專利名稱：：一種治療水痘的藥物及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種治療水痘的藥物及其制備方法，屬于血液制品領域。
背景技術：
：水痘-帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)感染引起的疾病。VZV感染是兒童期常見的疾病，可通過呼吸道分泌物傳播，傳染性強。健康兒童感染多癥狀輕微，但在某些特殊人群如免疫功能不全者會導致皮損異常大的播散性感染、繼發性A群鏈球菌和金黃色葡萄球菌等條件致病菌的感染及肺、腦、肝、腎、心、眼等臟器損傷等并發癥，甚至死亡。隨著器官移植與社會人口老年化的進程，VZV感染會很常見，也是亟待解決的問題。雖然水痘疫苗可以有效預防水痘的發生，但全世界仍有很多人未接種水痘疫苗，因此，可以治療水痘的藥物仍然為本領域研究重點之一。歐洲藥典公開了規格為25IU/ml的水痘人免疫球蛋白靜脈注射劑，采用篩選自然感染人群恢復期血漿為原料制備而得，用于水痘的預防。目前，未見有能夠有效治療水痘的藥物的相關報道。
發明內容本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種能夠有效治療水痘的藥物。本發明治療水痘的藥物是以水痘人免疫球蛋白為主要活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而成的制劑；其中，所述的水痘人免疫球蛋白采用人體進行水痘疫苗免疫后所得血漿為原料制備而得。其中，上述人體進行水痘疫苗免疫后所得血漿中水痘病毒抗體效價》8IU/ml。所述的血漿的來源如下1、使用凍干水痘減毒活疫苗對獻血員進行免疫注射。3個月后再次對獻血員進行加強免疫注射。2、收集獻血員加強免疫注射3個月后的血漿，并測定血漿中水痘病毒抗體效價，水痘病毒抗體效價》8U/ml的血漿為合格血漿。進一步的，本發明治療水痘的藥物，其水痘人免疫球蛋白的制備方法包括如下步驟a、融化血漿將水痘病毒抗體效價》8IU/ml的原料血漿于04。C融化；b、組分分離用質量百分含量為0.9%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質含量為4555g/L，調節pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為8%，反應過程溫度控制在-2.5±0.5°C，離心分離上清液，即得FI反應液；c、過濾將FI反應液調節pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇終濃度為20%，將反應液溫度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附雜質，攪拌、靜置、過濾，所得沉淀即為FII+III沉淀；d、沉淀溶解將FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化鈉溶液溶解，調節溶液pH值至5.10±0.05，調節溶液離子強度為O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為17%，控制溶液溫度為-4.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，所得濾液即為FII濾液；e、濾液沉淀FII濾液中加入氯化鈉溶液，調節溶液離子強度為0.05，調節溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為25%，每升乙醇補加lmol/L氯化鈉溶液0.05L，控制最終反應液溫度為一7.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，即得FII沉淀；f、層析FII沉淀用注射用水溶解后過濾，濾液用注射用水透析脫醇，然后用陰離子交換凝膠層析純化，得到IgG溶液；g、超濾將IgG溶液超濾，所得超濾液4倍濃縮，然后用注射用水調節超濾液中蛋白濃度為15士5g/L，用0.5mol/L的鹽酸調節超濾液pH值至4.8士0.1、電導率不超過350uS/cm;h、巴氏滅活病毒將g步驟所得溶液于60士0.5i:水浴中連續加溫10小時；i:低PH孵放滅活病毒將h步驟滅活病毒后的蛋白溶液過濾、澄清、再次超濾，濃縮或凍干即得。其中，上述制劑的劑型優選為靜脈注射劑。進一步的，所述靜脈注射劑的規格為50IU/ml，40ml。本發明所要解決的第二個技術問題是提供上述靜脈注射劑的制備方法，該方法包括如下步驟a、融化血漿將水痘病毒抗體效價》8IU/ml的原料血漿于04。C融化；b、組分分離用質量百分含量為0.9%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質含量為4555g/L，調節pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為8%，反應過程溫度控制在-2.5±0.5°C，離心分離上清液，即得FI反應液；c、過濾將FI反應液調節pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇終濃度為20%，將反應液溫度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附雜質，攪拌、靜置、過濾，所得沉淀即為FII+III沉淀；d、沉淀溶解將FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化鈉溶液溶解，調節溶液pH值至5.10±0.05，調節溶液離子強度為O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為17%，控制溶液溫度為-4.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，所得濾液即為FII濾液；e、濾液沉淀FII濾液中加入氯化鈉溶液，調節溶液離子強度為0.05，調節溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為25%，每升乙醇補加lmol/L氯化鈉溶液0.05L，控制最終反應液溫度為一7.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，即得FII沉淀；f、層析FII沉淀用注射用水溶解后過濾，濾液用注射用水透析脫醇，然后用陰離子交換凝膠層析純化，得到IgG溶液；g、超濾將IgG溶液超濾，所得超濾液4倍濃縮，然后用注射用水調節超濾液中蛋白濃度為15士5g/L，用0.5mol/L的鹽酸調節超濾液pH值至4.8士0.1、電導率不超過350uS/cm;h、巴氏滅活病毒將g步驟所得溶液于60士0.5i:水浴中連續加溫10小時；i:低PH孵放滅活病毒將h步驟滅活病毒后的蛋白溶液過濾、澄清、再次超濾，然后用0.5mol/L的鹽酸調整蛋白溶液pH值為3.84.4、水痘病毒抗體效價》50IU/ml，補加麥芽糖至麥芽糖質量濃度為10%，過濾除菌，然后于2325。C放置21天；j:成品分裝按所需規格分裝、即得。其中，a步驟中所用的原料血漿應采用國家批準的診斷試劑進行傳染性病原微生物標志物如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HCV抗體、HIV(1+2)抗體、梅毒、ALT等復核檢査，結果應為陰性。剔除不符合要求的血漿，嚴格防止在融漿操作過程中不符合要求的血漿袋與正常血漿交叉污染。裝血漿的血漿袋表面應消毒，然后破袋、融化血漿。其中，b步驟用質量百分含量為O.9%的氯化鈉溶液稀釋血漿蛋白的目的是增加c步驟沉淀中IgG的含量。其中，b、c、d步驟中調節pH值所用的pH值調節劑可以為常規的靜脈注射液pH值調節劑，優選為pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液。其中，為了c步驟中硅藻土的吸附效果最好且不浪費硅藻土以節約成本，硅藻土加入量優選為每升溶液18g。其中，d步驟為了使沉淀中的組分IgG充分溶解，沉淀溶解選用用6-12倍W/V的0.01mol/L氯化鈉溶液溶解。其中，e步驟加入lmol/L氯化鈉溶液，并調整pH值至6.90士0.05，力陽5%的乙醇至終濃度為25%，其目的是提高高純度IgG的收率。e步驟中調節pH值所用的pH值調節劑為lmol/L的NaHC03溶液其中，f步驟透析脫醇所用透析袋的截留分子量為30KD，f步驟層析時，采用PS370型陰離子交換凝膠柱，以PH值為6.7士0.3的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，調整蛋白質濃度為1545g/L、pH值為6.7±0.3，上樣，流速控制為40120cm/h，收集IgG，上樣結束后，用磷酸鹽緩沖液洗滌層析柱上的殘余IgG，與收集的IgG液合并。凝膠層析去除了溶液中絕大部分的雜蛋白與IgA，使流出液IgG的純度》99。/。，IgG單體與二聚體的含量》97呢。其中，h步驟處理中間品時未加保護IgG的穩定劑，目的是強化滅活病毒效果；巴氏加熱方法可滅活脂包膜與非脂包膜病毒，常規巴氏加熱方法滅活產品的pH值為7.0，本發明中采用巴氏加熱方法滅火病毒時溶液的pH值為4.8士0.1，可以提高滅活速率，其滅活病毒種類譜顯著較單純的低pH孵放法廣泛(對非脂包膜病毒有效)。h步驟滅活病毒結果滅活HIV、VSV、Sindbis與Polio-l均2;4Log數量病毒。其中，i步驟中所述的再次超濾所用的超濾膜截留分子量為10KD。為了確保病毒滅活完全，i步驟進行低pH孵放滅活病毒，低pH孵放滅活病毒對HAV(甲型肝炎病毒，H印atitisAVirus)與人細小病毒B19(humanparvovirusB19)等非脂包膜病毒滅活效果較好。其中，j步驟所述的規格為50IU/ml，40ml。本發明所要解決的第三個技術問題是提供了上述藥物在制備治療或預防巨細胞病毒疾病的藥物中的用途。本發明藥物可以有效治療水痘，還能用于治療或預防巨細胞病毒疾病，為巨細胞病毒疾病的預防和治療提供了一種新的途徑，本發明方法制備的靜注水痘人免疫球蛋白，其質量好、收率與純度高(IgG的純度》99。/。，IgG單體與二聚體的含量》97。/。)、病毒安全性高，具有廣闊的應用前景。具體實施例方式下面結合實施例對本發明的具體實施方式做進一步的描述，并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。實施例l水痘人免疫球蛋白的制備1、使用中國生物制品總公司長春生物制品研究所生產的O.5ml/支的凍干水痘減毒活疫苗對獻血員進行免疫注射。3個月后再次對獻血員進行加強免疫注射。2、收集獻血員加強免疫注射3個月后的血漿，并測定血漿中水痘病毒抗體效價，水痘病毒抗體效價》8U/ml的血漿為合格血漿。3、生產前每袋血漿采用國家批準的診斷試劑進行傳染性病原微生物標志物如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HCV抗體、HIV(1+2)抗體、梅毒、ALT等復核檢査，結果應為陰性。剔除不符合要求的血漿，嚴格防止在融漿操作過程中不符合要求的血漿袋與正常血漿交叉污染4、血漿袋表面消毒、破袋、融化血漿溫度至04。C，按低溫乙醇蛋白分離法進行組分分離以9g/L氯化鈉溶液稀釋血漿蛋白質含量至4555g/L，調節pH值7.0±0.4，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為8%。將反應液溫度控制在-2.5±0.5°C。5、將FI反應液調節pH值6.80士0.10，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為20%。將反應液溫度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土，攪拌后過濾，收集的沉淀立即于-3(TC以下存放。6、FI+n+III沉淀物溶解后，調節pH值5.10±0.05，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為17%，控制反應液溫度在-4.5±0.5°C。攪拌、靜置后過濾。7、每升濾過液加入lmol/L氯化鈉溶液O.04L，調節反應液pH值6.90±0.05，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為25%，每升乙醇補加lmol/L氯化鈉溶液O.05L最終反應液溫度控制在一7.5士0.5。C，攪拌靜置后過濾，收集沉淀。8、FII沉淀物以注射用水溶解后過濾，濾過液以注射用水透析脫醇。采用陰離子交換凝膠層析，以P朋.7士0.3磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，調整蛋白質濃度1545g/L、p朋.7士0.3，上樣，流速40120cm/h，使FII溶液流穿過層析柱，收集IgG。上樣結束后，用磷酸鹽緩沖液洗滌層析柱上的殘余IgG，與流穿液合并轉入下工序。用l2mol/L氯化鈉溶液洗脫吸附在層析柱上的雜蛋白，用0.2lmol/L氫氧化鈉溶液再生。填充料滿載時，再生使用不超過400個循環。9、層析后超濾，調整蛋白質濃度15士5g/L、pH4.8士0.1、電導率不超過350uS/cm后輸入巴氏滅活罐。10、制品在60士0.5"C水浴中連續加溫10小時，以滅活可能殘留的污染病毒。11、滅活后再次超濾，調整PH3.84.4、水痘抗體效價不低于50IU/ml，除菌過濾，將制品于2325'C，放置21天，進行低pH孵放滅活病毒。滅活結束將制品轉入28'C冷庫存放原液經純化、超濾、除菌過濾后即為水痘人免疫球蛋白原液。實施例2靜脈注射用水痘人免疫球蛋白的制備用實施例1制備的水痘人免疫球蛋白原液配制靜脈注射劑，使靜脈注射劑中IgG含量不低于50g/L、水痘抗體效價不低于50IU/ml，并補加入麥芽糖至10%。在萬級局部一百級潔凈間進行分裝，每瓶分裝2000IU(50IU/ml，40ml)/瓶，含人血來源水痘抗體2000IU，效價不低于50IU/ml，裝量40ml。試驗例l靜脈注射用水痘人免疫球蛋白的質量檢測及結果靜注水痘人免疫球蛋白，規格2000IU(50IU/ml，40ml)/瓶，代表數量2000瓶，抽檢數量20瓶。檢驗依據參考靜注乙型肝炎人免疫球蛋白國家注冊標準YBS00102008。靜注水痘人免疫球蛋白的質量檢測及結果見表l。表l靜脈注射用水痘人免疫球蛋白的質量檢測及結杲<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>試驗例2水痘人免疫球蛋白以巨細胞病毒為靶抗原的特異性抗體效價測定1、試驗目的由于特異性抗體效價的量與人免疫球蛋白中和相關病毒后的細胞蝕斑計數呈負相關關系，因此，如果本發明水痘人免疫球蛋白中所含的巨細胞病毒抗體效價能基本達到靜注巨細胞病毒人免疫球蛋白特異性抗體效價水平，即可確定本發明水痘人免疫球蛋白能預防和治療巨細胞病毒疾病。測定本發明水痘人免疫球蛋白含巨細胞病毒抗體效價，以靜注巨細胞病毒人免疫球蛋白為陽性對照。2、材料與方法2.1免疫球蛋白2.1.1本發明7K痘人免疫球蛋白(Humanvaricellaimmunoglobulin,HVIG)，試制品，批號200605101，IgG含量:125.9g/L，規格2ml/瓶，檢測效價13.28IU/ml。2.1.2靜注巨細胞病毒人免疫球蛋白(HumanCytomegalovirusImmunoglobulinforIntravenousAdministration,HCIG)，Lot:MIVCMV-198，IgG含量52g/L，規格10g/瓶失效期6-19-2006，檢測效價76.82IU/ml。MassachusettsPublicHealthBiologicLaboratoriesUSA生產。2.2IgG酶聯免疫試劑盒2.2.1水痘-帶狀皰疹病毒IgG酶聯免疫試劑盒(VaricellaZosterVirusIgGELISA)，德國IBL-HamburgGmbH公司產品，批號VG-173。2.2.2巨細胞病毒IgG酶聯免疫試劑盒(CytomegalovirusIgGELISA)，意大利DIESSE公司產品，批號142。2.3方法2.3.l檢驗條件與操作程序分別按IgG酶聯免疫試劑盒的說明書進行。2.3.2受試品的稀釋度使用IgG酶聯免疫試劑盒配置的稀釋液稀釋受試品。通過效價初篩試驗，分別取得每個IgG受試品適宜的一個稀釋度。2.3.3受試品的0D均值每個相同的樣品分別加入到8個定量酶標孔，統計得到的除去最高、最低2個值后6個0D值的均值。2.3.4標準曲線對數回歸系數分別使用5個質控品的標示量與0D檢測均值通過對數回歸求得質控品的檢測值，再使用該方程代入5個質控品的標示量分別計算出相應的校正0D值，使標準曲線對數回歸系數》99.9%。2.3.5校正系數與校正值質控品抗體效價標示值/檢測值=校正系數(F系數)，如果受試品的抗體效價檢測值位于兩個F系數相差較大的區間時，采用兩個相鄰的效價檢測值校正系數之和/兩個相鄰的標示效價值之和X該受試品的檢測效價值4亥受試品的F系數。每個受試品的效價檢測值X校正系數二校正值(F值)。3、試驗結果試驗結果見表2。表2水疸、巨細胞病羞免疫球蛋白與相應靶抗原的待異性抗體效價測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表2可以看出，本發明水痘人免疫球蛋白與巨細胞病毒人免疫球蛋白所含的巨細胞病毒抗體效價相近(分別為877、1477mlU/mg);此外，水痘人免疫球蛋白與巨細胞病毒人免疫球蛋白所含的水痘病毒抗體效價相當(分別為105.5、100mlU/mg)，所以確定水痘疫苗能誘發人體產生巨細胞病毒抗體。據此推測，本發明水痘人免疫球蛋白能夠預防和治療巨細胞病毒感染性疾病。權利要求1.一種治療水痘的藥物，其特征在于它是以水痘人免疫球蛋白為主要活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而成的制劑；其中，所述的水痘人免疫球蛋白是采用人體進行水痘疫苗免疫后所得血漿為原料制備而得。2、根據權利要求l所述的治療水痘的藥物，其特征在于所述的人體進行水痘疫苗免疫后所得血漿中水痘病毒抗體效價》8IU/ml。3、根據權利要求2所述的治療水痘的藥物，其特征在于所述的水痘人免疫球蛋白的制備方法包括如下步驟a、融化血漿將水痘病毒抗體效價》8IU/ml的原料血漿于04。C融化；b、組分分離用質量百分含量為0.9%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質含量為4555g/L，調節pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為8%，反應過程溫度控制在-2.5±0.5°C，離心分離上清液，即得FI反應液；c、過濾將FI反應液調節pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇終濃度為20%，將反應液溫度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附雜質，攪拌、靜置、過濾，所得沉淀即為FII+III沉淀；d、沉淀溶解將FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化鈉溶液溶解，調節溶液pH值至5.10±0.05，調節溶液離子強度為O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為17%，控制溶液溫度為-4.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，所得濾液即為FII濾液；e、濾液沉淀FII濾液中加入氯化鈉溶液，調節溶液離子強度為0.05，調節溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為25%，每升乙醇補加lmol/L氯化鈉溶液0.05L，控制最終反應液溫度為一7.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，即得FII沉淀；f、層析FII沉淀用注射用水溶解后過濾，濾液用注射用水透析脫醇，然后用陰離子交換凝膠層析純化，得到IgG溶液；g、超濾將IgG溶液超濾，所得超濾液4倍濃縮，然后用注射用水調節超濾液中蛋白濃度為15士5g/L，用0.5mol/L的鹽酸調節超濾液pH值至4.8士0.1、電導率不超過350uS/cm;h、巴氏滅活病毒將g步驟所得溶液于60士0.5i:水浴中連續加溫10小時；i:低PH孵放滅活病毒將h步驟滅活病毒后的蛋白溶液過濾、澄清、再次超濾，濃縮或凍干即得。4、根據權利要求l所述的治療水痘的藥物，其特征在于所述制劑的劑型為靜脈注射劑。5、根據權利要求4所述的治療水痘的藥物，其特征在于所述靜脈注射劑的規格為50IU/ml，40ml。6、權利要求4所述的靜脈注射劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟a、融化血漿將水痘病毒抗體效價》8IU/ml的原料血漿于04。C融化；b、組分分離用質量百分含量為0.9%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質含量為4555g/L，調節pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反應液乙醇濃度為8%，反應過程溫度控制在-2.5±0.5°C，離心分離上清液，即得FI反應液；c、過濾將FI反應液調節pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇終濃度為20%，將反應液溫度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附雜質，攪拌、靜置、過濾，所得沉淀即為FII+III沉淀；d、沉淀溶解將FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化鈉溶液溶解，調節溶液pH值至5.10±0.05，調節溶液離子強度為O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為17%，控制溶液溫度為-4.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，所得濾液即為FII濾液；e、濾液沉淀FII濾液中加入氯化鈉溶液，調節溶液離子強度為0.05，調節溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為25%，每升乙醇補加lmol/L氯化鈉溶液0.05L，控制最終反應液溫度為一7.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，即得FII沉淀；f、層析FII沉淀用注射用水溶解后過濾，濾液用注射用水透析脫醇，然后用陰離子交換凝膠層析純化，得到IgG溶液；g、超濾將IgG溶液超濾，所得超濾液4倍濃縮，然后用注射用水調節超濾液中蛋白濃度為15士5g/L，用0.5mol/L的鹽酸調節超濾液pH值至4.8士0.1、電導率不超過350uS/cm;h、巴氏滅活病毒將g步驟所得溶液于60士0.5i:水浴中連續加溫10小時；i:低PH孵放滅活病毒將h步驟滅活病毒后的蛋白溶液過濾、澄清、再次超濾，然后用O.5mol/L的鹽酸調整蛋白溶液pH值為3.84.4、水痘病毒抗體效價》50IU/ml，補加麥芽糖至麥芽糖質量濃度為10%，過濾除菌，然后于2325。C放置21天；j:成品分裝按所需規格分裝、即得。7、根據權利要求6所述的靜脈注射劑的制備方法，其特征在于b、c、d步驟中調節pH值所用的pH值調節劑為pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液；e步驟中調節pH值所用的pH值調節劑為lmol/L的^Ht^溶液。8、根據權利要求6所述的靜脈注射劑的制備方法，其特征在于c步驟中硅藻土的加入量為每升溶液18g。9、根據權利要求6所述的靜脈注射劑的制備方法，其特征在于f步驟透析脫醇所用透析袋的截留分子量為30KD;i步驟中所述的再次超濾所用的超濾膜截留分子量為10KD。10、權利要求15任一項所述的藥物在制備治療或預防巨細胞病毒疾病的藥物中的用途。全文摘要本發明涉及一種治療水痘的藥物及其制備方法，屬于血液制品領域。本發明所解決的技術問題是提供了一種能夠有效治療水痘的藥物。本發明治療水痘的藥物是以水痘人免疫球蛋白為主要活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而成的制劑；其中，所述的水痘人免疫球蛋白采用人體進行水痘疫苗免疫后所得血漿為原料制備而得。本發明藥物還可用于治療或預防巨細胞病毒疾病，具有廣闊的應用前景。文檔編號A61P31/22GK101361973SQ20081030464公開日2009年2月11日申請日期2008年9月24日優先權日2008年9月24日發明者魏憲義申請人:四川遠大蜀陽藥業股份有限公司;魏憲義