專利名稱：：一種同種異體骨移植替代材料納米dbm的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種骨移植用同種異體納米脫鈣骨基質(zhì)材料納米DBM。
背景技術(shù)：
：骨移植手術(shù)是臨床中僅次于輸血的常見組織移植術(shù)，各種原因造成的骨缺損的修復(fù)是骨科醫(yī)生所需要面對(duì)的一個(gè)難題。另外，隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)程度的加深外科技術(shù)的發(fā)展，脊柱外科、神經(jīng)外科等對(duì)骨移植的需求也越來越大。近10年來，骨移植替代物的研究是脊柱外科領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前應(yīng)用的骨移植替代材料主要有自體骨、異體骨和合成材料三類。理想的骨移植物應(yīng)具備以下三個(gè)基本特點(diǎn)1、含有骨誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；2、含有骨傳導(dǎo)基質(zhì)，有利于骨修復(fù)過程中血管的長(zhǎng)入，提供三維的立體骨架可引導(dǎo)骨修復(fù)朝一定的方向進(jìn)行；3、含有骨生成細(xì)胞，有利于骨生成。自體骨因同時(shí)具備上述特點(diǎn)而至今仍是植骨融合的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在供骨量有限、延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間、增加患者創(chuàng)傷以及供骨區(qū)長(zhǎng)期麻木、疼痛等缺陷。合成性材料主要為羥基磷灰石(HydroxyapatiteHA)、磷酸三鈣(TricalciumPhosphateTCP)、硫酸鈣(CalciumSulfateCS)、聚乳酸(PolylacticacidPLA)或這些材料的復(fù)合物。人工合成材料與自體骨、異體骨相比具有無(wú)毒、易于滅菌以及取用量無(wú)限制等優(yōu)勢(shì)，但其最大的缺陷是不具備骨誘導(dǎo)因子和骨生成細(xì)胞，僅具有骨傳導(dǎo)性，易碎、剪切力小、抗骨折性能差。異體骨移植的優(yōu)勢(shì)在于良好的骨傳導(dǎo)性，經(jīng)過特定方法處理還可以保留骨誘導(dǎo)性，但其免疫排斥反應(yīng)始終未得到根本解決，且可能導(dǎo)致細(xì)菌或病毒感染。有一種由同種異體骨經(jīng)特殊處理后制成的脫鈣骨基質(zhì)(DemineralizedBoneMatrix,DBM)，采用改良Urist法制備，步驟為1.取材將新鮮同種異體骨剔除骨膜和所有軟組織并劈成骨塊，刮除骨髓，用無(wú)菌凈化水沖洗干凈，置無(wú)水乙醇脫水、乙醚脫脂，通風(fēng)干燥后置-80'C冰箱凍干備用。2.脫脂將上述骨塊依次浸泡于無(wú)水乙醇、乙醚脫脂后，用蒸餾水反復(fù)沖洗去盡乙醚和溶解的油脂；3.脫鈣以0.6N鹽酸浸泡72小時(shí)，浸泡過程中不斷攪拌，每12小時(shí)更換鹽酸溶液一次，使所有的骨組織充分脫鈣；用蒸餾水沖洗并蒸餾水浸泡過夜，充分去除骨塊內(nèi)的鹽酸；將骨塊依次浸泡于無(wú)水乙醇、乙醚脫脂后，置通風(fēng)處自然揮發(fā)殘余乙醚；4.干燥、消毒將上述骨塊置37°。恒溫干燥箱內(nèi)干燥，三次稱量恒重后將其分裝密封；再用C(^照射消毒，照射劑量為20KGy。即為DBM骨塊。[詳見ReddiAH,HugginsC.Biochemicalsequencesinthetransformationofnormalfibroblastsinadolescentrats.ProcNatlAcadSciUSA,1972，69:1601-1605.]DBM同時(shí)具有骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)作用，且具有天然骨的組成成分，可以作為許多生長(zhǎng)因子的天然載體，具有良好的生物學(xué)特性，因此在植骨融合術(shù)中的應(yīng)用得到深入研究。但DBM作為骨移植替代物還存在如下不足l.分批處理時(shí)存在骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)性能差異；2.雖然DBM的抗原性較弱，但在少數(shù)受體內(nèi)會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)而最終導(dǎo)致骨移植的失敗；3.生物力學(xué)性能較差，不適合用于需要承受重力和其他應(yīng)力的部位。這使得DBM的使用范圍大大減小。近年來納米技術(shù)的突破性進(jìn)展，對(duì)生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了巨大影響。納米技術(shù)可大大改善生物材料的表面特性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使生物材料的生物學(xué)性能大大提高，將納米技術(shù)應(yīng)用于骨移植材料的研究已成為這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但至今未見運(yùn)用納米技術(shù)制成同種異體納米脫鈣骨基質(zhì)材料(簡(jiǎn)稱納米DBM)成功用于骨移植的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為臨床提供一種成骨誘導(dǎo)性及傳導(dǎo)性好、抗原性低、可隨意塑形的同種異體骨移植替代材料納米DBM。本發(fā)明納米DBM的制備方法如下1)制備DBM骨塊采用改良Urist法按常規(guī)制備同種異體DBM骨塊；2)制備DBM粉末將上述DBM骨塊置于液氮冷凍粉碎機(jī)，在液氮的液面保持稍高于研磨球的情況下進(jìn)行預(yù)粉碎，得DBM粉末；3)制備納米DBM:將上述DBM粉末置于超細(xì)研磨粉碎機(jī)內(nèi)，加入適量蒸餾水，在17。C25。C下進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速由800r/min升至1200r/min，充分研磨后將勻漿進(jìn)行高速離心，棄上清液，得納米DBM。納米DBM呈灰白色，經(jīng)電鏡檢測(cè)，粒徑為50100nm，表面稍粗糙，有不規(guī)則納米溝槽。納米DBM質(zhì)地均勻、堅(jiān)韌，有一定延展性，可任意塑形。將其塑形為所需形狀和大小的骨移植物后置37。C恒溫干燥，密封包裝，用Co6Q照射消毒后備用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，鑒于納米材料的特性，本發(fā)明納米DBM具有良好的生物相容性和植骨融合效果，是一種良好的骨移植替代材料。本發(fā)明以同種異體骨為原料，取材容易，可滿足臨床需要；納米DBM可隨意塑形，其作為骨移植替代材料使用方便；應(yīng)用納米技術(shù)構(gòu)建DBM，大大減少了因DBM自身脫鈣所帶來的生物力學(xué)下降的后果，以使其更適用于植骨融合時(shí)的骨支撐作用；具有納米結(jié)構(gòu)的DBM材料，生物相容性好，不引起免疫排斥反應(yīng)，從而解決了臨床骨移植替代材料骨融合效果不佳的難題；其可作為如骨形態(tài)發(fā)生蛋白等外源性促進(jìn)骨再生生長(zhǎng)因子的良好載體，具有良好的促進(jìn)骨再生能力。具體實(shí)施方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例1:制備兔納米DBM1、采用改良Urist法制備兔DBM骨塊，步驟如下1)取材新西蘭家兔1只(第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，下同)，按常規(guī)取新鮮兔骨100g,剔除骨膜和所有軟組織并劈成骨塊，刮除骨髓后用無(wú)菌凈化水反復(fù)沖洗，置無(wú)水乙醇脫水2h，乙醚脫脂lh，通風(fēng)處過夜干燥后，將骨塊置-8(TC冰箱凍干備用；2)制備DBM骨塊(1)脫脂依次將上述骨塊浸泡于100ml無(wú)水乙醇2小時(shí)，去乙醇；加乙醚100ml浸泡12小時(shí)，去乙醚；用蒸餾水沖洗3次，去盡乙醚和溶解的油脂；(2)脫鈣將脫脂后的骨塊以0.6N鹽酸100ml浸泡72小時(shí)，浸泡過程中不斷攪拌，每12小時(shí)更換鹽酸溶液一次，以保證所有的骨組織充分脫鈣；將骨塊取出后用蒸餾水沖洗5次，再用蒸餾水浸泡過夜，以充分去除骨塊內(nèi)的鹽酸；(3)脫水、干燥、消毒將上述骨塊依次置于無(wú)水乙醇100ml浸泡2小時(shí)，去除乙醇，置于乙醚100ml浸泡1小時(shí)，去乙醚，將其置于通風(fēng)處自然揮發(fā)殘余乙醚；再將其置37。C恒溫干燥箱內(nèi)干燥，三次稱量恒重，得DBM骨塊24g，將其分裝密封，再按常規(guī)用0)6()照射消毒后備用。3)制備DBM粉末將上述DBM骨塊與進(jìn)口鋼質(zhì)研磨球一同放入液氮冷凍球磨粉碎機(jī)的容器內(nèi)。將液氮充入容器內(nèi)直至液面稍高于研磨球，以800RPM進(jìn)行研磨2小時(shí)，同時(shí)保持液氮液面始終稍高于研磨球，得DBM粉末備用。2、制備納米DBM:將上述DBM粉末置于超細(xì)研磨粉碎機(jī)(MICROS)內(nèi)，加入適量蒸餾水進(jìn)一步研磨粉碎，轉(zhuǎn)速和研磨時(shí)間依次為①800r/min，5min;②1000r/min，10min;③1200r/min，10min;④1200r/min，15minX10次;MICROS初始研磨溫度為17'C，工作中最高溫度為25。C，研磨時(shí)由循環(huán)水進(jìn)行冷卻降溫。研磨結(jié)束后將勻漿進(jìn)行高速離心(7500r/min)，取得納米DBM沉淀，電鏡掃描放大100020000倍，可見納米DBM直徑為50100nm，表面略粗糙，有不規(guī)則納米溝槽。將沉淀塑形成長(zhǎng)條形后置于37'C恒溫干燥箱進(jìn)行干燥，使用Cc^照射消毒備用。實(shí)施例2:制備小鼠納米DBM小鼠20只(第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，下同)，雌雄不限，體重2530g。按常規(guī)取骨50g，采用改良Urist法制備同種異體DBM骨塊并制成納米DBM，方法同實(shí)施例l，得納米DBM12g。納米DBM生物相容性實(shí)驗(yàn)l.急性毒性實(shí)驗(yàn)1)制備小鼠納米DBM浸提液將實(shí)施例2制備的條狀納米DBM放入無(wú)菌生理鹽水中，在37。C恒溫水浴箱中持續(xù)浸泡120h(材料重量與浸提介質(zhì)容量的比例為0.1g/ml)，得浸提液。2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取健康成年小鼠10只，雌雄不限，體重2530g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只，實(shí)驗(yàn)組腹腔內(nèi)注射浸提液(50ml/kg體重)，對(duì)照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水(50ml/kg)。實(shí)驗(yàn)前后均用市售飼料飼養(yǎng)，觀察注射后24、48、72h小鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)靈敏度、活動(dòng)量、進(jìn)食量、體重變化。結(jié)果見表l。表1納米DBM急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果賴l晉:實(shí)驗(yàn)組(納米DBM浸提液)對(duì)照組(生理鹽水)50ml/kg#1弁2弁3#4#5弁l#2#3弁4#5死亡癱瘓呼吸抑制精神狀態(tài)佳佳佳一般佳佳佳一般佳佳反應(yīng)靈敏靈敏靈敏靈敏靈敏靈敏靈敏靈敏靈敏靈敏進(jìn)食正常正常正常正常正常正常正常正常正常正?；顒?dòng)正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常體重變化十2g+lg-lg+lg-2g-lg+2g+2g-lg+lg由表1可見，實(shí)驗(yàn)組5只小鼠，均未死亡，無(wú)癱瘓、呼吸抑制等反應(yīng)，進(jìn)食、活動(dòng)、反應(yīng)等一般情況良好，體重?zé)o明顯變化，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，說明納米DBM無(wú)毒。2.熱原實(shí)驗(yàn)1)制備兔納米DBM浸提液用實(shí)施例1制備的條狀兔納米DBM制備浸提液，方法同急性毒性實(shí)驗(yàn)。2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取新西蘭家兔3只，雌雄不限，體重2.32.7kg，測(cè)納米DBM浸提液注射前后體溫。注射前體溫測(cè)試用電子體溫計(jì)測(cè)家兔肛溫，每小時(shí)檢測(cè)1次，連續(xù)4次，體溫在38.6。C39.rC，且最大溫差《0.4。C，符合要求，正常飼養(yǎng)至第7天，再次測(cè)肛溫2次，兩次的間隔時(shí)間為1小時(shí)，取6次體溫的平均值為正常體溫。注射后體溫測(cè)試:第7天測(cè)體溫后，分別從家兔耳緣靜脈推注預(yù)熱至37°C的DBM浸提液，注射劑量為每公斤體重10ml(10ml/kg)，飼養(yǎng)條件同前，于注射后前3小時(shí)內(nèi)每小時(shí)測(cè)肛溫1次，共3次，以3次中最高的一次體溫減去正常體溫，為該家兔的體溫升高度數(shù)。結(jié)果見表2。表2納米DBM熱原實(shí)驗(yàn)結(jié)果家兔l體溫(2.4kg，初始一周后。C)實(shí)驗(yàn)家兔2體溫(2.3kg，初始一周后。C)實(shí)驗(yàn)家兔3體溫(2.7kg，。C)初始一周后實(shí)驗(yàn)1小時(shí)38.738.838.939.039.039.338.738.838.92小時(shí)38.638.739.039.139.139.238.738.739.13小時(shí)38.739,038.939.338.838.94小時(shí)38.939.038.6平均38.72538.7539.039.0538.738.75最大體0'250'210-35溫升咼由表2可見，家兔體溫升高在0.210.35。C，根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部"生物材料和醫(yī)療器材生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)要求"，符合熱原檢測(cè)規(guī)定，說明納米DBM無(wú)致熱作用。3.溶血試驗(yàn)1)制備稀釋兔血靜脈抽取新西蘭家兔血5ml，力a2%草酸鉀0.25ml抗凝，吸出4ml加至0.9%生理鹽水5ml中進(jìn)行稀釋，即為稀釋兔血；2)溶血實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組取條狀納米DBM材料1份約5g，浸泡于含有10ml生理鹽水的試管內(nèi)，37。C水溫中維持30min，然后加入0.2ml稀釋兔血，緩慢混合，置37。C水浴60min;陰性對(duì)照組取3只試管，每只試管中加10ml生理鹽水，再加入0.2ml稀釋兔血，置37。C水浴60min;陽(yáng)性對(duì)照組取3只試管，每只試管中加10ml蒸餾水，再加0.2ml稀釋兔血，輕輕振動(dòng)，使之完全溶血，置37。C水浴60min;將上述各組的試管分別以2000r/min離心5分鐘，取上清，再用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)545nm測(cè)吸光度，陰性和陽(yáng)性對(duì)照組各取3只試管測(cè)得的平均值。溶血程度按以下公式計(jì)算溶血程度=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-陰性對(duì)照組吸光度y(陽(yáng)性對(duì)照組吸光度-陰性對(duì)照組吸光度)X100。/。。結(jié)果見表3。表3納米DBM體外溶血試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表3可見，納米DBM浸提液對(duì)體外新鮮兔血溶血率為3.76%，在允許范圍內(nèi)(3%5%)，說明納米DBM無(wú)溶血作用。納米DBM的植骨融合效果實(shí)驗(yàn)1.模型制作取新西蘭家兔18只，雌雄不限，體重2.53.0kg，隨機(jī)分成納米DBM組、DBM組、自體骨組3組，每組6只。麻醉前家兔禁食、禁水12小時(shí)，所有動(dòng)物手術(shù)操作過程相同。用氯胺酮肌肉注射麻醉，劑量為每公斤體重50mg(以下用50mg/kg表示)。將家兔俯臥位固定于兔板上，術(shù)區(qū)常規(guī)剃毛、消毒鋪無(wú)菌單，肌肉注射160萬(wàn)單位青霉素。按常規(guī)腰椎后正中縱向依次切開皮膚、皮下組織，沿棘突骨膜下向兩側(cè)剝離椎旁肌，顯露雙側(cè)椎板和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)。將椎板、小關(guān)節(jié)和橫突表面去皮質(zhì)準(zhǔn)備植骨床，三組分別植入納米DBMlg、DBMlg、自體骨lg，逐層縫合切口。傷口不包扎。術(shù)后肌肉注射青霉素80萬(wàn)單位/日，連續(xù)3天。手術(shù)前后所有家兔均單獨(dú)分籠，允許自由活動(dòng)，市售兔飼料喂養(yǎng)。2.影像學(xué)觀察術(shù)后2周、4周、8周、12周分別按常規(guī)拍攝腰椎正、側(cè)位X片及腰椎CT平掃。結(jié)果如下術(shù)后2周，納米DBM、DBM、自體骨三組X片均見植骨區(qū)高密度影，CT掃描見植骨區(qū)高信號(hào)影，成骨量少，植骨塊與椎板有明顯間隙，尚未融合。三組無(wú)明顯差異。術(shù)后4周，X片顯示納米DBM、DBM和自體骨3組植骨區(qū)密度均較2周時(shí)增高，CT掃描見植骨區(qū)有部分成骨，植骨塊與椎板間隙較模糊，但納米DBM組較DBM組及自體骨組成骨量稍多。術(shù)后12周，X片可見納米DBM、DBM及自體骨三組均取得骨性融合，但納米DBM組與其它兩組相比，融合骨塊大、質(zhì)地均勻、密度高。說明納米DBM融合效果更好。3.組織學(xué)觀察術(shù)后4周、12周時(shí)，每組各隨機(jī)抽取3只家兔，心臟內(nèi)空氣注射處死，切取椎板、關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、橫突和新形成的骨塊制作標(biāo)本，脫鈣切片后進(jìn)行HE染色。顯微鏡下觀察結(jié)果表明，術(shù)后4周時(shí)，納米DBM組和自體骨組可見新生骨和纖維骨痂形成，DBM組僅見纖維骨痂形成。12周時(shí)三組均達(dá)到骨性連接，但納米DBM組新生骨中較其他兩組具有更多的骨細(xì)胞。上述結(jié)果表明，本發(fā)明納米DBM材料具有良好的生物相容性和植骨融合效果，是一種更理想的骨移植替代材料。權(quán)利要求1.一種同種異體骨移植替代材料納米DBM，其特征在于納米粒直徑為50-100nm，制備方法如下1)采用改良Urist法按常規(guī)將新鮮同種異體骨制成DBM骨塊；2)將DBM骨塊置于液氮冷凍粉碎機(jī)預(yù)粉碎，得DBM粉末；3)制備納米DBM將DBM粉末置于超細(xì)研磨粉碎機(jī)內(nèi)，加入適量蒸餾水，溫度保持在17℃～25℃，轉(zhuǎn)速由800r/min升至1200r/min，充分研磨后將勻漿進(jìn)行高速離心，棄上清液，得納米DBM，干燥、分裝、密封、消毒即可。2.按權(quán)利要求1所述的同種異體骨移植替代材料納米DBM，其特征在于制備納米DBM用超細(xì)研磨粉碎機(jī)研磨時(shí)，轉(zhuǎn)速和研磨時(shí)間依次為①800r/min，5min;②1000r/min，10min;③1200r/min，10min;1200r/min，15minX10次。3.權(quán)利要求1或2所述納米DBM在制備骨移植物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及生物材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種骨移植用同種異體納米脫鈣骨基質(zhì)材料納米DBM。其由新鮮同種異體骨制備而成，制備方法為1)采用改良Urist法按常規(guī)將新鮮同種異體骨制成DBM骨塊；2)將DBM骨塊置于液氮冷凍粉碎機(jī)預(yù)粉碎，得DBM粉末；3)制備納米DBM將DBM粉末置于超細(xì)研磨粉碎機(jī)內(nèi)，加入適量蒸餾水，在17℃～25℃下進(jìn)行充分研磨，將研磨后所得的勻漿進(jìn)行高速離心，棄上清，得納米DBM，塑形、干燥后消毒備用。本發(fā)明以同種異體骨為原料，取材容易；納米DBM可隨意塑形；因?yàn)槭羌{米結(jié)構(gòu)，其作為骨移植替代材料，生物相容性好，可作為如骨形態(tài)發(fā)生蛋白等外源性促進(jìn)骨再生生長(zhǎng)因子的良好載體，具有良好的促進(jìn)骨再生能力。文檔編號(hào)A61L27/00GK101396570SQ20081020252公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2008年11月11日優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日發(fā)明者嚴(yán)望軍,雷房,巍朱,賈連順,將邵,列錢,陳雄生,凱黃申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)