專利名稱：瘧原蟲環子孢子蛋白抗腫瘤增殖和遷移的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質的新用途，特別涉及癥原蟲環子孢子蛋白抗肺瘤增 殖和遷移的新用途。
背景技術：
研究發現，核因子-kB (NF-kB)是架接炎癥和腫瘤的橋梁。腫瘤培育巨噬 細胞(tumor-educated macrophage)分泌的腫瘤壞死因子-a ( TNF-a )通過與腫 瘤細胞膜表面的TNF-a受體結合，可活化NF-kB,促進腫瘤的存活和增殖。Toll 樣受體(Toll-like receptor, TLR)激動劑也可通過與腫瘤細胞膜表面的TLR結 合，活化NF-kB,促進胂瘤的存活和增殖。因此，NF-kB抑制劑是治療腫瘤的 重要手段。
環子孑包子蛋白(circumsporozoite protein, CSP )是^篁蓋于疾原蟲子孑包子表面 的主要蛋白，通過與肝細胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPGs)特異性結合，可介導子孢子特異性粘附于肝細胞膜上， 是子孢子特異入侵肝細胞的重要蛋白之一。最近的研究發現，侵入肝細胞后， 位于納蟲空泡的子孢子表面的CSP能借助其pelex功能域從納蟲空泡中溢出， 進入細胞漿中，竟爭性抑制NF-kB進入細胞核內，抑制NF-kB的活化和局部的 炎癥反應，從而逃避宿主對瘧原蟲的免疫攻擊。因此，CSP是NF-kB抑制劑。
迄今為止，未見癡原蟲CSP抑制肺瘤增殖和遷移的相關才艮道。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供瘧原蟲CSP在制備抗腫瘤增殖和遷
移的藥物中的用途。
進一步，所述腫瘤為肝癌和結腸癌。
3本發明的目的之二在于提供含有編碼瘧原蟲CSP的基因的重組表達載體在
制備抗腫瘤增殖和遷移的藥物中的用途。 進一步，所述腫瘤為肝癌和結腸癌。
本發明的有益效果在于本發明成功構建了 CSP的重組表達載體pFLAG-CMV8-CSP,并通過脂質體轉染的方式將其轉染入人肝癌細胞株HepG2和結腸 癌細胞株SW480,研究結果顯示，CSP主要表達于HepG2細胞的胞漿內，能夠 抑制TNF-a和脂多糖(LPS )刺激HepG2細胞和SW480細胞活化NF-kB，并抑 制SW480細胞的增殖；鑒于NF-kB在促進腫瘤細胞增殖和遷移中發揮重要的作 用，因此，CSP有望進一步開發成為抗腫瘤增殖和遷移的新型蛋白藥物，包含 CSP基因的重組表達載體有望進一步開發成為抗腫瘤增殖和遷移的新型基因藥 物，具有良好的臨床應用前景。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本
發明作進一步的詳細描述，其中
圖1為CSP基因的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖2為pFLAG-CMV8-CSP的雙酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖3為轉染pFLAG-CMV8-CSP后HepG2細月包中表達CSP的直4妄免疫熒光
檢測結果；
圖4為轉染pFLAG-CMV8-CSP后抑制TNF-a刺激HepG2細胞活化NF-kB 結果；
圖5為轉染pFLAG-CMV8-CSP后抑制TNF-a刺激SW480細胞活化NF-kB 結果；
圖6為轉染pFLAG-CMV8-CSP后抑制SW480細胞增殖結果。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進《亍詳細的描述。優選實施例 中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第
三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
一、CSP的重組表達載體的制備
1、 疰原蟲子孢子的分離和總RNA的提取
取約氏癡原蟲BY265抹，按常規方法感染斯氏按蚊，于感染后第15天，解 剖感染斯氏按蚊的唾液腺，分離子孢子；采用Trizol試劑(Roche公司)提取子 孢子的總RNA,按照試劑說明書操作，提取的總RNA測定吸光值(OD)，取 OD26o,28o值位于1.8 2.0之間的RNA樣品用于后續實驗；
2、 引物的設計與合成
根據CSP的基因序列(GenBank登錄號為DQ012939),設計l對引物，在 每條引物的5'端加上保護堿基，再在其后分別引入/f/m/ni或^w7// I限制性內 切酶識別序列；設計的引物委托invitrogen公司進行合成；引物序列如下上游 引物5'-ccc§§g^gggaagaagtgtaccattttag-3'，下劃線部分為i^m/ni酶切位點；下 游引物5'-cgggatcccgttaattaaagaatactaatac-3,,下劃線部分為5a附// I酶切4立點；
3、 CSP基因的RT-PCR擴增和純化
以步驟1所得總RNA為模板，以01igo(dT),5為反轉錄引物，反轉錄制備瘧 原蟲子孢子的cDNA;反應體系和反應條件為濃度為0.5 jig/^iL的總RNA2 pL、 濃度為0.5嗎/iuL的01igo(dT)15 1 ^L、雙蒸水補充至總體積為12 jaL,于溫度7(TC 水浴10分鐘，立即水浴5分鐘，再加入5xMMLV酶反應緩沖液5 |iL、濃度為 10 mmol/L的dNTPs 2 (JL、濃度為10 U/^iL的MMLV反轉錄酶(Promega公司) 2pL、雙蒸水補充至總體積為20 ^L,于溫度42。C水浴1小時，70。C變性15分 鐘終止反應；
以反轉錄制備的瘧原蟲子孢子的cDNA為模板，采用步驟2所得上下游引物，進行CSP基因的PCR擴增，反應體系為模板1^L、濃度為10(imol/L的 上、下游引物各0.5^iL、濃度為1Ommol/L的dNTPs0.5 pL、 10xDNA聚合酶反 應緩沖液2.5 ^L、濃度為5 U/pL的DNA聚合酶(TaKaRa公司)0.25 ^L、濃度 為25 mmol/L的MgCl2溶液1.5 pL、雙蒸水補充至總體積為25 (iL;反應條件為 溫度95。C預變性3分鐘，然后溫度94。C變性30秒、42。C退火30秒、72'C延伸 l分鐘，共35個循環，最后溫度72。C延伸5分鐘；
PCR產物用質量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，結果如圖1 所示，其中M泳道為DNA分子量標準，1泳道為PCR產物，^^圖可知，PCR 產物在約1280 bp的位置出現一條特異性DNA條帶，與目的片段預期大小相符；
按照上述方法重復進行5次PCR擴增，取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳， 選擇約1280 bp的目的片段切膠，采用Omega瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omega 公司)回收純化目的片段，按照試劑盒說明書操作，即得純化的CSP基因；
4、重組表達載體pFLAG-CMV8-CSP的構建和鑒定
將步驟3所得純化的CSP基因用歷m/ III和Sam/f I ( TaKaRa公司)進行 雙酶切，雙酶切方法為濃度為20 ng/|iL的CSP基因30 ^L、濃度為15 U/|iL 的歷Wni3iiL、濃度為15U/nL的^wz// I 3pL、 10x緩沖液5nL、雙蒸水補 充至總體積為50 (iL，于溫度37。C孵育20小時；雙酶切產物進行酚、氯仿法純 化，方法如下取雙酶切產物40 ^L，加入々包和酚40 [iL，溫和混勻后12000 g 離心5分鐘，取上清液，加入氯仿40nL，溫和混勻后12000g離心5分鐘，取 上清液，加入無水乙醇80 pL和濃度為3 mol/L、 pH值為5.2的乙酸鈉溶液4 |iL, 混勻后于溫度-70。C靜置1小時，14000 g離心30分鐘，棄上清，沉淀用濃度為 750 mL/L的乙醇1 mL、 12000 g離心5分鐘洗滌后，再加入雙蒸水10 pL稀釋， 制得純化的CSP基因片段；將真核表達載體pFLAG-CMV8 ( Sigma公司)按照 上述同樣方法用///m/III和Sam// I進行雙酶切，雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電 泳，選擇約4700bp片段進行切膠回收，獲得純化的pFLAG-CMV8片段；將上 述純化的CSP基因片段與pFLAG-CMV8片段進行連接，連接方法為濃度為
630ng/pL的CSP基因片段5 nL、濃度為50 ng/pL的pFLAG-CMV8片段1 pL、 濃度為5 U/|iL的T4 DNA連接酶(NEB公司)1 pL、 10xT4 DNA連接酶反應 緩沖液2nL、雙蒸水補充至總體積為20 nL,于溫度16。C孵育16小時；
將連接產物轉化入大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞，轉化方法為將連接產 物10pL加至XLl-Blue感受態細胞100pL中，冰浴30分鐘，溫度42。C熱休克 45秒，立即水浴2分鐘，再轉移至預熱至溫度37。C的LB液體培養基350 pL中， 在溫度37°C 、振搖速度225轉/分鐘的條件下振搖培養1小時；
取轉化產物涂布于含有氨節青霉素(AMP)的LB平板上，于溫度37。C孵 育18小時，從平板上挑取單個菌落，接種于含有AMP的LB液體培養基4mL 中，在溫度37。C、振搖速度225轉/分鐘的條件下振搖培養16小時，用質粒抽 提試劑盒(OMEGA公司)小量抽提重組質粒，按照試劑盒說明書操作；
將所得重組質粒用//"/w/III和5am// I進行雙酶切鑒定，取雙酶切產物進行 瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示，其中M泳道為DNA分子量標準，l泳道為 重組質粒，2泳道為雙酶切產物，從圖可知，雙酶切產物在約1280bp的位置出 現一條特異性DNA條帶，表明重組質粒中含有CSP基因；將雙酶切法鑒定為 陽性的重組質粒委托Invitrogen公司對插入片段進行測序，結果重組質粒中插入 片段的核香酸序列和開放閱讀框架與GenBank登錄的CSP基因序列完全一致， 表明pFLAG-CMV8-CSP構建成功；
5、重組表達載體pFLAG-CMV8-CSP的大量制備
取步驟4鑒定正確的含有pFLAG-CMV8-CSP的大腸桿菌XL1-Blue,接種 于含有AMP的LB液體培養基中，在溫度37°C 、振搖速度225轉/分鐘的條件 下振搖培養至4卯nm波長處的OD值達到1 ~ 1.5,采用去內毒素超純質粒抽提 試劑盒(北京博大泰克生物基因技術有限責任公司)大量抽提重組質粒，按照 試劑盒說明書操作，所得重組質粒用雙蒸水溶解，紫外分光光度法測定純度和 濃度，置溫度-20。C保存，備用。
二、 CSP的體外表達檢測
7方法采用直接免疫焚光法，將人肝癌細胞株HepG2接種于放有蓋玻片的 24孔板中，每孔1.5xl()S個細胞，用含有濃度為100 mL/L的小牛血清(FCS) 的DMEM培養液，在溫度37°C 、 C02氣體濃度為50 mL/m3的條件下培養24小 時，待細胞融合率達到約80%時，采用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)將pFLAG-CMV8-CSP轉染入HepG2細胞，按照試劑說明書 操作，轉染24小時后，收集細胞爬片(即蓋玻片)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂 洗3次，用固定液(即濃度為40mg/mL、 pH值為7.2 ~ 7.6的多聚曱醛溶液)于 室溫下固定20分鐘，以PBS漂洗3次，再用通透液(即含有濃度為2 mL/L的 曲拉通X-100的PBS )于室溫下通透5分鐘，以PBS漂洗3次，再用封閉液(即 含有濃度為10mg/mL的牛血清白蛋白的PBS)于室溫下封閉1小時，棄去封閉 液，加入l : 500封閉液稀釋的異辟b氰酸熒光素(FITC)標記的抗FLAGM2單 克隆抗體(Sigma公司)，于室溫下孵育1小時，以PBS漂洗5次，自然干燥后 用濃度為400 mL/L的甘油封片，置熒光顯微鏡下觀察；同時設pFLAG-CMV8 對照組(以pFLAG-CMV8替代pFLAG-CMV8-CSP );
結果如圖3所示，轉染pFLAG-CMV8-CSP后HepG2細胞的胞漿內有明 顯的強染，細胞膜上也有少量強染，而轉染pFLAG-CMV8的HepG2細胞只有 一些非特異的比較微弱的熒光，表明FLAG-CSP融合蛋白主要分布在HepG2細 胞的胞漿內，在細胞膜上也有少量表達。
三、CSP抑制肺瘤細胞NF-kB的活化能力檢測
方法采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司)，按照試劑 盒說明書操作，分別將人肝癌細胞抹H印G2和結腸癌細胞抹SW480接種于24 孔板中，每孔1.5xl()S個細胞，用含有濃度為100 mL/L的FCS的DMEM培養 液，在溫度37。C、 C02氣體濃度為50 mL/m3的條件下培養24小時，待細胞融 合率達到約90%時，采用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000將pFLAG-CMV8-CSP 5嗎、營火蟲焚光素酶報告質粒pBxII-luc 0.2略和海腎熒光素酶報告質粒 RL-TK 2 ng分別轉染入HepG2細胞和SW480細胞，按照試劑說明書操作，轉染24小時后，更換新鮮培養液，并加入濃度為100ng/mL的TNF-a ( eBioscience公司)刺激6小時，吸去培養上清，用PBS洗板1次，再加入lxPBL裂解液
(Promega公司)100 |iL,于室溫下作用15分鐘后，取細胞裂解液20pL，加入螢火蟲焚光素酶底物和海腎熒光素酶底物各100 pL，用化學發光分析儀
(luminometer)讀取菱光素酶活性，并計算相對熒光素酶活性(即海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性的比值)；同時設pFLAG-CMV8對照組(以pFLAG-CMV8替代pFLAG-CMV8-CSP )和陰性對照組(未加入TNF-a);
結果如圖4所示，轉染pFLAG-CMV8-CSP后TNF-a刺激HepG2細胞的相對熒光素酶活性為0.2282，明顯低于pFLAG-CMV8對照組(0.5706),甚至低于陰性對照組(0.4384);如圖5所示，轉染pFLAG-CMV8-CSP后TNF-a刺激SW480細胞的相對熒光素酶活性為0.2599,明顯4氐于pFLAG-CMV8對照組(0.5223 )，甚至低于陰性對照組(0.3217);表明培養液中可能存在痕量LPS,可通過TLR4活化NF-kB,同時表明CSP不但能抑制TNF-a刺激HepG2細胞和SW480細胞活化NF-kB,而且還能抑制培養液中痕量LPS通過TLR4活化NF-kB,顯示CSP對腫瘤細胞NF-kb的活化具有很強的抑制作用。四、CSP抑制腫瘤細胞增殖能力檢測
方法將人結腸癌細胞抹SW480接種于12孔板中，每孔3xl()s個細胞，用含有濃度為100 mL/L的FCS的DMEM培養液，在溫度37°C 、 C02氣體濃度為50 mL/n^的條件下培養24小時，待細胞融合率達到約90%時，采用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000，分別轉染pFLAG-CMV8 1.6 pg和pFLAG-CMV8腸CSP 0.4嗎、0.8嗎、1.2嗎、1.6嗎(轉染質粒總量不足1,6嗎者，用pFLAG-CMV8補充至1.6嗎)至SW480細胞中，按照試劑說明書操作，轉染24小時后，取各培養上清100 (iL,加入10 SunBio Am-Blue細胞增殖與活性檢測試劑(上海生博醫學生物工程科技有限公司)，37。C孵育1小時后，用酶標儀測定OD57Q OD,值；
結果如圖6所示，轉染pFLAG-CMV8-CSP后，其能以劑量依賴的方式抑
9制SW480細胞的增殖，而轉染pFLAG-CMV8后對SW480細力包的增殖無影響。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
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權利要求
1、瘧原蟲環子孢子蛋白在制備抗腫瘤增殖和遷移的藥物中的用途。
2、 根據權利要求1所述的疾原蟲環子孢子蛋白在制備抗腫瘤增殖和遷移的 藥物中的用途，其特征在于所述腫瘤為肝癌和結腸癌。
3、 含有編碼權利要求1所述的疾原蟲環子孢子蛋白的基因的重組表達載體 在制備抗肺瘤增殖和遷移的藥物中的用途。
4、 根據權利要求3所述的含有編碼癡原蟲環子孢子蛋白的基因的重組表達 載體在制備抗腫瘤增殖和遷移的藥物中的用途，其特征在于所述腫瘤為肝癌 和結腸癌。
全文摘要
本發明公開了瘧原蟲環子孢子蛋白即CSP用于制備抗腫瘤增殖和遷移的藥物的新用途；本發明成功構建了CSP的重組表達載體pFLAG-CMV8-CSP，并通過脂質體轉染的方式將其轉染入人肝癌細胞株HepG2和結腸癌細胞株SW480，研究結果顯示，CSP主要表達于HepG2細胞的胞漿內，能夠抑制TNF-α和LPS刺激HepG2細胞和SW480細胞活化NF-κB，并抑制SW480細胞的增殖，有望進一步開發成為抗腫瘤增殖和遷移的新型蛋白藥物，包含CSP基因的重組表達載體有望進一步開發成為抗腫瘤增殖和遷移的新型基因藥物，具有良好的臨床應用前景。
文檔編號A61K38/17GK101480489SQ200810233209
公開日2009年7月15日 申請日期2008年12月3日 優先權日2008年12月3日
發明者艷 丁, 徐文岳 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學