多聚體綴合物的制作方法

專利名稱：多聚體綴合物的制作方法
多聚體綴合物
本發明涉及一種多聚體試劑和由該多聚體試劑和生物活性試劑形成的 多聚體綴合物。所述多聚體綴合物與未修飾的生物試劑相比，具有較長的 體內壽命和提高的親和力。本發明還涉及包含所述綴合物的藥物或診斷組 合物，及其生產方法。本發明另外提供所述綴合物用于檢測、確定、分開 和/或分離特異性結合配偶體以及用于診斷、預防和治療其中直接或間接涉 及所述特異性結合配偶體的疾病的用途。
背景技術：
在過去的幾十年中，作為應用于工業和科學的藥物物質或生物技術產 品的生物藥物的開發已經獲得迅速進展。已經確定、開發、或已經市場銷 售了許多選自肽、蛋白質、核酸或小分子類型的生物活性試劑。
治療法開發的主要商業興趣包括生長因子及其受體如TNF、 VEGF或 EGF。此外，具有抗原結合活性的生物活性試劑，如抗體、抗體片段、抗 體樣分子、和支架蛋白己經獲得了顯著實用性。
多克隆抗體的生產普遍己知。詳細流程可以在下列文獻中發現例如， Green等，多克隆抗血清的生產(Production of Polyclonal Antisera)，在免瘦 化^"^"^^(/mwwwoc/7em/ca//Votoco/力中(Manson， 編輯),第1-5頁(Human 出版社(Humana Press) 1992)以及Coligan等，兔、大鼠、小鼠和倉鼠中的 多克隆抗血清生產(Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters),在觀/fj^疫學》^"徵CM;rew/ /VotocoAs /wwwno/ogy)中,第 2.4.1部分(1992)。另外，幾種關于純化和濃縮多克隆抗體以及單克隆抗 體的技術是熟知的(Coligan等，第9單元，觀/f^疫學流薦(C鮮^ Pratoco/s/" 7mmw7o/ogv)， Wiley Interscience， 1994)。
單克隆抗體的生產也是普通已知的。實例包括雜交瘤方法(Kohler和 Milstein， 1975,,256:495-497, Coligan等.，第2.5.1 - 2.6.7部 分；禾卩Harlow等.，^"J^皇^^(J"^)oWeiv爿丄a60rato^y7Wi3m/a/),第726頁(Cold Spring Harbor出版社(Cold Spring Harbor Pub.)1988).)、三體 瘤(trioma)技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等.，1983，今日免疫學 (Immunology Today) 4:72)，以及用于生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技 術(Cole,等.，1985，在單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中，Alan R. Liss, Inc.,第77-96頁)。
盡管由抗體提供的成功和可能性，但是某些缺點可以限制實際應用。 因而，問題在于以充分的量提供它們功能性抗體的生產在真核細胞培養 系統中進行-特別高成本的方法。此外，分別由于其大尺寸和其在血清中的 長的保留時間(慢的血液清除)的抗體分子的低的組織滲透性妨礙許多治療
應用。盡管較小的抗體片段諸如scFv或Fab片段(參見以上)可以在細菌中 制備并由此基本處于較低的成本，但是該重組生產的收率低于理想水平， 這歸因于它們不利的折疊特性和需要形成若干二硫鍵。而且，重組抗體片 段與親本抗體相比，通常不太穩定，并顯示較低的結合活性。
為了規避所述限制，試圖提供抗體結合的原理-即通過位于保守蛋白支 架上的高變表面-暴露區-與其它蛋白的結合(Skerra, 2000)。這意味著基本 可變環改變，從而產生人工結合性質。為了該目的，通常天然結合蛋白， 諸如脂籠蛋白(Beste等.，1999)或纖連蛋白III型結構域(Koide等.，1998)已 經被用作以類似于來自柔性"環"結構的抗體的方式形成結合位點的起始 點，所述柔性"環"結構的修飾容許識別不同于天然配體的配體。
除DNA衍生的結合分子即所謂的適體外，抗體的另一個備選方案可 以是選自由"泛蛋白-樣蛋白"的蛋白超家族的蛋白組成的組中的結合分子， 具體地，具有泛蛋白-樣折疊基序的那些，以及其各自具有泛蛋白-樣折疊 基序的片段或融合蛋白。WO2004/106368涉及該"泛蛋白-樣蛋白"的超 家族的修飾蛋白，即具有泛蛋白-樣折疊的蛋白。作為所述修飾的結果，該 蛋白具有先前不存在的關于預定結合配偶體的結合親和性。也通過參考將 WO2004/106368的內容引入本文。
對于支架衍生的結合蛋白，有效的是，由于在蛋白表面上形成鄰近區 域的那些氨基酸的修飾，所述結合蛋白在該蛋白的至少一個表面-暴露區域 中優選具有先前不存在的關于預定結合配偶體的結合親和性，同時維持原 始折疊基序。總之，證明的是，抗體或適體的可能備選方案因而是具有抗體樣結合 行為的--組蛋白。
然而，仍存在關于抗體、抗體片段、和抗體樣分子諸如支架蛋白治療 用途的主要限制，原因在于其與天然人抗體相比的快速腎排泄、或弱溶解 性、或免疫原性、或降低的結合親和性和/或親和力。
由于該原因，進行了許多嘗試，以改進所述常規具有遠低于50,000道 爾頓的分子量的抗原結合蛋白的藥理學性質。綜述出版在自然生物技術 (Nature Biotechnology),第21巻，第4號，2006: 1126-36或自然綜述免疫 學(Nature Reviews Immunology),第6巻，2006: 343 -357中。
PEG化(PEGylation)，即聚(乙二醇)(即PEG)與生物活性試劑的共價附 著，已經應用于許多蛋白和抗體片段中，從而降低其免疫原性并增加其在 血漿中的循環時間0^i^生激/f法^^i/絲藥激(C47VC五i S/OT77EW戶r & i /lD/0尸/^i M4C五LT/C4丄》，第"泰第4號，2W6: 2S5-3W」。然而， 在許多情形中，PEG化通過雙阻斷機理(dual blocking mechanism)導致減小 的靶締合率(分7^"齊辨Afo/尸/zarmaco"，第68巻，2005: 1439-1454)。 Chapman, AP提供了關于PEG化對多種抗體或抗體片段的不同效果的詳 細綜述(觀/f J ^^逮送《貢^^(^Aa"cedDrag De"veo; Aev^w」，第54巻，2002: 531-545)。
另一種用于增加抗體樣片段的半衰期和親和力的方法是兩種以上的所 述制劑通過引入分子間二硫鍵、肽連接體或化學交聯劑的多聚化。與單體 Fab相比，己經對二-和三聚'Fab片段示范了關于化學交聯重組抗體片段的 改進的腫瘤靶向(targeting)。然而，Fab片段的半衰期不能通過該方法改善 (癌癥研究(Cancer Res.)(1994); 54 (23):6176-85)。
多聚化和PEG化均代表調整治療抗體的藥物動力學性質的有用策略， 且它們的組合應用可以另外改進腫瘤靶向(生物化學雜志(JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)第281巻，第46號，第35186—35201頁，2006 年11月17日)。然而，隨后的抗原結合試劑的交聯和PEG化過程是復雜 的，且因此具有某些關于收率和成本的缺點。
因此，嘗試在一種多聚體試劑中組合多聚化和PEG化。關于這方面， 公開了若干方法。
8US 2003/0211078涉及結合生物分子的新型制藥用組合物及其使用方 法，所述組合物具有改進的循環半衰期，增加的親和力，增加的親和性， 或多功能性。公開了假-抗體，其包括與至少兩個靶-結合部分共價偶聯的 有機部分，其中所述靶-結合部分選自由與特異性靶向的生物分子結合的蛋 白、肽、肽模擬物(peptidomimetic)、禾口非-肽分子組成的組。這種假-抗體 構建體(constmct)的實例顯示出具有若干靶結合分子的多聚體結構，其通過 一個單一的PEG部分連接。
WO03/093346涉及具有復雜支化結構的高分子量多官能聚乙二醇衍 生物。由合成方案1和2以及WO03/093346的權利要求1顯而易見，這 種分子的核結構通過將活化的PEG與雜-三-官能分子諸如2-氨基-l,3-丙二 醇或1,3-二氨基-2-丙醇反應而產生。這樣，所述多官能聚乙二醇衍生物的 應用受到限制。
由US2005/0175620已知所謂的價平臺分子(valency platform molecules)
和其制備方法，所述價平臺分子包括高分子量聚乙二醇部分以及其具有生 物活性分子的綴合物。高分子量聚乙二醇部分具有，例如，大于22,000 道爾頓，例如，至少40,000道爾頓的分子量。在一個實施方案中，提供包 括價平臺分子的組合物，其中所述分子具有小于約1.2的多分散性。還提 供了價平臺分子和生物活性分子如糖、聚(糖)、氨基酸、聚(氨基酸)、核酸 或脂質的綴合物。因此，該引用僅描述了用于延長較低分子量的生物活性 試劑的半衰期的高分子PEG試劑。然而，.這種高分子PEG試劑不適合于 增加生物活性結合分子如抗體或抗體樣蛋白的親和力。
WO2005/061005描述了支化分子支架，其能夠將兩個聚合物殘基(例如 源自聚乙二醇)連接到2、 3或4個源自生物活性分子(例如，來自完整抗體 或來自其功能活性片段或衍生物)的殘基，后者經由水解穩定鍵附著到所述 支架。
WO03049684提供了包括與至少2個靶-結合部分共價偶聯的有機部分 的假-抗體，其中所述靶-結合部分選自由與特異性靶向的生物分子結合的 蛋白、肽、肽模擬物、和非肽分子組成的組。所述假-抗體可以在體外、原 位和/或體內影響特異性配體。
公開了一些多聚體試劑利用氨基酸諸如賴氨酸殘基作為支化單元。Galande, A.K.等利用多抗原肽(MAP)體系作為核支化單元制備了多聚體成 像探針(,學眾學^^志C/ M^. C7zem人第49巻，2006: 4715-4720)。這種多 聚體試劑的應用局限于特殊應用。Berna, M.等通過使多賴氨酸殘基與PEG 反應制備了單分散的PEG-樹枝狀大分子(Dendrons)(全激大分7 (5z'omflcramo/ecw/e^，第7巻，第1號，2006: 146-153)。然而，隨著賴氨酸 殘基數量的增多，肽鍵數量增多。這些肽鍵可能易于被肽酶水解并且進而 被免疫系統識別，由此產生不理想的副作用。此外，氨基酸和肽的制備通 常涉及微生物生產過程。因此，那些原料具有被微生物物質諸如毒素污染 的風險。
基于PEG化的聚酰胺型胺類(PAMAM)的多聚體試劑由Yang， H.和 Lopina, S.T.公幵(生激,學^W,^ 染志A'omW. / 饑々，第76 巻，第2號，2006:398-407)。 PAMAM常規具有超過30個游離氨基并因此 僅用于大量生物活性分子的多聚化。此外，幾乎不可能獲得具有用于基于 PAMAM的生物活性分子的附著位點的規定數量的均勻質量。
公開了許多多聚體同官能(homofunctional)PEG分子，其基于多元醇作 為中心核單位，諸如甘油或季戊四醇。這種多聚體同官能PEG分子通過 威兼遜(Williamson)醚合成或通過中心單元的羥基的乙基氧化制備。這兩種 合成策略均導致PEG和中心支化部分之間的醚鍵。相關專利引用如下
WO03/033028要求保護了一種包含非-蛋白聚合物如PEG的分子，其 具有至少3個與其連接的蛋白。中心非-蛋白聚合物的結構基于如實施例1 中公開的聚甘油(Shearwater聚合物公司(Shearwater Polymers Inc.))。關于 該非-蛋白聚合物的結構細節，我們參考WO01/62827。
Shearwater公司的WO01/62827公開了直接結合到N-馬來酰亞胺基部 分的氮的同官能多聚體非-肽聚合物。支化單元選自由甘油、甘油低聚物、 季戊四醇、山梨醇、和賴氨酸組成的組。后者僅適合于制備二-或三價多聚 體試劑。所有其它的支化單元需要以上提到的反應并以醚鍵結束，如用于 制備4-臂10kDaPEG馬來酰亞胺的WO01/62827的實施例4中所示的。
W095/25763公開了利用季戊四醇作為中心支化單元、通過威兼遜醚 合成制備的樹枝狀大分子(dentrimeric)-型的大分子。這種合成的收率相對 低，這使得該方法不太具有商業應用的吸引力。Stein等公開了通過使用來自Shearwater聚合物的8臂支化氨基-PEG 的多-肽綴合物的制備(f激綴合激眾辨^'oco"y"ga&C72渭.)第14巻，第l 號，2003: 86-92)。后者通過聚甘油的乙氧基化制備(關于細節，參見 Shearwater產品目錄，此外我們參考WO01/62827)。
之前引用的關于基于多元醇的多聚體試劑的公開內容均具有顯著的由 結構確定的缺點
a) 威兼遜醚合成導致基本上均勻的多聚體試劑，然而，這種反應的收 率非常低并使得該方法不具商業應用的吸引力。
b) 乙氧基化導致高收率的最終產物，然而，由于多聚化過程，由此產 生的多聚體試劑常規顯示出不利的高度質量變化，并且不可以以規定的低 分子量獲得。
盡管上述成功，理論上，4個生物結合分子的多聚化可以通過利用四 官能PEG獲得，這不是實踐選項，因為適合于制藥應用的均勻的四官能 化PEG不易獲得(免疫學方法雜志(J Immunol. Methods)2006第310巻 (1-2): 100-16)。
總之，仍存在對具有四個或更多附著位點的多聚體試劑的巨大需求， 所述多聚體試劑具有均勻的性質，可變的連接體長度、和規定的反應基數 量，此外能夠增加溶解性，調節分子量，以及改進綴合物與其生物活性分 子的親和力。
發明概述
因此，本發明的一個目的是提供一種多聚體結合試劑和由其獲得的多 聚體綴合物，其具有改進的體內性質，例如，減小的腎排除，并且其與單 體結合分子相比導致減少的體內所述綴合物劑量。本發明的另一個目的是 提供一種多聚體結合試劑，其包含顯示出與單體結合分子的親和力相比更 高親和力的綴合物。此外， 一個目的是提供生產那些試劑和構建體的方法， 以及后者在體外應用，例如，確定、分開和/或分離相應的結合配偶體中的 用途，或在體內應用，例如，在診斷、預防和治療其中直接或間接涉及相 應結合配偶體的疾病中的用途。
這些目的是通過獨立權利要求的主題實現的。優選的實施方案記述在從屬權利要求中。
存在對定義明確的多價聚合物試劑的需要，所述明確的多價聚合物試 劑能夠將活性試劑，特別是生物活性試劑多聚體化。本發明滿足該要求。
根據本發明，意外地證明，這種多聚體試劑中使用的已經相對短的聚 合物鏈可以導致親和力的大幅增加。因此，本發明的多聚體綴合物意外地 對相應結合配偶體表現出顯著增加的結合親和力。作為實例，與單體PEG
化結合分子相比，四聚體綴合物(包含四聚體化的PEG化的結合分子)導致 親和力作用增加至少多于30倍。此外，意外證明，己經小的合成起始材 料可以用于在非常有效的匯集合成中制備根據本發明的多聚體試劑。
總之，本綴合物顯示出意外的和改進的結合特性，其可以在體內和體 外應用中使用。
發明詳述
根據第一方面，本發明提供一種下式的多聚體試劑 Z-(X-Pol-Y)n
糾
Z是同官能-多官能烴，優選是支化的，具有l-50個碳原子，其任選包 含雜原子；
X是具有l-15個，優選2-10個，更優選3-5個碳原子的烴連接體，其 任選含有雜原子并其能夠在Z和Pol之間形成穩定的鍵； Pol是水溶性無毒聚合物； Y是能夠偶聯到生物活性試劑的偶聯劑，和 n是來自4-20，優選4-15，更優選4-8的整數。
Z優選選自寡月安(oligoamines)、寡幾酸(oligocarboxylic acids)、寡硫醇 (oligothiols)、寡烯(oligoalkens)、寡炔(oligoalkynes)、寡肼(oligohydrazines)、 寡疊氮化物(oligoazides)。
注意到Z優選不選自天然化合物，諸如肽化合物和氨基酸化合物。證 明的是，由于使用那些化合物，雜質被引入到反應混合物中，從而導致不
12希望的作用。在實踐應用中，這可以意味著降低的產物收率，質量變化，
以及微生物毒素污染。因此，z優選通過從同樣是合成材料的化學純合成
起始材料的合成制備。
在其它優選的實施方案中，Z是非手性的。證明通過利用那些化合物， 多聚體試劑的綴合物可以與手性藥物形成非對映異構體。如果藥物具有低 的分子量，則這具有特別的相關性。這種非對映異構體具有不同的物理化
學性質并且經常顯示出不同的關于其體內活性的藥理性質。因此，非對映 異構體在藥物制備中是非常不理想的。
注意的是，化合物的這些組對應于用于多聚體試劑合成中的z的起始
材料，并且不必然反映Z在最終化合物Z-(X-Pol-Y)n中的精確化學結構。 例如，如果Z是寡胺，則在最終合成的結構Z-(X-Pol-Y)n中，X可以例如 是酰胺-連接體(如下定義)。
特別優選的是寡胺，諸如1,2-乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四 胺、五亞乙基六胺、四亞乙基五胺、亞丙基胺諸如雙(2-氨基丙基)-胺、環 聚胺諸如1,4,7-三氮雜環壬烷、1,4,7,10-四氮雜環十二垸、星狀聚胺諸如 N l ，N l -雙(2-氨基乙基)-l,2-乙二胺、多熔素和精胺，優選季戊四胺。
關于Z的其它同官能-多官能烴是寡羧酸、寡硫醇、寡烯、寡炔、寡疊 氮化物。
在一個優選的實施方案中，X選自由酰胺-、酉旨-、硫醚-、三唑-、脲-、 C-C-或氨基甲酸酯(urethan)-鍵組成的組，優選三唑-、酰胺-或酯-鍵。按照 本發明，酰胺-鍵是最優選的(符合以上用作Z的優選的寡胺)。
在本發明的多聚體試劑中，Pol優選是分子量<10,000 Da,更優選 <2,000Da,最優選〈,000Da的聚合物，或，換言之，在150 Da和IO，OOO Da之間的范圍內。該范圍非常重要，原因如下
如果Pol的分子量低于150 Da，則特別在其中大的生物分子與多聚體 試劑偶聯的情況下可能發生位阻。因此，從本發明的觀點來看，優選Pol 的分子量的較低范圍是150Da。
注意到，特別地，具有低于2,000的分子量的Pol是優選的，因為， 在技術方面，那些聚合物可以以基本均勻的長度，即以"非-分散的 (non-dispersed)"性質獲得。那些非分散的聚合物又將導致最終產物的優良特征和質量。
上限< 10,000 Da是可推薦的，鑒于生產成本將增加，反應時間將增加， 并且最重要地，在該情形中與多聚體試劑結合的單獨生物活性試劑將像單 個分子一樣表現。或者，換言之，如果Po1〉 10,000，則親和力不能增加 太多。
在優選的實施方案中，Pol是聚乙二醇(PEG)。通過使用PEG化的分子， 可以利用PEG的突出特征，例如，無毒性，并且可以提供具有定制的分 子量的總綴合物，其通過不流過腎過濾屏障而減少綴合物從身體排除。
在另一個實施方案中，Pol是非-分散或低分散的。或者換言之，這包 括基本上無分子量的分布的分子，即該分子不是多分散的。
分散性的量度是多分散性指數(PDI)，其意指給定聚合物樣品中的分子 量的分布。如上提及地，計算的PDI是重均分子量除以數均分子量。它表 示一批聚合物中單獨分子量的分布。PDI具有總是大于1的值，但是當聚 合物鏈接近理想的高斯分布(=單分散性)時，PDI接近1。相反，通過分離 精確定義數量的乙二醇單元的PEG，例如通過頂替層析，PEG < 2000可以 以非-分散質量獲得(US6245238)。
根據本發明，n是來自4-20,優選4-15,更優選4-8的整數。因此，將 n的下限規定為4。假定該數字對以充分增高的親和力告終是關鍵的，如 果使用其中n=2或3的多聚體，則所述親和力可能顯著降低。在另一方面， n越高，則制備多聚體試劑的方法將越復雜。用于制備n〉20的多聚體試 劑的成本將過高，反應速率將過慢，并且物質Z不太可能以充分均勻性獲 得(即，不是多分散的)。n還可以在4-8、 4-7、 4-6或4-6的范圍內。此外， 它可以是4、 5、 6、 7或8。
在一個優選的實施方案中，Y分別獨立地選自這樣的化合物的組，所 述化合物可以與氨基、巰基、羧基、胍基、羰基、羥基、肼基、炔基、雜 環、C-親核體基、C-親電子體基、磷酸酯或硫酸酯結合，或可以與金屬形 成螯合物或絡合物，或可以與表面如塑料、金、銅、或硅形成鍵。
Y執行使多聚體試劑隨后偶聯于生物技術或合成產物以及天然產物和 技術產物的功能，即根據本發明的化合物優選含有活化的官能團Y。在活 化的形式中，Y各自優選地獨立選自由(0-烷基)2、 -08020 ^&(三氟代乙烷磺酰基)、(0-芳基)-疊氮化物、(O-垸基)-疊氮化物、O-炔-CO-Q、馬來酰 亞胺基、-O-CO-硝基苯基或三氯苯基、-S-S-烷基、-S-S-芳基、-SOr烯基(乙 烯砜)或-鹵素(Cl、Br或I)組成的組，其中Q獨立選自由H,0-芳基、0-芐 基、O-N-琥珀酰亞胺、O-N-磺基琥珀酰亞胺、O-N-苯鄰二甲酰亞胺、O-N-戊二酰亞胺、O-N-四氫苯鄰二甲酰亞胺、N-降冰片烯-2,3-二羧酰亞胺、羥 基苯并三唑和羥基-7-氮雜苯并三唑組成的組。Y優選是-CO-Q基。出現在 生物綴合物化學(Bioconjugate Chem,)1995， 6， 150-165中的Zalipsky， S.的綜 述提供了關于可能的活化的很好回顧。通過參考將該綜述作為整體引入本 文。
活化官能團容許根據本發明的化合物與生物活性化合物共價結合，由 此形成高度理想的穩定綴合物。與結合分子的偶聯優選通過活性分子中的 合適基團，例如，已經被引入到該分子中的半胱氨酸殘基實現。
注意到，在一個實施方案中，本發明的多聚體試劑僅攜帶相等的關于 Y的化合物。這種類似活化的實例在下文中關于四聚體顯示。然而，本發 明還提供這樣的實施方案，其中在一個多聚體分子中使用不同類型的Y活 化，即不同的Y組，其獨立選自上述組。
本發明的多聚體試劑例如具有下述結構
C137H260N8O60
精確質量2977,75 分子量2979,55
<formula>formula see original document page 15</formula>在第二方面，本發明提供一種多聚體綴合物，其中如上解釋的多聚體
試劑經由Y組分偶聯到生物活性試劑。
該生物活性試劑優選獨立選自具有治療或診斷相關性的肽、蛋白、核 酸或小分子。因此，在本發明的上下文中，所述綴合物可以包括相等的生 物活性試劑，或作為備選方案，可以包括一種或多種不同的獨立選擇的生 物活性試劑。
作為實例，所述生物活性試劑可以選自生長因子或其受體，如TNF、 VEGF、或EGF。在一個優選的實施方案中，所述生物活性試劑具有像抗 體、抗體片段、抗體樣分子和支架蛋白一樣的抗原結合活性。
術語"結合活性"用于本發明的上下文中時，意指對特異性靶分子具 有結合親和性的分子。
更精確地，所述試劑可以是生物受體，優選G蛋白-偶聯受體(GPCR; 例如人GLP-1受體、人PTH受體)、或EGF受體、HER2 、 HER3 、 VEGF/R1 -4、 Ep-CAM、或配體或其結構域、腫瘤標記(前列腺特異性膜抗原(PSMA))、 細胞因子(腫瘤壞死因子a(TNF-a)、腫瘤壞死因子J3(TNF-13))、白細胞介素 (例如IL-2、 IL-6、 IL-ll、 IL-12)、生長因子(例如NGF(神經生長因子)及其 前體-形式(pro-form)、 ProNGF、 BMPs、 EGF、 MIA、 MIA-2、 FGFs、血管 內皮生長因子(VEGF)、 PDGF、 P1GF、 IGFs)、激酶、整聯蛋白(例如，糖 蛋白受體nb/ma(GPIIb/nia))、 HSA(人血清清蛋白)、F4絲束蛋白、T和B 細胞抗原，優選CD4、 CDll、 CD14、 CD16、 CD20、 CD22、 CD25、 CD34、 CD47、 CD56、 CD83、 CD154、 CTLA-4、免疫球蛋白或其部分，例如全抗 體、(例如免疫球蛋白G、 E、 M)、例如人免疫球蛋白M的Fc部分或抗原 結合位點區域中的抗體片段、或糖(路易斯(Lewis) Y、路易斯X)、或毒素 如真菌毒素、或激素如皮質醇。
另外的實例是活性試劑和靶向試劑(targetingaent)的組合，例如，氨基 羧基酯如飽和或不飽和co-氨基羧基酯、染料、熒光標記、抗生素、小或大 溝粘合齊U(minor or major groove binder)、生物素化自由基、鏈霉抗生物素 自由基、嵌入自由基(intercalatingradical)、烷基化自由基、類固醇、脂質、 聚胺、葉酸、受體激動劑或受體拮抗劑、酶抑制劑、肽、抗體或抗體片段、 氨基糖、糖或寡糖如半乳糖、葡萄糖或甘露糖、反義聚合物、改性表面、表面活性劑或絡合劑。
如果使用抗體，則該抗體可以選自由多克隆抗體、單克隆抗體、人源 化抗體、嵌合抗體和合成抗體組成的組。
抗體可以另外連接到有毒和/或可檢測的試劑。
術語"抗體"，在本文中用于指完整抗體以及抗體片段，其具有一些選
擇性結合到表位的能力。這種片段包括，但不限于，Fab, F(ab')2和Fv抗 體片段。術語"表位"意指抗體的互補位可以與其結合的抗原的任何抗原 決定子。表位決定子通常由化學活性的表面分子基團(例如，氨基酸或糖殘 基)組成，并通常表現出三維結構以及特異性物理性質。
如上提及地，多克隆抗體的生產普遍已知。詳細流程可以在下列文獻 中發現例如，Green等，多克隆抗血清的生產(Production of Polyclonal
Antisera)， 在免疫化學方案(/mmM"0c/2ewz'ca/ Pratoco/力中(Manson， 編輯)
第l-5頁(Human出版社(HumanaPress) 1992)以及Coligan等，兔、大鼠、 小鼠和倉鼠中的多克隆抗血清生產(Production of Polyclonal Antisera in
Rabbits, Rats， Mice and Hamsters),在現/^^疫學》f樹Cwre"f尸ra ocofe /" /mm認o/ogv)中，第2.4.1部分(1992)。另外，專家熟悉若干關于純化和濃 縮多克隆抗體，以及單克隆抗體的技術(Coligan等，第9單元，現代免疫學
流禾呈(CWreW尸ratoco/s /" 7mmM"o/ogy)， Wiley Interscience， 1994)。
單克隆抗體的生產也是普通己知的。實例包括雜交瘤方法(Kohler和 Milstein， 1975, ^然(A^we), 256:495-497, Coligan等.，第2.5.1 - 2.6.7部 分；禾口 Harlow等.，貧沐'實教皇手鐵j"/7.&。(i^.'爿丄a6orato^y Ma冊"/),第 726頁(Cold Spring Harbor出版社(Cold Spring Harbor Pub.) 1988).)、三體 瘤(trioma)技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等.，1983，今日免疫學 (Immunology Today) 4:72)，以及用于生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技 術(Cole,等.，1985，在單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中，Alan R. Liss， Inc.,第77-96頁)。
抗體或適體的優選備選方案是具有抗體樣結合行為的蛋白組。所述蛋 白可以優選選自由晶體、內孢囊素、熱激蛋白、冷激蛋白、p-螺旋蛋白、 脂籠蛋白、certins、纖連蛋白或轉錄因子或是GFP、NGF、靛胭脂(tendamistat) 或溶菌酶組成的組。具體地，結晶可以在用于設計新結合分子中起結合蛋白或起起始蛋白
的作用，所述新結合分子具有占優勢的卩-片(beta-sheet)結構，諸如，具體
地，y-晶體，即目鏡的結構蛋白。優選地，晶體源自脊椎動物、嚙齒類動 物、鳥類或魚類，且更優選地選自a-、 13-或y-晶體蛋白，更優選地，其是
y-n晶體蛋白。
關于這一點，參考US 10/030,605的公開內容，通過參考將其引入本文。
抗體或適體的另一種備選方案可以是選自由"泛蛋白-樣蛋白"蛋白超 家族的蛋白組成的組的結合分子，具體地，具有泛蛋白-樣折疊基序的那些， 及其各自具有泛蛋白-樣折疊基序的片段或融合蛋白。WO2004/106368涉
及該"泛蛋白-樣蛋白"的超家族的修飾蛋白，即具有泛蛋白-樣折疊的蛋 白。作為所述修飾的結果，所述蛋白具有先前不存在的關于預定的結合配 偶體的結合親和性。也通過參考將WO2004/106368的內容引入本文。
對于這兩個結合蛋白組，有效的是，由于在蛋白表面上形成鄰近區域 的那些氨基酸的修飾，所述結合蛋白在該蛋白的至少一個表面-暴露區域中 優選具有先前不存在的關于預定結合配偶體的結合親和性，同時維持原始 折疊基序。
在另一個實施方案中，本發明的綴合物的總尺寸使得分子的腎排除顯 著減慢。這可以通過提供具有總分子量> 50,000 Da的綴合物實現。因此， 通過使用該尺寸的綴合物，可以提供具有長期活性的長-循環化合物。這種 類型的綴合物優選用于治療患者中的慢性病癥。
作為備選的實施方案，可將總尺寸設置為小于50,000 Da，從而提供提 供相對短期活性的綴合物，由此特別適合于治療急性病癥。
本發明的多聚體綴合物與其衍生自的未修飾的生物活性試劑相比，優 選表現出增加的親和力。如以上提及的，單體分子的親和力在使用本發明 的綴合物結構時，可以增強約30倍。
在第三方面中，本發明提供一種藥物或診斷組合物，其含有前述權利 要求中的一項或多項的多聚體綴合物和一種或多種輔劑和/或稀釋劑。
因此，對于根據本發明修飾和選擇的蛋白，可以使用廣譜的可能應用。 它們不僅可以用在醫學-制藥領域中，還可以用在分析學、營養和食品工業、營養增補劑、化妝品、醫學和非醫學診斷和分析等領域中。自然地，應用 領域取決于所選擇的結合配偶體的類型。
在人和獸醫治療和預防領域中，制藥用藥物可以通過本身已知的方法
制備。取決于蓋倫制劑(galenic preparation),這些組合物可以靜脈內、腹 膜內、肌內、皮下、經皮或通過其它施用方式施用。藥物制劑的類型取決 于待治療的疾病類型、疾病的嚴重性、待治療的患者以及醫學領域中的技 術人員己知的其它因素。施用可以通過注射或灌輸，通過吸入或通過常規 使用的其它方法親本進行的。
使所述組合物適應于包含治療有效劑量。待施用的劑量的量取決于待 治療的生物體、疾病的類型、患者的年齡和體重以及本身己知的其它因素。
該組合物可以包含本身已知的輔劑。這些包括例如穩定劑、表面活性 劑、鹽、緩沖劑、著色劑等。
藥物組合物可以采用用于局部或經皮施用的液體制劑、霜劑、洗劑的 形式，氣霧劑，采用粉末劑的形式，采用乳劑或脂質體制劑的形式。該組 合物優選是無菌的、非-致熱的和等張的，且包含本身已知的制藥常規和藥 用添加劑。另外，參考美國藥典(U.S.pharmac叩oeia)的規則。
在第四方面中，本發明提供一種生產如上文所述的多聚體試劑的方法， 其通過使同官能-多官能試劑Z與同官能或異官能聚合物X-Pol-Y反應， 從而形成穩定的鍵并獲得Z-(X-Pol-Y)n。
注意到該反應可以通過將X-Pol-Y與Z簡單聚合.，或，作為備選方案， 通過如下略述的匯集合成進行。
匯集合成是一種策略，其目的是改進多步驟化學合成的效率。在線性 合成中，總收率隨著每個反應步驟快速降低A — B — C —D。在匯集合 成中，反應時間表可以如下A —B;C —D;B + D —E，導致高得多的總 收率。匯集合成特別是在復雜分子的合成領域中具有優勢，并且因此可以 特別用于本方法中。
在另一個方面中，本發明涉及一種制備如上定義的多聚體綴合物的方 法，其包括下列步驟
-將如上定義的生物活性試劑和多聚體試劑溶解在合適的溶劑中；
-使如本文中定義的多聚體試劑Z-(X-Pol-Y)n與所述生物活性試劑在
19相同的溶液中反應；禾口
-將所述多聚體綴合物純化為基本上同質的制劑。 該方法中使用的溶劑優選能夠溶解生物活性試劑和多聚體試劑二者。
溶劑可以選自但不限于極性或非極性溶劑，例如選自有機溶劑諸如DMF、 DMSO、醇、二氯甲垸、氯仿、THF、 DMA、乙酸乙酯或水性緩沖液體系 諸如硼酸鹽、碳酸鹽、三羥甲基氨基甲垸、磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、 或甲酸鹽緩沖液。
在該方法的第一步中，生物活性試劑優選以0.1-25 mg/ml，優選1-10 mg/ml的濃度溶解在溶劑中。溶劑具有在3和12之間，優選在4和10之 間，更優選在5和9之間的pH，并具有小于250 mM，優選在10和150 mM 之間，更優選在50和100 mM之間的緩沖鹽的總濃度。其還可以包含添 加劑諸如鹽、穩定劑、變性劑、和還原劑或氧化劑。
優選地，參考待多聚化的生物活性試劑的摩爾量，將多聚體試劑 Z-(X-Pol-Y)n以l:n以下的摩爾比加入到生物活性試劑的溶液中。
例如通過適當的攪拌或搖動，將步驟2中的反應溶液連續均化，并保 持在-20。C禾卩5CTC，優選(TC和37。C，更優選4。C和25"之間的溫度。
在該方法的最終步驟中，將多聚體綴合物純化為純度>90重量％，更 優選>95重量％的基本上同質的制劑，且，優選地，純化通過色譜法、沉 淀、或尺寸排阻諸如滲析或交叉流動過濾進行。
另一個方面提供一種可以通過以上方法獲得的多聚體試劑和一種多聚 體綴合物。
本發明的多聚體綴合物可以用于診斷、預防和治療其中直接或間接涉 及相應的結合配偶體的疾病。
在下文中，提供實施例進一步舉例說明本發明。然而，本發明不局限 于此，且下列實施例僅基于以上說明顯示本發明的實用性。為了完整公開 本發明，還參考本申請和附錄中引用的文獻，將其全部內容通過參考引入 本申請。
本發明進一步通過隨后的實施例和


。附圖顯示如下
圖1:單體Affilin 8A7與它的靶即人TNFa結合的濃度依賴性ELISA(圓 形)。將與BSA的結合繪制為參比(正方形)。圖2:單體Affilin 8A7(正方形)和四聚體Affilin 8A7(圓形)與人TNFa 結合的濃度依賴性ELISA。將與BSA(三角形)和微量滴定板的結合繪制為 參比(菱形)。
圖3:四聚體Affilin 8A7(正方形)和四聚體泛蛋白野生型(圓形)與人 TNFa結合的濃度依賴性ELISA。
圖4:四聚體19H2 Affilin與TNFa結合的濃度依賴性ELISA。在四聚 體(A)的一個臂中包含11個PEG單元的構建體表現出與關于具有23個 PEG單元的四聚體的檢測相同的KD值。
圖5:八聚體19H2 Affilin與TNFa結合的濃度依賴性ELISA。 Kd值 隨單體到二聚體、四聚體和八聚體而增加。
實施例
按照本發明多聚化試劑的實例
不依賴于多聚化試劑的最終結構和活化， 一般的合成策略是匯集的 (convergent),并且如下從中心的同-或異-官能的支化/核單元Z開始，使 用有效偶聯化學物將同-或異官能的PEG Po/與所述核單元的近端反應。 在第二步中，活化PEG部分的近端，從而導致基團r。在優選的實施方案 中，反應步驟1中使用的同-或異官能的PEGPol在一個近端已經具有了反 應性官能團r或保護的反應官能團"。在下文中， 一般程序記述為由聚
胺開始，但引入不同的反應基團y。這些一般反應可以容易地轉移至基于
不是寡胺的Z的多聚化試劑。
按照本發明，寡胺可以用作核結構，其與異雙官能或同雙官能PEG反 應，以形成多聚化試劑。季戊四胺核結構可以如Hayes等所述合成(四面體 (r"ra/ze^o") 2003, 59, 7983-7996)。備選的寡胺可以選自精胺、寡亞乙基 胺如二亞乙基三胺或寡亞丙基胺如雙(2-氨基丙基)-胺的組。此外，寡胺還 可以是雜環寡胺的成員，例如三環萜(cyclen)。作為多聚化試劑中的間隔團 以及在PEG化試劑方面使用的PEG單元在大多數情形中可商購獲得，否 則PEG單元可以從作為聚(乙二醇)或其衍生物的關鍵原料開始進行合成。 這種PEG單元的合成是化學家公知的。
由于其高收率，酰胺化反應在肽化學中長期已知。因此，在優選實施方案中，胺核和PEG-單元將在酰胺化步驟中偶聯。PEG-單元在具有活性 官能團Y的近端活化。基本上，對Y沒有限制，在生物制藥學改良領域 中公知許多實例，并在別處被公開。
分別通過還原氨基化和可逆席夫堿形成，醛官能團可以用于生物試劑 的綴合。存在不同的方法以引入醛。最優選地，可商購的異雙官能PEG 作為關鍵原料使用。
這些PEG與中心核單元Z反應后，通過使用特定氧化方法諸如斯文 (Swern)、或Pfitzner-Moffat氧化(基于活化的DMSO的方法)或TEMPO-氧 化，直接氧化PEG-鏈的羧基末端，以引入醛官能團。為了穩定性原因， 最有利的是使用在醛官能和PEG單元的近端之間具有相對長的碳鏈的醛。 這些醛例如可以是丙醛、丁醛、或醛羧酸(例如6-醛庚酸)的衍生物。在另 外的實施方案中，用縮醛保護的醛的鹵素或磺酸鹽衍生物將PEG鏈的羥 基末端烷基化(US5990237、 US5252714)。另一種方法是通過與氨基-PEG 衍生物的酰胺化反應引入co-醛羧酸衍生物。
備選地，醛官能可以通過使寡胺與NHS活化的PEG-醛衍生物直接引 入。在該情形中，醛官能可以是未保護的或縮醛保護的。縮醛保護基團可 以通過酸催化去除以形成寡醛，或通過在稍微酸性條件下進行的還原氨基 化過程中原位裂解去除。
引入疊氮化物官能
疊氮化物官能團可以容易地通過使例如寡胺與NHS活化的PEG-疊氮 化物衍生物反應引入。這種的PEG的疊氮化物衍生物可以通過將HO-PEG-酸的羥基官能轉化為相應的疊氮化物制備。這種方法是化學家公知的。
用于形成作為馬來酰亞胺活化的多聚化試劑的一般程序
向處于二氯甲烷(90 mL)中的MAL-PEG-NHS (5.4 mmol)的溶液中加入 處于DMSO(c = 500 mg/mL)和三乙胺(100 jiL)中的寡胺(1.4 mmol， 500 mg/ml)的溶液。然后，在20-25。C攪拌反應混合物48小時。攪拌程序后，物稀釋反應化合物。然后，分離有機相， 并在真空中去除溶劑。通過柱色譜法的純化提供了作為無色的粘稠的油或 白色固體的最終產物(收率50-80 %)。
用于形成作為醛活化的多聚化試劑的一般程序(參見實施例5): 寡醇形成(Oligoolformation):
向處于二氯甲垸(20 mL)中的異雙官能HO-PEG-NHS(2.21 mmol)的溶 液中加入處于DMSO(c = 75 mg/mL)中的寡胺(1 mL; 0.55 mmol)的溶液。 然后，在20-25。C攪拌反應混合物12小時。攪拌程序后，在減壓條件下去 除溶劑。通過柱色譜法的純化提供了作為無色的粘稠的油的最終產物(實施 例3)(收率50%)。
氧化
在IO分鐘內，向處于-78。C(干冰浴)中的干二氯甲烷(30 mL)和DMSO (500 iiL)的混合物中加入草酰氯(l.l mL;在二氯甲烷中2M， 2 mmol; 5.5 當量)溶液。在-78。C再攪拌反應混合物15分鐘。隨后，在15分鐘內，在 -78°〇加入處于二氯甲垸(8 mL)中的寡醇(01igool)(實施例3, 0.37 mmol)的 溶液。在-78。C再攪拌40分鐘后，加入三乙胺(700 pL)。
在-78。C再攪拌反應化合物2小時。然后，將反應化合物加熱到25"C， 并真空中去除溶劑。通過柱色譜法的純化提供了作為無色的粘稠的油的最 終產物(實施例4)(收率50%)。
實施例lC"lH248Ni2064
精確質M: 3133,65 分子量3135,52
MALDI-MS: m/z: 3134.6 [M+H]十；3156.8 [M+Na]十；3172.8 [M+K]十. 'H-NMR (400 MHz, CDCI3): 5 = 2.42-2.52 (16H); 2.93 (8H); 3.37-3.41 (8H); 3,48-3.54 (8H); 3.55-3.69 (176H); 3.71-3.77 (8H); 3.79-3.84 (8H); 6.48 (4H); 6.67 (8H); 7.63-7.67 (4H).
13C-NMR (100.6 MHz, CDC13): 5 = 34.42; 34.58; 37.41; 38.61; 39.31; 45.41; 67.25; 69.77; 70.24; 70.34; 70.56; 70.62 (OCH2信號);134.29; 169.87; 170.57; 172.82.
實施例2
<formula>formula see original document page 24</formula>
精確質量5246,91 分子量5250,04
MALDI掘m/z: 5269.79 [M+Na]+.
'H-顧R (400 MHz, CDC13): 5 = 2,42-2.52 (16H); 2.82 (8H); 3.37-3.41 (8H); 3.48-3.54 (8H); 3.55-3.64 (368H); 3.71-3.75 (8H); 3.79-3.83 (8H); 6.58 (4H);<formula>formula see original document page 25</formula><formula>formula see original document page 26</formula>C113H220N15O52 精確質量2633,51 分子量2635,03
26
實施例5
o
精確質量2977,75 分子量2979,55
MALDI-MS: m/z: 2978.74 [M+H]+; 3000.75 [M+Na]+; 3016.71 [M+K]+. 'H-畫R (300 MHz, CDC13): 5 = 1.63-1.66 (16H); 2.17-2.22 (8H); 2.41-2.52(16H); 2.79-2.83(8H); 3.40-3.48 (8H); 3.50-3.55 (8H); 3.56-3.68 (176H); 3.70-3.76 (8H); 6.50 (4H); 7.65 (4H); 9.73 (4H). 13C-NMR (75.4 MHz, CDC13): 5 =21,69; 25.16; 36.06; 37.41; 39.35; 41.03; 43,68; 45.41; 67,26; 69.91; 69.96; 70,26; 70.34; 70.62; 172.82; 202,38.
實施例6 (疊氮化物)
N H
<
、<formula>formula see original document page 27</formula>
精確質量3193,51 分子量3195,39
關于Affilin 8A7的實施方案
利用本發明中所述的多聚體工具，已經制備了泛蛋白基Affilin分子的 四聚體。具有針對人TNFa的親和性的Affilin 8A7選自根據專利 WO2004/106368的組合泛蛋白文庫。由噬菌體展示進行3輪親和性富集后， 變體8A7代表人工結合位點中的共有序列。因此針對其它特征選擇變體， 并且在表達和純化以后，通過ELISA測量與預定靶即人TNFa的結合。圖 1顯示了 8A7單體與TNFa濃度依賴性特異性結合信號。可檢測到弱但特 異性的相互作用，其具有3 的表觀解離常數(KD)。為了測試泛蛋白支架本身或多聚體試劑是否具有針對TNFa的非特異
性親和性，生成泛蛋白四聚體作為參比。為了確保馬來酰亞胺活化的四聚
體PEG-分子與8A7和野生型泛蛋白的特異性偶聯，利用重疊延長連接將 表面暴露的側鏈絲氨酸58在DNA水平替換為半胱氨酸第一 PCR包含 10 pl Pwo緩沖液(10x,羅氏(Roche)), 2 (il dNTPs (10 mM,羅氏(Roche)), 1 pi Fl引物(IOO (iM), 1 pi SPWS57Crev引物(IOO |aM), 1 pl模板(處于 pET20b+中的8A7或泛蛋白，1:5稀釋)，1 pl Pwo聚合酶(250 U，羅氏 (Roche))和84 pl無RNA酶的水。第二 PCR: 10 )il Pwo緩沖液(10x,羅氏 (Roche))， 2 )il dNTPs (10 mM,羅氏(Roche)), 1 pl SPWS57CfW引物(100 ,,1 nl pET20b+rev—助引物(100 ^M), 1 |ul模板(處于pET20b+中的8A7 或泛蛋白，1:5稀釋)，1 |il Pwo聚合酶(250 U,羅氏(Roche))和84 |il無 RNA酶的水。這兩個PCR利用下列流程運行94。C變性l分鐘，隨后進 行25次循環的變性(94。C,30秒)、退火(65。C，45秒)和延長(72。C, 40秒)。 25次循環后，最后的延長步驟進行5分鐘(72t:)。由此產生的PCR片段利 用PCR純化試劑盒(Quiagen, Hilden)純化。這兩個片段用在最后的PCR中， 所述PCF包含10 )al Pwo緩沖液(10x,羅氏(Roche)), 2 (al dNTPs (10 mM, 羅氏(Roche)), 1 pl Fl弓|物(100 ^M)， 1 pl WUBIFlagXhoIrev引物(100 pM)， 2 pi來自PCR 1的模板，2 |il來自PCR 2的模板，1 )ul Pwo聚合酶(250 U,羅氏(Roche))和81 ^無RNA酶的水。該PCR利用以上己經描述的PCR 程序運行。PCR后，產物利用PCR純化試劑盒(Quiagen)純化，并用Xbal 和Xhol消化。消化進行如下8 |il PCR片段(第三PCR), lplXhoI (普洛麥 格(P腿ega)), 1 pi Xbal (普洛麥格(Promega)), 2 jal BSA (10x,普洛麥格 (Promega)),2pl緩沖液H(羅氏(Roche))和6pl無RNA酶的水。混合物在 37。C溫育3小時。pET20b+載體(Novagen)也用Xbal/Xhol消化，所述 Xbal/Xhol為2 ^ Xhol (普洛麥格(Promega)), 2 pi Xbal (普洛麥格 (Promega)), 2 )il BSA (10x,普洛麥格(Promega)), 2 |il緩沖液H (羅氏 (Roche)), 6 )il pET20b+載體和6 ^無RNA酶的水。混合物又在37。C溫育 3小時。消化的PCR片段和載體通過凝膠提取純化。PCR片段利用2 % NuSieve瓊脂糖凝膠運行，且載體利用0.6 % SeaKem瓊脂糖凝膠分離(二 者均來自BMA)。從凝膠中切割下片段，并利用凝膠提取試劑盒(Qukgen)提取DNA。純化的片段用在連接反應中3 pi PCR片段，1 pl pET20b+載 體(Xbal/Xho1切割的)，1 T4連接酶(普洛麥格(Promega)), 2 pl T4連接酶 緩沖液(普洛麥格(Promega))和13 |il無RNA酶的水。連接在6。C溫育過夜， 并且然后利用MinElute清除試劑盒(Quiagen)純化。純化的載體用于通過電 穿孔轉化Nova藍細胞。電穿孔后，將細胞涂布在含有100嗎/ml氨芐青 霉素的LB-瓊脂板(LB/Amp)上并在37。C溫育過夜。
DNA序列分析顯示從絲氨酸57到半胱氨酸的正確替換(見附錄)。為 了表達8A7和泛蛋白，通過用LB/Amp稀釋預培養物1:100，將克隆培養 在1.5L搖瓶中，并在37'C，以200rpm攪拌該培養物直到600nm處的光 學密度(OD6oo)為0.5。表達通過添加IPTG(最終濃度lmM)誘導。培養在 30。C和200 rpm下持續4小時。細菌細胞通過在4°C, 6000 x g離心20分 鐘收獲。將細胞沉淀混懸在30ml包括核酸酶(benzonase)和溶菌酶的 NPI-20緩沖液中。細胞通過在冰上進行超聲波(3x20秒)破裂。在4。C和 40000x g離心混懸液30分鐘后獲得包含可溶性蛋白的上清液。兩種與6 個組氨酸殘基融合的蛋白通過室溫下的親和性層析純化。用50 ml包括5 mM巰基乙醇(P-ME)的NPI-20平衡Ni-瓊脂糖(5 ml, GE衛生保健(GE Healthcare))柱。將包含可溶性蛋白的上清液應用于該柱，隨后進行使用 NPI-20 ((3-ME, 50 ml)的清洗步驟。以線性梯度到50 % NPI-500 ((3-ME)將結 合的蛋白洗脫到100ml中。通過SDS-PAGE，針對它們的純度分析餾分。 匯集合適的餾分，并將其以lml/min流速應用于用包含10mMDTE的PBS (pH 7.4)平衡的凝膠過濾柱(Superdex 75， 1.6 x 60 cm, GE衛生保健(GE Healthcare))。匯集純化的蛋白，并將其應用于用偶聯緩沖液(50 mM磷酸 鹽，pH 7.0)平衡的2x5ml Hitrap脫鹽柱(GE衛生保健(GE Healthcare))。然 后，加入馬來酰亞胺活化的四聚體PEG分子(按照權利要求8，實施例l)， 直到蛋白:PEG摩爾比為4:1。混合物在25。C溫育2小時，并且然后通過在 25。C加入卩-ME 30分鐘到最終濃度100 mM終止反應。用50 mM乙酸鹽 緩沖液(pH 5.0) l:5稀釋后，利用乙酸將混合物的pH值調至5.0。然后， 將蛋白質應用于來源S柱(Resource S column)(lml, GE衛生保健(GE Healthcare))。然后利用線性鹽梯度0至1 M的NaCl (50 mM乙酸鹽緩沖液, pH 5.0)洗脫未反應的單體蛋白和相應的四聚體。四聚體的純度通過rpHPLC分析和凝膠電泳檢驗。四聚體的正確分子量利用MALDI分析驗 證。
8A7(單體和四聚體)和四聚體泛蛋白與人TNFa的結合通過濃度依賴 性ELISA評估。將增加量的純化的單體或四聚體應用于用人TNFou BSA 和PBS包被的NUNC-medisorp板。使用50 ^ (10 jag/ml)/孔的抗原包被在 4。C進行過夜。用PBS， 0.1 %吐溫20 pH 7.4 (PBST)清洗該板后，利用封 阻溶液(PBS pH 7.4; 3 % BSA; 0.5%吐溫20)在37。C封阻孔2小時。再用 PBST清洗孔三次。然后，在室溫下，在孔中溫育不同濃度的單體和四聚 體8A7Affilin以及四聚體泛蛋白1小時(50 pl體積)。用PBST清洗孔后， 以在PBST中稀釋1:2000應用抗-FLAG POD綴合物(西格瑪(Sigma))。用 300 pl緩沖液PBST/孔清洗該板三次。將50 )LilTMB底物溶液(KEM-EN-Tec) 加入到每個孔中，并溫育15分鐘。通過每孔加入50 nl0.2MH2SO4終止 反應。利用TECAN Sunrise ELISA-讀數器(TECAN Sunrise ELISA-Reader) 對ELISA板進行讀數。光度吸收測量在450 nm處進行，使用620 nm作 為參考波長。圖2明確顯示四聚體8A7與人TNFa的特異性結合，其具 有100nM的表觀KD值。在與單體的比較中，親和性增加30倍。不能檢 測到泛蛋白四聚體與TNFcx的結合(圖3)。
使用的序列如下 Fl引物
5' - ggag3cc3C3acggtttccctctegaaat組tttgtttaactttaag肌gg3g3tatecatatg SPWS57Crev引物
5' - cacaaagagtgcggccatcttccagttgcttgcctgcccagatgagcc SPWS57Cfw引物
5' - ggaagatggccgcactctttgtgactacaacatc 。ET20b+rev助引物5 ， - gggaagaaagcgaaaggagcgg
WUBIFlagXhoIrev弓|
;'-ccattccacctcgagacctttatcatcatcatctttgteatcgccgccacgcag3cgcagc
8A7 (S57C) DNA序列
GATAA
8A7 (S57C)氨基酸序列
EDGRTLCDYNILKTGPLHLVLRLRGGDYKDDDDKGLEHHHH朋
泛蛋白(S57C) DNA序列:
CTGATAA
泛蛋白(S57C)氨基酸序列:EDGRTLCDYNIQKESTLHLVLRLRGGDYKDDDDKGLEHHHHHH
關于A伍lin 19H2的實施方案
使用在Z和Y之間的連接體臂中具有11個和23個PEG單元的通式 物質，將另一種基于泛蛋白的Affilin(19H2)四聚化。
如對8A7 Affilin(如上)所述，進行表達、純化和偶聯以及四聚體的純化。 ELISA用于檢測這兩種四聚體(PEGll和PEG23連接體)與其靶分子TNFa 的結合。圖4顯示連接體長度不影響四聚體的親和力，二者均顯示3，7nM 的表觀KD。
還進行并測試遺傳產生的二聚體的四聚化(單體的八聚化)以及單獨的 二聚體。為了該目的，利用標準PCR技術二聚化19H2 Affilin。也插入兩 個19H2分子之間的連接體序列。該連接體是雙Gly4Ser標準連接體。所 述同源二聚體中的第二 19H2分子在位置57處具有替換(絲氨酸到半胱氨 酸)，從而選擇性偶聯具有馬來酰亞胺活化的四聚體PEG(11)分子的二聚體 (通式見上)。如上關于單體所述地進行表達、純化、偶聯和結合分析。圖 5顯示19H2的單體、二聚體、四聚體和八聚體針對TNFa的結合性質的 比較。如可以由其得知的，八聚體表現出最佳結合性質。
權利要求
1.一種下式的多聚體試劑Z-(X-Pol-Y)n其中Z是同官能-多官能烴，優選是支化的，具有1-50個碳原子，其任選包含雜原子；X是具有1-15個，優選2-10個，更優選3-5個碳原子的烴連接體，其任選含有雜原子并其能夠在Z和Pol之間形成穩定的鍵；Pol是水溶性無毒聚合物；Y是能夠偶聯到生物活性試劑的偶聯劑，和n是來自4-20，優選4-15，更優選4-8的整數。
2. 權利要求1的多聚體試劑，其中X選自由酰胺-、酯-、硫醚-、三唑 -、脲-、C-C-、或氨基甲酸酯-鍵組成的組，優選三唑-、酰胺-或酯-鍵。
3. 權利要求1或2的多聚體試劑，其中Z選自寡胺、寡羧酸、寡硫醇、 寡烯、寡炔、寡肼。
4. 權利要求1-3中一項或多項的多聚體試劑，其中Pol是分子量 <10,000 Da，優選<2,000 Da，更優選<1,000 Da，最優選在150 Da和10,000 Da之間的聚合物。
5. 前述權利要求中一項或多項的多聚體試劑，其中Pol是聚乙二醇 (PEG)。
6. 前述權利要求中一項或多項的多聚體試劑，其中Pol是非-分散性的。
7. 前述權利要求中一項或多項的多聚體試劑，其中每個Y獨立地選自 這樣的化合物的組，所述化合物可以與氨基、巰基、羧基、胍基、羰基、 羥基、肼基、炔基、雜環、C-親核體基、C-親電子體基、磷酸酯或硫酸酯 結合，或可以與金屬形成螯合物或絡合物，或可以與表面如塑料、金、銅、 或硅形成鍵。
8.權利要求1-5中一項或多項的多聚體試劑，所述多聚體試劑具有下 列結構Cl37H260N8O60精確質量2977,75 分子量2979,55
9. 前述權利要求中一項或多項的多聚體試劑，其中八聚體通過遺傳產 生的二聚體的四聚化產生。
10. —種多聚體綴合物，其中前述權利要求中一項或多項的所述多聚 體試劑經由y組分偶聯到生物活性試劑。
11. 權利要求10的多聚體綴合物，其中所述生物活性試劑各自獨立選 自具有治療或診斷相關性的肽、蛋白、核酸或小分子。
12. 權利要求10或11的多聚體綴合物，其中所述生物活性試劑各自獨立選自生長因子如tnf、 vegf、或egf或它們的受體。
13. 權利要求10-12中一項或多項的多聚體綴合物，其中所述生物活 性試劑具有像抗體、抗體片段、抗體樣分子和支架蛋白一樣的抗原結合活 性。
14. 權利要求11的多聚體綴合物，其中所述生物活性試劑選自y-晶體 蛋白。
15. 權利要求11的多聚體綴合物，其中所述生物活性試劑選自由下列 組成的組各自具有泛蛋白-樣折疊基序的"泛蛋白-樣蛋白"的蛋白超家族的蛋白，以及它們的各自具有泛蛋白-樣折疊基序的片段或融合蛋白。
16. 權利要求14或15的多聚體綴合物，其中由于在所述蛋白表面上形成鄰近區域的那些氨基酸的修飾，所述生物活性試劑在所述蛋白的至少 一個表面-暴露區域中具有先前不存在的關于預定結合配偶體的結合親和 性，同時維持原始折疊基序。
17. 權利要求10-16中一項或多項的多聚體綴合物，其中所述綴合物 的總尺寸使得分子的腎排除顯著減慢。
18. 權利要求10-17中一項或多項的多聚體綴合物，其中所述綴合物 與其衍生自的未修飾的生物活性試劑相比，表現出增加的親和力。
19. 一種藥物或診斷組合物，所述藥物或診斷組合物含有前述權利要 求中一項或多項的多聚體綴合物以及一種或多種輔劑和/或稀釋劑。
20. —種制備權利要求1-9的多聚體試劑的方法，所述方法通過使同 官能-多官能試劑Z與同官能或異官能聚合物X-Pol-Y反應，以形成穩定 的鍵和獲得Z-(X-Pol-Y)n。
21. 權利要求20的方法，其中所述反應通過匯集合成進行。
22. —種制備權利要求10-18的多聚體綴合物的方法，所述包括下列 步驟-將權利要求中定義的生物活性試劑和多聚體試劑溶解在合適的溶 劑中；-使在權利要求20或21中獲得的多聚體試劑Z-(X-Pol-Y、與所述生物活性試劑在所述生物活性試劑的相同的溶液中反應；和-將所述多聚體綴合物純化為基本上同質的制劑。
23. 權利要求22的方法，其中所述溶劑能夠溶解所述生物活性試劑和 所述多聚體試劑二者。
24. 權利要求22或23的方法，其中將所述生物活性試劑以0.1-25 mg/ml，優選l-10mg/ml的濃度溶解在所述溶劑中。
25. 權利要求22-24的方法，其中所述溶劑具有在3和12之間，優選 在4和10之間，更優選在5和9之間的pH。
26. 權利要求25的方法，其中所述溶劑具有小于250 mM，優選在10 和150mM之間，更優選在50和100mM之間的緩沖鹽的濃度。
27. 權利要求22-26的方法，其中所述溶劑含有添加劑，例如鹽、穩 定劑、變性劑、和還原劑或氧化劑。
28. 權利要求22-27中一項或多項的方法，其中參考待多聚化的所述 生物活性試劑的摩爾量，將所述多聚體試劑Z-(X-Pol-Y)n以l:n以下的摩 爾比加入到所述生物活性試劑的溶液中。
29. 權利要求22-28中一項或多項的方法，其中所述反應溶液被連續 均化，并保持在0'C和50°C，優選4。C和37t:，更優選4。C和25。C之間的 溫度。
30. 權利要求22-29中一項或多項的方法，其中將所述多聚體綴合物 純化為純度>90重量％，更優選>95重量％的基本上同質的制劑。
31. 權利要求30的方法，其中所述純化通過色譜法、沉淀、或尺寸排 阻諸如滲析或交叉流動過濾進行。
32. —種可通過權利要求20或21的方法獲得的多聚體試劑。
33. —種可通過權利要求22-30中一項或多項的方法獲得的多聚體綴
34. 根據權利要求10-18或33中一項或多項的多聚體綴合物用于診 斷、預防和治療其中直接或間接涉及相應的結合配偶體的疾病的用途。
全文摘要
本發明涉及一種多聚體試劑和一種由此多聚體試劑和生物活性試劑形成的多聚體綴合物。所述多聚體綴合物與未修飾的生物試劑相比，具有較長的體內壽命和增加的親和力。本發明還涉及一種包含所述綴合物的藥物或診斷組合物及其生產方法。本發明另外提供所述綴合物用于檢測、確定、分開和/或分離特異性結合配偶體以及用于診斷、預防和治療其中直接或間接涉及所述特異性結合配偶體的疾病的用途。
文檔編號A61K47/48GK101616691SQ200880004542
公開日2009年12月30日 申請日期2008年2月11日 優先權日2007年2月9日
發明者烏爾里克·菲德勒, 埃里克·菲德勒, 弗蘭克·里恩德爾斯, 托馬斯·海伊, 拉爾夫·克雷默, 馬爾庫斯·菲德勒 申請人:希爾蛋白質有限公司