化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺癌藥物的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺癌藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于采用免疫治療法治療腫瘤的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及 一種蛋氨酸腦啡肽在體內(nèi)注射和體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下對腸癌、胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行 治療，以達(dá)到治療目的的方法。
背景技術(shù)：
1975年Hughes等人從豬腦抽提液中分離的、具有內(nèi)源性嗎啡 樣活性的蛋氨酸腦啡肽(methionine enk印halin， MEK)。后來研究發(fā)現(xiàn)是由 腎上腺產(chǎn)生的前激素和前腦啡肽衍生來，釋放入血，由酪-甘-甘-苯丙-蛋氨酸 五個(gè)氨基酸構(gòu)成的五肽。正常體內(nèi)含量極低，每毫升血漿50-150pg。 1975年 被首次發(fā)現(xiàn)蛋氨酸腦啡肽具有免疫調(diào)節(jié)作用。白細(xì)胞包括有粒白細(xì)胞(中性 粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞)無粒白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞). 正常的T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞(NK)含有MEK受體， 一些的腫 瘤細(xì)胞如胰腺癌細(xì)胞和腸癌細(xì)胞也含有MEK受體。近年來研究證明蛋氨酸腦 啡肽對免疫系統(tǒng)真有如下作用增加淋巴細(xì)胞數(shù)量和活性，增加CD2， CD4， CD8 等受體分子的表達(dá)，增加T細(xì)胞玫瑰花節(jié)形成百分率，增加NK細(xì)胞數(shù)量活性， 增加有絲分裂素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，增加Y-干擾素，白介素和腫瘤壞死因子等 多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增加單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)和中性粒細(xì)胞的趨化作用， 對樹突狀細(xì)胞的成熟和活性有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)與癌細(xì)胞受體結(jié)合可以誘 導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡。我們的研究也證明了上述部分結(jié)果。雖然蛋氨酸腦啡肽具有 顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，但如何對胰腺癌和腸癌腫瘤 患者加以治療，卻沒有具體方法，更沒有人類治療胰腺癌和腸癌的報(bào)道。
我們采用化合物蛋氨酸腦啡肽用于治療腸癌、胰腺癌患者的方法與實(shí)際例 子及療效，目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明提供一種化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺 癌藥物的應(yīng)用，其目的在于解決現(xiàn)有的臨床方法在治療腸癌、胰腺癌方面不能有效和存在的問題。
技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺癌藥物的應(yīng)用，所述的蛋氨
酸腦啡肽以0. 0001-10mg/ml制備成注射劑作為治療腸癌、胰腺癌藥物的應(yīng)用
將上述濃度范圍內(nèi)的蛋氨酸腦啡肽在體外T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件中 進(jìn)行剌激，體外培養(yǎng)的溫度25-38C°范圍、2-7天的時(shí)間，使其濃度范圍為 ]0—2 10—'6克分子/升后回輸體內(nèi)?；蛘咧苯硬捎渺o脈注射、皮下注射或肌肉注 射的劑型。
蛋氨酸腦啡肽加在體外淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件中與一定濃度的淋巴因 子、如胸腺肽、白細(xì)胞介素、干擾素一起使用，蛋氨酸腦啡肽與白細(xì)胞介素 的重量比為1: K)0 10000;蛋氨酸腦啡肽與胸腺肽的重量比為1:100 10000。
蛋氨酸腦啡肽還包括其它蛋氨酸腦啡肽的類似物，如亮氨酸腦啡肽以相
同的方法使用。
優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明的特點(diǎn)在于蛋氨酸腦啡肽在體外直接作用于培養(yǎng)條件 下的免疫系統(tǒng)細(xì)胞或體內(nèi)直接注射治療。同時(shí)通過與癌細(xì)胞受體結(jié)合誘導(dǎo)癌細(xì) 胞凋亡。用量小，效率高。經(jīng)蛋氨酸腦啡肽激活的免疫系統(tǒng)細(xì)胞具有邊普通方
法激活更高效的免疫細(xì)胞增殖數(shù)量和細(xì)胞活性， 一般應(yīng)高出5-10倍，特別是T
淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加。治療后癌癥患者腫瘤部位明顯縮小或消失。但是，應(yīng) 當(dāng)指出，蛋氨酸腦啡肽是一種對免疫系統(tǒng)細(xì)胞數(shù)量和活性雙向調(diào)節(jié)劑，僅僅在 一定的濃度范圍內(nèi)有正向調(diào)節(jié)作用，超出此范圍及呈現(xiàn)負(fù)向調(diào)節(jié)作用，抑制免 疫系統(tǒng)細(xì)胞的生長。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明如下 實(shí)施例1:
將化合物蛋氨酸腦啡肽溶解于注射用水或生理鹽水，分別制成濃度為
0.0005mg/ml、 0. 001mg/ml 0. 7mg/ml、 2mg/ml注射劑。實(shí)施例2:
將化合物蛋氨酸腦啡肽溶解于注射用水或生理鹽水，分別制成濃度為
0. 0005mg/ml、 0. 001mg/ml 0. 7mg/ml、 2mg/ml的凍干粉針制劑。
給藥方式為通過皮下、靜脈或腹腔注射的方式直接施用于患者。 實(shí)施例3:
取正常人靜脈血30毫升，放入含有肝素抗凝劑的試管內(nèi)(每毫升血液加 入O. 1毫升125-205U)，領(lǐng)取含有淋巴細(xì)胞分離液20毫升的試管，將血液輕 輕加到淋巴細(xì)胞分離液上，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，用吸管吸取淋巴細(xì)胞 層，用1640培養(yǎng)液洗滌兩次，每次加入30毫升，1500轉(zhuǎn)/分，5分鐘。調(diào)整 細(xì)胞濃度為106個(gè)/毫升，按下列設(shè)計(jì)分組培養(yǎng)
(1) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(2) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—2克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(3) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—5克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(4) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—6克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(5) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，1(T克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(6) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—8克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(7) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，1(T克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(8) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10,克分子/升蛋氨酸腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(9) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—"克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(10) ， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10"6克分子/升蛋氨 酸腦啡肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
將上述培養(yǎng)放入37。C細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在24、 48、 72、 96、 120、 168小時(shí)時(shí)取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行E-花環(huán)形成試 驗(yàn)，檢測陽性百分率(百分率越高，表示T細(xì)胞活性越高)，并將120小時(shí)的 結(jié)果作為最終結(jié)果，通過靜脈或腹腔注射的方法回輸患者體內(nèi)。通過實(shí)驗(yàn)證明， 蛋氨酸腦啡肽在體外培養(yǎng)再回輸體內(nèi)的方法，只有在此濃度下(10—2 10—16克 分子/升)及這種培養(yǎng)條件(體外培養(yǎng)的溫度25-38C。范圍、2-7天的時(shí)間) 才有治療和免疫的效果，其它情況均為無效。
實(shí)施例4:
1， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液；
2， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—3克分子/升蛋氨酸腦啡 肽的細(xì)胞培養(yǎng)液+ 1毫克小牛胸腺肽；胸腺肽的濃度為1毫克/毫升。
將上述培養(yǎng)放入37'C細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在24、 48、 72、 96、 120小時(shí)時(shí)取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行E-花環(huán)形成試驗(yàn)，并 將120小時(shí)的結(jié)果作為最終結(jié)果，將細(xì)胞處理后回輸體內(nèi)。
實(shí)施例5:
1， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液；
2， 106淋巴細(xì)胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—3克分子/升蛋氨酸腦啡 肽的細(xì)胞培養(yǎng)液+ l毫克白細(xì)胞介素；白細(xì)胞介素的濃度為2毫克/毫升。
將上述培養(yǎng)放入37t細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在24、 48、 72、 96、 120小時(shí)時(shí)取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行E-花環(huán)形成試驗(yàn)，并將120小時(shí)的結(jié)果作為最終結(jié)果，將細(xì)胞處理后回輸體內(nèi)。
在以上實(shí)施例的研究基礎(chǔ)上，做以下實(shí)驗(yàn)
蛋氨酸腦啡肽治療腸癌和胰腺癌的試驗(yàn) 一，腸癌的治療實(shí)驗(yàn)
1. 方法在裸鼠身上移植人HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞制備癌癥模型，每日給蛋氨
酸腦啡肽，劑量20mg/kg。連續(xù)21天。
2. 結(jié)果85%的小鼠在三周內(nèi)顯示出腫瘤細(xì)胞生長抑制現(xiàn)象，相比之下， 對照組有93%腫瘤發(fā)生。
二，胰腺癌的治療實(shí)驗(yàn)
1. 方法接種了人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞的裸鼠，給蛋氨酸腦啡肽20mg/kg， 每日一次，連續(xù)21天。
2. 結(jié)果與對照組相比，所有裸鼠出現(xiàn)明顯的腫瘤生長抑制。
三，對胰腺癌患者的治療實(shí)驗(yàn)
白XX:男，45歲，經(jīng)診斷為急性胰腺癌，未接受任何治療，給蛋氨 酸腦啡肽20mg/kg，每天一次，連續(xù)30天。經(jīng)CT檢查，前后比較，腫瘤 消失，患者自覺癥狀恢復(fù)正常。
趙XX:男，54歲，晚期結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，目前所有對癥治療都已經(jīng)無 效，生命垂危，給蛋氨酸腦啡肽20mg/kg，每天一次，連續(xù)90天。經(jīng)CT .檢査，前后比較，腫瘤消失，患者自覺癥狀恢復(fù)正常。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論上述病例，在特定濃度范圍的蛋氨酸腦啡肽加在體內(nèi)注射 和體外淋巴細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)條件下對胰腺癌和腸癌均有明顯的治療作用，有 效率極高。
權(quán)利要求
1、化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療腸癌、胰腺癌藥物的應(yīng)用，所述的蛋氨酸腦啡肽以0.0001-10mg/ml制備成注射劑。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療結(jié)腸癌、胰 腺癌藥物的應(yīng)用，其特征在于將權(quán)利要求l濃度范圍內(nèi)的蛋氨酸腦啡肽在 體外對培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行剌激，體外培養(yǎng)的溫度25-38C°范圍、2-7天 的時(shí)間，使其濃度范圍為10一2 10—'6'克分子/升后回輸。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療結(jié)腸癌、胰 腺癌藥物的應(yīng)用，其特征在于將權(quán)利要求l濃度范圍內(nèi)的蛋氨酸腦啡肽， 以靜脈注射、皮下注射或肌肉注射的劑型。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療結(jié)腸癌、胰腺癌藥物的應(yīng)用，其特征在于蛋氨酸腦啡肽加在體外淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條 件中單獨(dú)或與一定濃度的淋巴因子、如胸腺肽、白細(xì)胞介素、干擾素一起使 用，蛋氨酸腦啡肽與白細(xì)胞介素的重量比為1: 100 10000;蛋氨酸腦啡肽與胸腺肽的重量比為1: 100 10000。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療結(jié)腸癌、胰腺癌藥物的應(yīng)用，其特征在于蛋氨酸腦啡肽還包括其它蛋氨酸腦啡肽的類似 物，如亮氨酸腦啡肽以相同的方法使用。
全文摘要
本發(fā)明屬于采用免疫治療法治療腫瘤的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種蛋氨酸腦啡肽在體內(nèi)注射和體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下對腸癌、胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行治療，以達(dá)到治療目的的方法。所述的蛋氨酸腦啡肽以0.0001-10mg/ml制備成注射劑或在體外T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件中進(jìn)行刺激，使其濃度范圍為10^-2～10^-16克分子/升后回輸體內(nèi)，或者直接經(jīng)靜脈、皮下、肌肉注射。本發(fā)明的特點(diǎn)在于蛋氨酸腦啡肽在體內(nèi)或體外直接作用于培養(yǎng)條件下的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，或癌細(xì)胞，用量小，效率高。經(jīng)蛋氨酸腦啡肽激活的免疫系統(tǒng)細(xì)胞具有比普通方法激活更高效的免疫細(xì)胞增殖數(shù)量和細(xì)胞活性，一般應(yīng)高出5-10倍，特別是T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加。蛋氨酸腦啡肽直接通過受體結(jié)合殺傷胰腺癌和腸癌細(xì)胞。
文檔編號A61K38/08GK101411865SQ20081022908
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日
發(fā)明者單風(fēng)平, 呂昌龍 申請人:單風(fēng)平