一種豬鏈球菌2型免疫保護性抗原的制作方法

專利名稱：一種豬鏈球菌2型免疫保護性抗原的制作方法
技術領域：
本發明涉及家畜傳染病中疫苗制備技術領域。具體涉及一種豬鏈球菌2型保護性抗原制備。針對豬鏈 球菌2型的防制，本發明設計了編碼一種新保護性抗原蛋白基因的克隆、表達及功能驗證和應用。所述的 基因表達的抗原蛋白能夠提高豬抵抗豬鏈球菌2型的能力。
背景技術：
豬鏈球菌(Sfrepfococcussu('s, S. su,'s)是引起豬鏈球菌病的主要病原，依據細菌表面 的莢膜多糖(CPS)可以將S. su/'s分為35個血清型，分別為1/2型和1 34型，但最近也有 人提出32型和34型應該歸于streptococcus orisra忖i,而不應該歸于豬鏈球菌，其中豬鏈球 菌2型是毒力最強、其中豬鏈球菌2型(SS2)致病性強、流行廣，該型亦是臨床分離頻率 最高的血清型。SS2是一種重要的人畜共患病病原體，能引起豬腦膜炎(meningitis)、心內 膜炎(endocarditi)、敗血癥(septicemia)、關節炎(arthritis)、漿膜炎(polyserositis)、 肺炎(pneumonia)等，常引起斷奶仔豬或育肥豬突然死亡；人類感染該菌，可導致腦膜炎， 引發永久性耳聾、敗血癥、心內膜炎，甚至死亡。1991年首次報道在廣東省發現豬2型鏈 球菌疑似病例，1998 - 1999年江蘇省部分地區連續2年在盛夏季節暴發該病。目前己有足 夠的流行病學資料證實，SS2已經對我國的養殖業和人民健康構成了嚴重的威脅。
由于缺乏豬鏈球菌病的流行病學資料，致病機理不清，無有效的疫苗和敏感的診斷方法， 在很多國家豬鏈球菌病一直未能得到有效地控制。
盡管對豬鏈球菌2型的致病機理目前仍處在研究和發現階段，影響了豬鏈球菌2型疫苗 研究的順利進行，但該疫苗的研究仍取得了一定的進展。目前研究的豬鏈球菌2型疫苗主要 有滅活疫苗、活疫苗、基因工程活載體疫苗和亞單位苗，但在實際應用中各有不足之處。滅 活疫苗對同源的豬鏈球菌具有較好的免疫保護，但由于不同菌株的毒力基因表性存在較大差 異，對于異源菌株的保護力不佳；活疫苗可使豬得到保護,但不能清除定居在扁桃體或關節里 的2型豬鏈球菌,也不能清除隱性感染豬扁桃體內的細菌；活載體疫苗主要是當今與未來疫苗 研制與開發的主要方向之一，疫苗兼有常規活菌苗和滅活菌苗的優點，但是按照美國食品與 藥物管理局(Food and drug administ ration , FDA)的規定,活疫苗中不能存在抗藥質粒, 并且在人和動物體內,無法用抗生素來維持重組質粒的穩定性；亞單位苗具有活菌苗的免疫效 力高、及滅活菌苗的安全性好等優點，但是,亞單位苗的抗原成分單一,對其他血清型的保護作 用有限。
鑒于此，本發明著手于豬鏈球菌2型新型免疫保護性抗原的研究，尋找免疫保護效果好， 并且在豬鏈球菌2型以外的其它豬鏈球菌血清型中廣泛存在的免疫原性蛋白，進而組合成有 效的豬鏈球菌疫苗。

發明內容
本發明的第一個目的是獲得一株能夠分泌豬鏈球菌2型免疫保護性抗原蛋白的重組大腸 桿菌，利用該重組大腸桿菌獲得免疫原性更好的保護性抗原蛋白，利用該保護性抗原蛋白制備一種適用于預防或/和防治豬鏈球菌2型的亞單位疫苗。
本發明的第2個目的在于將所制備的重組大腸桿菌在制備豬鏈球菌2型亞單位疫苗中的 應用。
為了實現本發明的目的，申請人通過制備，獲得一株能夠分泌豬鏈球菌2型免疫保護性
抗原(基因登錄號見附圖1)的重組大腸桿菌6Esc/ eric力ia BL21/pET-28a-0197，
該菌株已于2008年10月9日送交湖北省武漢市武漢大學內的保藏在中國典型培養物保藏中
心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO: M208146 。
在本發明的實施例中，申請人提供了這種新的豬鏈球菌2型免疫保護性抗原0197的詳細 制備方法，并描述了該保護性抗原蛋白的可能應用的前景。
更詳細的技術方案如《具體實施方式
》所述。


圖1:本發明使用的抗原基因序列的登錄號及其在鏈球菌98HAH33中所處的位置(括號內顯
示為有下劃線的為所述的三個抗原基因序列在Genebank的登錄號，其后的冒號后的數字
為該登錄號所示基因序列在鏈球菌98HAH33基因組中的位置，該位置后顯示的加粗斜體字
為所述的鏈球菌的菌株號)。
圖2:是本發明使用的pET-28a ( + )載體圖譜；
圖3:是本發明的重組抗原蛋白0197基因PCR (1)及重組質粒雙酶切鑒定圖(2); 圖4:是本發明重組抗原蛋白0197純化后SDS-PAGE及Western Blot圖； 圖5:是本發明重組抗原蛋白0197免疫小鼠后的所誘導誘導很高的抗體水平； 圖6:是本發明重組抗原蛋白0197免疫小鼠后的所誘導誘導抗體IgG亞類測定； 圖7:是本發明重組抗原蛋白0197免疫小鼠后的攻毒(5LD5。)保護力效果顯示； 圖8:是本發明重組抗原蛋白0197免疫小鼠后的攻毒(20LD5。)保護力效果顯示。
具體實施例方式
實施例l:豬鏈球菌2型重組抗原蛋白0197的克隆及表達
一材料
1) 質粒與菌株
本發明采用的pET-28a(+)質粒(購自Noagen公司)，大腸埃希氏菌BL21 (DE3)感受
態購自中國湖北省武漢生命技術有限公司。該pET-28a(+)質粒圖譜如圖2所示。
本發明所用菌株為豬鏈球菌2型CVCC606菌株購自中國北京中國獸醫藥品監察所，屬于 一個商業菌株。
2) 豬鏈球菌2型抗原基因參見說明書附圖1所述。
3) 主要試劑及緩沖液(Buffer)
氯化鈉、EDTA二鈉鹽、乙醇、甲醇、麗春紅S、三氯乙酸(TCA)是上海國藥公司產品； Tris堿(Tris-HCI)、 二硫蘇糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、過硫酸銨、 四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸鈉、乙酸鈉(購自上海生工生物工程技術有限公司)。甘氨酸、考馬斯亮藍R-250購自AMRESCO公司。牛血清白蛋白(BSA)、胰酶、蛋白酶抑制劑(PMSF)、 甲醛均為Sigma公司產品。蛋白酶K (貯存液濃度為20mg/ml，使用液濃度為lmg/ml) 購自上海華舜生物工程有限公司；氨芐青霉素(Ampcillin)、卡那霉素(Kanamycin)、胎 牛血清、誘導劑IPTG (異丙基-b-d-硫代半乳糖苷)均為lnvitrogen公司產品；吸頭與離心 管是AxyGen公司產品。Taq酶及10xTaq酶Bu行er、 BamH I、 Xhol I等核酸內切酶及相關 Buffer、 T4連接酶及10xT4連接酶Buffer、 Rnase、 UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試 劑盒、DNA marker (DL-2000、 DL-15000)均為寶生物(大連)有限公司產品。
辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG 、羊抗豬IgG購自Sigma公司。底物液配制 底物液A: 0. 006%H202緩沖液；底物液B:取Na2HP04M2H2014. 2 g，檸檬酸10. 5g，用雙蒸 水定容至500raL配成0. 1磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH5. 0),然后加上聯苯二胺(TMB)。使用時將 A液和B液等體積混合，混合后5分鐘內使用，現配現用。
大腸桿菌培養基LB液體培養液及固體培養基(每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g， NaCl 10g，用10mol/LNa0H調pH至7.5， 121。C高壓滅菌20min， 4'C保存備用。在每100 毫升LB液體培養基中加入1.5g瓊脂即為固體LB培養基，12rC高壓滅菌20min， 4"C保 存備用)。
鏈球菌培養基TSB、 TSA培養基、RPMI-1640培養基及弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購 自Sigma公司。
純化三個豬鏈球菌2型抗原蛋白采用Ni Sepharose 6 Fast Flow純化柱(GE Healthcare公司產品)。
美國艾克森美孚白油購自東莞市行興行石化有限公司(埃克森美孚總代理) PBS緩沖液NaC18.0g， KC10.2g， KH2P04 0.24g， Na2HP04X 12H20 3.628g，溶于800ml蒸 餾水中，用鹽酸調pH值為7.4，蒸餾水定容至1000ml， 121。C高壓滅菌20min，室溫保存。 Western-blotting緩沖液
電轉緩沖液39mmol/L甘氨酸，48 mmol/LTris堿，0.037% SDS (電泳級)，20%甲醇。
配制lOOOmL轉移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸，5.8gTris堿，0.37gSDS,加200mL
甲醇，力卩ddH20至總量為1000 mL。
TBS (pH8.0)緩沖液10腿ol/LTris隱HCl， 150 mmol/LNaCl。 TBST緩沖液在上述TBS中加入終濃度為0.05%Tween-20即可。 麗春紅S (10x)貯存液2g麗春紅S， 30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加ddH2〇 至100 mL。 質粒抽提相關溶液
溶液l:含0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris HCI (pH8.0), 0.01 mol/L EDTA， 121
'C高壓滅菌20min后置室溫備用。 溶液ll:含0.2mol/L NaOH， 1%SDS，現配現用。
溶液lll:取5mol/L乙酸鈉60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5 mL，調pH至5.0。2mol/LNaOH: 8g NaOH力口入100mL ddH20。
10%SDS: 10g SDS加入80mL ddH2〇中，加熱攪拌溶解，定容至100mL。
5 mol/L NH4Ac: 327.7g NH4AC加入ddH2〇中溶解，定容至500mL。
10mol/LNH4Ac: 655.4g NH4AC溶于ddH2〇，定容至500mL。
13% PEG8000 (1.6 mol/L NaCI): 13gPEG8000， 9.35g NaCI，溶于ddH2〇，定
lOOmL， 121。C高壓滅菌20min。
3mol/LNaAc: 80mL ddH2〇中加入40.81 g醋酸鈉，定容至lOOmL， 12rc高壓滅菌 20min。
酚:氯仿:異戊醇(體積比為25:24:1):取飽和酚25mL、氯仿24mL、異戊醇lmL，充分混 勻后，用TE (pH8.0)覆蓋，于棕色瓶中保存。
氯仿:異戊醇(體積比24:1):取氯仿48 mL、異戊醇2mL，充分混勻后，TE (pH8.0) 覆蓋，棕色瓶中保存。
TE溶液1mmol/LEDTA， 10mmol/L Tris-CI pH值為8.0。 引物設計與合成
應用引物設計軟件Primer 5.0，設計了用于擴增朋W7W基因的引物對，該引物由上海 生工生物技術有限公司合成。引物序列如下 正向引物為5-GCTGAATTCACGACAGAGACTTCMCA ( EcoRl);
反向引物為5-TAGCTCGAGGCGCTGTTCACCTGT (XhoI)。 試驗動物采用7周齡雌性BALB/c小白鼠，購自湖北省疾病預防控制中心。 2、抗原蛋白制備方法
豬鏈球菌2型(SS2)基因組DNA的提取
1) 豬鏈球菌2型(SS2)菌培養
將CVCC606株菌種接種于含有10%滅活新生牛血清的TSA培養基上(見上所述)，挑取 單個菌落接種于TSB液體培養基中，置于搖床中(150r/min) ， 37°C震蕩培養過夜。
2) 豬鏈球菌2型(SS2)基因組DNA的提取
取1.0ml菌液于1.5ml的離心管中，8000r/min離心5min，棄上清。沉淀懸于500 u 1 TE(PH8.0)中，加10%的SDS，使其終濃度為1°/。，然后加3yl蛋白酶K (20mg/ml) ， 37 。C作用2h。離心取上清，用等體積的酚/氯仿抽提1次，上清用二倍體積的無水乙醇在-20 。C沉淀10min， 12000r/min離心20min，沉淀用70%的乙醇洗兩次，室溫放置20min，讓酒 精揮發干凈。沉淀用20 yl滅菌的去離子水溶解，-2CTC保存。
3) 目的基因的擴增
以上述方法提取的CVCC606株菌的基因組作為PCR模板。使用表1所示的引物進行PCR 擴增。PCR反應體系如下
ddH20 10XTaq Buffer dNTP (2. 5raM each)
37.5p1 5. Oii 1 4. On 1
上游引物 下游引物
1. Op 1DNA模板 1 u 1
Taq酶(5U/ti 1) 0.5H 1
反應程序為94。C預變性5min; 94°C lmin; 55°C lmin; 72°C 5min; 30個循環，延伸72°C 10 min。
4) PCR產物回收
采用海生工生物工程技術有限公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，按照 UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒的說明書的步驟進行，具體操作如下
1) 用0. 8%的瓊脂糖膠電泳，使目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，在長波紫外燈下， 用在酒精燈火焰上燒過的手術刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂塊，放入1. 5ml滅菌離心 管中。
2) 按每lOOmg瓊脂糖膠加入400W Binding Buffer,置50-60。C水浴中10min,使瓊脂 糖凝膠徹底融化(加熱溶膠時，每2min混勻一次)。
3) 將UNIQ-IO柱放入收集管中，將融化的膠溶液轉移到UNIQ-10柱中，室溫靜置2min， 室溫8000rpm離心lmin。
4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，加入 500)4 Wash Solution,室溫8000rpm離心lmin。
5) 重復步驟4，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一個收集 管中，室溫12000rpm離心15 sec。
6) 將UNIQ-10柱放入一個滅菌的1. 5ml離心管中，根據PCR產物量的相對多少，在柱子 底部的膜中央加10-20W Elution Buffer或ddH20，室溫或37°C
放置2min室溫12000rpm離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用
或保存于-2(TC備用。 重組表達質粒的構建
利用EcoRl + XholI (購自寶生物(大連)有限公司產品)同時酶切PCR擴增的戰W/97 基因片段和pET-28a(+)，回收PCR擴增片斷以及表達載體，將酶切后報^^7基因片段與酶 切后pET-28a(+)連接，構建出pET-28a-0197質粒。上述酶切位點在本發明所用質粒 pET-28a(+)中均為單一酶切位點(插入位置在EcoRl與Xholl酶切位點之間)。 連接產物的轉化
取感受態細胞DH5 a 100 iU加入到1. 5mlEP管中，將連接后的重組質粒pET-28a-0197 各5-10ii 1加入并混勻。置冰上30min后，42。C熱激90sec,冰浴3min-5min。加入400 u 1 LB， 于37t;200rpm振蕩培養45min使其復蘇。復蘇后的重組大腸桿菌懸液于4'C5000rpm離心 10min，棄去400lU上清，用剩余的100y 1重懸沉淀涂布于含有25u g/ml Kna的LB瓊脂平 板。37。C增殖lh，再將平板翻過來，倒置37。C培養14h-16h至菌落出現。 重組質粒的酶切鑒定
質粒的提取使用堿裂解法(參照《分子克隆實驗指南》第三版.黃培唐等譯，北京，科學出版社，2002版介紹的方法)進行，具體操作步驟如下
1) 用滅菌牙簽在LB平板上隨機挑取數個單菌落，分別接種于3ml 25ixg/ml卡那霉素 的LB液體培養基中，37'C振蕩培養過夜。
2) 將菌液轉入1. 5ml離心管內，于4"8000rpm離心3min，棄上清，再將剩余的1. 5ml 菌液重復離心，倒立離心管于吸水紙上，使液體流盡。
3) 加入100 u 1冰預冷的溶液I ，渦旋使菌體充分懸浮，再加入200 u 1新配制的溶液 II，反復顛倒離心管數次，冰浴5min，最后加入150.0tU冰預冷的溶液ni，溫和顛 倒離心管數次，冰浴10min。
4) 于4。C以12000rpm離心10min，吸取上清至另一支1. 5ral離心管中，加入等體積的 異丙醇，混和均勻，室溫靜置5min。
5) 室溫12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75W令乙醇漂洗后，按照常規真空千燥 或自然干燥方法干燥。
6) 沉淀用200ul含20ul Rnase (20ng/ml)的TE (pH8. 0)溶解，56。C水浴30min 或37。C水浴lh以除去RNA。
7) 加7. 5mol/L NH4Ac 100y 1，室溫靜置5min，再于室溫12000rpm離心5min。
8) 吸取上清到另一1.5ml的EP管中，加入2倍體積的冷無水乙醇，冰浴置10min。
9) 于4。C12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75%冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20 u 1 ddH20或TE (pH8.0)，置-2(TC冰箱保存備用。
重組質粒的雙酶切鑒定利用EcoRl+XholI酶切PET-28a-0197表達質粒，酶切后應出現預
期大小的外源片段和載體片斷即為正確的重組質粒。
重組表達菌株的構建取感受態細胞BL-21 (DE3) 100n 1加入到1.5mlEP管中，將重組質粒 pET-28a-0197各0. 5 y 1加入并混勻。置冰上30min后，42。C熱激90秒，冰浴3min-5min。 將其涂布于含有25 u g/ml Kna的LB瓊脂平板。37匸正置lh，再將平板翻過來，倒置37。C培 養14h-16h至菌落出現。 目的基因在大腸桿菌中的表達及純化
目的基因的誘導表達:將含重組抗原蛋白0197的表達菌株接種于含有25ug/ml Kna的3mL LB液體培養基，于37'C搖床培養。從培養好的菌液中取100uL接種于10mL含有25(jg/ml Kna的新鮮LB液體培養基中，于37t:振蕩培養約3h，至〇0600達到0.6-1.0時，加IPTG 至終濃度為0.8 mmol兒，繼續培養3h后收集菌體。 表達產物的SDS-PAGE電泳分析 SDS-PAGE電泳樣品的制備
將誘導后的重組大腸桿菌于8000r/min離心15min。沉淀用1/10體積的50mMTris-cl (pH8.0)重懸，并加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰浴30min。冰浴條件下進行超聲碎破，直至菌液不再粘稠，IO00Or/min，離心30min。分別取少量裂解后的上清和沉淀，加入Zx蛋白電泳上樣緩沖液125pl,oTT25pl及TE液100pl，震蕩混勻，100℃煮沸IOmin,1200Or/min離心smin，進行SDS一PAGE電泳分析。SDS聚丙烯酞胺凝膠的配制及電泳
12％的分離膠配制純化水1.6ml,30％丙烯酞胺溶液2.0ml,1.smol/LTris一Base溶液(pHS.8)1.3ml,10%SDS0.Osml,10％過硫酸錢0.Osml和TEMED0.003ml。將各成分加入后迅速混合，加入制膠板中，上面加純化水。5％積層膠配制純化水2.lml,300k丙烯酞胺溶液0.5ml,1.omol/LTris一Base溶液(pH6.8)0.38ml,10%SDS0.O3ml,10％過硫酸按0.O3ml,TEMED0.003耐；將各成分加入后迅速混合，加入制膠板的分離膠的上面，灌滿后插入加樣梳。待積層膠凝固后，取下梳子；將凝膠固定于電泳裝置上，加入足夠量的TriS一甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入各樣品電泳電壓200V，電流在20mA一40mA范圍內，電泳1h,至澳酚藍泳出膠底面，終止電泳。聚丙烯酞胺凝膠染色與脫色
卸下凝膠，用考馬斯亮藍R25O染色液(45％甲醇，45q0純化水，10％冰乙酸，0.25％的考馬斯亮藍R250)染色3Omin，再用脫色液(45％甲醇，45％純化水，10W0冰乙酸)進行脫色lmin,觀察結果。重組蛋白的純化
將收集的重組抗原蛋白表達菌使用Bindingbuffer(20InMTris一HCIpH7.9,smMImidazole,0.5MNaCI)重懸，超聲波破碎，4oC12,0009離心15min取上清上樣。分別使用Bindingbuffer和Washingbuffer(20mMTris一HCIpH7.9,15InMImidazole,0.5MNaCI)洗柱直至OD值達到基線附近，換用Elutionbuffer(20mMTris一毗1pH7.9,40mMIm主daZole,0.5MNaCI)洗脫結合的重組抗原蛋白，收集波峰部分蛋白作為純化的重組抗原蛋白用于進一步分析。
本實施例的效果見圖3所示。重組抗原蛋白居刃／夕7純化SDS一隊GE電泳分析見圖4。實施例2重組抗原蛋白的特性分析1.用western一blot方法分析重組抗原蛋白的抗原性將上述純化的重組抗原蛋白0197按照常規方法進行SDS一PAGE電泳。其步驟是1)轉移切出6張Whatman3M濾紙和1張硝酸纖維膜(NC膜)，濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或略小于凝膠，用鉛筆在濾膜一角作標記，確保轉印后膜與凝膠的相對方向；將硝酸纖維膜在純化水中浸泡5min；在另一淺托盤中加入少量轉移緩沖液，將6張Whatman3M濾紙浸泡于其中。然后按照如下步驟安裝轉移電泳槽平放石墨電極的底座(陽極)，依次放3層3M濾紙、硝酸纖維膜、聚丙烯酞胺凝膠和3層3M濾紙。徹底排除各層間的氣泡；將轉移電泳槽的上蓋扣到石墨電極一轉移膜膠復合體上；連接電源， 根據凝膠板面積按照0.65 mA/cm2-1.0raA/cm2的參數接通電流，電泳轉移0. 5h-2h。
2) 麗春紅染色轉移結束后，取下NC膜，于去離子水中漂洗2次-3次后，轉移至麗春 紅染色液中染色5min-10min，觀察轉印效果，并用鉛筆標出蛋白Marker位置；室溫下 用去離子水漂洗硝酸纖維膜直至顏色褪去；
3) 將NC膜置于5%的脫脂奶粉中，室溫封閉2h;
4) 洗膜棄封閉液，用1XTBST洗NC膜3遍，每次5min;
5) —抗孵育將NC膜放入用5%的脫脂奶粉稀釋的兔抗SS2型菌陽性血清(體積比1:50)， 37。C孵育2h;
6) 洗膜取出NC膜，用1XTBST洗膜3次，每次10min;
7) 二抗孵育:將膜轉入5%的脫脂奶粉稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(體積比1:5000)， 37。C孵育2h;
8) 洗膜取出NC膜，用 1XTBST洗膜3次，每次10min;
9) 顯色將NC膜置于新配置的DAB顯色液中，置暗處顯色，待蛋白帶的顏色深度達到要 求后，用1XTBST沖洗以終止反應。
2.重組蛋白抗血清的制備
1) 重組蛋白濃度的測定
參照《分子克隆實驗指南》第三版，黃培唐等譯，北京，科學出版社，2002年版介紹的 方法，將牛血清白蛋白用PBS緩沖液溶解，然后按體積進行倍比稀釋。分別取每個濃度的蛋 白標準液lOOul,加入到5ral的考馬斯亮蘭染料液中，反應10min后，在波長595nm處 測吸光度，根據測得的OD值與相應濃度的關系，繪制標準曲線，并推導出換算公式。
2) 疫苗的制備及免疫試驗
重組抗原蛋白疫苗的制備將重組抗原蛋白0197與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，使 疫苗中抗原蛋白終濃度為500wg/ml。第二次免疫用疫苗采用弗氏不完全佐劑。
免疫方法給所述的試驗小鼠腹腔接種弗氏完全佐劑乳化的重組蛋白疫苗(接種量為
100ul/只)；2周后腹腔接種弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白疫苗(接種量為100ul/只)；間
隔10天后于眼眶放血，收集血清。
本實施例中采用Western-blot方法分析重組抗原蛋白，發明效果見圖4。
實施例3:重組抗原蛋白小鼠免疫保護力試驗 1.重組蛋白的表達及純化
將含pET-28a-0197質粒的表達菌株接種于含0. 25p g/ml卡那霉素的3 mL LB液體培養基，于37'C搖床培養。從培養好的菌液中取100 n L接種于10 mL含2. 5 y g卡那霉素的新鮮 LB液體培養基中，于37。C振蕩培養約3h，至OD卿達到0.6-1.0時，加IPTG至終濃度為0. 8 mmol/L，繼續培養3h后收集菌體。
將以上收集的重組抗原蛋白表達菌用Binding buffer(20 mMTris-HC1 pH7.9， 5 mM Imidazole, 0.5腦aCl)重懸，超聲波破碎，4'C12,000g離心15min取上清上樣。分別使用 Binding buffer和Washing buffer(20 mMTris-HCl pH7.9， 15 mM Imidazole, 0.5 MNaCl) 洗柱直至0D值達到基線附近，換用Elution buffer (20 mMTris-HCl pH7. 9， 40mM Imidazole, 0.5 MNaCl)洗脫結合的重組蛋白，收集波峰部分蛋白作為純化的重組蛋白。
2. 重組蛋白濃度的測定(Bradford法)
具體操作見實施例2。
3. 重組抗原蛋白疫苗制備及免疫方法
1) 重組抗原蛋白疫苗的制備
將重組抗原蛋白0197與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，使疫苗中抗原蛋白終濃度為500 yg/ml用于首次免疫，第二次免疫使用弗氏不完全佐劑，其余組分與首免相同。
滅活疫苗制備將豬鏈球菌2型CVCC606株菌經純培養后，挑取單個菌落8 10個， 涂于TSA平板上(含10%滅活牛血清)。37。C培養16h 18h后，用滅菌的0. 01mol/L PBS 將平板上的菌苔洗下，稀釋至7.5X109cfu/ml，用甲醛滅活(3%。) 24h 48h，然后與弗氏
佐劑按1:1體積混合乳化，終濃度達到3. 0 X 103cfu/ml 。
2) 免疫方法
試驗小鼠腹腔免疫弗氏完全佐劑乳化的抗原蛋白100p1 /只；2周后腹腔免疫弗氏不完 全佐劑乳化的抗原蛋白100yl /只。
3) 半數致死量(LD5 )的測定
(1) 預試驗在預試中求得8周齡雌性BALB/c小鼠全死亡或90%以上死亡的劑量和動 物不死亡或10%以下死亡的劑量，分別作為正式試驗的最高與最低劑量。
(2) 注射方式腹腔注射。
(3) 動物分組設立4個劑量組，每組6只BALB/c小鼠。
(4) 劑量將由預試驗得出的最高、最低劑量均換算為常用對數，然后將最高、最低 劑量的對數差，按所需要的組數，分為幾個對數等距(或不等距)的劑量組。
(5) 試驗結果的計算與統計。
4) 試驗分組及免疫
7周齡，體重18土2g雌性BALB/c小白鼠30只，平均分為3組、疫苗I組(0197)、 弗氏佐劑對照組和PBS對照組，每組20只。腹腔注射，每2周免疫1次，共2次，免疫劑 量為0. lml/只，期間每周斷尾取血，用于血清特異性抗體的監測。
5) 血清特異性抗體的檢測使用純化的重組抗原蛋白0197 250 ng/100u 1于4。C過夜包被酶聯板，1% BSA 37。C封 閉lh，洗滌液洗板1次后封裝于-2(TC保存。將加強免疫一周后的小鼠采血分離血清，倍比 稀釋后取100yl加入酶聯板，同時設弗氏佐劑對照和空白對照。37X:反應30niin。洗板3次 后加入體積比l:5,000稀釋的羊抗鼠IgG (H+L) - HRP，37。C反應30min。洗板5次后加入100u 1 底物液，避光顯色10min后加入0.25WHF終止反應，于630nm讀數。取OD值大于0. 3的血清
最大稀釋倍數作為血清抗體滴度。
6) 重組抗原蛋白誘導小鼠抗體IgG亞類測定
將加強免疫2周后的小鼠采血分離血清，倍比稀釋后取100ul加入酶聯板，37'C反應 30min。洗板3次后每個稀釋度的血清分別加入體積比1:5， 000稀釋的羊抗鼠IgGl - HRP、 IgG2a -服P， 37。C反應30min。洗板5次后加入100 u 1底物液，避光顯色10min后加入0. 25%HF 終止反應，于630nm讀數。取OD值大于0. 3的血清最大稀釋倍數作為該IgG亞類的滴度。
7) 免疫鼠攻毒后保護情況
對加強免疫兩周后的小鼠進行攻毒試驗。攻毒試驗分為兩批進行，每組10只，每個蛋白 免疫的小鼠分別接種5LD5o和20LD5o劑量的CVCC606株菌。連續觀察一周，記錄小鼠的 臨床特征及死亡情況。
本實施例中重組抗原蛋白的表達、純化效果見圖4; CVCC606株菌半數致死量(LDs。)為 4Xl(fCFU;對重組抗原蛋白0197進行血清特異性抗體的檢測發現能誘導很高的抗體水平， 效果見圖5;重組抗原蛋白誘導小鼠抗體IgG亞類測定，結果見圖6。將純化的重組抗原蛋白 0197免疫小鼠，以5 LDs。和20 LDs。攻毒評價重組抗原蛋白的免疫保護力，結果如圖7所示。。
本發明通過克隆表達豬鏈球菌2型抗原蛋白0197，對0197的特性經行實驗分析，證明 了該抗原蛋白具有較好的免疫原性，免疫小鼠后能誘導較高抗體水平，并主要誘導Th2型免 疫。攻毒保護力實驗表明該蛋白能夠明顯增強小鼠對SS2的抵抗力，是一種很好的免疫保護 性抗原，可以作為豬鏈球菌2型亞單位疫苗的候選抗原。
權利要求
1、一種能夠分泌豬鏈球菌2型抗原蛋白的重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-0197，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NOM208146。
2、 一種由權利要求1所述重組大腸桿菌分泌的豬鏈球菌2型抗原蛋白。
3、 一種由權利要求2所述重組大腸桿菌分泌的豬鏈球菌2型抗原蛋白制備的 亞單位疫苗。
4、 權利要求1所述的重組大腸桿菌在制備豬鏈球菌2型抗原蛋白中的應用。
5、 權利要求1所述的重組大腸桿菌在制備豬鏈球菌2型亞單位疫苗中的應用。
全文摘要
本發明屬于家畜傳染病技術領域。具體涉及一種豬鏈球菌2型免疫保護性抗原及其制備方法與應用。涉及本發明的核心技術是制備了能夠分泌豬鏈球菌2型抗原蛋白0197的表達菌株Escherichia coli BL21/pET-28a-0197，該菌株保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NOM208146。本發明還公開了適用于豬鏈球菌2型的亞單位疫苗的抗原蛋白的制備方法及用途。
文檔編號A61P31/04GK101418275SQ20081022534
公開日2009年4月29日 申請日期2008年10月30日 優先權日2008年10月30日
發明者張安定, 慕小鳳, 冉 李, 金梅林, 博 陳, 陳煥春 申請人:華中農業大學