來自"年老的哺乳動物"，不存在所述自體抗體實際來自被治療的患者的 要求。另外，該專利公開了來自年老的哺乳動物的天然和單克隆抗核自體 抗體，和產生單克隆抗核自體抗體的雜交瘤細胞系。美國專利號5,750,102公開這樣一種方法，其中來自患者腫瘤的細胞 用MHC基因轉染，所述MHC基因可能克隆至來自該患者的細胞或組織。 然后，使用這些轉染的細胞對該患者進行預防接種。
美國專利號4,861,581公開這樣一種方法，所述方法包括下列步驟 獲得單克隆抗體，所述單克隆抗體對哺乳動物的腫瘤細胞和正常細胞的內 部細胞成分是特異性的，但是對外部成分不是特異性的；標記所述單克隆 抗體，使所標記的抗體與已經接受治療的哺乳動物組織接觸以殺死腫瘤細 胞；并且通過測量所標記的抗體與退化的腫瘤細胞的內部細胞成分的結合 而確定治療的功效。在制備針對人細胞內抗原的抗體時，專利權所有人認 為惡性細胞代表這樣的抗原的便利的來源。
美國專利號5,171,665提供一種新型抗體以及其生產方法。具體地， 該專利教導形成這樣的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有與人腫瘤相關的 蛋白質抗原例如結腸和肺的那些強結合而與正常細胞以弱得多的程度結 合的性質。
美國專利號5,484,596提供一種癌癥治療方法，所述方法包括從人癌 癥患者手術摘除腫瘤組織，處理所述腫瘤組織以獲得腫瘤細胞，輻射所述 腫瘤細胞以成為存活的但非致瘤性的，并且使用這些細胞制備用于患者的 疫苗，所述疫苗能夠抑制原發瘤的復發而且同時抑制轉移。該專利教導開 發與腫瘤細胞的表面抗原反應的單克隆抗體。如第4欄，第45行及以后 所述的，專利權所有人在開發人腫瘤形成的表達單克隆抗體的活性特異性 免疫治療中使用自生的腫瘤細胞。
美國專利號5,693,763教導一種糖蛋白抗原，其是人癌癥特有的，并 且不依賴于起源的上皮組織。
美國專利號5,783,186涉及在表達Her2的細胞中誘導程序性細胞死亡 的抗-Her2抗體，產生所述抗體的雜交瘤細胞系，使用所述抗體治療癌癥 的方法和包括所述抗體的藥物組合物。
美國專利號5,849,876描述了用于產生針對黏蛋白抗原的單克隆抗體 的雜交瘤細胞系，所述黏蛋白抗原由腫瘤和非腫瘤組織來源純化。
美國專利號5,869,268涉及產生人淋巴細胞的方法，所述人淋巴細胞 產生對需要的抗原特異性的抗體，產生單克隆抗體的方法，以及由所述方
17法產生的單克隆抗體。該專利特別涉及有效用于癌癥診斷和治療的抗-HD 人單克隆抗體的生產。
美國專利號5,869,045涉及與人癌癥細胞反應的抗體、抗體片段、抗 體綴合物和單鏈免疫毒素。這些抗體作用的機制是雙重的，原因在于分子 與在人癌癥表面上存在的細胞膜抗原反應，并且此外，原因在于所述抗體 具有在癌癥細胞內部內在化的能力，隨后結合，使它們特別有效用于形成 抗體-藥物和抗體-毒素綴合物。在它們的未修飾形式中，所述抗體還在特
定的濃度表現出細胞毒性特征。
美國專利號5,780,033公開自體抗體用于腫瘤治療和預防的應用。然 而，這種抗體是來自年老的哺乳動物的抗核自體抗體。在這種情形中，認 為該自體抗體是在免疫系統中發現的一種自然抗體類型。因為該自體抗體 來自"年老的哺乳動物"，不存在所述自體抗體實際來自被治療的患者的 要求。另外，該專利公開了來自年老的哺乳動物的天然和單克隆抗核自體 抗體，和產生單克隆抗核自體抗體的雜交瘤細胞系。
美國專利號5,916,561公開了針對CD44基因變體外顯子v6的特異性 抗體VFF-18及其變體。該抗體相對于其它同類抗體有所改進，因為其識 別人CD44 v6變體而不識別大鼠的CD44v6變體。此外，該抗體公開了 對于CD44 v6表達的診斷測定。對于該抗體沒有公開任何體外或體內的 功能。
美國專利號5,616,468公開了單克隆抗體Var3.1，該抗體針對包含由 人的CD44基因的外顯子6A編碼的序列的合成肽制備。特別地，該抗體 與人CD44的90kD形式不發生結合且可以與Hermes-3抗體相區別。提 供了檢測CD44的v6變體的方法以及基于該抗原篩選和測定惡性轉化的 方法。還提供了基于檢測血清中的抗原篩選炎癥疾病的方法。
美國專利號5,879,898公開了與人CD44變體6的129bp的外顯子結 合的特異性抗體，所述129bp的外顯子產生43個氨基酸的肽。該單克隆 抗體由許多雜交瘤細胞系制備MAK<CD44>M-U.12, MAK<CD44>M-2.42.3， MAK<CD44>M-4.3.16。該抗體從一種融合蛋白產 生，該融合蛋白包含新CD44 v6氨基酸序列的至少一個六肽。此外，公 開了用于檢測外顯子6變體的免疫測定，該測定可用作癌癥的診斷。值得
18注意地，沒有公開該抗體的體外或體內功能。
美國專利號5,942,417公開了編碼CD44樣多肽的多核苷酸以及使用 該多核酸及其變體制備重組蛋白的方法。該專利權利要求了這些多肽的抗 體但沒有具體實施例也沒有分泌這些抗體的保藏的克隆。Northern印跡法 證實該多核苷酸在若干類型的組織中出現，但沒有該多核苷酸翻譯和表達 的相應證據。因此，沒有證據說明抗體是針對該多核苷酸的基因產物制備 的，這些抗體具有體外或體內功能，以及它們是否與人癌性疾病相關。
美國專利號5,885,575公開了與CD44的變體表位反應的抗體以及通 過使用該抗體識別該變體的方法。從大鼠細胞中分離出編碼該變體的分離 的多核苷酸，且針對該變體的抗體mAbl.lASML識別分子量為120 kD, 150 kD, 180 kD,和200 kD的蛋白。單克隆抗體1.1ASML的施用延緩了大 鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生長和轉移。值得注意地，正如其缺乏 針對LCLC97人大細胞肺癌的活性所證實的，.1ASML不識別人腫瘤。 從LCLC97中分離出人的同系物但沒有制備出識別該同系物的等價抗體。 由此，盡管制備了對大鼠CD44的變體具有特異性的抗體且該抗體顯示影 響大鼠腫瘤的生長和轉移，但是沒有證據說明該抗體對人腫瘤具有效應。 更具體地，該發明人指出該抗體不識別人癌癥。
發明概述
本申請利用在U.S. 6,180,357專利中教導的生產患者特異性抗癌抗體 的方法分離雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系編碼減輕癌性疾病的單克隆 抗體。這些抗體可以針對一種腫瘤特異性制備，并且因此使得癌癥治療的 量身定制成為可能。在本申請的情形中，具有殺傷細胞(細胞毒性)或抑 制細胞生長(抑制細胞)特性的抗癌抗體在下文中稱為細胞毒性的。這些 抗體可以用于輔助癌癥的分階段和診斷，并且可以用于治療腫瘤轉移。這 些抗體還可以用于通過預防治療的方式用于預防癌癥。與根據傳統藥物發 現樣本(paradigm)產生的抗體不同，以這種方式產生的抗體可以靶向這樣 的分子和途徑，所述分子和途徑先前沒有顯示出對于惡性組織的生長和/ 或存活是必需的。此外，這些抗體的結合親和力適合起始可能不易受更強 的親和性相互作用影響的細胞毒性事件的需要。此外，將標準化療形式如放射性核素與本發明的CDMAB綴合也在本發明的范圍內，由此集中在所 述化療藥的應用。所述CDMAB也可以與毒素、細胞毒性部分、酶例如生 物素綴合的酶、細胞因子、干擾素、靶標或受體部分或造血細胞綴合，由 此形成抗體綴合物。所述CDMAB可以單獨或與一種或多種CDMAB/化 療試劑組合使用。個體化的抗癌治療的前景將在患者的管理方式中引起改變。可能的臨 床方案(scenario)是在出現時獲得腫瘤樣品，并且儲存。從該樣品，腫瘤 可以用一組預先存在的減輕癌性疾病的抗體而確定類型。將患者進行常規 分階段，但是可用的抗體可以用于將患者進一步分階段。患者可以立即用 現有的抗體進行治療，并且使用本發明描述的方法或通過利用噬菌體展示 文庫與本發明公開的篩選方法聯合，可以產生一組對腫瘤特異性的抗體。 由于其它腫瘤可能攜帶一些與被治療的腫瘤相同的表位，故將產生的所有 抗體加入到抗癌抗體文庫中。按照該方法產生的抗體可以有效用于治療許 多患有與這些抗體結合的癌癥的患者中的癌性疾病。除了抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦的治療作為多形式治 療方案的一部分。通過本方法分離的抗體對非癌癥細胞是相對無毒的事實 允許以高劑量抗體組合，單獨的，或與常規治療組合。高治療指數還允許 在短時間范圍內再次治療，這應該降低耐受治療的細胞出現的可能性。如果患者對初始的治療療程沒有反應或發展了轉移，則可以重復產生 針對腫瘤的特異性抗體的方法，進行再次治療。此外，所述抗癌抗體可以 與從該患者獲得的紅血細胞綴合，并且重新輸注用于治療轉移。對于轉移 癌存在很少有效的治療，并且轉移通常預示著導致死亡的最壞結果。然而， 轉移癌通常充分地血管化，通過紅血細胞遞送抗癌抗體可以具有將所述抗 體集中在腫瘤部位的作用。甚至在轉移之前，大部分癌癥細胞依賴于宿主 的血液供應它們的生存，并且與紅血細胞綴合的抗癌抗體還可以有效針對 原位腫瘤。備選地，所述抗體可以與其它造血細胞綴合，如淋巴細胞、巨 噬細胞、單核細胞、天然殺傷細胞等。存在5類抗體，并且每類與由其重鏈賦予的功能相關。通常認為由裸 抗體殺傷癌癥細胞通過抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)或補體依賴性細 胞毒性(CDC)進行介導。例如，鼠lgM和IgG2a抗體可以通過結合補體系統的C-1成分而激活人補體，由此激活可以導致腫瘤消退的補體激活經典途徑。對于人抗體，最有效的補體激活抗體通常是IgM和IgGl。 IgG2a 和IgG3同種型的鼠抗體有效征募具有Fc受體的細胞毒性細胞，其將導致 由單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和某些淋巴細胞進行的細胞殺傷。IgGl 和IgG3同種型的人抗體介導ADCC。通過Fc區介導的細胞毒性需要效應子細胞、它們相應的受體、蛋白例 如NK細胞、T細胞和補體的存在。在缺乏這些效應子機制的條件下，抗 體的Fc部分是惰性的。抗體的Fc部分可以賦予影響抗體體內藥物動力學 的性質，但在體外，這是無效的。我們測試抗體的細胞毒性測定不具有任何效應子機制的存在，且在體 外進行。這些測定不具有效應子細胞(NK、巨噬細胞、或T細胞)或補 體的存在。因為這些測定完全由加在一起的物質定義，所以可以表征每種 成分。本發明中使用的測定僅包含靶細胞、培養基和血清。靶細胞不具有 效應子功能，因為它們是癌細胞或成纖維細胞。在沒有具有效應子功能性 質的外源細胞的存在下，沒有具有這種功能的細胞元件。培養基不含有補 體或任何細胞。如銷售者公開地，用于支持靶細胞生長的血清不具有補體 活性。此外，在我們自己的實驗室中，我們驗證了所用血清中不存在補體 活性。因此，我們的工作證明了這樣的事實，即抗體的作用完全歸因于通 過Fab介導的抗原結合的作用。有效地，靶細胞僅識別和僅與Fab相互作 用，因為它們不具有Fc的受體。盡管雜交瘤分泌用靶細胞測試的完整免 疫球蛋白，但是免疫球蛋白中與該細胞枏互作用的部分僅是Fab，其起抗 原結合片段的作用。至于目前要求的抗體和抗體結合片段，本申請，在提交時，根據圖1 中的數據證明了細胞毒性。如上指出地，和如本文中通過客觀證據證實地， 該作用完全歸因于Fab對腫瘤細胞的結合。抗體介導的細胞毒性歸因于抗體與靶抗原的直接結合，而與通過Fc 復原的效應子機制無關的技術領域中存在充足的證據。關于這一點的最佳 證據是體外實驗，其不具有補充細胞，或補體(從而正式排除那些機制)。 這些類型的實驗使用完整的免疫球蛋白進行，或使用抗原結合片段諸如 F(ab)，2片段進行。在這些類型的實驗中，抗體或抗原結合片段可以直接誘21導靶細胞的凋亡，諸如在抗Her-2和抗EGFR抗體的情形中，這二者已被 US FDA批準市售用于癌癥治療法。
抗體介導的癌癥殺傷的另一種可能的機制可以通過使用作用為催化 細胞膜中的不同化學鍵以及與之締合的糖蛋白或糖脂的水解的抗體，即所 謂的催化抗體。
存在3種抗體-介導的癌癥細胞殺傷的其它機制。第一種是使用抗體 作為疫苗來誘導機體產生針對存在于癌癥細胞上的推定的抗原的免疫反 應。第二種是使用這樣的抗體，所述抗體靶向生長受體，并且干擾它們的 功能，或下調所述受體，以致有效地喪失其功能。第三種是所述抗體對細 胞表面部分的直接連接的作用，所述細胞表面部分的直接連接可能導致直 接的細胞死亡，諸如死亡受體如TRAIL Rl或TRAIL R2的連接，或整聯 蛋白分子如(xV(33的連接等。
癌癥藥物的臨床應用基于所述藥物在對患者的可接受的危險模式下 的益處。在癌癥治療中，通常是在益處之后最追求生存，然而，除了延長 生命之外，還存在許多其它公認的益處。這些其它的益處，其中治療沒有 不利地影響生存，包括癥狀減輕，針對不利事件的保護，復發時間的延長 或沒有疾病的生存，并且延長發展的時間。這些標準通常被接受，并且管 理團體如美國食品及藥品管理局(U.S. Food and Drug Administration) (F.D.A.)核準產生這些益處的藥物(Hirschfeld等.腫瘤學/血液學的重要綜 述(Critical Reviews in Oncology/Hematolgy) 42:137-143 2002)。除了這些 標準之外，公認還存在其它的可以預示這些類型的益處的終點(endpoint)。 部分地，由美國F.D.A.授予的加速的核準流程承認存在可能預測患者益處 的替代品。到2003年年末時，在這種流程下已經核準了 16種藥物，并且 這些中有4種已經繼續獲得了完全的核準，即，隨后的研究已經表明由替 代品終點預測的直接的患者益處。確定藥物在實體瘤中的作用的一個重要 的終點是通過測量針對治療的響應而評估腫瘤負荷(Themsse等.國家癌癥 研究所雜志(Journal of the National Cancer Institute) 92(3):205-216 2000)。 關于所述評估的臨床標準(RECIST標準)已由癌癥國際專家組實體瘤工作 組的響應評估標準公布。與適當的對照組相比較，對腫瘤負荷具有證明的 作用的藥物，如由RECIST標準所述的目標響應所示，最終傾向于產生直
22接的患者益處。在臨床前設定中，腫瘤負荷通常更直接進行評估和記錄。 因為臨床前研究可以轉換成臨床設定，在臨床前模型中產生延長的生存的 藥物具有最大的預測臨床用途。與產生針對臨床治療的積極響應類似，在 臨床前設定中減少腫瘤負荷的藥物還可能對疾病具有顯著的直接影響。盡 管延長生存是在癌癥藥物治療的臨床結果后最追求的，但是存在其它的益 處，其具有臨床應用，并且清楚地，可能與疾病發展的延遲、延長的生存 或二者相關的腫瘤負荷減少還可以導致直接的益處和具有臨床影響
(Eckhardt等.發展的治療學目標化合物的臨床試驗設計的成功與失敗 (Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial
Designs of Targeted Compounds); ASCO教科書，第39次年會，2003,第209
-219頁)。
基本使用US 6,180,357的方法，在用來自患者肺腫瘤活檢組織和來自 肺癌細胞系NCI-H460 (ATCC, Virginia, MA)的細胞免疫小鼠之后，獲得小 鼠單克隆抗體H460-16-2。H460-16-2抗原在來自不同組織的廣泛范圍的人 細胞系的細胞表面上表達。乳腺癌細胞系MDA-MB-231 (MB-231)和皮膚 癌細胞A2058在體外對H460-16-2細胞毒性效應敏感。
在細胞培養中H460-16-2對MB-231細胞的細胞毒性結果通過在其被 植入小鼠時對這些癌細胞的抗腫瘤活性得以進一步延伸(如S.N. 10/603,000中公開的)。臨床前異種移植腫瘤模型被認為是治療功效的有效 預測。
在人乳腺癌的預防性體內模型中，在治療期間，H460-16-2治療比同 種型對照抗體顯著(pO.OOOl)更有效地抑制腫瘤生長。在治療期結束時， 接受H460-16-2的小鼠的腫瘤生長只有對照組的1.3%。在治療后的后續期 間，H460-16-2的治療效應繼續維持，且直到測量期結束，治療組的平均 腫瘤體積一直顯著地小于對照組。使用存活作為抗體功效的度量標準，據 估計在治療后的70天，H460-16-2治療組中的死亡風險是抗體緩沖液對 照組的大約71 % (p=0.028)。這些數據說明H460-16-2治療與對照治療組 相比賦予了存活益處。由于沒有誘導任何毒性跡象，包括體重降低和臨床 痛苦，H460-16-2治療似乎是安全的。因此，H460-16-2治療是有效的，因 為在充分成熟的人乳腺癌模型中，它與對照治療組相比延緩了腫瘤的生長并提高了存活。
此外，H460-16-2在成熟體內腫瘤的模型中證明了對MB-231細胞的 抗腫瘤活性(如S.N. 10/603,000中公開的)。將使用H460-16-2的治療和 標準化療藥物順鉑進行了比較，比較顯示順鉑和H460-16-2治療組和接受 抗體稀釋緩沖液或同種型對照抗體治療的組相比具有顯著更小的平均腫 瘤體積(pO.OOl)。 H460-16-2治療介導了大約為順鉑化療的2/3的腫瘤抑 制但沒有順l白治療中觀察到的顯著的(19.2%)體重降低(p< 0.003)和臨 床痛苦，包括在順鉑治療中觀察到的2例治療相關的死亡。H460-16-2的 抗腫瘤活性及其最小化的毒性使其成為一種具有吸引力的抗癌治療試劑。
在治療后階段，H460-16-2顯示了顯著的存活益處(pO.02)，因為在治 療后的〉70天，H460-16-2組的死亡風險大約是同種型對照抗體組的一 半。觀察到的存活益處持續到治療后的120天，其時相比67。/。的H460-16-2 治療組，100%的同種型對照和順鉑治療的小鼠死亡。和同種型對照抗體組 相比，通過以26 %延緩腫瘤生長，H460-16-2維持對腫瘤的抑制。在治 療后的31天，H460-16-2通過以相對于同種型對照組以48%減慢腫瘤生長 從而限制腫瘤體積，這和在治療結束時觀察到的49%的降低相當。在乳腺 癌的成熟腫瘤模型中，這些結果意味著H460-16-2在治療期以外維持腫瘤 抑制的潛力且證明了該抗體在哺乳動物體內降低腫瘤負荷和提高存活的 能力。
除了在乳腺癌的成熟體內腫瘤模型中的有益效果，H460-16-2治療與 化療藥物(順鉑)的組合在前列腺癌的成熟體內模型中具有針對PC-3細 胞的抗腫瘤活性(如S.N. 10/810,165中公開的)。利用配對t-檢驗， H460-16-2加順鉑的治療與緩沖液對照(pO.OOOl)，單獨的順鉑治療 (p-0.004)或單獨的H460-16-2治療(pO.0001)相比，在治療期后不久顯著更 有效抑制腫瘤生長。在治療期結束時，施用H460-16-2加順鉑的小鼠具有 僅生長至緩沖液對照組的28.5%的腫瘤。對于PC-3 SCID異種移植模型， 體重可以用作疾病進展的代用指示。所有組的小鼠均經歷嚴重的體重減 少。在該研究中，所有組中的小鼠在治療期結束時顯示出約23-35%的體 重減少。用H460-16-2治療的組顯示最小程度的體重減少(21.7%)。治療后， 第48天，與緩沖液對照相比，不存在與H460-16-2和順鉑治療相關的顯著體重增加(p^.5042)。因此，H460-16-2加順鉑的治療是有效的，因為其 在人前列腺癌的充分成熟模型中，與同種型對照治療組相比，延緩腫瘤生 長。
為了證實H460-16-2表位是藥物靶標，此前確定了 H460-16-2抗原在 正常人體組織中的表達(S.N. 10/603,000)。通過與抗CD44抗體；克隆 L178 (如S.N. 10/647,818中公開的)和克隆BU75 (如S.N. 10/810,165中 公開的)的比較，此項工作得到了擴展。通過H460-16-2的IHC染色，大 部分組織未能表達H460-16-2抗原，包括要害器官，如肝、腎(管狀上皮 細胞的邊緣染色除外)、心臟和肺的細胞。組織染色的結果意味著 H460-16-2呈現對各種細胞類型的受限結合但與浸潤性巨噬細胞、淋巴細 胞和成纖維細胞結合。BU75抗體顯示了相似的染色模式。然而，注意到 至少一種差別；和H460-16-2相比，BU75對淋巴細胞的染色更強。
H460-16-2抗原的定位及其在人群諸如乳腺癌患者中的普遍性的確定 對評價H460-16-2的治療用途和設計有效臨床試驗是重要的。為了弄清 H460-16-2抗原在癌癥患者乳腺腫瘤中的表達，之前篩選來自50名乳腺癌 患者的腫瘤組織樣品，以確定H460-16-2抗原的表達(S.N. 10/603,000)，并 與L178 (S.N. 10/647,818), BU75 (S.N. 10/810,165)和抗Her2抗體c-erbB-2 (S.N. 10/810,165)進行比較。這些研究的結果相似并顯示出62%的組織樣品 是H460-16-2抗原染色陽性的而73。/。的乳腺腫瘤組織是BU75表位陽性的。 在患者樣品中H460-16-2的表達似乎對癌細胞具有特異性，因為染色局限 于惡性細胞。H460-16-2染色了 IO份來自乳腺癌患者的正常組織樣品中的 4份，而BU75染色了 8份。H460-16-2和BU75抗原的乳腺腫瘤表達似乎 主要定位在惡性細胞的細胞膜上，使CD44成為具有吸引力的治療靶標。 基于激素雌激素和孕酮的受體在乳腺腫瘤中的表達對H460-16-2的表達進 行了進一步的評估，這兩種激素受體在乳腺腫瘤的發展、治療和預后中發 揮重要作用。在H460-16-2抗原表達和雌激素或孕酮受體表達之間沒有明 顯的關聯性。當根據腫瘤的階段或癌癥發展的程度分析腫瘤時，再一次地， 在H460-16-2抗原表達和腫瘤階段之間沒有清晰的關聯。使甩BU75獲得 了相似的結果。與c-erbB-2相比，H460-16-2顯示完全不同的染色特征， 其中對H460-16-2抗原顯陽性的乳腺腫瘤 織樣品的52%對Her2表達顯陰性，這顯示對乳腺癌患者至今未滿足的靶治療需要。在對H460-16-2和Her2均顯陽性的乳腺腫瘤組織切片之間也存在染色強度的差別。c-erbB-2抗體也陽性染色正常乳腺組織切片之一。
為了進一步擴展H460-16-2的潛在治療益處，此前確定了抗原在各種人癌癥組織中的頻率和定位(S.N. 10/603,000)并與克隆L178 (S.N.10/647，818)進行比較。這些腫瘤類型中的大部分對L178抗原也是陽性的。和人乳腺腫瘤組織一樣，H460-16-2和L178的定位發生在腫瘤細胞的細胞膜上。然而，和H460-16-2相比，L178中存在基本更多的膜定位。同樣的，在由H460-16-2和L178染色的腫瘤類型中，43 X的組織對L178抗體顯示了更高強度的染色。
另外，此前確定了抗原在前列腺和肝正常組織和癌癥組織中的頻率和定位(S.N. 11/364,013)。由前列腺癌陣列，19/53 (36%)測試的腫瘤對H460-16-2顯陽性。H460-16-2特異于腫瘤細胞和基質成纖維細胞。細胞定位主要在膜和細胞質膜，其具有或不具有腔定位。陽性細胞的百分比范圍是<10% - >50%，這顯示抗體與腫瘤細胞的異源結合。不能嚴格評估抗體結合與腫瘤階段的關系，這歸因于不同腫瘤階段中腫瘤數量的差異，對于I, II, III和IV期分別是1/1 (100%), 4/12 (33%), 0/2 (0%)禾口 11/33 (33%)。存在對Gleason分數G3-G4 (36%)比對Gl-G2 (25%)更高的結合。Gleason分數是分級前列腺癌的系統。Gleason分級系統對組織樣品中的兩個最大面積的癌癥指定級別。級別范圍是l-5， l是最小入侵的，且5是最大入侵的。3級腫瘤，例如，很少轉移，但是轉移在4級或5級中普遍。然后將這兩級加在一起產生Gleason分數。認為分數2-4是低級；5-7是中級；且8-10是高級。具有低Gleason分數的腫瘤典型地生長足夠慢以致可能不造成對患者壽命的顯著威脅。所有3份正常前列腺組織切片對抗體顯陽性。然而，組織特異性針對肌上皮和基質成纖維細胞且忽略腺上皮。圖12示范H460-16-2與測試的前列腺腫瘤結合的不均勻性10/53， 6/53， 3/53的陽性腫瘤分別在<10-10% 、 <50-50%和>50的分類中。作為其結合前列腺癌細胞的結果，H460-16-2的治療益處可以潛在地擴展到治療前列腺癌。
由肝癌陣列，H460-16-2抗體顯示與21/49 (43%)測試肝癌結合，包括11/37 (30%)原發性的，7/8 (88%)轉移性肝細胞癌，1/2 (50%)原發性和2/2
26(100%)轉移性膽管癌。與早期i和n相比，抗體顯示出對晚期腫瘤III和IV期顯著更高的結合(p = 0.03) [I期，0/2 (0%); II期，2/17 (12%); III期，8/16(500/。)和IV期，6/8 (75%)]。 H460-16-2特異于腫瘤細胞并浸潤炎性細胞。細胞定位主要在膜。 一些腫瘤也展示擴散細胞質染色模式。抗體與9/9的非-贅生性肝組織結合。然而，結合局限于血竇細胞并浸潤淋巴細胞。H460-16-2抗原似乎特異性表達在晚期肝腫瘤組織上。H460-16-2因此在治療肝癌中具有作為治療藥物的潛力。
根據與文獻中的IHC數據的比較，似乎沒有CD44的形式與本文中出現的IHC數據精確匹配。CD44的標準形式通常在人腦中表達；H460-16-2抗原不在人腦中表達。針對全CD44同種型的抗體不對肝(包括Kuppfer細胞)發生染色且對生殖周期的所有階段中的子宮內膜腺陽性染色。H460-16-2抗原清晰地存在于Kuppfer細胞上且僅存在于生殖周期的分泌性子宮內膜腺上。H460-16-2抗原清楚地存在于組織巨噬細胞上且僅有變體形式V4/5和V8/9顯示出偶爾的巨噬細胞染色。與抗CD44L178和現在的BU75相比，觀察到的H460-16-2相似但不同的結合模式，說明H460-16-2抗原是CD44的獨特表位。
如以前公開地(S.N. 10/647,818)，額外的生化數據也說明H460-16-2識別的抗原是CD44的一種形式。這得到了研究的支持，研究顯示與CD44反應的單克隆抗體(L178)通過免疫沉淀識別與H460-16-2結合的蛋白。Western印跡法研究也提示由H460-16-2識別的CD44的表位不存于v6或v10上。H460-16-2表位也可由于其是碳水化合物和構象依賴性的而被區分，而很多抗CD44抗體是針對CD44的肽部分的。這些IHC和生化結果證明H460-16-2與CD44抗原的變體結合。由此，多數證據顯示H460-16-2通過與CD44變體上存在的獨特的碳水化合物依賴性構象表位的連接介導抗癌效應。為了本發明的目的，所述表位定義為"CD44抗原部分"，其特征在于與由雜交瘤細胞系H460-16-2編碼的單克隆抗體、其抗原結合片段或其抗體綴合物結合的能力。
為了進一步說明H460-16-2的抗癌效應背后的機制，進行了透明質酸(HA)結合測定(如S.N. 10/810,165中所公開的)。確定了需要平均濃度為1.87 (+/- 1.01)微克/mL的H460-16-2抑制MDA-MB-231細胞與HA的50%的粘附。這些結果說明H460-16-2與，至少部分地與CD44上的區域相互作用，所述區域促進與HA的結合并因此通過下調血管發生或腫瘤通過ECM的入侵可以介導其抗癌效應。
除HA結合測定外，進行了細胞周期實驗，以確定H460-16-2的體外和體內抗癌效應是否歸因于對細胞周期的調節(如S.N. 10/810,165中所公開的)。24小時和使用20微克/mLH460-16-2后，與同種型對照相比，存在MDA-MB-231凋亡細胞數量的增加。該效應還似乎是劑量依賴性的。因此，H460-16-2的功效可能也全部或部分地歸因于其凋亡誘導能力。
為了進一步說明H460-16-2的作用機制，研究H460-16-2對在乳腺癌異種移植模型中體內生長的MDA-MB-231腫瘤中的凋亡的作用(如S.N.11/364,013中公開的)。凋亡細胞利用形態學標準諸如單細胞的消除、細胞收縮和染色質壓縮為致密質(dense mass)計算。緩沖液對照處理組產生平均總分為17個細胞(士 5.29)，而H460-16-2處理組產生平均總分為22.5個細胞(±4.20)。因此，如利用細胞形態學所確定地，使用H460-16-2治療
傾向于增加凋亡。
生成兩種嵌合形式的H460-16-2，如在S.N. 11/364，013中所公幵地。一種形式是同種型IgGl，即K((ch)ARH460-16-2-IgGl)，且另一種是同種型IgG2，即K((ch)ARH460-16-2-IgG2)。來自嵌合的IgGl和嵌合的IgG2-分泌克隆的上清液能夠利用類似于對鼠科H460-16-2獲得的信號，在Western印跡法中檢測CD44 (如S.N. 11/364,013中所公開的)。
這兩種嵌合抗體均在乳腺癌的成熟模型中與鼠科形式的H460-16-2相比較(如S.N. 11/364,013中所公開的)。鼠科H460-16-2和(ch)ARH460-16-2-IgGl均在人乳腺癌的成熟MDA-MB-231體內模型中減少腫瘤的生長。在第62天，即施用最后劑量后5天，使用H460-16-2的治療導致39%的腫瘤生長抑制(平均T/C = 57%)。這種腫瘤生長的減少與對照顯著不同^=0.0037)。嵌合抗體(ch)ARH460-16-2-IgGl導致64%的增強的腫瘤生長抑制(TGI)(平均170 = 26.9%; <0.0001)。相反，嵌合抗體的lgG2形式，即(ch)ARH460-16-2-IgG2在與緩沖液對照相比較時，沒有顯示出腫瘤生長的抑制(TGI = 0%;平均T/C = 122%; p=0.7264)。
進行膜聯蛋白-V染色確定H460-16-2的嵌合形式是否能夠以與鼠科副本相同的方式在MDA-MB-231人乳腺癌細胞系上誘導凋亡(如S.N.11/364,013中所公開的)。發現用同種型對照處理的細胞的自發凋亡效應類似于僅用賦形劑處理的細胞。在每次實驗中，發現鼠科和人嵌合IgGl和IgG2H460-16-2抗體都在乳腺癌細胞系中以劑量依賴性方式誘導凋亡，對(ch)ARH460-16-2 IgGl和IgG2抗體觀察到更高的凋亡效應。結果說明在體外(ch)ARH460-16-2-IgG2抗體在與嵌合IgGl抗體相比時，具有最大的凋亡效應。全部3種抗體顯示出超過其預期的同種型對照的％壞死和壞死/凋亡數量的增加。對(ch)ARH460-16-2-IgG2觀察到最大的％壞死和壞死/凋亡數量的增加，其次是(ch)ARH460-16-2-IgGl，再其次是H460-16-2。
總之，這些數據說明鼠科和嵌合H460-16-2抗原是癌癥相關抗原且在人體中表達，并且是病理相關癌癥靶標。此外，這些數據還說明H460-16-2抗體與人癌癥組織結合，且可被合適地用于診斷、治療預測或預后的測定。此外，由于該抗原在絕大多數非惡性細胞中沒有表達，該抗原的細胞膜定位是細胞癌癥狀態的指示，且該發現允許該抗原、其基因或衍生物、其蛋白或其衍生物被用于診斷、治療預測或預后的測定。
其它涉及抗CD44抗體使用的研究具有H460-16-2所沒有呈現的治療潛力的局限。H460-16-2證實了體外和體內的抗腫瘤活性。此前所述的抗體 如 MAK<CD44>M-1.U2， MAK<CD44>M-2.42.3 和MAK<CD44>M-4.3.16沒有屬于它們的體外和體內細胞毒性且VFF-18與MabU36顯示沒有固有的腫瘤細胞毒性。此外，呈現了體內腫瘤效應的其它抗CD44抗體也具有在H460-16-2上不明顯的某些局限。例如，ASMLl.l、 K926、抗CD44禾B IM-78.1分別顯示了對大鼠、鼠科、異種移植模型中生長的大鼠和鼠科腫瘤的體內抗腫瘤活性。H460-16-2在人體癌癥模型中證實了抗腫瘤活性。H460-16-2也針對人CD44而抗體如ASMLl.l僅識別大鼠CD44。克隆515抗CD44抗體的確抑制人卵巢細胞系的腹膜腫瘤移植但不阻止或抑制腫瘤的生長。H460-16-2在SCID小鼠異種移植模型中能夠抑制人乳腺腫瘤的生長。GKW.A3是抗人CD44單克隆抗體，其能夠在預防性但非成熟模型中抑制在小鼠中生長的人轉移性黑素瘤的腫瘤生長。H460-16-2己在人乳腺癌的預防性和成熟的鼠科異種移植模型中證實了顯著的抗腫瘤活性。因此，很明顯，H460-16-2和此前所
29述的抗CD44抗體相比具有更好的抗腫瘤性質。其在SCID小鼠的人乳腺 腫瘤上的體外和體內抗腫瘤活性己被證實并且靶向人CD44。該抗體還在 人乳腺癌的預防性和成熟(更臨床相關的)模型中呈現了活性，且該抗體 在人前列腺癌成熟模型中與順鉑一起呈現出活性。
本發明描述了 H460-16-2的發展和使用，所述H460-16-2是通過專利 US 6,180,357中所述方法開發的，和通過其在細胞毒性測定中、在動物模 型中腫瘤生長中和在患有癌癥的那些患者中延長存活時間中的效應確定 的。
本發明描述了癌癥治療領域中的一個進步，因為其描述了與靶分子， CD44上存在的一個或多個表位特異性結合，并在人肝癌體內模型中直接 介導對腫瘤生長和轉移的抑制的試劑。本文中的大多數證據證明嵌合 H460-16-2通過與在肝癌上表達的CD44上存在的表位的連接，介導抗癌 效應，這應該被廣泛理解為包括任何由肝細胞產生的原發性或轉移性腫瘤 位點。該申請證明利用轉移性對比原發性人肝癌細胞系觀察CD44的表達。 本發明還公開嵌合H460-16-2較小腫瘤負荷和人肝癌體內轉移的可能性。
這與任何其他以前所述的抗-CD44抗體相比是一個進步，因為沒有抗 體顯示出具有相似性質。它還提供本領域中的進步，因為其清楚地證明 CD44直接參與與某些類型的腫瘤的生長和發育相關的事件。它還代表癌 癥治療中的進步，因為其具有在人患者中展示類似抗癌性質的潛力。另一 種進步是抗癌抗體文庫中包含這些抗體應該通過確定不同抗癌抗體的組 合，提高靶向表達不同抗原標記的腫瘤的可能性，從而發現在靶向和抑制 腫瘤生長和發育中最有效的。
總之，本發明教導了 H460-16-2抗原作為治療試劑靶標的應用，該試 劑在施用時能夠降低哺乳動物體內表達該抗原的癌癥的腫瘤負荷(由此延 緩疾病進展)和哺乳動物體內表達該抗原的癌癥轉移的可能性，并還能夠 導致治療的哺乳動物延長的存活。本發明還教導了 CDMAB(H460-16-2) 及其衍生物、配體及其可以結合片段在靶向其抗原以降低哺乳動物內表達 該抗原的癌癥的腫瘤負荷和延長患有表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的壽 命中的應用。此外，本發明還教導了在癌細胞中檢測H460-16-2的用途， 其可被用于對患有表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的診斷、治療預測和預
30后。
因此，本發明的一個目的是利用產生針對來源于特定個體的癌性細胞
或一種或多種特定的癌癥細胞系的減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)的方法， 以分離雜交瘤細胞系，和所述雜交瘤細胞系編碼的相對應的分離的單克隆 抗體及其抗原結合片段，所述CDMAB對于癌癥細胞是細胞毒性的，但是 同時對于非癌性細胞相對是無毒的。
本發明的另一個目的是教導減輕癌性疾病的抗體，其配體和抗原結合 片段。
本發明的另一個目的是產生減輕癌性疾病的抗體，其細胞毒性通過抗 體依賴性細胞毒作用介導。
本發明的另一個目的是產生減輕癌性疾病的抗體，其細胞毒性通過補 體依賴性細胞毒作用介導。
本發明的另一個目的是產生減輕癌性疾病的抗體，其細胞毒性是它們 催化細胞的化學鍵水解的能力的功能。
本發明的另一個目的是產生減輕癌性疾病的抗體，所述抗體有效用于 癌癥診斷、預后和監測的結合測定。
本發明的其它目的和優點將通過下述描述變得清楚，其中通過舉例說 明和實施例的方式描述本發明的某些實施方案。
本專利或申請文件包含至少一幅彩色附圖。在提出要求并支付了必要 費用后，專利局將提供帶有彩色附圖的本專利或專利申請公開文本的復印 件。
圖1結合在人肝腫瘤和正常組織微陣列上的H460-16-2的總結。 圖2是來自人組織微陣列的代表性顯微圖，其顯示利用H460-16-2 (A) 或同種型對照抗體(B)獲得的在肝腫瘤組織上和利用H460-16-2 (C)或同種 型對照抗體(D)獲得的在非-贅生性肝組織上的結合模式。H460-16-2對腫 瘤細胞展示強陽性染色，并僅限于對血竇細胞的染色(黑色箭頭)并浸潤 非-贅生性肝組織上的淋巴細胞(綠色箭頭)。放大倍數是200倍。
圖3顯示CD44過表達和多種HCC細胞系轉移潛力之間的相關性。圖4顯示(ch)ARH460-16-2-IgGl在成熟同位HCC腫瘤模型中對HCC 腫瘤生長和轉移的影響。數據點表示平均值+ASEM。
圖5顯示(ch)ARH460-16-2-IgGl在成熟同位HCC腫瘤模型中對腫瘤 生長的定量影響。柱狀圖總結來自四組動物的腫瘤的的平均基礎信號，以 光子/s/cm"steridian為單位。每個柱表示腫瘤接種后第45天時的平均基礎 水平信號。
圖6在視覺上顯示(ch)ARH460-16-2-IgGl在成熟同位HCC腫瘤模型 中對原發性腫瘤生長的影響。
圖7是在有或無抗體處理的條件下發展的不同轉移數量的表格。
發明詳述
一般地，以下詞語或短語在概述、說明、實施例、和權利要求中使用 時具有指定的定義。
術語"抗體"以最寬泛的意義使用，并且特別涵蓋，例如，單一的單 克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑、和中和抗體、去免疫的(de-immunized)、 鼠、嵌合的或人源化的抗體)，具有多表位特異性的抗體組合物，單鏈抗 體，雙抗體，三鏈抗體，免疫綴合物和抗體片段(見下文)。
當用于本發明時，術語"單克隆抗體"是指從一群基本上均一的抗體 獲得的抗體，即，除了可能以較少量存在的可能天然存在的突變之外，包 括所述群體的個體抗體是相同的。單克隆it體是高度特異性的，針對單一 的抗原位點。此外，多克隆抗體制劑包括針對不同決定簇(表位)的不同 抗體，與所述多克隆抗體制劑相反，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決 定簇。除了它們的特異性，因為單克隆抗體可以不被其它抗體污染地合成， 所以單克隆抗體是有利的。修飾詞"單克隆"表示該抗體的特征是從基本 上均一的抗體群體獲得，并且不被解釋為抗體的生產需要通過任何特定的 方法。例如，按照本發明使用的單克隆抗體可以通過由Kohler等^然 (7VamreJ, 25(5:邦5 (1975)首先描述的雜交瘤(鼠或人)方法制備，或可 以通過重組DNA方法(參見，例如，美國專利號4,816,567)制備。"單克隆 抗體"還可以使用例如Clackson等，^然(7V自e入352:624-628 (1991) 和Marks等，分子主激,染,志a Mo/.歷o/.入222:581-597 (1991)中所述的技術，從噬菌體抗體文庫分離。
"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優選地包括其抗原-結合或可
變區。抗體片段的實例包括小于全長的抗體，Fab，Fab，， F(ab，)2,和Fv片 段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體，單結構域抗體分子，融 合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。
"完整的"抗體是一種這樣的抗體，其包括抗原-結合可變區以及輕 鏈恒定結構域(CO和重鏈恒定結構域CH1、 CH2和CH3。恒定結構域可以 是天然序列恒定結構域(例如，人天然序列恒定結構域)或其氨基酸序列 變體。優選地，完整的抗體具有一種或多種效應子功能。
根據它們重鏈恒定結構域的氨基酸序列，可以將完整抗體分成不同的 "種類"。存在五種主要類別的完整抗體IgA, IgD, IgE， IgG,和IgM，且 這些中的一些可以進一步分成"亞類"(同種型)，例如，IgGl,IgG2,IgG3， IgG4， IgA，和IgA2。對應于不同類型抗體的重鏈恒定結構域分別稱為ot， 5， 和P。不同類型免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型是公知的。 抗體"效應子功能"指屬于抗體Fc區(天然序列Fc區或氨基酸序列 可變Fc區)的那些生物學活性。抗體效應子功能的實例包括Clq結合； 補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體-依賴性細胞-介導的細胞毒性 (ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)的下調
等坐
"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"和"ADCC"是指細胞介導的反應， 其中表達Fc受體(FcRs)的非特異性細胞毒性細胞(例如，天然殺傷(NK) 細胞，嗜中性粒細胞，和巨噬細胞)識別在靶細胞上的結合的抗體，并且 隨后引起該耙細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞，即NK細胞，僅表達 FcyRIII，而單核細胞表達FcyRI， FcyRII和FcyRIIL FcR在造血細胞上的 表達總結在Ravetch和Kinet，免疫學年度綜述"畫.T ev. /腦國/J 9:457-92 (1991)的第464頁表3中。為了評估目的分子的ADCC活性，可 以進行體外ADCC測定，諸如在美國專利號5,500,362或5,821,337中所述 的測定。對于所述測定有用的效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和 天然殺傷(NK)細胞。備選地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在 體內進行評估，例如，在動物模型中，諸如在Clynes等.戶7VAS (USA)
3395:652-656 (1998)中公開的動物模型中。
"效應子細胞"是表達一種或多種FcR并執行效應子功能的白細胞。 優選地，該細胞表達至少FcYRIII并執行ADCC效應子功能。介導ADCC 的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、 單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；其中PBMC和NK細胞是優 選的。效應子細胞可以從其天然來源分離，例如從如本文中所述的血液或 PBMC中分離。
術語"Fc受體"或"FcR "用于描述結合抗體Fc區的受體。優選的 FcR是天然序列人FcR。而且，優選的FcR是結合IgG抗體的受體(y受 體)并包括FcyRI, FcyRII，和Fey RIII亞類的受體，包括這些受體的等位基 因變體和備選剪接形式。FcYRI1受體包括Fc，nA("激活受體")和FcryRIIB
("抑制受體")，它們具有主要在它們的細胞質結構域不同的相似的氨基 酸序列。激活受體Fc丫RIIA在其細胞質結構域包含免疫受體基于酪氨酸的 激活基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其細胞質結構域包含免疫受體基于 酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見在M. Dagron，免疫學年度綜述 i ev./附wm"o/.) 15:203-234(1997)中的綜述)。FcRs在Ravetch和Kinet,免 疫學年度綜述(Annu. Rev. Immunol) 9:457-92 (1991); Capd等，竟疫學^T^
(7mm,om"/2o^;> 4:25-34 (1994);和de Haas等,^^l^皇游^",學^^志" 丄W. Me^U 126:330-41 (1995)中綜述。其它FcRs，包括將在將來鑒定 的那些，包含在本發明的術語"FcR"中。該術語還包括新生受體，FcRn， 其負責將母親的IgGs轉運到胎兒(Guyer等，^疫學J^志O！ /mmimo/J 117:587 (1976)和Kim等，欲///,疫學染志fEur. J /mm柳o/J 24:2429 (1994))。
"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"是指分子在存在補體的條件下裂解 靶點的能力。補體激活途徑通過補體系統的第一補體(Clq)同與同源抗原復 合的分子(例如，抗體)的結合而起始。為了評估補體激活，可以進行 CDC測定，例如，如在Gazzano-Santoro等，免瘦學^"法^^若a/mm柳o/. MeAod^ 202: 163 (1996)中所述。
術語"可變"是指這樣的事實，即，在抗體之間，某些可變結構域的 部分在序列上大量不同，并且其用于每種特定的抗體對于其特定的抗原的結合和特異性。然而，在抗體的整個可變結構域中可變性不是均勻分布的。 它集中在在輕鏈和重鏈可變區內稱為高變區的三個片段中。可變結構域的
更高度保守的部分稱為構架區(FRs)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域分別包 括4個FRs，其主要采取(3-折疊構型，通過三個高變區連接，其形成環連 接，并且在某些情形中形成P-折疊結構的一部分。每條鏈中的高變區通過 FRs緊密相鄰保持在一起，并且與另一條鏈的高變區一起有助于形成抗體 的抗原-結合位點(見Kabat等,^^學^邀游歪^游 "e^em^ 尸rafe/ra1 0/7附附""0/6^'(^//"&^5^ ,第5版.公共衛生月艮務(Public Health Service),全國衛生研究所(National Institutes of Health) , Bethesda, Md. (1991))。恒定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出多種效應 子功能，諸如在抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)中的抗體參與。
當用于本發明時，術語"高變區"是指抗體負責抗原結合的氨基酸殘 基。高變區通常包括來自"互補決定區"或"CDR"的氨基酸殘基(例如，在 輕鏈可變結構域中的殘基24-34 (LI), 50-56 (L2)和89-97 (L3)和在重鏈可 變結構域中的31-35 (HI), 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat等，^瘦學,邀
共衛生服務(Public Health Service),全國衛生研究所(National Institutes of Health) ,Bethesda，Md.(1991))和/或來自"高變環"的那些殘基(例如，在 輕鏈可變結構域中的殘基2632 (Ll)， 50-52 (L2)和91-96 (L3)和在重鏈可 變結構域中的26-32 (HI), 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia和Lesk，分子 生物學雜志(J Mo/. 5/o/./l96:901-917(1987))。"構架區"或"FR"殘基是除 了如本文所定義的所述高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。木瓜蛋白 酶消化抗體產生兩種相同的抗原-結合片段，其稱為"Fab"片段，每個具有 單個抗原-結合位點，并且產生殘留的"Fc"片段，它的名稱反應了它容易結 晶的能力。胃蛋白酶處理產生F(ab')2片段，其具有兩個抗原-結合位點， 并且仍然能夠交聯抗原。
"Fv"是包含完整的抗原-識別和抗原-結合位點的最小抗體片段。該區 域由緊密、非共價締合的一個重鏈和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。 正是在這種構型中每個可變結構域的三個高變區相互作用，以限定在 Vh-Vl二聚體表面上的抗原-結合位點。籠統地，6個高變區賦予抗體的抗
35原-結合特異性。然而，甚至單個可變結構域(或僅包括對抗原特異的3 個高變區的Fv的一半)具有識別和結合抗原的能力，盡管是以比完整的
結合位點低的親和力結合。Fab片段還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第 一恒定結構域(CHI)。 Fab，片段不同于Fab片段，其通過在重鏈CH1結構 域的羧基端添加幾個殘基而不同，所述添加的殘基包括來自抗體鉸鏈區的 一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH在本發明中是Fab'的名稱，其中恒定結構 域的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離的巰基(thiol)基團。F(ab，)2抗體片 段最初作為一對Fab，片段產生，其在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片 段的其它化學偶聯也是已知的。
基于它們的恒定結構域的氨基酸序列，來自任何脊椎物種的抗體的 "輕鏈"可以被指定為兩種明顯不同的類型中的一種，所述兩種明顯不同 的類型稱為kappa (k)和lambda (X)。
"單鏈Fv"或"scFV，抗體片段包括抗體的Vh和Vt結構域，其中這些 結構域存在于單一的多肽鏈中。優選地，Fv多肽還包括在Vh和V^結構 域之間的多肽連接體，其使得scFv能夠形成用于抗原結合的理想結構。 對于scFv的綜述，參見Pliickthun，在卓克燈貧沐游藥湮學(7726 尸/zarwaco/og7 o/Mowoc/o"a/ Jw/z'Z c^z.es )中，巻113, Rosenburg禾口 Moore編, Springer-Verlag，紐約，第269-315頁(1994)。
術語"雙抗體"是指具有兩個抗原-結合位點的小抗體片段，所述片
段包括與在同一多肽鏈(vh-vo中的可變輕鏈結構域(vo連接的可變重鏈 結構域(vh)。通過使用太短而不允許在同一條鏈中的兩個結構域之間成對 的連接體，迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域成對，并且產生兩個
抗原-結合位點。例如，在EP404,097;WO 93/11161;禾口 Hollinger等，夷房 ^^棄學腐學叛Ato/.OS^j , 90:6444-6448 (1993)中更充
分地描述了雙抗體。
術語"三鏈抗體"或"三價三聚體"指三個單鏈抗體的組合。三鏈抗
體使用v!^或vh結構域的氨基酸末端構建，即無任何連接體序列。三鏈抗
體具有三個Fv頭部，其中多肽以環形、頭到尾的方式排列。三鏈抗體的 可能構象是平面的，其具有位于平面上彼此成120度角的三個結合位點。 三鏈抗體可以是單特異性、雙特異性或三特異性的。"分離的"抗體是一種已經被鑒定并且與其天然環境的成分分離和/ 或從中回收的抗體。它的天然環境的污染成分是將干擾抗體的診斷或治療 應用的物質，并且可以包括酶、激素、和其它蛋白樣或非蛋白樣溶質。因 為將不存在抗體天然環境的至少一種成分，分離的抗體包括在重組細胞內 原位的抗體。然而， 一般地，分離的抗體應該通過至少一個純化步驟制備。 與目的抗原如CD44抗原性部分"結合"的抗體是一種能夠以充足的 親和力結合所述抗原的抗體，以便所述抗體通過靶向表達所述抗原的細胞
而有效用作治療或診斷劑。在所述抗體是一種結合CD44抗原性部分的抗 體的情形中，與其它受體相反，它通常優先結合CD44抗原性部分，并且 不包括偶然發生的結合，如非特異性Fc接觸，或不包括其它抗原所常見 的與翻譯后修飾結合，并且可以是一種不與其它蛋白顯著交叉反應的抗
體。用于檢測與目的抗原結合的抗體的方法在本領域中是公知的，并且可 以包括，但不限于，如FACS、細胞ELISA和Western印跡的測定。
當用于本發明時，表述"細胞"、"細胞系"和"細胞培養物"可以互 換地使用，并且所有這樣的名稱包括后代。還應該理解，由于故意的或偶 然的突變，所有的后代在DNA內容物上可能不是精確相同的。包括在初 始轉化的細胞中篩選的具有相同功能或生物學活性的突變的后代。這將通 過使用不同名稱的上下文變得清楚。
"治療或處理"是指治療性治療和預防或預防性措施，其中目的是預 防或減緩(減輕)目的病理癥狀或病癥。需要治療的那些包括已經患有病 癥的那些.，以及傾向于患有病癥的那些，或要預防病癥的那些。因此，在 本發明中待治療的哺乳動物可以已經診斷患有病癥或可以是傾向于或易 受病癥影響的。
術語"癌癥"和"癌性的"是指或描述哺乳動物中的生理狀況，所述 生理狀況的典型特征在于失控的細胞生長或死亡。癌癥的實例包括，但不 限于，癌，淋巴瘤，胚細胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴惡性病。所述癌癥 的更具體的實例包括鱗狀細胞癌(例如，上皮鱗狀細胞癌)，肺癌，包括 小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀癌，腹膜癌，肝細胞癌，胃 的或胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質細胞
瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，直腸
37癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎臟或腎癌，前列腺 癌，陰道癌，甲狀腺癌，肝的癌癥，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。
"化療藥"是有效用于治療癌癥的化學化合物。化療藥的實例包括烷
基化試劑，如塞替哌和環磷酰胺(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安， 英丙舒凡，哌泊舒凡；吖丙啶類如苯佐替派(benzodopa),卡波醌，美妥 替哌(meturedopa),禾卩烏瑞替哌(uredopa);氮丙啶禾口 methylamelamines， 包括六甲蜜胺，曲他胺，三亞乙基磷酰胺，塞替哌 (triethylenethiophosphoramide)禾卩三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮 芥 (nitrogen mustards ) 如苯丁酸氮芥,萘氮芥 (chlornaphazine), cholophosphamide,雌莫司汀，異環磷酰胺，氮芥(mechlorethamine),鹽 酸氧氮芥，美法侖，新氮芥，苯芥膽甾醇，潑尼莫司汀，曲磷胺，烏拉莫司 汀；亞硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀， 尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins),放線菌素， authramycin,偶氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C, calicheamicin, carabicin, carnomycin，
嗜癌霉素，色霉素，放線菌素D,柔紅霉素，地托比星，6-重氮 -5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊達比星，馬塞羅 霉素，絲裂霉素，麥考酚酸，諾拉霉素，橄欖霉素，培洛霉素，potfiromydn， 嘌羅霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑霉素，鏈佐星，殺結核菌素，烏苯 美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉 酸類似物如den叩terin,甲氨喋呤，喋羅呤，三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達 拉濱，6-巰嘌呤，thiamiprine,硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱，阿扎胞苷， 6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿 苷，5-FU;雄激素諸如卡普睪酮，屈他雄酮丙酸鹽，環硫雄醇，美雄垸，睪 內酉旨；抗腎上腺藥(anti-adrenals)如氨魯米特，米托坦，曲洛司i旦；葉酸補 償物如frolinic acid;醋葡醛內酯；羥醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ; 5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil;比生群；依達曲沙 (edatraxate) ; defofamine;秋水仙胺；地吖酉昆；elformithine;依利醋銨；依 托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫 哌達醇；尼曲吖啶;噴司他丁；異丙嗪(phe匪et);吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼；PSK⑧；雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細格孢氮雜酸；三亞胺醌；2,2，,2"-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan);長春地 辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環磷酰胺；塞替哌；紫杉垸類，例如，紫 杉醇(TAXOL⑧，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,新澤西)和多西 他賽(TAXOTERE⑧，Aventis, Rhone-Poulenc Rorer， Antony,法國)；苯丁酸 氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨喋呤；鉑類似物如順鉑和卡鉬； 長春堿；鉬；依托泊苷(YP-16);異環磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春 新堿；長春瑞濱；諾維本；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；道諾霉素；氨 喋呤；適羅達；伊班膦酸鹽；CPT-11;拓撲異構酶抑制劑RFS 2000; 二氟甲 基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；esperamicins;卡培他濱；以及任何上述物質的 藥用鹽、酸或衍生物。下列物質也包含在本定義中，它們是作用調控或 抑制激素對腫瘤的作用的抗激素藥劑，諸如抗雌激素藥，包括例如他莫昔 芬，雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬， keoxifene， LY117018,奧那司酮，和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素藥諸 如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及任何上述物 質的藥用鹽、酸或者衍生物。
用于治療目的的"哺乳動物"是指分類為哺乳動物的任何動物，包括 人，小鼠，SCID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和農場動物，以及動物園、運 動或寵物動物，諸如綿羊、狗、馬、貓、牛、等等。優選地，所述哺乳動 物是人。
"寡核苷酸"是長度短的、單鏈或雙鏈的多脫氧核苷酸，其通過已知 方法化學合成(如磷酸三酯、亞磷酸酯、或亞磷酰胺化學，使用固相技術， 如在1988年5月4日公布的EP 266,032中所述的，或通過脫氧核苷H-磷 酸酯中間物，如Froehler等，樣虔薪秀f7Vz/c/. Jc/A i 仏入14:5399-5407, 1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝膠上純化它們。
按照本發明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的"人源化的"和域"嵌合 的"形式是指這樣的抗體，所述抗體包含特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球 蛋白鏈或其片段(如Fv， Fab， Fab，, F(ab，)2或抗體的其它抗原-結合亞序列)， 與原始抗體相比較，其導致人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA) 或人抗-人抗體(HAHA)反應的減少，并且所述抗體包含來源于所述非人免疫球蛋白的、對再現所需要的作用是必需的必需部分(例如， 一個或多個 CDR(S)、抗原結合區、可變結構域等)，同時保留與所述非人免疫球蛋白 相當的結合特征。對于大部分，人源化的抗體是這樣的人免疫球蛋白(受
體抗體)，其中來自該受體抗體互補決定區(CDRs)的殘基被來自非人物種
(供體抗體)CDRs的、具有需要的特異性、親和性和能力的殘基取代， 所述非人物種如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv構 架區(FR)殘基被相對應的非人FR殘基取代。此外，所述人源化的抗體可 以包括在受體抗體和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的殘基。進行 這些修飾以進一步限定和最優化抗體性能。通常，所述人源化的抗體應該 包括基本上不少于至少一個、和典型地兩個可變結構域，其中所有或基本 上所有的CDR區與非人免疫球蛋白的那些相對應，并且所有或基本上所 有的FR殘基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗體任選地還 應該包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒 定區。
"去免疫的(De-immunized)"抗體是對于給定的物種是無免疫原性的 或較少免疫原性的免疫球蛋白。去免疫可以通過抗體的結構改變實現。可 以使用本領域技術人員已知的任何去免疫技術。例如，用于使抗體去免疫 性的一種適宜的技術記述在于2000年6月15日公布的WO 00/34317中。
誘導"凋亡"的抗體是一種通過任何方式誘導程序性細胞死亡的抗體， 所述方式示例而不限于，膜聯蛋白V的結合，胱天蛋白酶活性，DNA的 片段化，細胞收縮，內質網膨脹，細胞片段化和/或膜囊泡的形成(稱為凋 亡小體)。
用于本文中時，"抗體誘導的細胞毒作用"應該理解為意指源自下列各 項的細胞毒性作用由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的 雜交瘤上清液或抗體，由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生 的分離的單克隆抗體的人源化抗體，由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC 的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，其抗原結合片段，或抗體 配體，該作用不必須與結合程度有關。
在整個說明書中，備選地，雜交瘤細胞系，以及由其產生的分離的單 克隆抗體，還通過它們的內部名稱H460-16-2(鼠科)，(h)ARH460-16-2-IgGl，
40(ch)ARH460-16-2-IgGl,或保藏命名ATCC PTA-4621指示。
用于本文中時，"抗體-配體"包括這樣的部分，所述部分表現出針對 靶抗原的至少一個表位的結合特異性，并且其可以是完整的抗體分子、抗 體片段、以及至少具有它的抗原-結合區或部分(即，抗體分子的可變部分) 的任何分子，例如，Fv分子,Fab分子,Fab'分子,F(ab')2分子，雙特異性抗 體，融合蛋白，或特異性識別和結合所述抗原的至少一個表位的任何遺傳 工程分子，所抗原是通過由名稱為ATCC PTA-4621的雜交瘤細胞系產生 的分離的單克隆抗體(ATCC PTA-4621抗原)、由以保藏號PTA-4621保藏 在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體的人源化抗體、由以保藏號 PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體、 和其抗原結合片段結合的。
用于本文中時，"減輕癌性疾病的抗體"(CDMAB)指以有益于患者的 方式，例如，通過減小腫瘤負荷或延長攜帶腫瘤的個體的存活而改善癌性 疾病過程的單克隆抗體，及其抗體-配體。
"CDMAB相關結合試劑"，最廣義理解為包括，但不僅限于，任何形 式的人或非人抗體，抗體片段，抗體配體，等，其競爭性結合至少一個 CDMAB耙表位。
"競爭性結合劑"理解為包括具有針對至少一個CDMAB靶表位的結 合親和力的任何形式的人或非人抗體、抗體片段、抗體配體等。
待治療腫瘤包括原發性腫瘤和轉移性腫瘤，以及不應性(refractory) 腫瘤。不應性腫瘤包括未能響應或對使用單獨的化療試劑、單獨的抗體、 單獨的輻射或其組合的治療有抗性的腫瘤。不應性腫瘤還包括似乎受到所 述試劑治療的抑制但在停止治療后多至5年，有時多至10年或更長復發 的腫瘤。
可以治療的腫瘤包括不血管化的，或基本尚未血管化的，以及血管化 的腫瘤。可以由此治療的實體瘤的實例包括乳腺癌、肺癌、結腸直腸癌、 胰腺癌、神經膠質瘤和淋巴瘤。所述腫瘤的一些實例包括表皮狀腫瘤，鱗 片狀腫瘤，諸如頭和頸部腫瘤，結腸直腸腫瘤，前列腺腫瘤，乳腺腫瘤， 肺腫瘤，包括小細胞和非小細胞肺腫瘤，胰腺腫瘤，甲狀腺腫瘤，卵巢腫 瘤，和肝腫瘤。其他實例包括卡波西肉瘤，CNS瘤，成神經細胞瘤，毛細血管成血管細胞瘤，腦膜瘤和腦轉移瘤，黑素瘤，胃腸和腎癌和肉瘤，橫 紋肌肉瘤，成膠質細胞瘤，優選成膠質細胞瘤多形性，和平滑肌肉瘤。 用于本文中時，"抗原結合區"意指分子識別靶抗原的部分。
用于本文中時，"競爭性抑制"意指使用常規的交互(reciprocal)抗體競 龜 |A臺fe^^口ai實n么i^^^古辛的:/iiA吝祭/er占 曰n 岀a々a at廣廠dta_k，i
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的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體(ATCC PTA-4621抗體)、由以保藏號 PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體的人源化抗體、 由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體的 嵌合抗體、和其抗原結合片段、抗體配體針對所述決定簇位點。(Bdanger L., Sylvestre C.禾口 Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures (通過競爭性禾口夾心式禾呈 序進行關于a胎蛋白的酶聯免疫測定).ClinicaChimicaActa48, 15) 用于本文中時，"靶抗原"是ATCC PTA-4621抗原或其一部分。 當用于本文時，"免疫綴合物"意指與細胞毒素、放射性試劑、細胞 因子、干擾素、靶標或報告蛋白部分、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療藥劑化 學或生物學連接的任何分子或CDMAB，如抗體。所述抗體或CDMAB可 以在分子的任何位置處與所述細胞毒素、放射性試劑、細胞因子、干擾素、 靶標或報告蛋白部分、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療藥劑連接，只要它能夠 結合其耙點。免疫綴合物的實例包括抗體毒素化學綴合物和抗體-毒素融合 蛋白。
適合于作為抗腫瘤試劑使用的放射性試劑是本領域中那些技術人員已 知的。例如，使用131I或211At。利用常規技術使這些同位素與抗體附著 (例如，Pedley等，Br. J. Cancer (英國癌癥雜志)68,69-73 (1993))。備選 地，與抗體附著的抗腫瘤試劑是激活前藥的酶。可以施用前藥，所述前藥 將保持其無活性形式直到到達腫瘤位點，當施用抗體復合物時，其在該處 轉化為其細胞毒素形式。實踐中，將抗體-酶綴合物施用于患者，并容許定 位在待治療的組織的區域內。然后，將前藥施用于患者，以致于在待治療 的組織區域內發生向細胞毒性藥物的轉化。備選地，與抗體綴合的抗腫瘤 試劑是細胞因子，諸如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)或腫瘤壞死因子 (x(TNF-a)。抗體使細胞因子靶向腫瘤，以致于細胞因子在不影響其他組織
42的條件下介導對腫瘤的損傷或破壞。利用常規重組DNA技術使細胞因子
與抗體在DNA水平融合。還可以使用干擾素。
用于本文中時，"融合蛋白"意指任何嵌合蛋白，其中抗原結合區與生 物學活性分子，例如毒素、酶、熒光蛋白、發光標記、多肽標記物、細胞 因子、干擾素、靶標或報告蛋白部分或蛋白藥物相連接。
本發明還預期本發明的CDMAB，其與靶標或報告蛋白部分相連接。 靶標部分是結合對的第一成員。抗腫瘤試劑，例如，與所述對的第二成員 綴合，并由此針對抗原結合蛋白結合的位點。所述結合對的常見實例是抗 生物素蛋白和生物素。在優選的實施方案中，生物素與本發明CDMAB的 靶抗原綴合，并由此提供關于抗腫瘤試劑的靶標或與抗生物素蛋白或鏈霉 抗生物素蛋白綴合的其他部分。備選地，生物素或另一種所述部分與本發 明的CDMAB的靶抗原連接，并且，例如，在其中產生可檢測信號的試劑 與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白綴合的診斷系統中，作為報告蛋白使 用。
產生可檢測信號的試劑有效用于體內或體外診斷目的。信號產生試劑 產生可測量的信號，該信號可以通過外部方式，通常電磁輻射測量檢測。 通常，信號產生試劑是酶或發色團，或通過熒光、磷光或化學發光而發光。 發色團包括吸收紫外或可見區的光的染料，且可以是酶催化反應的底物或 降解產物。
而且，本發明的范圍包括本發明的CDMAB在體內和體外用于研究或 診斷方法的用途，這是本領域中公認的。為了執行如本文中預期的診斷方 法，本發明還可以包括包含本發魂CDMAB的試劑盒。所述試劑盒應該有 效用于通過檢測所述CDMAB靶抗原在所述個體細胞上的過表達，而確定 個體處于某種類型的癌癥風險中。
診斷測定試劑盒
預期使用采用用于確定腫瘤存在的診斷測定試劑盒形式的按照本發明 的任何合適的CDMAB。在患者中檢測出腫瘤通常基于在獲自該患者的生 物樣品，諸如血液、血清、尿液和/或腫瘤活組織切片中存在一種或多種腫 瘤特異性抗原，例如蛋白和/或編碼該蛋白多核苷酸。所述蛋白起指示具體的腫瘤，例如結腸、乳腺、肺或前列腺腫瘤的存 在或不存在的標記的作用。還預期所述抗原應該具有檢測其他癌性腫瘤的
效用。診斷測定試劑盒中包含包括本發明的CDMAB的結合試劑、或 CDMAB相關結合試劑，容許檢測生物樣品中與該試劑結合的抗原的水平。 多核苷酸引物和探針可以用于檢測編碼腫瘤蛋白的mRNA水平，這也指 示癌癥的存在或不存在。為了使該結合測定具有診斷性，應該產生這樣的 數據，即該數據使統計學顯著水平的抗原關于正常組織中存在的抗原相關 聯，從而使得結合識別成為癌性腫瘤存在的確定診斷。預期許多形式應該 有效用于本發明的診斷測定，如本領域中那些普通技術人員所已知的，從 而使用結合試劑檢測樣品中的多肽標記。例如，如Harlow和Lane， Antibodies: A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)，第9-14章，1988中舉例說明的。還預期了 上述診斷測定形式的任意和全部組合、改變或改進。
患者中存在或不存在癌癥典型應該通過以下步驟確定(a)使獲自患 者的生物樣品與結合試劑相接觸；(b)檢測樣品中與該結合試劑相結合的 多肽的水平；和(c)比較多肽水平和預先確定的截取值。
在舉例說明的實施方案中，預期所述測定應該試劑包括使用固定在固 體支持物上的基于CDMAB的結合試劑結合和去除樣品剩余物中的多肽。 結合的多肽可以再利用含有報告基團并特異性結合該結合試劑/多肽復合 物的檢測試劑進行檢測。例證性檢測試劑可以包括特異性結合所述多肽的 基于CDMAB的結合試劑或特異性結合所述結合試劑的抗體或其他試劑， 諸如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。在備選的實施方案中，預 期可以使用競爭性測定，其中多肽用報告基團標記，并容許其在溫育結合 試劑和樣品后與固定的結合試劑結合。用固定的結合試劑指示樣品的反應 性是該樣品的成分抑制標記的多肽與結合試劑結合的程度。適合用于所述 測定中的多肽包括結合試劑對其具有結合親和力的全長腫瘤特異性蛋白 和/或其部分。
應該對診斷試劑盒提供固體支持物，其可以采用本領域中那些普通技 術人員已知的蛋白質可以與之附著的任何材料形式。合適的實例可以包括 微量滴定板中的測試孔或硝基纖維素或其他合適的膜。備選地，所述支持物可以是珠或盤，諸如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑料材料諸如聚苯乙烯或 聚氯乙烯。所述支持物還可以是磁性粒子或光纖傳感器，諸如美國專利號
5,359,681中公開的那些。
預期所述結合試劑應該利用多種本領域中那些技術人員已知的技術固 定在所述固體支持物上，所述技術詳細地記述在專利和科學文獻中。術語 "固定"指非共價結合，諸如吸附，和共價附著，其在本發明的情形中， 可以是試劑和支持物上的官能團之間的直接鍵合，或可以是通過交聯試劑 的鍵合。在優選但非限制性實施方案中，通過吸附與微量滴定板的孔或與 膜固定是優選的。吸附可以通過使結合試劑在適當緩沖液中與固體支持物 接觸一段合適的時間實現。接觸時間可以隨溫度變化，且通常應該在約1 小時到約1天的范圍內。
結合試劑與固體支持物的共價附著一般通過首先使該支持物與雙官能 試劑反應，所述雙官能試劑與該支持物和所述結合試劑上的官能團，諸如 羥基或氨基基團反應。例如，結合試劑可以利用苯醌或通過使支持物上的 乙醛基團與結合配偶體上的胺和活性氫的縮合而共價附著于具有適當聚 合物涂層的支持物。
還預期診斷測定試劑盒應該采用兩-抗體夾心式測定形式。該測定可以 通過首先使抗體，例如本文中公開的已經固定在固體支持物， 一般為微量 滴定板的孔上的CDMAB，與樣品相接觸，從而容許樣品中的多肽與固定 的抗體結合。然后，從固定的多肽-抗體復合物中除去禾結合的樣品，并添 加含有報告基團的檢測試劑(優選地，能夠結合該多肽上不同位點的二級 抗體)。然后利用對特異性報告基團合適的方法確定保持與固體支持物結 合的檢測試劑的量。
在特殊的實施方案中，預期抗體一旦如上所述固定在支持物上，則通 過使用本領域中那些普通技術人員已知的任何合適的封端劑，諸如牛血清 清蛋白或吐溫20 (Sigma Chemical Co.(西格瑪化學公司)，St Louis, Mo.) 封閉支持物上剩余的蛋白結合位點。固定的抗體然后與樣品一起溫育，并 容許多肽與抗體結合。在溫育前，可以使用合適的稀釋劑，諸如磷酸鹽緩 沖液(PBS)稀釋樣品。通常，應該將合適的接觸時間(即溫育時間)選 擇為符合足以檢測在獲自具有特異性選擇的腫瘤的個體的樣品中存在多肽的一段時間。優選地，接觸時間足以獲得在結合和未結合多肽之間平衡 時獲得的結合水平的至少約95%的結合水平。本領域中的那些普通技術人 員應該公認獲得平衡所需要的時間可以容易地通過測定一段時間內發生 的結合水平確定。
還預期未結合的樣品應該再通過用合適的緩沖液洗滌固體支持物而去 除。應該再將二級抗體，其含有報告基團，添加到固體支持物中。然后， 應該以足以檢測結合多肽的時間量，進行對檢測試劑和固定的抗體-多肽復 合物的溫育。隨后，再除去未結合的檢測試劑，并利用報告基團檢測結合 的檢測試劑。用于檢測報告基團的方法必須對所選的報告基團類型具有特 異性，例如對放射性基團具有特異性，閃爍計數或放射自顯影術通常是合 適的。可以使用分光光度法檢測染料、發光基團和熒光基團。可以利用與 不同報告基團(一般地，放射性或熒光基團或酶)偶聯的抗生物素蛋白檢 測生物素。酶報告基團通常可以利用添加底物(通常，持續一段特定的時 間)，和隨后進行該反應產物的分光光度或其它分析來檢測。
為了使用本發明的診斷測定試劑盒來確定癌癥，諸如前列腺癌的存在 或不存在，由與固體支持物保持結合的報告基團檢測的信號通常與對應于 預先確定的截取值的信號進行比較。例如，用于檢測癌癥的示例性截取值 可以是當固定的抗體與來自無癌癥的患者的樣品一起溫育時獲得的平均
信號。 一般地，認為產生高于預先確定的截取值約3標準偏差的信號的樣 品對癌癥應該是陽性的。在另一個實施方案中，按照Sackett,臨床流行病 學■ (Clinical Epidemiology) . Basic Science forClinical Medicine (臨床醫學 的基本科學知識)，Little Brown and Co.(小布朗公司),1985,第106-7頁 的方法，截取值可以通過利用接收操作曲線(Receiver Operator Curve)確 定。在該實施方案中，截取值可以由對于診斷測試結果的每個可能的截取 值的真陽性率(即靈敏性)和假陽性率(100%-特異性)對的圖表確定。 該圖表中最接近左上角的截取值(即包含最大面積的數值)是最準確的截 取值，且產生高于通過該方法確定的截取值的信號的樣品可以認為是陽性 的。備選地，截取值可以沿該圖表左移，從而最小化假陽性率，或右移， 從而最小化假陰性率。 一般地，認為產生高于通過該方法確定的截取值的 信號的樣品對癌癥是陽性的。預期能夠通過該試劑盒實現的診斷測定應該以流經(flow-through)或
條帶測試形式進行，其中結合試劑固定在膜，諸如硝基纖維素上。在流經 測試中，樣品中的多肽在樣品流經該膜時與固定的結合試劑結合。第二種 標記的結合試劑在包含該第二種結合試劑的溶液流經該膜時，再與結合試 劑-多肽復合物結合。然后如上所述檢測結合的第二種結合試劑。在條帶測 試形式中，將膜的與結合試劑結合的一個末端浸沒在含有樣品的溶液中。 樣品沿該膜移動經過含有第二種結合試劑的區域并到達固定的結合試劑 的區域。第二種結合試劑在固定的抗體區域內的濃度表示癌癥的存在。在 結合位點產生一種可以通過視覺閱讀的模式，諸如線，將指示陽性測試。 缺乏這種模式表示陰性結果。
一般地，選擇固定在膜上的結合試劑的量， 從而在生物樣品含有足以在采用上述形式的兩-抗體夾心式測定中產生陽 性信號的多肽水平時，產生視覺可辨的模式。在該診斷測試中優選使用的 結合試劑是本發明公開的抗體、其抗原結合片段、和如本文中所述的任何
CDMAB相關結合試劑。固定在膜上的抗體的量應該是有效產生診斷測定 的任意量，且可以在約25納克-約l微克的范圍內。典型地，所述測試可 以對非常小量的生物樣品進行。
另外，本發明的CDMAB可以用于實驗室研究，這歸因于其識別其靶
抗原的能力。
為了使本文中所述的發明可以得到更完整的理解，提供下述說明。 本發明提供特異性識別和結合ATCC PTA-4621抗原的CDMAB (即， ATCC PTA-4621 CDMAB，由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤 產生的分離的單克隆抗體的人源化抗體，由以保藏號PTA-4621保藏在 ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，其抗原結合片段， 或抗體配體)。
由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗 體的CDMAB可以采用任意形式，條件是其具有這樣的抗原結合區，所述 抗原結合區競爭抑制由雜交瘤ATCC PTA-4621產生的分離的單克隆抗體 與其靶抗原的免疫特異性結合。因此，與ATCC PTA-4621抗體具有相同 結合特異性的任何重組蛋白(例如，融合蛋白，其中抗體與第二蛋白諸如 淋巴因子或腫瘤抑制生長因子組合)落入本發明的范圍內。在本發明的一個實施方案中，CDMAB是ATCCPTA-4621抗體。
在其他實施方案中，CDMAB是抗原結合片段，其可以是Fv分子(諸 如單鏈Fv分子)，Fab分子，Fab'分子，F(ab')2分子，具有ATCC PTA-4621 抗體的抗原結合區的融合蛋白、雙特異性抗體、雜種抗體或任意重組分子。 本發明的CDMAB針對ATCC PTA-4621單克隆抗體所針對的表位。
本發明的CDMAB可以被修飾，即通過分子中的氨基酸修飾，從而產 生衍生物分子。化學修飾也是可能的。通過直接的突變的修飾、親和力成 熟法、噬菌體展示或鏈改組也可以是可能。
親和力和特異性可以通過突變CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)殘基 和篩選具有理想特征的抗原結合位點得到改進或提高(例如，Yang等，J. Mol.Biol.(分子生物學雜志)，(1995)254:392-403)。 一種方法是隨機化各 個殘基或殘基的組合，從而在一群另外相同的抗原結合位點中，發現2-20 個氨基酸的子集處于特定的位置。備選地，可以通過傾向差錯PCR法誘 導一定范圍的殘基突變(例如，Hawkins等，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)， (1992)226:889-96)。在另一個實例中，包含重鏈和輕鏈可變區基因的噬菌 體展示載體可以在大腸桿菌(E 的突變菌株中增殖(例如，Low等，J.
Mol. Biol.(分子生物學雜志)，(1996) 250:359-68)。這些誘變方法是本領 域中技術人員已知的許多方法的舉例。
增加本發明抗體親和力的另一種方式是進行鏈改組，其中重鏈或輕鏈 與其他重鏈或輕鏈隨機配對，從而制備具有更高親和力的抗體。抗體的不 同CDR也可以與其他抗體中的相應CDR進行改組。
衍生的分子應該保留所述多肽的功能性質，即，具有所述取代的分子 仍應該允許該多肽與IDAC 051206-01抗原或其部分的結合。
這些氨基酸取代包括，但不必然限于，本領域中己知的，如"保守的" 氨基酸取代。
例如，蛋白質化學的成熟理論是，稱為"保守的氨基酸置換"的某些 氨基酸取代，可以常常可以在蛋白中，在不改變該蛋白構象或功能的條件 下制備。
所述改變包括將異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、和亮氨酸(L)中的任一種 取代為任何其他這些疏水性氨基酸；天冬氨酸(D)取代為谷氨酸(E)且反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代為天冬酰胺(N)且反之亦然；和絲氨酸(S)取 代為蘇氨酸(T)且反之亦然。其他取代也可以認為是保守的，這取決于具 體氨基酸的環境或其在蛋白質三維結構中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙 氨酸(A)通常可以互換，丙氨酸和纈氨酸(V)也同樣可以互換。相對疏水 性的甲硫氨酸(M)，通常可以與亮氨酸和異亮氨酸互換，且有時與纈氨酸 互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)通常在這樣的位置中互換，在所述位置中 氨基酸殘基的顯著特性是其所帶的電荷，且改變這兩種氨基酸殘基的pK 并不重要。還有其他改變可以在特定的環境中被認為是"保守的"。
實施例1
人肝腫瘤組織染色
進行IHC研究進一步評估H460-16-2與人肝腫瘤組織的結合。以前進 行IHC最優化研究，從而確定進一步實驗的條件。H460-16-2單克隆抗體 如以前在S.N. 10/603,000中公開那樣進行生產和純化。
抗體與49份人肝腫瘤和9份正常肝組織的結合利用人的、肝正常和腫 瘤組織微陣列進行(Imgenex，圣地亞哥，CA)。提供關于每名患者的下列信 息年齡、性別、器官和診斷。組織切片通過在58°C烤箱中干燥1小時 去石蠟，并通過浸沒在科普林缸(Coplinjars)中的二甲苯中5次、持續4 分鐘脫蠟。在經過一系列分級乙醇洗滌(100%-75%)處理后，在水中對 切片進行再水合。將載玻片浸沒在IO mM檸檬酸緩沖液pH6(Dako，多倫 多，安大略省)中，然后在高、中、和低能量設置下各微波加熱5分鐘，并 最后浸沒在冷PBS中。然后，將載玻片浸沒在3%過氧化氫溶液中6分鐘， 用PBS洗滌3次，每次5分鐘，干燥，與通用封閉溶液(Dako，多倫多，安 大略省) 一起在室溫下溫育5分鐘。將H460-16-2，即抗-AFP (al胎蛋白； 克隆AFP-ll， Abeam, Cambridge, MA)或同種型對照抗體(針對黑曲霉 (/^^rg/〃w 葡萄糖氧化酶，即一種在哺乳動物組織中既不存在也
不可誘導的酶；Dako,多倫多，安大略省)稀釋在抗體稀釋緩沖液(Dako, 多倫多，安大略省)中，達到其工作濃度(除對抗-PSMA稀釋到10微克/mL 外，使每種抗體均為5微克/mL)，并在室溫下溫育1小時。用PBS洗滌 載玻片3次，每次5分鐘。 一抗的免疫反應性利用與提供的HRP綴合的二抗(Dako Envision System (Dako預見系統)，多倫多；安大略省)在室溫 下檢測/顯現30分鐘。在這個步驟后，用PBS洗滌載玻片3次，每次5分 鐘，并通過添加DAB(3,3，-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(3,3，-diaminobenzidine tetmhydrachloride)， Dako,多倫多，安大略省)生色團底物溶液形成顏色 反應，從而在室溫下進行免疫過氧化物酶染色10分鐘。在自來水中洗滌 載玻片終止生色反應。在用Meyer's蘇木精(Meyer's Hematoxylin) (Sigma Diagnostics (西格瑪診斷學)，Oakville， ON)復染色后，載玻片用分級乙醇
(75-100%)脫水并用二甲苯清洗。利用封片劑(Dako Fammount,多倫多， 安大略省)對該載玻片進行蓋玻片封片。利用Axiovert 200 (Ziess Canada, 多倫多，ON)對載玻片進行顯微鏡檢查，并利用北方日食成像軟件
(Northern Eclipse Imaging Software) (Mississauga， ON)獲得和保存數字圖 像。通過組織病理學說對結果進行閱讀、打分和解釋。
如圖1中所公開地，H460-16-2抗體顯示出與21/49 (43%)的所測試的 肝癌，包括11/37 (30%)原發性，7/8(88%)轉移性肝細胞癌，1/2 (50%)原發 性和2/2(100%)轉移性膽管癌的結合。與早期I和II期相比，該抗體顯示 出與晚期腫瘤III和IV期顯著更高的結合(p = 0.03) [I期，0/2 (0%); II期， 2/17 (12%); III期，8/16 (50%)和IV期，6/8 (75%)]。 H460-16-2特異于腫瘤 細胞并滲透炎性細胞。細胞定位主要在膜。 一些腫瘤還表現出擴散的細胞 質染色模式。抗體與9/9的非-贅生性肝組織結合(圖2)。然而，該結合 僅限于血竇細胞并滲透淋巴細胞H460-16-2抗原似乎特異性表達在晚期 肝腫瘤組織上。H460-16-2因此具有作為治療肝癌的治療藥物的潛力。
因此，H460-16-2抗原似乎表達在肝腫瘤組織上，其具有對轉移性和 晚期肝腫瘤組的結合優選性。H460-16-2因此具有作為關于肝細胞癌的診 斷試劑，和作為治療肝癌的治療藥物的效用。
實施例2
CD44與多種HCC細胞系的轉移潛力的相關性
為了進一步在體外評估該相關性，通過利用(ch)ARH460-16-2-IgGl抗 體的流式細胞計數法，評估6種具有不同轉移潛力的肝細胞癌(HCC)細 胞系(Hep3B (American Type Culture Collection(美國典型培養物保藏中心)，Manassas, VA), Huh-7 (由H. Nakabayashi十専士饋貝曾，Hokkaido University School of Medicine (北海道大學醫學院),札幌，日本)，PLC (Japanese Cancer Research Bank (日本癌癥研究文庫)，東京，日本)，MHCC-97L, MHCC-97H禾tl HCCLM3 (Liver Cancer Institute (肝癌研究所)，Fudan University (復旦大學)，上海，中國))的CD44表達。為了檢測CD44在多 種HCC細胞系中的表達，用(ch)ARH460-16-2-IgGl或同種型對照抗體(10 微克/mL)對細胞染色1小時，并用合適的二抗對細胞染色30分鐘，并通 過FACS分析。
通過流式細胞計數法，發現當與原發性非轉移細胞系(Hep3B, Huh-7 和PLC)相比日寸，CD44的表達水平在轉移性HCC細胞系(MHCC-97L, HCCLM3和MHCC-97H)中更高(圖3)。
實施例3
HCCLM3細胞的同位HCC腫瘤模型 細胞的熒光素酶標記
為了進一步在體內評估該相關性，在同位HCC腫瘤模型中測試 (ch)ARH460-16-2-IgGl。為了螢光素酶標記HCCLM3 (—種轉移性HCC細 胞系，Yang等，Cancer Genet. Cytogenet.(癌癥遺傳性和細胞遺傳學) 158(2):180-183 2005)細胞，利用以前所述的方法(Cheung等，Cancer Res.(癌 癥研究)66(8):4357-4367 2006)，構建攜帶螢光素酶基因的慢病毒載體， 并將其轉染到細胞中。穩定轉染子由多于20個陽性克隆(其是利用濃度 為2微克/mL的殺稻瘟菌素選擇的)的集合中產生。
動物CCD實驗
將一百萬個HCCLM3螢光素酶標記的細胞皮下注射到裸鼠的右脅， 然后每日觀察其腫瘤發展的征兆。 一旦腫瘤達到直徑l-1.5cm，則摘除腫 瘤，并切成約l-2mm的立方體，隨后將其植入到5周齡雄性裸鼠的左肝 葉中。10天后，將裸鼠隨機分成4組，并用同種型對照或2、 10或20 mg/kg (ch)ARH460-16-2-IgGl處理。用稀釋劑稀釋儲備濃縮液后，將體積為200 微升的(ch)ARH460-16-2-IgGl測試抗體腹膜內施用于各組，所述稀釋劑含有2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04。然后， 以相同的方式每周施用抗體2次，總共12劑量，直到植入后第45天。
小鼠在腫瘤接種后第7天和第45天進行成像。依照香港大學教學和研 究使用活體動物委員會，用比例為4:1的氯胺酮-賽拉嗪混合物麻醉小鼠。 利用Xenogen IVIS 100冷卻的CCD照相機(Xenogen,新澤西，美國)進行成 像。在成像前15分鐘，用200微升15mg/mL的D-螢光素腹膜內注射小鼠， 其后，將它們置于不透光的室中。獲得灰度色標參考圖像，其后捕獲生物 發光圖像。捕獲時間范圍是3秒-l分鐘。顯示的圖像是發射光假圖像，以 光子/s/cm2/立體弧度為單位，其重疊在動物的灰度色標照片上。
(ch)ARH460-16-2-IgGl在人HCC的成熟模型中顯著減小腫瘤負荷(圖 4)。腫瘤植入后第45天時，(ch)ARH460-16-2-IgGl以劑量2、 10和20 mg/kg 分別將原發性肝腫瘤信號由37.6E+7士0.17減至9E+7±0.72， 2.3 E+7± 0.52 禾口0.1E+7土0.5 (圖5)。還對來自不同組的代表性原發腫瘤照相(圖6)。 在研究過程中，這兩組之間不存在顯著的平均體重差異。
(ch)ARH460-16-2-IgGl在人HCC的成熟同位模型中顯著抑制肝內和 肺轉移。治療組和對照組中具有肺和肝內轉移的小鼠數量顯示在圖7中。 (ch)ARH460-16-2-IgGl以劑量2 mg/kg顯著抑制肝內轉移，從(5/5) 100% 降至(2/5) 40%。 (ch)ARH460-16-2-IgGl也以劑量2 mg/kg顯著抑制肺轉 移，從(5/5)100%降至(0/5)0% (圖7)。除肝和肺轉移外，對照組還表現出 腸(4/5)和泌尿器官(3/5)的轉移。
總之，(ch)ARH460-16-2-IgGl在該成熟的人同位HCC腫瘤模型中， 是充分耐受的，減小腫瘤負荷和肝內和肺轉移。
大量的證據顯示鼠科和嵌合H460-16-2通過與在肝癌上表達的CD44 上存在的表位連接而介導抗癌效應。已經顯示出在轉移性對比原發性人肝 癌細胞系中觀察到更高的CD44表達。還顯示出嵌合H460-16-2在體內減 小腫瘤負荷和人肝癌轉移的可能性。因此，嵌合H460-16-2具有診斷和治 療肝癌的治療潛力，所述肝癌廣義理解為包括由肝細胞產生的任何原發性 或轉移性腫瘤位點。
本說明書中提到的所有專利和出版物均表示本發明所屬領域中那些技術人員的水平。以與將各篇出版物通過參考具體和分別引入本文中相同的 程度將所有專利和出版物通過參考弓!入本文。
應該理解盡管舉例說明了本發明的某些形式，但是其不僅限于本文中 所述和所示部分的具體形式或安排。對于本領域中的那些技術人員清楚的 是，在不偏離本發明范圍的條件下可以進行多種變化，且不認為本發明僅 限于說明書中所示和所述的內容。本領域中的技術人員應該容易理解，本 發明充分適合于執行目的并獲得提到的結果和優勢，以及其中固有的那 些。本文中所述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物學相關化合物、方法、 程序和技術是當前優選實施方案的代表，其意欲示范而非意欲限制范圍。 其中的變化和其他用途是本領域中那些技術人員可以想到的，其包含在本 發明的精神內，且由所附權利要求的范圍限定。盡管聯系具體的優選實施 方案描述了本發明，但是應該理解，所要求的發明不應該不適當地僅限于 這些具體的實施方案。實際上，所述執行本發明模式的多種改進對本領域
中的那些技術人員是顯而易見的，其意欲屬于以下權利要求的范圍。ATCC_
10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209.電話703-365-2700.傳真:703-365-2745
國際微生物保藏組織以專利程序為目的的布達佩斯條約
鄉表搭
按照細則Rule 7.3發布原始保藏情形中的收據和 按照細則Rule 10發布的存活證明(譯文)
致(保藏人或律師的名稱和地址) ，里烏斯研究公司
律師:Jena de Sousa-Hitzler 55 York Street 16th Floor
多倫多，安大略省 加拿大，M5J 1R7
保藏代表阿里烏斯研究公司
保藏人給予的鑒定參考 專利保藏命名
小鼠雜交瘤H460-16-2 PTA-4621 小鼠雜交瘤H460-22-I PTA-4622 小鼠雜交瘤7BD1-60 PTA-4623
該保藏物伴隨_科學描述 一以上指出的提議的分類描述。該保藏物于2002年9月4日由本國 際保藏機構接收，并己被接受。
按照您的要求1我們將在30年中通知您關于該品系的請求。
如果簽署布達佩斯條約的專利局確認其接收的權利，或如果引用該品系的美國專利得到授權，該 品系將成為可以獲得的，且ATCC在美國專利和商標局或保藏人的指示下釋放該品系。
如果該培養物在保藏有效期內死亡或被破壞，您將負責用相同的活培養物替換它們。
該品系將從保藏日期開始被維持至少30年，或最近一次要求樣品后5年，二者選較長的時期。美 國和許多其他國家簽署布達佩斯條約。
以t引用的培養物的存活于2002年9月6日檢測。在該日期時，該培養物是存活的。 國際保藏機構美國典型培養物保藏中心，Manassas, VA20U0-2209美國。 有權代表ATCC的人的簽字
_ 日期2002年10月9曰
Marie Harris,專利專家，ATCC專利保藏
cc: Ferris Lander先生 (參考目錄或案件號2056.009和美國系列號09/727361)
權利要求
1.治療原發性人腫瘤部位和轉移性部位的方法，其中所述原發性人腫瘤或轉移瘤表達抗原的至少一個表位，所述抗原特異性結合由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC中的克隆產生的分離的單克隆抗體或其CDMAB，其特征在于，競爭抑制所述分離的單克隆抗體或其CDMAB與其靶抗原結合的能力，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效導致所述哺乳動物腫瘤負荷減小的量的所述分離的單克隆抗體或其所述的CDMAB。
2. 權利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB與細胞毒性部分綴合。
3. 權利要求1的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。
4. 權利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。
5. 權利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導抗體依賴性細胞毒性。
6. 權利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體或其CDMAB的人源化抗體。
7. 權利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體或其CDMAB的嵌合抗體。
8. 在哺乳動物中治療易受抗體誘導的細胞毒性影響的原發性人腫瘤部位和轉移性部位的方法，其中所述原發性人腫瘤或轉移瘤表達抗原的至少一個表位，所述抗原特異性結合由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC中的克隆產生的分離的單克隆抗體或其CDMAB，其特征在于，競爭抑制所述分離的單克隆抗體或其CDMAB與其靶抗原結合的能力，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效導致所述哺乳動物腫瘤負荷減小的量的所述分離的單克隆抗體或其所述的CDMAB。
9. 權利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB與細胞毒性部分綴合。
10. 權利要求8的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。
11. 權利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。
12. 權利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導抗體依賴性細胞毒性。
13. 權利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體或其CDMAB的人源化抗體。
14. 權利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體或其CDMAB的嵌合抗體。
15. 用于治療表達人CD44抗原的一個或多個表位的人癌性腫瘤的方法，所述人CD44抗原與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細胞系H460-16-2產生的分離的單克隆抗體特異性結合，所述方法包括向患有所述人癌癥的個體施用至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述分離的單克隆抗體或其CDMAB識別與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細胞系H460-16-2產生的分離的單克隆抗體所識別的相同的一個或多個表位；其中所述一個或多個表位的結合導致腫瘤負荷的減小。
16. 用于治療表達人CD44抗原的一個或多個表位的人癌性腫瘤的方法，所述人CD44抗原與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細胞系H460-16-2產生的分離的單克隆抗體特異性結合，所述方法包括向患有所述人癌癥的個體施用至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述分離的單克隆抗體或其CDMAB識別與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細胞系H460-16-2產生的分離的單克隆抗體所識別的那些相同的一個或多個表位；其中所述施用導致腫瘤負荷的減小。
17. 用于確定選自人癌性腫瘤的組織樣品中存在癌細胞的結合測定法，所述癌細胞表達人CD44抗原的一個或多個表位，所述人CD44抗原與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細胞系H460-16-2產生的分離的單克隆抗體特異性結合，所述方法包括提供至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述分離的單克隆抗體或其CDMAB識別與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細胞系H460-16-2產生的分離的單克隆抗體所識別的那些相同的一個或多個表位；使所述至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述人組織樣品相接觸；和確定所述至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述組織樣品的幺士A^口 1=1 ;由此指示所述組織樣品中存在所述癌細胞。
18. 權利要求1的方法，其中所述原發性人腫瘤部位和/或轉移性部位由肝細胞產生。
19. 權利要求8的方法，其中所述原發性人腫瘤部位和/或轉移性部位由肝細胞產生。
20. 權利要求15的方法，其中所述人癌性腫瘤由肝細胞產生。
21. 權利要求16的方法，其中所述人癌性腫瘤由肝細胞產生。
22. 權利要求17的方法，其中所述人癌性腫瘤由肝細胞產生。
23. 用于檢測人癌性腫瘤存在的測定試劑盒，其中所述人癌性腫瘤表達抗原的至少一個表位，所述抗原特異性結合由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC中的克隆產生的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB的特征在于，競爭抑制所述單克隆抗體與其靶抗原結合的能力，所述試劑盒包括由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC中的克隆產生的分離的單克隆抗體或其CDMAB，和用于檢測所述單克隆抗體或其CDMAB是否結合多肽的工具，所述多肽以特定截取值水平的存在對所述人癌性腫瘤的存在具有診斷性。
全文摘要
本發明涉及癌性疾病的診斷和治療，具體涉及原發性和轉移性人腫瘤細胞的細胞毒性的調控；且更具體涉及分離的單克隆抗體或其減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)，任選以與一種或多種化療劑組合的方式，作為用于在所述人腫瘤，例如任何由肝細胞產生的原發性或轉移性腫瘤部位中起始細胞毒性應答的方式的應用。本發明還涉及利用本發明CDMAB的結合測定法。
文檔編號A61K39/395GK101663049SQ200880007668
公開日2010年3月3日 申請日期2008年3月10日 優先權日2007年3月9日
發明者戴維·S·F·揚, 特倫斯·健華·李, 范尚達, 達阿德·薩伊格, 龍尼·東平·潘 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司