專利名稱：一種升高高密度脂蛋白、防治動脈粥樣硬化的藥物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種升高高密度脂蛋白(HDL)、防治動脈粥樣硬化的藥物及其制備方法。
背景技術：
脂蛋白代謝的異常與動脈粥樣硬化發生、發展關系密切。已有大量臨床證據顯示，長期 良好的控制血脂，降低血中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)， 升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，可以減輕并抑制動脈粥樣斑塊，增加粥樣斑塊的穩定性， 減少大血管事件的發生。目前，臨床用于升高HDL、降低LDL抗動脈粥樣硬化的藥物主要 有
.他汀類，不良反應輕微，嚴重的不良反應少見，包括橫紋肌溶解癥(表現肌痛、無力、 肌酸磷酸酶升高等癥狀)、肝炎以及血管神經性水腫等。與苯氧酸類、煙酸、紅霉素、環孢霉 素合用可增加橫紋肌溶解癥的發生率使其加重。2001年8月8日拜耳制藥公司發出緊急指示 立即停止銷售且召回西立伐他汀鈉。因美國有31例，其他國家有21例服用此藥而死亡，其 中12例同時服用吉非貝齊。此外，全世界報道因服用此藥發生致死性橫紋肌溶解癥者有480 例。同年中國SFDA發出通知，暫停銷售和使用西立伐他汀鈉。西立伐他汀鈉事件引起醫藥 界對調血脂藥物與肌病、橫紋肌溶解癥關系的高度重視。
煙酸類雖可升高HDL，但不良反應多，如面部潮紅、心悸和惡心嘔吐、腹瀉等。大劑量 可引起血糖和血尿酸濃度增高、肝功能異常和變態反應等。
貝特類可致橫紋肌溶解癥， 一旦發生可能非常嚴重，引起肌紅蛋白尿癥和腎衰，尤見 于已有腎損傷的病人。此外，苯氧酸類可致腹痛、腹瀉、惡心等胃腸道反應。少數患者出現 變態反應。可見輕度一過性肝臟轉氨酶升高。由于氯貝特有導致膽結石的作用，故使用應限 定在已實施了膽囊切除術的患者。
膽汁酸結合樹脂不良反應較多，常見胃腸道不適、便秘；血漿TG水平增加；長期應
用，干擾脂溶性維生素及如干擾氯噻嗪、地高辛和華法林等藥物的吸收。大劑量發生脂肪痢等；考來烯胺因以氯化物形式應用，長期應用可引起高氯性酸血癥。上述藥物要么療效欠
佳、要么不良反應難以耐受。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有升高HDL、調節血脂、預防動脈粥樣硬化作用的中藥有效 部位——南蛇藤莖含有的萜類(COTTs)成分，與現有藥物比較具有高效、低毒、價廉、患 者耐受性好的優勢，這是利用南蛇藤莖(首創性的拓寬藥用部位)提取得到的砲類成分。
一種升高高密度脂蛋白、防治動脈粥樣硬化的藥物，其特征在于，它是南蛇藤莖的砲類 提取物。
所說的南蛇藤莖的提取物通過以下方法提取將南蛇藤莖用乙醇提取得浸膏，浸膏加水 分散后再經石油醚萃取、乙酸乙酯萃取，然后收集乙酸乙酯層，用水洗滌后，減壓濃縮，干 燥，得南蛇藤莖萜類成分。
本專利將衛矛科南蛇藤屬植物南蛇藤CWaWmy oAz'cw/art^ Thunb. (COT)的干燥藤莖分 離提取獲得的主要有效成分萜類(Terpenes)應用于正常大鼠，發現應用南蛇藤莖砲類(COTTs) 成分的大鼠血清膽固醇降低、HDL顯著升高，可預防動脈粥樣硬化，這是首次發現南蛇藤莖 所含有的萜類具有的此作用，迄今為止，尚未見類似報道。在此基礎上我們針對南蛇藤所含 有的豐富的萜類化合物進行成分分析及其制備的工藝進行了研究。
具體實施例方式
實施例一南蛇藤莖萜類成分的提取
取南蛇藤莖飲片，加6倍量95%乙醇提取2次，合并提取液，回收乙醇，浸膏加水分散 后用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層，用水洗滌3次后，減壓濃 縮，干燥，得南蛇藤莖萜類成分。
對南蛇藤莖提取物的乙酸乙酯部位進行相關的化學研究已分離鑒定雷公藤內酯甲，雷 公藤內酯乙，常春藤皂苷元、3p-乙酰齊墩果酸、山海棠二砲內酯A、 (-)-16a-hydroxykauran-19-oicacid、異槲皮苷、槲皮素-7-O-卩-D-葡萄糖苷、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、澤蘭黃素、2,4,6-三甲氧基苯酚-l-0-(3-D-葡萄糖苷、衛矛醇等。
上述發明中所述的提取溶劑為50% 100% (W/W)乙醇，上述發明中的干燥方法為噴 霧干燥。
萜類的含量在50%以上。
實施例二升高HDL、防治動脈粥樣硬化的應用 l.COTTs對脂質代謝的影響及抗氧化作用。
(1) 小鼠高脂血癥模型及COTTs干預作用
建立高血脂模型組喂食高脂飼料(配方膽固醇0.3%+蛋黃粉10%+豬油10%+基礎飼 料79.2%+0.5%膽酸鹽)，自由進食，進水，每天一次給予灌服0.2mg/10g的蒸餾水，在造模 同時連續給予四周蒸餾水。
(2) 高血脂模型組+辛伐他汀，灌服4.0mg/Kg的辛伐他汀溶液四周。
(3) 高脂模型組+南蛇藤萜(實施例一制得):灌服200， 120，60mg/kg四周。 末次給藥后禁食12h，①采血，全血自動生化分析儀檢測血清各項指標。②處死小鼠，小鼠 取出肝臟，福爾馬林固定，乙醇梯度洗脫，石蠟包埋，然后用旋轉切片機(Lieca 2135, Germany) 切成5 ii m薄片，采用hematoxylin and eosin (H&E)染色。
結果如表1
表1.南蛇藤總萜對高脂血癥小鼠血清脂質的影響(x-±S,n=10)
組別
正常組 模型組 陽性組 南高組 南中組 南低組
TC (咖o1/1)
TG(mmo1/1)
LDL (咖o1/1)
HDL(mmo1/1)
3. 41±0. 85
4. 97 ±0. 57*
3. 67±0. 38A
4. 05±0.56 4. 20±0. 50 4. 47 ±0. 56*
0. 99±0. 25
1. 11±0. 31 1. 08±0. 13 0.96±0.24 0. 87±0.21 1.08±0.21
0. 18±0. 09 0. 25±0. 03* 0. 18±0. 09A 0.19±0.08 0. 23±0. 06 0. 21±0. 06
3. 03 ±0. 62AA 1.65±0. 58* 1. 79±0. 44' 3.61±0.60A' 3. 84±0.61A' 1. 75±0. 38
注與正常組比較，*p<0.05;與模型組比較，AP<0.05， AAP<0.01a. 建立高脂血癥模型,連續經口給予COTTs四周，可顯著升高HDL、降低血總膽固醇、甘 油三酯和血清脂蛋白，效果優于辛伐他汀；
b. 建立高脂血癥模型,連續經口給予COTTs四周，COTTs組血清脂質過氧化物產物丙二醛、 氧化型低密度脂蛋白顯著降低,超氧化物歧化酶活力增強，抗氧化效果優于抗氧化劑普羅 不考。
2.COTTs防治動脈粥樣硬化
(1) COTTs對動脈粥樣硬化家兔模型的干預效果
建立高脂模型健康家兔喂詞高脂飼料(1%膽固醇+8%豬油+7%蛋黃粉+84%基礎飼料)， 除對照組外，各組于耳中動脈一次性注射牛血清白蛋白(250mg/kg)，對血管內皮產生免疫損 傷，5周后形成類似人AS的病變。 自由進食，進水，模型組造模同時灌以蒸餾水。
(2) 陽性對照組模型組+辛伐他汀，灌服4.0mg/Kg的辛伐他汀溶液5周。
(3) 治療組模型組+南蛇藤萜(實施例一制得)灌服120， 60，30mg/kg 5周。 末次給藥后禁食12h，
a.取兔主動脈，進行血管平滑肌細胞(VSMC)培養，經10、 20、 40、 80、 160ug/ml 系列濃度的COTTs干預，對體外培養VSMC增殖的影響取對數生長的VSMC,接種于96孔板， 每孔200ul， C02培養箱培養，待細胞的貼壁融合率達60%左右時，吸棄培養基，分別加入 含不同濃度COTTs的培養基200iU，每組設3孔，另設正常細胞對照組和空白對照組，實驗終 止前4h加入MTT液，每孔20iU，繼續培養4h，置微量振蕩器上低速振蕩IO min， 570 nm波 長處測定A值，計算生長抑制率(％) =(1-用藥組平均吸光度/對照組平均吸光度)X100%。 以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制量效關系曲線，計算IQo。
COTTs體外對VSMC增殖的影響在80 160u g L i濃度下對VSMC細胞的增殖具有抑 制作用，并呈明顯的劑量依賴效應關系，IQo為154ug'L — 1b.家兔主動脈血管內皮平滑肌細胞培養，用同上濃度的COTTs作用于傳代培養的細胞， 發現COTTs對血管內皮平滑肌的增殖有抑制作用，表明COTTs對動脈粥樣斑塊內新生血管 具抑制作用、并可穩定脆性粥樣斑塊。
取兔主動脈甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。
新生血管免疫組織化學檢測對偶數張切片進行免疫組織化學染色石蠟切片用SP法 染色，新生血管染色呈棕黃色/棕褐色，內皮細胞標志物CD31染色為陽性結果。計數方法為 每張切片選擇3個血管最多的區域，400倍光鏡下計數，取平均每個視野的新生血管數定為新 生血管密度。新生血管的判斷標準凡是染成棕黃色，數個內皮細胞或內皮細胞簇作為l個新 生血管(管腔較大、有較厚肌層的血管均不計數)。應用COTTs抑制新生血管形成的作用高 劑量組8.7士1.6 (支)，與模型組比較(14.3±3.4)差異極顯著；中、低劑量組亦有顯著性差 異。
主動脈形態學檢查第5周處死動物，自主動脈瓣至髂動脈分叉處取出主動脈，在背側 面縱行切開，從主動脈弓取約lcm標本，用40g/L多聚甲醛(pH7.4)固定，低溫石蠟包埋、切片， 然后HE染色。
肉眼觀察主動脈斑塊情況主動脈剖開后,對照組主動脈內膜表面光滑，未見動脈粥樣 斑塊，AS模型組病變嚴重，粥樣斑塊面積大，分級為2 3級，廣泛累及各段內膜，粥樣斑塊 厚。主動脈組織切片顯微鏡可見對照組主動脈內膜完整，AS模型組內膜顯著增厚，內皮多 處破損，并有數層泡沫細胞，內膜下SMC由斑塊深部向淺層增生明顯，位于病灶深部SMC大多 呈長梭形，淺層者多為梭形或類圓形，細胞外基質明顯增多；C0TTs處理后，低劑量組內皮破 損輕微，有散在的少量泡沫細胞出現，細胞外基質增加不明顯，尤為高劑量下，主動脈內膜 較光滑，內膜下未見SMC增生。
權利要求
1、一種升高高密度脂蛋白、防治動脈粥樣硬化的藥物，其特征在于，它是南蛇藤莖的萜類提取物。
2、 制備權利要求1所說的藥物的方法，其特征在于，將南蛇藤莖用乙醇提取得浸膏，浸膏加 水分散后再經石油醚萃取、乙酸乙酯萃取，然后收集乙酸乙酯層，用水洗滌后，減壓濃縮， 干燥，得南蛇藤莖萜類成分。
3、 如權利要求1所說的制備方法，其特征在于，取南蛇藤莖飲片，加6倍量95%乙醇提取2 次，合并提取液，回收乙醇，浸膏加水分散后用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次， 收集乙酸乙酯層，用水洗滌3次后，減壓濃縮，干燥，得南蛇藤莖砲類成分。
全文摘要
本發明公開了一種升高高密度脂蛋白(HDL)、防治動脈粥樣硬化的藥物及其制備方法。它是從南蛇藤屬植物南蛇藤莖中提取分離得到的萜類部位。經藥理學實驗證明，該提取物對正常及高脂模型動物具有良好的預防和治療作用，它的有效成分較明確，有利于保證調節血脂、預防AS的有效性和長期使用的安全性。
文檔編號A61K36/185GK101439075SQ20081024255
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月23日 優先權日2008年12月23日
發明者慧 劉, 云 孫, 強 王, 夏 邱 申請人:揚州大學