專利名稱：一種人促紅細胞生長素脂質體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物藥物脂質體，尤其涉及一種人促紅細胞生長素(EPO) 的脂質體。
背景技術：
EPO已廣泛應用于臨床上各種貧血的治療。其中最有效的是腎衰、尿毒癥 所伴隨貧血的治療，其他對腫瘤相關性貧血，人類免疫缺陷病毒(HIV)相關貧 血，骨髓移植后貧血，早產兒和孕產婦貧血，為手術期減少異源性輸血等方面 也有良好的療效。
當前使用的rHuEPO都是單體EPO， EPO在人體內的半衰期比較短， 一般來 說EPO靜脈注射后在3-4天后在血液中就很難檢測出活性，所以臨床上，常采用 皮下注射或者靜脈注射、每周注射頻率為2-3次，用藥頻繁；而慢性貧血病人常 需要大劑量長期應用，因此常規的EPO用藥頻率和用藥量較大，給病人帶了諸多 不便和經濟壓力。另外長期大量使用EPO會產生一些副作用，如血管反應性下降， 血壓升高，血粘度增加，血栓形成等；情況嚴重的還會造成腦部供血不足，甚 至引發腦缺血。Dillard等(DillardDG， 2001)還發現給前庭神經鞘瘤病人術 前常規應用EPO治療能使瘤體迅速增長，用免疫組織化學染色的方法確定腫瘤細 胞有EPO和E-POR基因的表達，推測EPO可能與該腫瘤的發生有一定關系。
脂質體為一種生物膜雙分子層囊性微球，由水相中脂質雙層疏水區的脂肪 鏈通過疏水鍵相互聚集自行收縮排列而形成，脂質體可用于包封各種捕獲于雙 分子層內部或雙分子層中間的水相中的親水性化合物，或則捕獲于雙分子層內 的疏水性化合物，它們特別適于通過包封水溶性差或在治療劑量下表現出不可 接受的毒性的化合物從而釋放生物活性物質。專利申請CN1298296提供了一種 EPO脂質體，其使用了甘油并制備成小單層脂質體的溶液，在脂質體中引用甘油 或其它保護劑，會帶來其他不可預料的影響；并且該申請脂質體的制備采用乙 醇注射法，而少量乙醇的存在會導致膜材韌性不足，脂質體的泄漏率增大；另 一方面該申請的脂質體主要為小單層脂質體，其包裹EPO緩釋作用未達到最佳。
發明內容
本發明所解決的技術問題是提供一種穩定性好，且緩釋作用良好、半衰期
較長的非腸胃性EPO脂質體。
為了解決上述技術問題，本發明提供了一種EPO脂質體，其含有
a) 有效量的EPO或EPO衍生物；
b) 中性磷脂； C)膽固醇或其衍生物；
d) 類脂化合物；
e) 緩沖液。
其中磷脂與膽固醇或其衍生物、類脂化合物的摩爾比為5 10:1 5:1 3，上述 脂質體為小單層和大多層脂質體共存的脂質體，其粒徑50 2000nm，優選100 1000nm，平均粒徑在300 600nm之間。
EPO衍生物包括基因重組人EPO，以及經過其他化學、物理或生物化學等 方法修飾過過的重組人EPO，重組人EPO包括含165個氨基酸的o;型和iS型EPO; 修飾過的重組人EPO，主要是氨基甲酰化EPO，包括經過修飾的過一或次氨基甲 酰化EPO，或經過生物化學等方法修飾的免疫原性下降或消失的EPO組分。其中， 脂質體所包含的EPO單位劑量中含EPO活性成分1000-10000IU/ml，優選 3000陽5000IU/ml。
用于制備脂質體的有磷脂選自卵磷脂、大豆磷脂，磷脂酰肌醇、腦磷脂、 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、蛋磷脂酰膽堿、二棕櫚酰-DL-a 磷脂酰膽堿、神經鞘磷脂、鞘髓磷脂、二肉豆蔻卵磷脂、二鯨蠟磷酸酯，上述 磷脂都不帶電荷，本發明優選卵磷脂。
膽固醇及其衍生物，如膽固醇、膽固醇乙酰等的關鍵作用是和磷脂一起， 將膜材的相變溫度調節到預期的目標，客觀上起到可以調節雙分子層流動性、 通透性、增加脂質體膜材的柔韌性等目的，本發明優選膽固醇。
合適比例的類脂化合物可以改變脂質體表面電荷性質，用以防止脂質體凝 聚、融合，改變劑型，制備凍干劑，避免滲漏，延長脂質體保存時間、防止脂 質體絮凝沉淀。如果比例不合適，將導致脂質體加速破裂，滲漏率加。
類脂化合物是具有長或短的碳原子鏈的類脂肪化合物，在脂質體膜材中與 磷脂一起成膜，使脂質體膜帶有一定的特性，例如帶有正電荷的類脂化合物有
5硬脂酰胺、磷脂酰乙醇胺等、還有一些諸如PEG化的磷脂酰膽堿，或耦聯有單 克隆抗體的磷脂。本發明優先硬脂酰胺或磷脂酰乙醇胺。
上述緩沖液為非用作腸胃性的緩沖溶液，可選自pH值為6.4 7.4范圍內 的磷酸緩沖液，Tri-HCl緩沖液，碳酸鈉緩沖液或NaCl溶液。
上述EPO脂質體還可以進一步包含免疫調節劑或附加劑，免疫調節劑為細 胞因子類蛋白，包括千細胞生長因子(SCF)，干擾素(IFN-ce、 IFN-/3)，白 介素(IL-1、 IL隱2、 IL-3、 IL-4、 IL14、 IL16)、胰島素樣生長因子I (IGF-1) 等。附加劑為抗氧化劑，如維生素E等。
本發明還提供了上述EPO脂質體的制備方法，凍干水化法，包括如下步驟
1) 將磷脂、膽固醇或其衍生物及類脂化合物以摩爾比5 10:1 5:1 3溶 于有機溶媒中，置于旋轉蒸發器中，除去有機溶媒形成磷脂膜；
2) 加入緩沖液，40 6(TC繼續旋轉蒸發，水浴式超聲處理10 20分鐘， 形成脂質體懸液；
3) 將脂質體懸液與EPO抗原溶液混合，脂質體粉碎均勻，加入冷凍保護 劑，進行冷凍干燥；
4) 滅菌，得到凍干粉劑；加無菌水、震蕩、再水化融合；得到脂質體EPO。 在脂質體EPO的上述制備方法中，其中所述的有機溶媒為二氯甲烷、氯仿、
甲醇的其中一種或兩種以上的混合溶液。
本發明還提供了上述脂質體EPO的另一種制備方法，逆相蒸發法，包括如 下步驟
1) 將磷脂、膽固醇及類脂化合物或其衍生物以摩爾比5 10:1 5:1 3溶 于有機溶媒中，加入不含EPO抗原溶液，在水浴35 6(TC條件下超聲處理10 20分鐘，得到穩定的油包水乳液；
2) 在40 6(TC下減壓蒸發，得到膠態物質；
3) 加入含EPO的緩沖液，40 6(TC旋轉蒸發，減壓蒸發10 20分鐘，除 去微量有機溶媒，得到脂質體水性混懸液，放置20 40分鐘，透析，除去游離 的未包入脂質體的EPO溶液；
4) 滅菌；得到脂質體EPO。
在上述步驟3)中可以進一步加入免疫調節劑和/或附加劑。在脂質體EPO的上述制備方法中，其中所述的有機溶媒為二氯甲烷、氯仿、 甲醇的其中一種或兩種以上的混合溶液，所述緩沖液為pH值為6.4 7.4范圍 內的磷酸緩沖液，Tri-HCl緩沖液，碳酸鈉緩沖液或NaCl溶液。
上述逆相蒸發法的制備方法首先加入的是不含EPO的緩沖液，避免了傳統 逆相蒸發方法中EPO與高濃度有機溶劑混合步驟導致的大量損失。
脂質體制備的基本原理都是將油性材料與水性材料經過適當處理后形成 油包水的制劑，通過實驗觀察幾種制備工藝對EPO活性的影響，尤其是監測其 在體內的激活造血紅細胞的活性，結果證明應選擇制備過程相對柔和、無劇烈 的理化條件改變的方法。本發明提供的EPO脂質體制備工藝為逆相蒸發法、凍 干水化法，優選的制備工藝是凍干水化法，與薄膜法、加壓擠出法、熔融法相 比較，本發明的逆相蒸發法和凍干水化法有設備簡單、成本適中、包封率適中， 容易擴大生產的優點。
本發明EPO脂質體在注射后進入機體的循環系統內，因脂質體膜與細胞膜 的結構成分相似，所以可以保護EPO分子不受血液中各種蛋白組份影響，也不 會與血液中的蛋白組分相結合，從而延長了 EPO在循環系統內的半衰期，同時， 由于脂質體顆粒本身容易被機體組織中的內皮組織吸附，并在這些組織中集積， 使EPO可以緩慢釋放，增長藥物的作用時間。而且EPO的包封率適中，也不 會引起肝毒副作用。另外進一步在脂質體中加入各種輔助成分，如干細胞生 長因子，胰島素樣生長因子-I，白介素等，可以更好的促進機體的造血功能， 穩定的維持EPO對造血組織積極作用。
本發明制備的EPO脂質體可以采用靜脈注射、皮下給藥或腹腔注射。本發 明的EPO脂質體為小單層和大多層脂質體共存的脂質體，且其脂質體溶液體系 的脂質體平均粒徑分布在100nm 600nm，優化范圍為300 600nm，為粒徑呈 正態分布的球形或橢球形脂質體，它能進一步延長EPO在動物體內的半衰期和 提高生物利用率，這是因為脂質體包裹EPO分子后，其顆粒大小遠遠大于EPO 分子本身，從而減小了腎臟對EPO的清除率，同時由于脂質體包裹了部分EPO 分子，使得被包裹的EPO分子的抗原決定位點被封閉或遮蓋而降低了 EPO的 免疫原性，同時也可能阻隔了蛋白酶作用位點和EPO分子的接觸，減少EPO 分子在血清中被降解的機會，具有的更佳緩釋作用。本發明的EPO脂質體，能 延長EPO的在體內的作用時間，而普通的EPO在注射入體內后在2-3后就無法起到增加機體的血細胞的作用了，而本發明則在注射后12-15天，還能檢測 出在生物體內的EPO脂質體。
由于本發明的脂質體膜是使用了帶有正電荷的脂質體膜，使脂質體包封抗 原的包封率增大；本發明脂質體的穩定性更好，脂質體的泄漏率大大降低，在 4r放置下，其粒徑穩定期限可以長達8個月，而普通的脂質體不超過1個月。
另外本發明脂質體的膜材中不引入甘油和其它保護劑，從而減少脂質體膜 材中多余成分帶來不可預料的其它影響。
圖l是凍干水化法制備的EPO脂質體注射后對Ret^的影響； 圖2是凍干水化法制備包封有EPO不同衍生物的小單層脂質體注射后對 Ret^的影響；
圖3是逆相蒸發法制備含輔助成分的EPO脂質體注射后對Ret^的影響； 圖4是脂質體包封率穩定性結果； 圖5是脂質體粒徑穩定性結果。
具體實施例方式
為了更好地理解本發明的技術方案和有益效果，下面結合具體的實驗及實 驗結果對本發明做進一步闡述。
EPO脂質體活性試驗
將各種方法制備的EPO脂質體，所有樣品的緩沖液為磷酸緩沖液(O.IM， pH7.0)，各脂質體EPO樣品的初始投入的EPO量都相同(共40000IU)，陰 性對照為不包含任何其他組分的磷酸緩沖液，陽性對照為含EPO的磷酸緩沖液 (EPO活性濃度為4000IU/ml)，分別去各個樣品l.Oml隨機注射(s.v.)到SPF 級Wistar大鼠(重量為300士5g)身上， 一次性注射，注射后第二天開始隔天取 血，參照中國藥典的方法進行EPO的活性測定， 一直持續到注射后第21天， 其各樣品的實驗結果見表l。
表1制備工藝對EPO脂質體活性的影響
制備方法試驗組例數(？(^各半)能檢測到EPO活性的最長時間
薄膜法214
逆相蒸發法216
8高壓勻漿法 2 凍干水化法 2
陽性對照 2 陰性對照 2
實施例1按照專利申請CN1298296方法制備脂質體EPO
參照專利申請CN1298296的方法制備EPO脂質體，控制其粒徑為90-95nm， 標志為樣品1#，和實施例2的脂質體EPO —起進行相關實驗。
實施例2采用凍干水化法制備脂質體EPO
取卵磷脂、膽固醇、硬脂酰胺按照摩爾比7:1:1，溶于有機溶媒二氯甲垸溶 液；旋轉蒸發，除去有機溶媒，形成磷脂膜層；加入適量磷酸緩沖液(pH7.4) 水化脂質體膜，將脂質體混懸液與EPO抗原溶液混合，調整均質機的壓力，分 別形成相應脂質體混懸液，分別過0.1um、 0.22um、過0.45um、 0.8um的濾膜； 即為脂質體EPO，標志為樣品2#、 3#、 4#、 5#，其中加入的EPO為2000IU/ml。 對照組樣品為含2000IU/ml EPO的磷酸緩沖液。
將上述4個樣品，每個樣品分別注射(s.v.)SPF級別的Wistar大鼠(300士5g) 各兩只，雌雄各半，照射后每隔24小時(l天)采血進行網織紅細胞Ret^(取 均值)的測量，取血測定一直持續至注射后第15天，其結果見圖l。與陰性對 照組比較t=5.569， PO.0001
將上述1#、 2#、 3#、 4#、 5#樣品分別測定包封率測定分別為17.3%、 18.7%、 22.4。％、 25.2%， 36.7%。同時，進行脂質體的粒徑檢測，平均粒徑分別為93.6nm (與文獻接近)、155.3nm、 232.4nm、 482.24nm、 724.3nm。
從結果看，本發明的脂質體EPO樣品與陰性、陽性對照有明顯的區別，也 與文獻報道的樣品(樣品1)有顯著性的差異。
實施例3采用凍干水化法制備包封有EPO不同衍生物的小單層脂質體
取卵磷脂及膽固醇、磷脂酰乙醇胺按照摩爾比6:1:1，溶于三氯甲垸與甲醇 的混合溶液；旋轉蒸發，除去有機溶媒，形成磷脂膜層；分別加入濃度為 2000IU/ml的o;型EPO、 /3型EPO、氨基甲酰化EPO、經修飾的免疫原性下降 的EPO，經過均質儀進行處理，過0.22um的濾膜，形成小單層脂質體混懸液; 即為各脂質體EPO，凍干水化后、分別標志為樣品組6#、 7#、 8#、 9#。對照樣
14.5 17.5
0品為相同效價的普通EPO溶液，按照實施例2的方法、注射樣品后，取血液， 測定大鼠血液中的Rety。。其結果見圖2。各組樣品與陽性照組比較t=5.569， PO細l
從結果看，本發明的各種樣品對動物網織紅細胞的影響有延長EPO的生 理作用，可以在較高水平上使EPO的作用時間延長。
實施例4采用逆相蒸發法制備含輔助成分的脂質體EPO
采用逆相蒸發法制備各種含附加劑的EPO脂質體，取磷脂及膽固醇、硬
脂酰胺摩爾比7: 5: 3，溶于氯仿與甲醇的混合溶液；旋轉蒸發，除去有機溶
媒，得到膠態物質；加入適量磷酸緩沖液(0.1M， PH6.8)，含有4000IU/ml的ce 型EPO,形成多層脂質體混懸液，用高壓均質儀將脂質體顆粒的平均粒徑均質 至300nm。在上述的脂質體分成5份，分別加入1000IU/ml的IL-3、 20ug/ml 的干細胞生長因子、50ug/ml胰島素樣生長因子、1000IU/ml的IFN，第5份不 加其他任何輔助成分的脂質體EPO、第6為EPO溶液對照，分別標志為樣品 為10#、 11#、 12#、 13#、 LP-EPO對照、EPO對照。按照實施例2的方法、注射 樣品后，取血液，測定大鼠血液中的Ret。/。。其結果見圖3， t二4.239， PO.OOl。
從結果看，附加有干細胞生長因子的EPO脂質體(樣品ll)和附加有胰 島素樣生長因子的EPO脂質體(樣品12)對于維持較高的網織紅細胞濃度有 顯著性意義，其它樣品和普通的EPO比較也具有顯著性意義。
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不 能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通 技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替 換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。 實施例5本發明的EPO脂質體穩定性試驗
取實施例1制備的1#作為對照，以及實施例2、 3、 4制備的4#、 5#、 6#、 10#、 12#等共6個樣品進行了穩定性考察，將溶液置于4'C靜止放置，主要的考 察指標為粒徑穩定性和包封率，每隔2個月進行該兩項指標的考察，粒徑(D 穩定性采用激光衍射粒度分析儀測定，包封率(EE)測定參考《中國藥典》(2005 年三部附錄)進行，主要觀測兩個指標相對于O個月的變化率(如包封率變化 值VEE=l—EEtl/ EEtc)。試驗結果顯示f樣品在4個月后包封率的下降超過 31.4%,粒徑增大超過35%，至于本發明的脂質體，10#、 12#在8個月后出現平
10均粒徑變化率較大(大于20%，但小于35%)，但4#、 5#、 6#等3個樣品在12 個月測定時也無明顯差異，導致這種差異，可能是10#、 12#所加入的附加劑導 致的脂質體膜材靜電荷發生輕微的改變，使得其穩定性不如4#、 5#、 6#等樣品。 其包封率穩定性見圖4，其粒徑穩定性結果見圖5。
權利要求
1、一種EPO脂質體，其含有a)有效量的EPO或EPO衍生物；b)中性磷脂；c)膽固醇或其衍生物；d)任一帶正電荷類脂化合物；e)緩沖液；其中磷脂與膽固醇或其衍生物、類脂化合物的摩爾比為5～10∶1～5∶1～3，所述脂質體為小單層和大多層脂質體共存的脂質體，脂質體粒徑為50～2000nm。
2、 權利要求1所述的EP0脂質體，其中所述脂質體粒徑為100 1000nm。
3、 權利要求l所述的EPO脂質體，其中所述磷脂選自卵磷脂、大豆磷脂， 磷脂酰肌醇、腦磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、蛋磷脂酰 膽堿、二棕櫚酰-DL-a磷脂酰膽堿、神經鞘磷脂、鞘髓磷脂、二肉豆蔻卵磷脂、 二鯨蠟磷酸酯；緩沖液選自pH值為6.4 7.4范圍內的磷酸緩沖液，Tri-HCl緩 沖液，碳酸鈉緩沖液或NaCl溶液。
4、 權利要求1所述的EP0脂質體，其中所述磷脂為卵磷脂，組分c)為膽 固醇，類脂化合物為硬脂酰胺或磷脂酰乙醇胺，緩沖液為pH值為6.4 7.4的 磷酸緩沖液。
5、 權利要求1 4任一所述的EP0脂質體，其中所述脂質體進一步包含有免 疫調節劑和/或附加劑，免疫調節劑選自干細胞生長因子，干擾素，白細胞介素 和胰島素樣生長因子I;附加劑為抗氧化劑。
6、 權利要求1所述的EP0脂質體，其中以凍干水化法或逆相蒸發法制備所述 脂質體。
7、 權利要求1所述EP0脂質體的制備方法，包括下述步驟1) 將磷脂、膽固醇或其衍生物及類脂化合物以摩爾比5 10:1 5:1 3溶于 有機溶媒中，置于旋轉蒸發器中，除去有機溶媒形成磷脂膜；2) 加入緩沖液，40 60。C繼續旋轉蒸發，水浴式超聲處理10 20分鐘， 形成脂質體懸液；3) 將脂質體懸液與EPO溶液混合，脂質體粉碎均勻，加入冷凍保護劑，進 行冷凍干燥；4) 滅菌，得到凍干粉劑；加無菌水、震蕩、再水化融合；得到脂質體EPO。
8、 權利要求7所述的制備方法，其中所述的緩沖液選自pH為6.4 7.4的 磷酸緩沖液，Tri-HCl緩沖液，碳酸鈉緩沖液或NaCl溶液，所述有機溶媒選自 二氯甲烷、氯仿、甲醇其中一種或兩種以上的混合溶液。
9、 權利要求1所述EPO脂質體的制備方法，包括下述步驟1) 將磷脂、膽固醇或其衍生物及類脂化合物以摩爾比5 10:1 5:1 3溶 于有機溶媒中，加入緩沖溶液，在水浴35 6(TC條件下超聲處理10 20分鐘， 得到穩定的油包水乳液；2) 在40 6(TC下減壓蒸發，得到膠態物質；3) 加入含EPO的緩沖液，40 6(TC旋轉蒸發，減壓蒸發10 20分鐘，除 去微量有機溶媒，得到脂質體水性混懸液，放置20 40分鐘，透析，除去游離 的未包入脂質體的EPO;4) 滅菌；得到脂質體EPO。
10、 權利要求9所述的制備方法，其中所述的緩沖液選自pH為6.4 7.4 的磷酸緩沖液，Tri-HCl緩沖液，碳酸鈉緩沖液或NaCl溶液，所述有機溶媒選 自二氯甲烷、氯仿、甲醇其中一種或兩種以上的混合溶液。
全文摘要
本發明提供一種EPO脂質體，其含有有效量的EPO或EPO衍生物，中性磷脂，膽固醇或其衍生物，任一帶正電荷類脂化合物；緩沖液；其中磷脂與膽固醇或其衍生物、類脂化合物的摩爾比為5～10∶1～5∶1～3，所述脂質體為小單層和大多層脂質體共存的脂質體，脂質體粒徑為50～2000nm；本發明還提供了制備所述EPO脂質體的凍干水化法和逆相蒸發法。本發明的EPO脂質體穩定性好，且能延長EPO在動物體內的半衰期和提高生物利用率，在體內的緩釋作用良好。
文檔編號A61K38/19GK101683521SQ200810216460
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月27日 優先權日2008年9月27日
發明者張水華, 易艷蓉, 柴向東, 韻 潘, 蔣為民, 邱小玲 申請人:深圳市海王英特龍生物技術股份有限公司