專利名稱：：一種含有假絲酵母尿酸氧化酶的藥用制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含有假絲酵母尿酸氧化酶的藥用制劑，尤其是涉及含有假絲酵母尿酸氧化酶的液體或凍干的組合物藥用制劑。
背景技術(shù)：
：假絲酵母尿酸氧化酶UOX全長303個(gè)氨基酸，分子量為34.19kDa，理論等電點(diǎn)為8.4。尿酸氧化酶(UOX)是嘌呤代謝途徑上的關(guān)鍵酶之一。不同種類的生物分解嘌呤堿的能力不一樣，因而代謝產(chǎn)物亦各不相同。人和猿類及一些排尿酸的動(dòng)物以尿酸作為嘌呤堿代謝的終產(chǎn)物。假絲酵母和大鼠等多種生物則能產(chǎn)生尿酸氧化酶，該酶進(jìn)一步分解尿酸，形成尿囊素。后者在水中的溶解度遠(yuǎn)大于尿酸，從而有利于大鼠等哺乳動(dòng)物清除體內(nèi)尿酸。在長期的進(jìn)化過程中，人類的尿酸氧化酶基因發(fā)生突變，不能正常編碼尿酸氧化酶，因此當(dāng)體內(nèi)尿酸水平增加時(shí)容易引起以血液尿酸水平增高為特征的痛風(fēng)或者尿酸性腎病。在臨床上，由于UOX能夠有效地分解尿酸，降低血液尿酸濃度，因此可以用來治療高尿酸癥。為了使假絲酵母尿酸氧化酶作用于人體或動(dòng)物，必須將其配制成一定的藥用制劑形式以供臨床使用，并且這種制劑能夠保證尿酸氧化酶在長期的保存過程中物理化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定和生物學(xué)活性穩(wěn)定。與眾多蛋白質(zhì)藥物一樣，將假絲酵母尿酸氧化酶做成制劑需要考慮多方面因素，以保證制品的質(zhì)量、工藝可行性、經(jīng)濟(jì)可行性以及法規(guī)可行性等。溶解性是許多蛋白質(zhì)藥用制劑需要考慮的因素之一，如何選用經(jīng)濟(jì)、可靠、有效的增溶劑或制備工藝對(duì)于制備出合格的制劑很重要。法國Sanofi公司開發(fā)了高尿酸血癥治療藥物"拉布力酶"，它是一種重組黃曲霉菌尿酸氧化酶凍干粉針劑，在2001年6月在德國和英國首次上市，但其產(chǎn)品價(jià)格較為昂貴。Sanofi公司于1996年在中國申請(qǐng)了發(fā)明專利并已獲得授權(quán)，
專利名稱：為"含有尿酸氧化酶的穩(wěn)定液體組合物及用于制備該液體組合物的凍干組合物"，專利號(hào)為96110721.9，其專利中描述的藥物組合物突出特點(diǎn)是含有助乳化劑、分散劑poloxamer188，以此來維持藥物的溶解性。美國有5種不同規(guī)格的泊洛沙姆(124，188，237，338，407)，只有泊洛沙姆188作為靜脈注射劑的乳化劑使用，其它規(guī)格的泊洛沙姆均用于口服或外用制劑中。世界范圍內(nèi)，泊洛沙姆還缺乏足夠的臨床使用，以驗(yàn)證其可靠性。目前泊洛沙姆輔料尚未進(jìn)口我國，即我國目前尚無注射規(guī)格的泊洛沙姆上市，我國尚未認(rèn)可該輔料。因此，國內(nèi)蛋白質(zhì)制劑不能使用該藥物作為輔料。另外，不同分子的尿酸氧化酶具有不同的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，其分子穩(wěn)定性和性質(zhì)相差較大，某一制劑處方對(duì)不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)無通用價(jià)值。假絲酵母尿酸氧化酶含有多個(gè)半胱氨酸，其分子內(nèi)和分子間錯(cuò)配在制劑研究中也值得關(guān)注。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種含有假絲酵母尿酸氧化酶的藥用制劑，采用特定的的處方組成，能夠保持藥物穩(wěn)定性和活性，降低成本。本發(fā)明中所述的活性成分假絲酵母尿酸氧化酶可通過基因重組獲得，制備方法可以參考中國專利031091504。根據(jù)生物制品制劑工藝及其處方的基本標(biāo)準(zhǔn)以及我公司已上市產(chǎn)品的賦型經(jīng)驗(yàn)和U0X的分子特性，分別從外觀、澄明度、生物活性等要求方面入手，以下處方配置方面入手摸索制劑工藝處方1.考察的賦型劑甘露醇、蔗糖、甘氨酸。2.考察的活性保護(hù)劑丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸。3.考察的助溶劑吐溫、甘油、聚氧乙烯蓖麻油、SDS等。4.考察的緩沖體系Tris-HCL(pH7.5、8.0、8.5和9.0)50mMPB緩沖液(pH7.0、7.5、和8.0)硼酸(pH7.0、7.5、8.0、8.5)。在輔料的選用上，我們放棄了目前在中國尚未被接受的poloxamer188，與已知文獻(xiàn)差別顯而易見。上述添加劑不同比例進(jìn)行處方組成并凍干，凍干后按順序依次檢測(cè)如下指標(biāo)外觀、用注射用水溶解后澄明度、生物活性(采用體外尿酸氧化法，具體參考已經(jīng)上市藥品拉布力酶的活性測(cè)定方法)、水分等指標(biāo)。通過實(shí)驗(yàn)研究，比較了大量的不同輔料組合，本發(fā)明最終提供了一種含有假絲酵母尿酸氧化酶的藥用制劑的理想組合，組合物包括活性成分假絲酵母尿酸氧化酶、甘露醇、保護(hù)劑和緩沖劑。篩選路線如下緩沖體系一常用的PB作為緩沖溶液，終濃度為50mM，選pH7.0、7.5、8.0(注pH8.0己接近PB緩沖能力上限，國外同類產(chǎn)品Rasburicase選用緩沖體系為pH8.0,40mMPB)，賦型劑分別選用甘露醇、蔗糖、甘氨酸，各自用量分別為2%，5%，7%,各分裝20支，共9組180支，進(jìn)行正交試驗(yàn)(見表一)。表一50mMPB緩沖液，UOX1.8mg/ml/支4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由試驗(yàn)結(jié)果可見，緩沖體系pH為7.0，7.5時(shí)溶解后澄明度太差，均渾濁，達(dá)不到要求。p118.0時(shí)甘露醇，庶糖為賦型劑的樣品用生理鹽水溶解后看不見明顯的渾濁，但在傘棚燈下可見乳光，同樣達(dá)不到要求，而且各賦型劑終濃度為2%時(shí)外觀賦性較差，甚至出現(xiàn)萎縮，外形不完整。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒有合乎要求的配方。緩沖體系二選擇硼酸。試驗(yàn)設(shè)計(jì)硼酸終濃度為50mM，pH為7.0、7.5、8.0，根據(jù)試驗(yàn)一，甘露醇終濃度可選擇5%、7%，在不影響賦型基礎(chǔ)上，選擇較低量5%。表二50mM硼酸緩沖液，U0X1.8mg/ml/支<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>可見pH8.0、9.0時(shí)外觀良好，但澄明度均達(dá)不到要求，且活性下降較明顯。最終確定緩沖體系為，pH9.0。制劑處方中保護(hù)劑的選擇為保護(hù)活性、使溶解后澄明度達(dá)到要求，加入甘氨酸，甘氨酸為疏水性氨基酸，有利于疏水性蛋白溶解，提高澄明度。表四.按表二PH9.0配方加入甘氨酸<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表四可見，甘氨酸在凍干過程中對(duì)uox活性有保護(hù)作用，但加入甘氨酸后，溶解后澄明度仍然達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)。為保護(hù)UOX蛋白分子，防止其在凍干過程中聚合或氧化，需加入另一種保護(hù)劑，選擇加入SDS，Arg，L-Cys，Glu。其中SDS已禁止用于靜脈注射液，本試驗(yàn)只作為對(duì)照研究，Arg為堿性氨基酸，Glu為酸性氨基酸，可用來凋節(jié)pH值，L-Cys具有抗氧化作用，可防止二硫鍵錯(cuò)配。試驗(yàn)結(jié)果見表五。表五.向1.8mgU0X，50mMTris—gly，5%甘露醇加入保護(hù)劑后凍千情況添加劑SDS(%)Arg(mM)L—Cys(raM)Glu(mM)加入量0.050.1102040510201020活性(U,/ml)16.45.2519.1119.3219.9517.1520.6923.219.720.69外觀良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好澄明度渾濁澄明乳光乳光乳光乳光澄明澄明乳光乳光序號(hào)12345678910由表五可見精氨酸和谷氨酸的加入并未改善制劑溶解后的澄明度問題，仍然有乳光；SDS可使活性明顯下降，這可能與SDS使UOX鏈松散變性有關(guān)；隨著半胱氨酸加入量升高，活性升高，溶解度提高。為確定半胱氨酸的加入量，分別加入5、10、20、40mML-Cys，凍干后檢測(cè)，結(jié)果見表表六.半胱氨酸加入量優(yōu)選序號(hào)1234L—Cys(mM)5102040活性(U/ml)15.526.126.2227.5外觀良好良好良好良好澄明度合格合格合格合格結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入IO、20、40mML-Cys外觀及澄明度均合格，隨著L-Cys量加大，活性并無明顯差異，因而選擇制劑成品中半胱氨酸的終濃度為10mM。本發(fā)明所述的藥用制劑處方最終確定的每支組分組成是重組假絲酵母尿酸氧化酶1-3.6mg/ml緩沖體系Tris-Gly10-80raMApH7.5-10賦型劑甘露醇1-7%7保護(hù)劑L一Cys5-40mM/l本發(fā)明所述的藥用制劑，是一種穩(wěn)定的液體或凍干組合物。組合物組分中，保護(hù)劑選用半胱氨酸，緩沖體系選用Tris-Gly，用于調(diào)節(jié)pH值。本發(fā)明所述的藥用制劑處方最為優(yōu)選的每支組分組成是重組假絲酵母尿酸氧化酶1.8mg/ml緩沖體系Tris-Gly50mM/LpH9賦型劑甘露醇5%保護(hù)劑L—Cys10mM/L對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)Tris-HCL作緩沖體系，加入甘氨酸作保護(hù)劑，加入半胱氨酸可防止蛋白聚合導(dǎo)致的凍干后澄明度下降，半胱氨酸加入量選10mM即可，加大量并未起到更明顯效果，甘露醇終濃度選用5%，該配方生物活性穩(wěn)定，澄明度、水分達(dá)到要求。本發(fā)明通過將各組份溶于注射用水或?qū)龈晌锶苡谧⑸溆盟@得藥物溶液，含假絲酵母尿酸氧化酶的藥物溶液通過凍干獲得穩(wěn)定的凍干制劑。該組合物是無菌的，可以通過皮下、靜脈或肌肉注射進(jìn)入人體或動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一種不同于現(xiàn)有技術(shù)的方法，篩選到一種含有假絲酵母尿酸氧化酶的穩(wěn)定的藥用制劑，不僅可以達(dá)到臨床使用的要求，而且可以使廣大患者從中受益、減少醫(yī)療費(fèi)用開支。具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明的假絲酵母尿酸氧化酶的藥用制劑做進(jìn)一步具體說明，但不僅限于以下實(shí)例。實(shí)施例1穩(wěn)定的假絲酵母尿酸氧化酶溶液的制備原液制備按照中國專利031091504方法制備的重組假絲酵母尿酸氧化酶，經(jīng)超濾置換到下述緩沖液甘氨酸100mM/L、Tris—HCl(pH9.0細(xì)幽/L)、L-Cys(20mM/L)，制備成重組假絲酵母尿酸氧化酶濃度為3.6mg/ml的原液；配液取該原液500ml，加入25。/。甘露醇200ml，加入注射用水定容至1000ml;過濾除菌采用0.22微米的濾膜過濾；分裝采用西林瓶分裝成每支lmi的制劑；凍干冷凍干燥，制成最終制劑。權(quán)利要求1、一種含有假絲酵母尿酸氧化酶的藥用制劑，其特征在于該制劑包括活性成分假絲酵母尿酸氧化酶、賦型劑、保護(hù)劑和緩沖體系。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用制劑，該組合物中賦型劑選用1-7%的甘露醇。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用制劑，該組合物中保護(hù)劑選用5-40mM/L的L-半胱氨酸。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用制劑，該組合物中緩沖體系選擇pH值為7.5-9、濃度為10-50mM/L的Tris-Gly。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用制劑，其中所述的活性成分假絲酵母尿酸氧化酶為基因重組物。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用制劑，是一種液體組合物。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用制劑，是一種凍干組合物。8、根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的藥用制劑，該組合物組分組成是重組假絲酵母尿酸氧化酶1-3.6mg/ml;Tris-Gly:pH7.5-10，10-80mM/L;甘露醇1-7%;L—半胱氨酸5-40mM/L。9、根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的藥用制劑，該組合物組分組成是重組假絲酵母尿酸氧化酶1.8mg/ml;Tris-Gly:pH9，50mM/L;甘露醇5%;L一半胱氨酸10mM/L。全文摘要本發(fā)明涉及一種含有假絲酵母尿酸氧化酶的藥用制劑，尤其是涉及含有假絲酵母尿酸氧化酶的液體或凍干的組合物藥用制劑。本發(fā)明的組合物包括活性成分假絲酵母尿酸氧化酶、甘氨酸、半胱氨酸和緩沖體系；該組合物是無菌的，可以通過皮下、靜脈或肌肉注射進(jìn)入人體或動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用。文檔編號(hào)A61K38/44GK101485882SQ200810224758公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2008年12月29日優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日發(fā)明者娜倪,迎劉,呂升陽,吳彥卓,濤孫,鵬張,徐明波,李亞軍,楊仲璠,梁果義,王俊玲,王勇波,王延山,連治國,齊燕明申請(qǐng)人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司