專利名稱：表面改性的鈦或鈦合金材料及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種金屬材料，特別涉及一種表面改性的鈦或鈦合金材料，還 涉及該表面改性的鈦或鈦合金材料的制備方法和應用。
背景技術：
目前，由創傷、骨折及骨質疏松癥等疾病引起的骨缺損是臨床面臨的普遍 問題，每年全球有數以百萬計的硬組織植入體用于骨固定或功能性組織全置換。 鈦及鈦合金因其優良的生物相容性和綜合力學性能成為目前臨床應用最廣泛的 硬組織植入材料，用于制作人工關節、骨內固定器材及骨重建材料等。但是， 鈦及鈦合金材料本身缺乏生物活性，無誘導骨整合性能，用其制成的植入體植 入體內后不能與周圍骨組織形成牢固的、長期穩定的結合，常發生松動和脫位 現象。因此，鈦及鈦合金植入體與骨組織間的整合性及長期穩定性是目前臨床 面臨的重大挑戰。理想的骨組織植入體應具有"主動"而非"被動"地與宿主 周邊組織作用的能力，如促進成骨細胞的增殖和分化等。
針對鈦及鈥合金材料存在的不足，采用表面工程的方法對其進行表面改性， 有望大幅度提高其綜合性能，從而更適合于醫學應用的要求。近年來，國內外 學者就鈦及鈦合金材料的表面改性開展了大量的工作，其總體思路是在鈦及鈦 合金表面生成有機(如蛋白質、酶等)或無機(如羥基磷灰石、二氧化鈦等)
生物活性涂層。表面改性方法大致分為三大類物理改性法、化學改性法以及 生物化學方法。物理改性法如等離子噴涂法等生產成本高，制得的羥基磷灰石 涂層與鈦及鈦合金材料之間為物理結合，存在結合力較弱、穩定性較差的缺點， 且絕大部分噴涂為直線噴涂，對復雜形貌的鈦及鈦合金材料容易造成涂層厚度 不均勻等問題。化學改性法如酸堿處理法等對鈦及鈦合金材料的腐蝕性大，而且制得的二氧化鈦涂層結構疏松，結合牢固性有待提高。生物化學方法是將蛋 白質或酶等有機高分子物質通過物理吸附、化學鍵合以及載體附著等方法結合 到鈦及鈦合金材料表面，其優勢在于能夠直接、有效地提高鈦及鈦合金材料的 生物活性，但在如何保證反應后蛋白質或酶等的生物活性方面還需要進行大量 的研究。迄今為止，還沒有一種表面改性的鈦及鈥合金材料成功應用于臨床。
發明內容
有鑒于此，為克服現有技術的不足，本發明的目的之一在于提供一種表面 改性的鈦或鈦合金材料，具有良好的成骨細胞相容性，可促進成骨細胞的增殖 和分化。
為達到此目的，本發明的表面改性的鈦或鈦合金材料，在鈦或鈦合金材料
的表面具有生物活性涂層，所述生物活性涂層由至少5層的殼聚4唐-絲素蛋白雙 層組成。
進一步，所述生物活性涂層由5 ~ IO層的殼聚糖-絲素蛋白雙層組成； 進一步，所述生物活性涂層由6層的殼聚糖-絲素蛋白雙層組成。 本發明的目的之二在于提供一種制備所述表面改性的鈦或鈦合金材料的方
法，不受材料大小和形狀的影響，搡作簡單，條件溫和，無需特殊設備，生產
成本低。
為達到此目的，本發明的制備所述表面改性的鈦或鈦合金材料的方法，包 括以下步驟
a、 稱取殼聚糖，加入濃度為10-30 mL/L的乙酸溶液，攪拌使溶解，制成 質量百分濃度為1%~4%的殼聚糖溶液；
b、 稱if又絲素蛋白，加入去離子水使溶解，制成質量百分濃度為2°/。~10%的 絲素蛋白溶液；
c、 稱取l-乙基-3-(3-二曱胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和嗎啉乙磺酸 (MES),加入去離子水使溶解，制成含有質量百分濃度為0. 05%~2°/。的EDC和
濃度為0, 05 ~ 0. 3 mol/L的MES的混合溶液；d、 將鈥或鈦合金材料置步驟a制得的殼聚糖溶液中，浸泡10-20分鐘， 取出；
e、 將經過步驟d處理的鈦或鈦合金材料用去離子水充分洗滌；
f、 將經過步驟e清洗的鈦或鈦合金材料置步驟b制得的絲素蛋白溶液中， 浸泡10~20分鐘，取出；
g、 將經過步驟f處理的鈦或鈦合金材料用去離子水充分洗滌；
h、 重復步驟d至g至少4次，使鈦或鈦合金材料的表面逐層自組裝上至少 5層的殼聚糖-絲素蛋白雙層；
i、 將經過步驟h處理的鈦或鈦合金材料置步驟c制得的EDC-MES混合溶液 中，在溫度4 ~ 2(TC條件下反應20 ~ 60分鐘，即制得表面改性的鈦或鈦合金材 料。
進一步，所述步驟a中殼聚糖溶液的質量百分濃度為2%，所述步驟d中浸 泡時間為20分鐘；
進一步，所述步驟b中絲素蛋白溶液的質量百分濃度為5%,所述步驟f中 浸泡時間為IO分鐘；
進一步，所述步驟c中混合溶液含有質量百分濃度為0. 1%的EDC和濃度為 0. 1 mol/L的MES，所述步驟i中反應溫度為4°C、反應時間為30分鐘。
進一步，所述步驟h為重復步驟d至g 4 ~ 9次，^f吏鈥或鈦合金材料的表面 逐層自組裝上5 ~ 10層的殼聚糖-絲素蛋白雙層；
進一步，所述步驟h為重復步驟d至g 5次，使鈦或鈦合金材料的表面逐 層自組裝上6層的殼聚糖-絲素蛋白雙層。
本發明的目的之三在于提供所述表面改性的鈦或鈦合金材料在制備醫用硬 組織植入材料中的應用。
本發明的有益效果在于本發明公開了 一種表面改性的鈦或鈦合金材料， 在材料表面具有由至少5層的殼聚糖-絲素蛋白雙層組成的生物活性涂層，該材 料具有良好的成骨細胞相容性，可促進成骨細胞的增殖和分化，顯示了進一步開發成為新型醫用硬組織植入材料的潛力，具有良好的臨床應用前景；本發明
作用將聚陽離子電解質殼聚糖和聚陰離子電解質絲素蛋白交替層疊組裝在鈦或 鈦合金材料的表面，制備方法簡單，涂層厚度可控，不受材料大小和形狀的影 響，適用于復雜形貌的材料，且制備條件溫和，無需特殊設備，生產成本低， 實用性強，具有較好的推廣應用價值。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發 明作進一步的詳細描述，其中
圖1為成骨細胞在本發明的表面改性的鈦膜上隨時間的增殖示意圖； 圖2為成骨細胞在本發明的表面改性的鈥膜上隨時間的分化示意圖。
具體實施例方式
殼聚糖為曱殼類動物、昆蟲和其它無脊推動物外殼中的曱殼素脫乙酰化后 的產物，是一種天然聚陽離子多糖(pKa=6. 3),具有良好的成膜性、生物相容 性、生物可降解性，以及多種生物活性如廣譜抑菌、促進上皮細胞增長、抑制 平滑肌增生等，廣泛應用于組織工程、藥物釋放等領域。絲素蛋白是一種源于 蠶絲的天然高分子蛋白質(pI-4. 22),含有18種氨基酸，其中ll種為人體必 需氨基酸，具有優良的生物相容性和力學性能，可以緩慢降解，近年來，隨著 對其獨特氨基酸組成及結晶結構等理化特性研究的深入，絲素蛋白在生物醫學 材料領域的應用日趨廣泛和深入。本發明選擇殼聚糖和絲素蛋白分別作為聚陽 離子和聚陰離子電解質，利用聚陽/陰離子間的靜電相互作用，采用逐層自組裝 的方法進行鈦或鈦合金材料的表面改性，并對制得的表面改性的鈦或鈦合金材 料進行了生物活性鑒定。
以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。原料殼聚糖(脫乙酰度95%,分子量20萬，青島海匯生物制品有限公司)； 平整鈦膜(通過電子束蒸發沉積，表面粗糙度約2. 5 nm)和Ti-6A1—V鈦合金 (西北有色金屬研究院)；絲素蛋白自制，制備方法如下稱取天然蠶絲，在 溫度IO(TC條件下，用濃度為5 mL/L的碳酸氫鈉溶液脫膠2次，每次30分鐘， 用去離子水充分洗滌后，加入摩爾比為1:2:8的氯化鈣-乙醇-水混合溶液， 在溫度7(TC條件下攪拌6小時使溶解，再用去離子水透析3天，冷凍干燥，制 得絲素蛋白。
實施例一
本實施例為表面改性的鈦膜，其制備方法包括以下步驟
a、 稱取殼聚糖0.5 g，加入濃度為10 mL/L的乙酸溶液50 mL,磁力攪拌 20分鐘使溶解，制成質量百分濃度為1°/。的殼聚糖溶液；
b、 稱取絲素蛋白1.0 g,加入去離子水50 mL使溶解，制成質量百分濃度 為2%的絲素蛋白溶液；
c、 稱取EDC 0.025 g和MES 0.533 g，加入去離子水50 mL使溶解，制成 含有質量百分濃度為0. 05%的EDC和濃度為0. 05 mol/L的MES的混合溶液；
d、 將鈦膜置步驟a制得的殼聚糖溶液中，浸泡10分鐘，取出；
e、 將經過步驟d處理的鈦膜用去離子水清洗2次，每次浸泡2分鐘；
f、 將經過步驟e清洗的鈦膜置步驟b制得的絲素蛋白溶液中，浸泡20分 鐘，取出；
g、 將經過步驟f處理的鈦膜用去離子水清洗2次，每次浸泡2分鐘；
h、 重復步驟d至g 4次，使鈦膜表面逐層自組裝上5層的殼聚糖-絲素蛋 白雙層；
i、 將經過步驟h處理的鈦膜置步驟c制得的EDC-MES混合溶液中，在溫度 l(TC條件下反應60分鐘，即制得表面改性的鈦膜。
實施例二本實施例為表面改性的鈦膜，其制備方法包括以下步驟
a、 稱取殼聚糖1. 0 g,加入濃度為1G mL/L的乙酸溶液5G mL，磁力攪拌 20分鐘使溶解，制成質量百分濃度為2%的殼聚糖溶液；
b、 稱取絲素蛋白2.5 g,加入去離子水50 mL使溶解，制成質量百分濃度 為5%的絲素蛋白溶液；
c、 稱取EDC 0.050 g和MES 1.066 g，加入去離子水50 mL使溶解，制成 含有質量百分濃度為0. 1%的EDC和濃度為0. 1 mol/L的MES的混合溶液；
d、 將鈦膜置步驟a制得的殼聚糖溶液中，浸泡20分鐘，取出；
e、 將經過步驟d處理的鈦膜用去離子水清洗3次，每次浸泡l分鐘；
f、 將經過步驟e清洗的鈦膜置步驟b制得的絲素蛋白溶液中，浸泡10分 鐘，取出；
g、 將經過步驟f處理的鈦膜用去離子水清洗3次，每次浸泡l分鐘；
h、 重復步驟c至f 5次，使鈥膜表面逐層自組裝上6層的殼聚糖-絲素蛋 白雙層；
i、 將經過步驟h處理的鈦膜置步驟c制得的EDC-MES混合溶液中，在溫度 4。C條件下反應3G分鐘，即制得表面改性的鈥膜。
實施例三
本實施例為表面改性的Ti-6A1-4V鈦合金，其制備方法包括以下步驟
a、 稱取殼聚糖1.5 g,加入濃度為20 mL/L的乙酸溶液50 mL,磁力攪拌 20分鐘使溶解，制成質量百分濃度為3%的殼聚糖溶液；
b、 稱取絲素蛋白4.0 g，加入去離子水50 mL使溶解，制成質量百分濃度 為8°/ 的絲素蛋白溶液；
c、 稱耳又EDC 0.075 g和MES 2.133 g，加入去離子水50 mL使溶解，制成 含有質量百分濃度為0. 15%的EDC和濃度為0. 2 mol/L的MES的混合溶液；
d、 將鈦合金置步驟a制得的殼聚糖溶液中，浸泡15分鐘，取出；
e、 將經過步驟d處理的鈦合金用去離子水清洗3次，每次浸泡l分鐘；f、 將經過步驟e清洗的鈦合金置步驟b制得的絲素蛋白溶液中，浸泡15 分鐘，取出；
g、 將經過步驟f處理的鈦合金用去離子水清洗3次，每次浸泡l分鐘；
h、 重復步驟c至f 7次，使鈦膜表面逐層自組裝上8層的殼聚糖-絲素蛋 白雙層；
i、 將經過步驟h處理的鈦膜置步驟c制得的EDC-MES混合溶液中，在溫度 15。C條件下反應45分鐘，即制得表面改性的鈦膜。
實施例四
本實施例為表面改性的Ti-6A1-4V鈥合金，其制備方法包括以下步驟
a、 稱取殼聚糖2. 0 g，加入濃度為30 mL/L的乙酸溶液50 mL,磁力攪拌 20分鐘使溶解，制成質量百分濃度為4%的殼聚糖溶液；
b、 稱取絲素蛋白5.0 g，加入去離子水50 mL使溶解，制成質量百分濃度 為10%的絲素蛋白溶液；
c、 稱取EDC 0.100 g和MES 3.199 g,加入去離子水50 mL4吏溶解，制成 含有質量百分濃度為0. 2%的EDC和濃度為0. 3 mol/L的MES的混合溶液；
d、 將鈦膜置步驟a制得的殼聚糖溶液中，浸泡20分鐘，取出；
e、 將經過步驟d處理的鈥膜用去離子水清洗4次，每次浸泡l分鐘；
f、 將經過步驟e清洗的鈦膜置步驟b制得的絲素蛋白溶液中，浸泡20分 鐘，取出；
g、 將經過步驟f處理的鈦膜用去離子水清洗4次，每次浸泡l分鐘；
h、 重復步驟c至f 9次，使鈦膜表面逐層自組裝上10層的殼聚糖-絲素蛋 白雙層；
i 、將經過步驟h處理的鈦膜置步驟c制得的EDC-MES混合溶液中，在溫度 20。C條件下反應20分鐘，即制得表面改性的鈦膜。本發明的表面改性的鈦或鈦合金材料的生物活性鑒定
1、 成骨細胞的增殖能力鑒定
方法將小鼠顱骨原代成骨細胞分別接種于未改性的鈦膜表面、本發明的 表面改性的鈥膜表面和聚苯乙烯細胞培養孔板(tissue culture polystyrenes, TCPS)內，細胞密度為5000/cm2，用含有濃度為100 mL/L的胎牛血清的DMEM 培養液，在溫度37。C、 C02氣體濃度為50mL/n^的條件下培養，每3天更換培養 液；分別于培養第l、 4、 7天，將細胞用濃度為2. 5 mg/mL的胰酶溶液消化后， 用Zl型庫爾特計凄t器(Coulter Counter,德國Beckman Coulter GmbH公司) 進行細胞計數，檢測細胞增殖能力；
結果如圖l所示，與未改性的鈦膜和TCPS相比，本發明的表面改性的鈦 膜具有良好的成骨細胞相容性，可促進成骨細胞的增殖。
2、 成骨細胞的分化能力鑒定
方法將小鼠顱骨原代成骨細胞分別接種于未改性的鈦膜表面、本發明的 表面改性的鈦膜表面和TCPS內，細胞密度為5000/cm2，用含有濃度為100 mL/L 的胎牛血清的DMEM培養液，在溫度37°C、 C02氣體濃度為50 mL/m'的條件下培 養，每3天更換培養液；于培養第7天，將細胞用濃度為2. 5 rng/mL的胰酶溶 液消化后，離心，細胞沉淀中加入濃度為10 mL/L的曲拉通X-IOO( Triton X-l00) 溶液，重復"冷凍-室溫融化"共3次，制得細胞裂解液，先用BCA蛋白定量試 劑盒(美國Sigma公司)測定細胞蛋白含量，再加入底物硝基苯磷酸鹽反應， 用微板計數器在波長450 nm處測定硝基酚的合成情況，以每毫克蛋白每分鐘合 成硝基酚的微摩爾數"pol硝基酚/分鐘/mg蛋白"表征堿性磷酸酶(ALP)的 活性，檢測細胞分化能力；
結果如圖2所示，與未改性的鈦膜和TCPS相比，本發明的表面改性的鈦 膜具有良好的成骨細胞相容性，可促進成骨細胞的分化。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管 通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所 附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
權利要求
1、表面改性的鈦或鈦合金材料，在鈦或鈦合金材料的表面具有生物活性涂層，其特征在于所述生物活性涂層由至少5層的殼聚糖-絲素蛋白雙層組成。
2、 根據權利要求1所述的表面改性的鈦或鈦合金材料，其特征在于所述 生物活性涂層由5 ~ 10層的殼聚糖-絲素蛋白雙層組成。
3、 根據權利要求1所述的表面改性的鈦或鈦合金材料，其特征在于所述 生物活性涂層由6層的殼聚糖-絲素蛋白雙層組成。
4、 制備權利要求1所述的表面改性的鈦或鈦合金材料的方法，包括以下步驟:a、 稱取殼聚糖，加入濃度為10-30 mL/L的乙酸溶液，攪拌使溶解，制成 質量百分濃度為1°/。~4%的殼聚糖溶液；b、 稱取絲素蛋白，加入去離子水使溶解，制成質量百分濃度為2%~10%的 絲素蛋白溶液；c、 稱取1-乙基-3-(3-二曱胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和嗎啉乙磺酸 (MES),加入去離子水使溶解，制成含有質量百分濃度為0. 05%~2%的EDC和濃度為0. 05 ~ 0. 3 mol/L的MES的混合溶液；d、 將鈦或鈦合金材料置步驟a制得的殼聚糖溶液中，浸泡10~20分鐘， 取出；e、 將經過步驟d處理的鈦或鈦合金材料用去離子水充分洗滌；f、 將經過步驟e清洗的鈦或鈦合金材料置步驟b制得的絲素蛋白溶液中， 浸泡10-20分鐘，取出；g、 將經過步驟f處理的鈦或鈦合金材料用去離子水充分洗滌；h、 重復步驟d至g至少4次，使鈦或鈦合金材料的表面逐層自組裝上至少 5層的殼聚糖-絲素蛋白雙層；i、 將經過步驟h處理的鈦或鈦合金材料置步驟c制得的EDC-MES混合溶液中，在溫度4 ~ 2(TC條件下反應20 ~ 60分鐘，即制得表面改性的鈦或鈦合金材 料。
5、 根據權利要求4所述的制備表面改性的鈦或鈦合金材料的方法，其特征 在于所述步驟a中殼聚糖溶液的質量百分濃度為2%,所述步驟d中浸泡時間 為20分鐘。
6、 根據權利要求4所述的制備表面改性的鈦或鈦合金材料的方法，其特征 在于所述步驟b中絲素蛋白溶液的質量百分濃度為5%，所述步驟f中浸泡時 間為IO分鐘。
7、 根據權利要求4所述的制備表面改性的鈦或鈦合金材料的方法，其特征 在于所述步驟c中混合溶液含有質量百分濃度為0. 1%的EDC和濃度為0.1 mol/L的MES,所述步驟i中反應溫度為4°C、反應時間為30分鐘。
8、 根據權利要求4所述的制備表面改性的鈦或鈦合金材料的方法，其特征 在于所述步驟h為重復步驟d至g 4~9次，使鈦或鈦合金材料的表面逐層自 組裝上5 ~ 10層的殼聚糖-絲素蛋白雙層。
9、 根據權利要求8所述的制備表面改性的鈦或鈦合金材料的方法，其特征 在于所述步驟h為重復步驟d至g 5次，使鈦或鈦合金材料的表面逐層自組 裝上6層的殼聚糖-絲素蛋白雙層。
10、 權利要求1所述的表面改性的鈦或鈦合金材料在制備醫用硬組織植入 材料中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種表面改性的鈦或鈦合金材料，在材料表面具有由至少5層的殼聚糖-絲素蛋白雙層組成的生物活性涂層，該材料具有良好的成骨細胞相容性，可促進成骨細胞的增殖和分化，顯示了進一步開發成為新型醫用硬組織植入材料的潛力，具有良好的臨床應用前景；本發明的表面改性的鈦或鈦合金材料可采用逐層自組裝方法進行制備，通過靜電吸附作用將聚陽離子電解質殼聚糖和聚陰離子電解質絲素蛋白交替層疊組裝在鈦或鈦合金材料的表面，制備方法簡單，涂層厚度可控，不受材料大小和形狀的影響，適用于復雜形貌的材料，且制備條件溫和，無需特殊設備，生產成本低，實用性強，具有較好的推廣應用價值。
文檔編號A61L27/06GK101411893SQ20081023308
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月20日 優先權日2008年11月20日
發明者忠 羅, 燕 胡, 蔡開勇 申請人:重慶大學