專利名稱：：雙芐基異喹啉類生物堿的新用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及雙芐基異喹啉類生物堿的新用途。
背景技術：
：雙芐基異喹啉類生物堿的結構式如式(I)所示式(I)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，R"是氫，l-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基。尺2和尺3是氫，取代酰基，直鏈或支鏈烷基和其中烷基可以被選自，N，S的雜原子間斷。112和113可以一起為0或S。W和RS是氫，取代酰基，直鏈或支鏈烷基或其中烷基可以被選自O，N，S的雜原子間斷。W和RS可以一起為0或S。XpX2，X3，X4可以相同或不同并且各自獨立地為鹵原子、羥基或1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或酰氧基，且n是03的整數。同時，包括C(1)和C(r)(RR、SS、1S1，R、1R1，S)的任何立體異構體。有關式(I)所示的雙芐基異喹啉類生物堿的化學性質及其衍生物的制備方法等已在中國專利00113166.4中描述。端粒是指真核生物線性染色體末端的非編碼DNA區域，其功能為在重組過程中協助染色體排列；穩定染色體末端結構，防止染色體間末端連接；可補償滯后鏈5'末端在消除RNA引物后造成的空缺。端粒DNA序列在體外能形成四鏈體結構(Wang，Y.andPatel，D.J.,Structure,2，1141-1156(1994).)。組織培養的細胞證明，端粒在決定細胞的壽命中起著重要作用，經過多代培養的老化細胞端粒變短，染色體也變得不穩定。細胞分裂的時候，因為3'末端在復制過程中是滯后鏈，DNA聚合酶不能復制染色體3'鏈的最末端，這種"末端復制問題"導致細胞每倍增一次端粒就縮短約30-200個堿基，大約經過60-70次復制后，端粒達到一個臨界長度，此時細胞就進入非分裂狀態，叫做衰老期，這將導致細胞凋亡直至死亡(Harley,C.B.，etal.，Nature,345,458-460(1990).)。端粒酶，是基本的核蛋白逆轉錄酶，可將端粒DNA加至真核細胞染色體末端。端粒酶在不同物種細胞中對于保持染色體穩定性和細胞活性有重要作用，能延長縮短的端粒，從而增強體外細胞的增殖能力。端粒酶在正常人體組織中活性被抑制，在腫瘤中被重新激活，可能參與惡性轉化。端粒酶在保持端粒穩定、基因組完整、細胞長期的活性和潛在的繼續增殖能力等方面有重要作用。Kim等發現，在85-90%的癌細胞中，一種逆轉錄酶-端粒酶被激活(Kim，N.W.,etal.,Science,266,2011-2015(1994).)，這提供了一種用于治療癌癥的特異的靶。端粒序列隨生物體的不同而不同。在人類和其他脊椎動物中，端粒含有TTAGGG的重復序列。在人體中，端粒酶將TTAGGG重復序列加入到端粒末端，以平衡細胞分裂所帶來的端粒縮短，結果端粒的長度被保持住，使得癌細胞永生化。人類端粒具有一段5-15kb的雙鏈區域，一條鏈富含嘌呤(A鏈)，一條鏈富含嘧啶(B鏈)。在3'末端，A鏈存在一個200個堿基長度的單鏈突出，該單鏈可作為端粒酶的引物。Zahler等發現，G-四鏈體的形成能阻止端粒酶與端粒的結合，從而抑制端粒酶的活性(Zahler，A.M.,etal.，Nature,350718-720(1991).)。G-四鏈體DNA是由含有一連串連續鳥嘌呤殘基的DNA形成的一種四鏈DNA結構(Cech，T.R.，Nature,332，777-778(1988).)。因此，關于穩定端粒G-四鏈體DNA的小分子的研究是目前抗癌藥物設計的一個熱點領域。
發明內容本發明的目的是提供雙芐基異喹啉類生物堿的新用途。本發明所提供的雙芐基異喹啉類生物堿的用途為式(I)所示的化合物或其藥物學上可接受的鹽在制備抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物中的應用；式(I)中，R'是氫或含l-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基；112和尺3分別為下述基團中的一種氫，取代酰基，直鏈或支鏈垸基，其中垸基可以被選自O，N，S的雜原子間斷；W和RS也可以一起為0或S;W和RS分別為下述基團中的一種氫，取代酰基，直鏈或支鏈烷基，其中垸基可以被選自O，N，S的雜原子間斷；W和RS可以一起為0或S;X"X2，X3，X4可以相同或不同并且各自獨立地為鹵原子、羥基或1-10個碳原子的直鏈或支鏈垸基或垸氧基或酰氧基，且n是0~3的整數；同時，包括C(1)和C(1，)(RR、SS、1S1，R、1R1，S)的任何立體異構體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(I)所述雙芐基異喹啉類生物堿，具體可為式(I)中，R'為甲基，R2、R3、R4、R5均為氫，Xu為與6位碳原子相連的甲氧基，Xu為與7位碳原子相連的羥基，X21為與12位碳原子相連的甲氧基，X^為與6'位碳原子相連的甲氧基，乂411(11=1)為氫，C(1)與C(l')的空間構型皆為S構型的化合物。所述真核生物為哺乳動物。所述腫瘤細胞為癌細胞；所述癌細胞具體可為乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、腦癌細胞、卵巢癌細胞、子宮癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、白血病細胞、頭頸癌細胞、胃癌細胞、鼻咽癌細胞、結腸癌細胞、視網膜癌細胞、膀胱癌細胞、肛門癌細胞或直腸癌細胞；優選為白血病細胞、胃癌細胞、肝癌細胞或鼻咽癌細胞。本發明還保護一種抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物，它的有效成分為式(I)所示的雙芐基異喹啉類生物堿或它們藥物學上可接受的鹽。所述真核生物為哺乳動物。所述腫瘤細胞為癌細胞；所述癌細胞具體可為乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、腦癌細胞、卵巢癌細胞、子宮癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、白血病細胞、頭頸癌細胞、胃癌細胞、鼻咽癌細胞、結腸癌細胞、視網膜癌細胞、膀胱癌細胞、肛門癌細胞或直腸癌細胞；優選為白血病細胞、胃癌細胞、肝癌細胞或鼻咽癌細胞。本發明提供的雙芐基異喹啉類生物堿的新用途還為式(I)所示的化合物或其藥物學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。所述腫瘤可為癌，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、皮膚癌、白血病、頭頸癌、胃癌、鼻咽癌、結腸癌、視網膜癌、膀胱癌、肛門癌或直腸癌；特別適合于制備預防和/或治療人白血病、人胃癌、人肝癌和人鼻咽癌的藥物。有效成分為式(I)所示的雙芐基異喹啉類生物堿或它們藥學上可接受的鹽的預防和/或治療腫瘤的藥物，也屬于本發明的保護范圍。所述預防和/或治療腫瘤藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質混合或包裹后導入機體。以雙芐基異喹啉類生物堿或它們藥學上可接受的鹽為活性成分的抗腫瘤藥物，需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。用雙芐基異喹啉類生物堿或它們藥學上可接受的鹽制備的預防和/或治療腫瘤藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。試驗證明，式(I)所示的雙芐基異喹啉類生物堿或它們藥學上可接受的鹽可與G-四鏈體DNA(簡稱為Tdo7)結合，增加G-四鏈體的穩定性，從而競爭性抑制端粒酶與端粒的結合，抑制端粒酶的活性，抑制端粒延伸，減弱細胞的增殖能力，促進細胞凋亡。雙芐基異喹啉類生物堿體外抗癌細胞增殖實驗結果表明，雙芐基異喹啉類生物堿對于人白血病細胞系HL-60、人胃癌細胞系BGC-823、人肝癌細胞系Bel-7402以及人鼻咽癌細胞系KB均有比較好的抑制效果，當雙芐基異喹啉類生物堿的藥物濃度為25uM時對上述癌細胞的抑制率均超過了90%。圖1雙芐基以喹啉類生物堿與Tdo7的熒光淬滅圖，圖中的曲線從上到下，Telo7與雙節基以喹啉類生物堿的摩爾比分別為0:1、0.05:1、0.1:1、0.25:1、0.5:1、1:1、2:1、4:1。圖2為Telo7單獨存在時的熔點曲線圖以及加入了雙芐基異喹啉的Telo7的熔點曲線圖；其中l為單獨Telo7的熔點曲線圖，2為雙芐基異喹啉與Tdo7混合的熔點曲線圖。具體實施例方式實施例l、雙芐基異喹啉類生物堿對G-四鏈體熱穩定性的影響(1)雙芐基異喹啉類生物堿與G-四鏈體的結合在K+離子存在的條件下，溶液中的[d(TTAGGGT)]序列以平行結構四鏈體狀態[d(TTAGGGT)]4存在。當Telo7(G-四鏈體DNA)與雙芐基異喹啉類生物堿(式(I)中R'為甲基，R2、R3、R4、15為氫，XU『1)為與6位碳原子相連的甲氧基，Xln(n=2)為與7位碳原子相連的羥基，乂211(11=1)為與12位碳原子相連的甲氧基，X3n(n=l)為與6'位碳原子相連的甲氧基，X4n(『l)為氫,C(1)與C(l')的空間構型皆為S構型，該化合物是防己諾林堿(中國藥品生物制品檢定所))相接觸時，雙芐基異喹啉類生物堿即與Telo7結合。熒光光譜中，可以觀察到，Telo7(G-四鏈體DNA)的加入使得雙芐基異喹啉生物堿的熒光信號發生淬滅，即Tdo7與雙芐基異喹啉生物堿的結合使其發生熒光淬滅。因而能夠證明Teb7與雙芐基異喹啉生物堿的5口口o具體方法如下1、配制緩沖液緩沖液為水溶液，含有以下終濃度的各種物質17.2mMK+(K2HP04/KH2P04);pH7.4。2、將4000D[d(TTAGGGT)]所示的單鏈Tel07(北京擎科生物技術有限公司)溶解在緩^液中，得到濃度為200uM的Telo7母液。3、將3.0mg雙芐基異喹啉類生物堿溶解在緩沖液中，得到濃度為10mM的雙芐基異喹啉類生物堿母液。4、制備一系列不同的摩爾比的Telo7與雙芐基異喹啉類生物堿的混合溶液，混合溶液中雙芐基異喹啉類生物堿的濃度為20uM不變，Telo7與雙芐基異喹啉類生物堿的摩爾比分別為0:1、0.05:1、0.1:1、0.25:1、0.5:1、1:1、2:1、4:1。5、將上述混合溶液25'C孵育12h，熒光測定，觀察雙芐基異喹啉類生物堿熒光強度的變化。由圖1可見，在雙芐基異喹啉類生物堿的溶液中，加入Telo7后，Telo7使雙芐基異喹啉類生物堿的熒光強度減弱，發生了熒光淬滅，因此確定Telo7四鏈體與雙芐基異喹啉類生物堿發生了結合。(2)與雙芐基異喹啉類生物堿結合后Telo7的熱穩定性Telo7四鏈體的熔點是指G4結構分解5(m時的溫度。DNA的熔點(Tm)反應了它的熱穩定性，熔點越高說明該G4結構越穩定，反之，熔點越低說明該G4結構越不穩定。G4結構越穩定表明對腫瘤細胞增殖的影響越大，抗腫瘤增殖效果越明顯。通過圓二色譜(CD)變溫實驗測定雙芐基異喹啉類生物堿與Telo7的混合溶液(摩爾比為10:1)中Telo7的熔點，以濃度為200uM的Telo7溶液作為對照。采用的儀器為Jasco815圓二色譜儀，實驗中采用的CD吸收池光程為lcm。在進行實驗前用高純N2除氧5分鐘，且實驗中一直用高純N2作為保護氣以保證沒有臭氧出現，實驗數據采集前，用緩沖液進行基線校對。在近紫外區220nm-320nm采集CD光譜，掃描速度為500nm/min，集次數為3次。在變溫實驗中采用JascoPTC-423S控溫儀，溫速度為2'C/min，通過監控262nmCD信號來進行Telo7熔點的測定，結果如圖2所示。試驗重復3次，數據采用平均值±標準差。結果表明，無雙芐基異喹啉類生物堿存在時(對照)，Tdo7的熔點為43土l°C;當雙芐基異喹啉類生物堿存在時，Telo7熔點升高至57土l°C，提高Telo7熔點達14°C。變溫CD結果證實雙芐基異喹啉類生物堿的存在可以顯著的提高Telo7的穩定性。實施例2、雙芐基異喹啉類生物堿對人白血病細胞增殖能力的影響試驗采用MTT法。MTT法的基本原理為四甲基偶氮唑鹽[MTT，3-(4,5-dimethylthiazo1-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide](購自北京化學試劑公司)是一種能接受氫原子的染料。活細胞線粒體中與NADP相關的脫氫酶在細胞內可將黃色的MTT轉化成不溶性的藍紫色的formazon，而死細胞則無此功能。用DMS0溶解formazon后，在一定波長下用酶標儀測定光密度值，即可定量測出細胞的存活率。按照公式可計算腫瘤細胞生長抑制率(％)=(0D對照-0D實驗)/0D對照X100%,進而計算得到半數抑制濃度(IC5。)。1)雙芐基異喹啉類生物堿對癌細胞增殖能力的影響具體操作步驟如下1)選用對數生長期的貼壁人白血病細胞HL-60，用0.25%胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI1640培養液配制成5000個/ml的細胞懸液，接種在96扎培養板中，每孔接種100ul，37°C，5%C02培養24h。2)按3個質量濃度梯度設雙芐基異喹啉類生物堿組(式(I)中R'為甲基，R2、R3、R4、15為氫，Xh(『l)為與6位碳原子相連的甲氧基，X"r^2)為與7位碳原子相連的羥基，X^(『l)為與12位碳原子相連的甲氧基，乂311(11=1)為與6，位碳原子相連的甲氧基，X4n(『i)為氫,c(i)與c(r)的空間構型皆為s構型，該化合物是防己諾林堿(中國藥品生物制品檢定所))，第1-3行的第1-3列孔按濃度從低到高依次加入雙芐基異喹啉類生物堿ioow，使每孔中雙芐基異喹啉類生物堿終濃度依次為12.5|uM、25pM、50pM;第1-3行第4列孔為對照1組，加入20(^1RPMI1640培養液。第1-3行第5列孔為空白組，每孔未接種細胞，只加入200ulRPMI1640培養液。37°C，5。/。C02培養72h。3)棄上清液，每孔加入10(^1新鮮配制的0.5mg/mlMTT的無血清培養液，37°C繼續培養4h。小心棄上清，并加入100plDMSO溶解MTTformazon沉淀，用微型超聲振蕩器混勻，用BIORAD550型酶標儀于490nm波長下測定96孔板每一孔的光密度值。按照下述公式計算腫瘤細胞生長抑制率，腫瘤細胞生長抑制率(％)=(OD對照-OD實驗)/OD對照X100%(其中OD對照、OD實驗為已經扣除OD空自的實驗數值)。實驗結果如表l所示。實施例3、雙芐基異喹啉類生物堿對人胃癌細胞、人肝癌細胞以及人鼻咽癌細胞增殖能力的影響試驗采用SRB法。SRB法的基本原理為SRB是一種蛋白質結合染料，粉紅色，可溶于水。SRB可與細胞蛋白的堿性氨基結合而顯色，在490nm-520nm波長處其OD值與活細胞數呈良好的線性關系。故可用作細胞數的定量。具體操作步驟如下1)分別將人胃癌細胞系BGC-823、人肝癌細胞系Bel-7402、人鼻咽癌細胞系KB細胞接種于含10X胎牛血清的RPMI1640培養基中。細胞培養用50ml培養瓶，置于37。C、5%0)2培養箱在全濕條件下培養。將增殖良好并處于對數生長期的上述三種細胞分別用含10%小牛血清的RPMI1640培養液配制成5000個/ml的細胞懸液，接種于96孔板內，100uL/孔。預培養24小時。2)按3個質量濃度梯度設雙芐基異喹啉類生物堿組(式(I)中W為甲基，R2、R3、R4、If為氫，X^(i^l)為與6位碳原子相連的甲氧基，X^(i^2)為與7位碳原子相連的羥基，乂211(11=1)為與12位碳原子相連的甲氧基，乂311(11=1)為與6'位碳原子相連的甲氧基，X4n(r^i)為氫,c(i)與c(r)的空間構型皆為s構型，該化合物是防己諾林堿(中國藥品生物制品檢定所))，第1-3行的第1-3列孔按濃度從低到高依次加入雙芐基異喹啉類生物堿lOOnl，使每孔中雙芐基異喹啉類生物堿終濃度依次為12.5pM、25|liM、50pM;第1-3行第4列孔為對照2組，加入200|nlRPMI1640培養液。第1-3行第5列孔為空白組，每孔未接種細胞，只加入200piRPMI1640培養液。37°C，5%C02培養72h。3)參照Skehan，s法(SkehanP,etal.JofNatCancerIns,1990，82(13):11071112)每孔加入0.4。/。SRB100uL，用BIORAD550型酶標儀于509nm波長下測定96孔板每一孔的光密度值。按照下述公式計算腫瘤細胞生長抑制率，腫瘤細胞生長抑制率(％)=(OD對照-OD實驗)/OD對照X100%(其中OD對照、OD實驗為已經扣除OD空白的實驗數值)。實驗結果如表l所示。表1雙芐基異喹啉類生物堿抑制腫瘤細胞增殖的試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由上表可以看出，雙芐基異喹啉類生物堿對于HL-60、BGC-823、Bel-7402以及KB細胞系均有比較好的抑制效果，其中，當雙芐基異喹啉類生物堿的濃度為25.0一時，對于人白血病細胞系HL-60、人胃癌細胞系BGC-823、人肝癌細胞系Bel-7402以及人鼻咽癌細胞系KB的抑制率均超過90%。顯示了雙節基異喹啉類生物堿能夠有效的抑制腫瘤細胞的增殖。權利要求1.式(I)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽在制備抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物中的應用；式(I)其中，R1是氫或含1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基；R2和R3分別為下述基團中的一種氫，取代酰基，直鏈或支鏈烷基，其中烷基可以被選自O，N，S的雜原子間斷；R2和R3也可以一起為O或S；R4和R5分別為下述基團中的一種氫，取代酰基，直鏈或支鏈烷基，其中烷基可以被選自O，N，S的雜原子間斷；R4和R5可以一起為O或S；X1，X2，X3，X4可以相同或不同并且各自獨立地為鹵原子、羥基或1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烷氧基或酰氧基，且n是0～3的整數；同時，包括C(1)和C(1’)為RR、SS、1S1’R、1R1’S構型的任何立體異構體。2、根據權利要求l所述的應用，其特征在于式(I)所示的化合物中，R'為甲基，R2、R3、R4、If均為氫，Xu為與6位碳原子相連的甲氧基，X^為與7位碳原子相連的羥基，X^為與12位碳原子相連的甲氧基，乂31為與6'位碳原子相連的甲氧基，X4n(n-1)為氫，C(1)與C(T)的空間構型皆為S構型。3、一種抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物，它的有效成分為權利要求1或2所述的式(I)化合物或其藥物學上可接受的鹽。4、根據權利要求1或2所述的應用或根據權利要求3所述的藥物，其特征在于所述真核生物為哺乳動物。5、根據權利要求1或2所述的應用或根據權利要求3所述的藥物，其特征在于所述腫瘤細胞為癌細胞；所述癌細胞為乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、腦癌細胞、卵巢癌細胞、子宮癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、白血病細胞、頭頸癌細胞、胃癌細胞、鼻咽癌細胞、結腸癌細胞、視網膜癌細胞、膀胱癌細胞、肛門癌細胞或直腸癌細胞；優選為白血病細胞、胃癌細胞、肝癌細胞或鼻咽癌細胞。6、權利要求1或2所述的式(I)化合物或其藥物學上可接受的鹽在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。7、根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述腫瘤為癌；所述癌為乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、皮膚癌、白血病、頭頸癌、胃癌、鼻咽癌、結腸癌、視網膜癌、膀胱癌、肛門癌或直腸癌；優選為白血病、胃癌、肝癌或鼻咽癌。8、一種預防和/或治療腫瘤的藥物，它的有效成分為權利要求1或2所述的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽。9、根據權利要求8所述的藥物，其特征在于所述腫瘤為癌。10、根據權利要求9所述的藥物，其特征在于所述癌為乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、皮膚癌、白血病、頭頸癌、胃癌、鼻咽癌、結腸癌、視網膜癌、膀胱癌、肛門癌或直腸癌；優選為白血病、胃癌、肝癌或鼻咽癌。全文摘要本發明公開了雙芐基異喹啉類生物堿的新用途。該用途是式(I)所示的雙芐基異喹啉類生物堿或它們藥物學上可接受的鹽在制備抑制真核生物腫瘤細胞增殖的藥物中的應用和在制備預防和/或治療腫瘤藥物中的應用。式(I)所示的雙芐基異喹啉類生物堿或它們藥學上可接受的鹽可與G-四鏈體DNA結合，增加G-四鏈體的穩定性，從而競爭性抑制端粒酶與端粒的結合，抑制端粒酶的活性，減弱細胞的增殖能力，抑制端粒延伸，促進細胞凋亡。體外抗癌細胞增殖實驗結果表明，雙芐基異喹啉類生物堿對于人白血病細胞系HL-60、人胃癌細胞系BGC-823、人肝癌細胞系Bel-7402以及人鼻咽癌細胞系KB均有比較好的抑制效果，當雙芐基異喹啉類生物堿的藥物濃度為25μM時對上述癌細胞的抑制率均超過了90％。文檔編號A61P35/00GK101371839SQ20081022390公開日2009年2月25日申請日期2008年10月8日優先權日2008年10月8日發明者向俊鋒,周秋菊,唐亞林,徐筱杰,騫李,陳麗蓉申請人:中國科學院化學研究所