專(zhuān)利名稱(chēng)：一種金納米棒基藥物載體及其制備工藝和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及一種金納米棒基藥物載體及其制備工藝和應(yīng)用，具體說(shuō)，是
涉及一種負(fù)載有hTERT基因反義寡聚核苷酸的金納米棒基藥物載體及其制備 工藝和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
納米藥物載體技術(shù)是以納米顆粒作為藥物的攜帶工具，將藥物分子包裹在 納米顆粒之中或吸附在其表面，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將藥物引入到細(xì)胞內(nèi)，從而 實(shí)現(xiàn)有效安全的治療。
與傳統(tǒng)的零維納米顆粒相比，金納米棒在藥物載體上的應(yīng)用具有如下優(yōu) 點(diǎn)1)金納米棒特別是功能化的金納米棒具有良好的生物相容性，對(duì)生物體 系的毒性小；2)金納米棒具有很高的比表面積，在其壁表面修飾生物體系可 以提高負(fù)載量；3)金納米棒可通過(guò)控制反應(yīng)物的濃度制備不同長(zhǎng)度的金納米 棒，適用于生物領(lǐng)域的應(yīng)用；4)金納米棒在水溶液中分散性良好，可在水溶 液體系下穩(wěn)定存在且不會(huì)發(fā)生團(tuán)聚；5)金納米棒可通過(guò)化學(xué)修飾帶有不同功
能的官能團(tuán)，適于不同生物體系的研究；6)金納米棒在520nm和700~900nm 有兩個(gè)明顯的等離子表面共振吸收峰，可利用其光熱效應(yīng)治療腫瘤細(xì)胞。
研究表明惡性腫瘤組織中的端粒酶高達(dá)84% 95%,端粒酶中的催化亞 單位hTERT(human telomerase revel etranscrlptase)是端粒酶活性決定因素，因此 hTERT基因被作為新一代腫瘤反義藥物治療的靶點(diǎn)。所述反義概念是lzan沐 Weintmub于1984年首次提出的，與傳統(tǒng)的化學(xué)療法相比，反義療法毒副作用更 小，因?yàn)樵谥委熯^(guò)程中反義藥物能選擇性地進(jìn)入癌細(xì)胞，從而有效地保護(hù)正常 細(xì)胞，其基本原理就是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工合成和生物合成的特定互補(bǔ) 的DNA或RNA序列，導(dǎo)入乾細(xì)胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA雜交雙鏈， 從而抑制或封閉基因表達(dá)，使其喪失活性，達(dá)到基因控制和治療的目的。研究 學(xué)者根據(jù)人類(lèi)端粒酶催化亞單位(hTERT)基因cDNA的序列分析，已設(shè)計(jì)出
hTERT基因反義寡聚核苷酸，其序列為5，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3，。
因成功的基因治療主要取決于如何將有特異性治療效果的治療基因有效 地導(dǎo)入靶細(xì)胞，而裸露的反義寡聚核苷酸等治療基因存在進(jìn)入細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很 低、易被核酸酶降解等問(wèn)題。因此，如何開(kāi)發(fā)一種高效、安全、無(wú)毒的藥物載 體，以將反義寡聚核苷酸等治療基因有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞，對(duì)實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤基因 療法具有重要意義，但至今有關(guān)這類(lèi)技術(shù)的報(bào)道很罕見(jiàn)，尤其是以人類(lèi)端粒酶 催化亞單位(hTERT)基因作為藥物治療靶點(diǎn)，負(fù)載有hTERT基因反義寡聚核 苦酸的金納米棒基藥物載體更未見(jiàn)任何報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種金納米棒基藥物載體及其制備工 藝和應(yīng)用，為金納米棒在藥物載體中的應(yīng)用開(kāi)辟一條新途徑。
為解決上述發(fā)明問(wèn)題，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案如下
一種金納米棒基藥物載體，其特征在于，在金納米棒上由內(nèi)至外依次包裹 有聚陰離子膜層、聚陽(yáng)離子膜層及hTERT基因反義寡聚核苷酸層。
所述聚陰離子膜層的材料選自聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸及透明質(zhì)酸中的 任意一種。
所述聚陽(yáng)離子膜層的材料選自聚二烯丙基二甲基氯化銨、殼聚糖、聚乙烯 亞銨、聚酰胺胺及聚丙烯胺中的任意一種。
本發(fā)明所述的金納米棒基藥物載體的制備原理是利用基團(tuán)之間的靜電作 用力進(jìn)行層層自組裝，具體工藝如下
a) 制備金納米棒采用十六烷基三甲基溴化銨作為軟模板和導(dǎo)向劑，用 種子生長(zhǎng)法在水溶液中制備金納米棒；
b) 制備聚陰離子膜層首先將步驟a)制備的金納米棒水溶液在5000 ~ 14000rpm轉(zhuǎn)速下離心10-30分鐘，去掉上清液；然后將離心處理后的金納米 棒浸入由氯化鈉和聚陰離子化合物組成的混合水溶液中，其中氯化鈉濃度為 0.001 ~0.1mol/l,聚陰離子化合物濃度為l~100mg/ml;最后在4 35。C進(jìn)行搖 床振蕩10~60分鐘；
c) 制備聚陽(yáng)離子膜層首先將步驟b)制備的包裹有聚陰離子膜層的金納 米棒水溶液在5000 - 14000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 ~ 30分鐘，去掉上清液；然后
將離心處理后的包裹有聚陰離子膜層的金納米棒浸入由氯化鈉和聚陽(yáng)離子化
合物組成的混合水溶液中，其中氯化鈉濃度為0.001 ~0.1mol/l,聚陽(yáng)離子化 合物濃度為l~100mg/ml;最后在4 ~ 35。C進(jìn)行搖床振蕩10 ~ 60分鐘；
d)制備hTERT基因反義寡聚核苷酸層首先將步驟c)制備的包裹有聚 陰離子膜層及聚陽(yáng)離子膜層的金納米棒水溶液在5000- 14000 rpm轉(zhuǎn)速下離心 10~30分鐘，去掉上清液，然后用pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行分散，控制溶 液中包裹有聚陰離子膜層及聚陽(yáng)離子膜層的金納米棒的濃度為0.001 ~ O.lmol/1;最后將分散在pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中的hTERT基因反義寡聚核 苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反義寡聚核苷酸的終濃度為5~ 150,ol/l，再靜置10 60分鐘，在5000~ 14000rpm轉(zhuǎn)速下離心10~30分鐘， 去掉上清液，重新分散在pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中即可。
步驟b)中所述的聚陰離子化合物為聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸或透明質(zhì) 酸，優(yōu)選聚苯乙烯磺酸鈉。
步驟c)中所述的聚陽(yáng)離子化合物為聚二烯丙基二甲基氯化銨、殼聚糖、聚 乙烯亞銨、聚酰胺胺及聚丙烯胺中的任意一種，優(yōu)選聚乙烯亞銨。
本發(fā)明中的金納米棒的制備工藝已在Langmuir期刊，2004,20 (15)， 6414 ~ 6420中公開(kāi)，為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再贅述。
本發(fā)明所述的金納米棒基藥物載體因負(fù)載有hTERT基因反義寡聚核苷酸， 所以可應(yīng)用于制備惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶的抑制劑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下
本發(fā)明首次將hTERT基因反義寡聚核苷酸負(fù)載在金納米棒上，解決了裸
露的反義寡聚核苷酸存在轉(zhuǎn)染率低的問(wèn)題，所制備的金納米棒基藥物載體不僅 具有轉(zhuǎn)染率高、靶向性強(qiáng)、抑制惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的效果明顯等優(yōu)點(diǎn)，
而且安全、無(wú)毒，為金納米棒在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了一條新途徑；另外，
本發(fā)明的層層自組裝制備工藝操作簡(jiǎn)單，成本低廉，適于規(guī)模化生產(chǎn)。
圖l為經(jīng)過(guò)不同修飾后的金納米棒的紫外-可見(jiàn)光譜圖； 圖中曲線1為未修飾的金納米棒的紫外-可見(jiàn)光譜圖；曲線2為包裹有 聚陰離子膜層的金納米棒的紫外-可見(jiàn)光譜圖；曲線3為包裹有聚陰離子膜層
及聚陽(yáng)離子膜層的金納米棒的紫外-可見(jiàn)光譜圖；a 、 b為金納米棒的兩個(gè)表 面等離子共振特征吸收峰。
圖2為未修飾的金納米棒的電鏡圖3為包裹有聚陰離子膜層及聚陽(yáng)離子膜層的金納米棒的電鏡圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明 實(shí)施例1
一、 試劑與儀器
氯金酸(HAuCU)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、硝酸銀(AgN03)、 抗壞血酸(AA)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，硼氫化鈉(NaBH4)購(gòu) 自上海三浦化工有限公司，hTERT基因反義寡聚核苷酸(5， -GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3 ，)由上海生工生物科技公司合成，聚乙烯亞 銨(PEI)、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)購(gòu)自Aldrich,釆用雙蒸水。
二、 金納米種子的制備
將0.25ml 0.01M HAuCl4加入到9.15ml 0.1M CTAB溶液中輕輕攪拌混勻，
溶液呈橙黃色；在冰水洛下加入0.60ml 0.01MNaBH4溶液，快速攪拌2分鐘， 溶液呈淡棕黃色；在3(TC水浴中靜置2小時(shí)，備用。
三、 金納米棒的制備
首先將28.27ml 0.10M CTAB和0.01M 1.2ml HAuCU在30。C水浴下輕輕攪 拌混勻，然后加入0.18ml 0.01MAgN03和0.20ml 0.10M的抗壞血酸，攪拌混 勻，得到無(wú)色透明的生長(zhǎng)溶液；最后加入0.15ml上述種子溶液，輕輕攪拌10 秒，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶液顏色發(fā)生如下變化無(wú)色—淺粉紫色—紫色—深紫 色；在3(TC水洛下靜置24小時(shí)即可。
四、 聚陰離子膜層的制備
首先將上述制備的金納米棒水溶液在14000 rpm轉(zhuǎn)速下離心IO分鐘，去 掉上清液(即棄除溶液中游離的CTAB);然后將離心處理后的金納米棒浸入由 NaCl和PSS組成的混合水溶液中，其中NaCl濃度為O.OOlmol/1, PSS濃度 為10mg/ml;最后在25"C進(jìn)行搖床振蕩30分鐘。
五、 聚陽(yáng)離子膜層的制備 首先將上述制備的包裹有PSS膜層的金納米棒水溶液在14000 rpm轉(zhuǎn)速下 離心10分鐘，去掉上清液(即棄除溶液中游離的PSS);然后將離心處理后的包 裹有PSS膜層的金納米棒浸入由NaCl和PEI組成的混合水溶液中，其中NaCl 濃度為0.001mol/l， PEI濃度為10mg/ml;最后在25℃進(jìn)行搖床振蕩30分鐘。
六、hTERT基因反義寡聚核苷酸層的制備
首先將上述制備的包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米棒水溶液在14000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，去掉上清液(即棄除溶液中游離的PEI),然后用pH7.2 的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行分散，控制溶液中包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米 棒的濃度為O.Olmol/1;最后將分散在pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中的hTERT基 因反義寡聚核苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反義寡聚核苷酸的終 濃度為75umo1/1,再靜置30分鐘，在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，去掉上 清液(即棄除溶液中游離的hTERT基因反義寡聚核苷酸)，重新分散在pH7.2的 磷酸鹽緩沖溶液中即可。
由圖l可見(jiàn)經(jīng)過(guò)陰、陽(yáng)離子高聚物修飾的金納米棒的縱向吸收峰波長(zhǎng)由 727nm紅移到736nm,發(fā)生了明顯紅移，說(shuō)明金納米棒修飾上了 PEI/PSS膜。
由圖2和圖3所示的電鏡圖可進(jìn)一步證明PEI/PSS包裹上了金納米棒，其 厚度大約在3-5nm左右。
實(shí)施例2
一、 試劑與儀器
與實(shí)施例1中所述相同。
二、 金納米種子的制備
與實(shí)施例1中所述相同。
三、 金納米棒的制備
與實(shí)施例1中所述相同。
四、 聚陰離子膜層的制備
首先將上述制備的金納米棒水溶液在14000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，去 掉上清液(即棄除溶液中游離的CTAB);然后將離心處理后的金納米棒浸入由 NaCl和PSS組成的混合水溶液中,其中NaCl濃度為0.001mol/l， PSS濃度 為100mg/ml;最后在35℃進(jìn)行搖床振蕩10分鐘。
五、 聚陽(yáng)離子膜層的制備
首先將上述制備的包裹有PSS膜層的金納米棒水溶液在14000 rpm轉(zhuǎn)速下 離心10分鐘，去掉上清液(即棄除溶液中游離的PSS);然后將離心處理后的包 裹有PSS膜層的金納米棒浸入由NaCl和PEI組成的混合水溶液中，其中NaCl 濃度為0.001mol/l， PEI濃度為100mg/ml;最后在35。C進(jìn)行搖床振蕩10分鐘。
六、hTERT基因反義寡聚核苷酸層的制備
首先將上述制備的包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米棒水溶液在14000 rpm轉(zhuǎn)速下離心IO分鐘，去掉上清液(即棄除溶液中游離的PEI)，然后用pH7.2 的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行分散，控制溶液中包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米 棒的濃度為O.lmol/1;最后將分散在pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中的hTERT基因 反義寡聚核苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反義寡聚核苦酸的終濃 度為150pmol/l,再靜置10分鐘，在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心IO分鐘，去掉上清 液(即棄除溶液中游離的hTERT基因反義寡聚核苷酸)，重新分散在pH7.2的磷 酸鹽緩沖溶液中即可。
實(shí)施例3
一、 試劑與儀器 與實(shí)施例1中所述相同。
二、 金納米種子的制備 與實(shí)施例1中所述相同。
三、 金納米棒的制備 與實(shí)施例1中所述相同。
四、 聚陰離子膜層的制備
首先將上述制備的金納米棒水溶液在5000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去掉 上清液(即棄除溶液中游離的CTAB);然后將離心處理后的金納米棒浸入由 NaCl和PSS組成的混合水溶液中，其中NaCl濃度為O.lmol/1, PSS濃度為 lmg/ml;最后在4'C進(jìn)行搖床振蕩60分鐘。
五、 聚陽(yáng)離子膜層的制備
首先將上述制備的包裹有PSS膜層的金納米棒水溶液在5000 rpm轉(zhuǎn)速下 離心30分鐘，去掉上清液(即棄除溶液中游離的PSS);然后將離心處理后的包 裹有PSS膜層的金納米棒浸入由NaCl和PEI組成的混合水溶液中，其中NaCl 濃度為0.1mo1/1， PEI濃度為lmg/ml;最后在4'C進(jìn)行搖床振蕩60分鐘。
六、hTERT基因反義寡聚核苷酸層的制備
首先將上述制備的包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米棒水溶液在5000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去掉上清液(即棄除溶液中游離的PEI),然后用pH7.2 的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行分散，控制溶液中包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米 棒的濃度為0.001mol/l;最后將分散在pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中的hTERT基 因反義寡聚核苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反義寡聚核苷酸的終 濃度為5pnol/i,再靜置60分鐘，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去掉上清 液(即棄除溶液中游離的hTERT基因反義寡聚核苷酸)，重新分散在pH7.2的磷 酸鹽緩沖溶液中即可。
實(shí)施例4
一、 試劑與儀器 與實(shí)施例1中所述相同。
二、 金納米種子的制備 與實(shí)施例1中所述相同。
三、 金納米棒的制備 與實(shí)施例1中所述相同。
四、 聚陰離子膜層的制備
首先將上述制備的金納米棒水溶液在5000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去掉 上清液(即棄除溶液中游離的CTAB);然后將離心處理后的金納米棒浸入由 NaCl和PSS組成的混合水溶液中，其中NaCl濃度為O.lmol/1， PSS濃度為 100mg/ml;最后在4'C進(jìn)行搖床振蕩60分鐘。
五、 聚陽(yáng)離子膜層的制備
首先將上述制備的包裹有PSS膜層的金納米棒水溶液在5000 rpm轉(zhuǎn)速下 離心30分鐘，去掉上清液(即棄除溶液中游離的PSS);然后將離心處理后的包 裹有PSS膜層的金納米棒浸入由NaCl和PEI組成的混合水溶液中，其中NaCl 濃度為0.1mo1/1， PEI濃度為100mg/ml;最后在4。C進(jìn)行搖床振蕩60分鐘。
六、 hTERT基因反義寡聚核苷酸層的制備
首先將上述制備的包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米棒水溶液在5000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去掉上清液(即棄除溶液中游離的PEI),然后用pH7.2 的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行分散，控制溶液中包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米
棒的濃度為0.01mol/l;最后將分散在pH7.2的嫌酸鹽緩沖溶液中的hTERT基 因反義寡聚核苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反義寡聚核苷酸的終 濃度為50nmo1/1，再靜置60分鐘，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去掉上清 液(即棄除溶液中游離的hTERT基因反義寡聚核苷酸)，重新分散在pH7.2的磷 酸鹽緩沖溶液中即可。 實(shí)施例5
一、 Hela細(xì)胞的培養(yǎng)
Hela宮頸癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。將Hela細(xì)胞在含10%小牛血 清的RPMI-1640培養(yǎng)基中于37i:、 5%(302飽和溫度下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期細(xì)胞。
二、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的測(cè)定
將熒光染料FAM標(biāo)記的裸露的hTERT基因反義寡聚核苷酸及FAM標(biāo)記 的本發(fā)明的金納米棒基藥物載體，分別加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hda細(xì)胞中，在 37°C、 5% C02飽和溫度下培養(yǎng)24h;取未經(jīng)任何處理的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì) 胞作為陰性對(duì)照；胰酶消化后，用70%的乙醇固定；用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)其 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的金納米棒基藥物載體可將hTERT基因 反義寡聚核苷酸的轉(zhuǎn)染率提高56.78%。
三、 細(xì)胞調(diào)亡率的測(cè)定
將裸露的hTERT基因反義寡聚核苷酸、包裹有PSS膜層及PEI膜層的金 納米棒及本發(fā)明的金納米棒基藥物載體分別加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hda細(xì)胞中， 在37。C、 5% C02飽和溫度下培養(yǎng)48h;取未經(jīng)任何處理的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela 細(xì)胞作為陰性對(duì)照；胰酶消化后，用70%的乙醇固定；用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè) 它們的凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)裸露的hTERT基因反義寡聚核苷酸處理 的Hela細(xì)胞凋亡率為5.7%，經(jīng)過(guò)包裹有PSS膜層及PEI膜層的金納米棒處理 的Hela細(xì)胞凋亡率為6.7%，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的金納米棒基藥物載體作用的Hela 細(xì)胞凋亡率達(dá)到20.7%。
權(quán)利要求
1. 一種金納米棒基藥物載體，其特征在于，在金納米棒上由內(nèi)至外依次包裹有聚陰離子膜層、聚陽(yáng)離子膜層及hTERT基因反義寡聚核苷酸層。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金納米棒基藥物載體，其特征在于，所述聚陰離 子膜層的材料選自聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸及透明質(zhì)酸中的任意一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金納米棒基藥物載體，其特征在于，所述聚陽(yáng)離 子膜層的材料選自聚二烯丙基二甲基氯化銨、殼聚糖、聚乙烯亞銨、聚酰胺胺 及聚丙烯胺中的任意一種。
4. 一種權(quán)利要求l所述的金納米棒基藥物載體的制備工藝，其特征在于， 包括如下具體步驟a) 制備金納米棒釆用十六垸基三甲基溴化銨作為軟模板和導(dǎo)向劑，用 種子生長(zhǎng)法在水溶液中制備金納米棒；b) 制備聚陰離子膜層首先將步驟a)制備的金納米棒水溶液在5000 ~ 14000rpm轉(zhuǎn)速下離心10~30分鐘，去掉上清液；然后將離心處理后的金納米 棒浸入由氯化鈉和聚陰離子化合物組成的混合水溶液中，其中氯化鈉濃度為 0.001 ~ O.lmol/1,聚陰離子化合物濃度為l~100mg/ml;最后在4 35。C進(jìn)行搖 床振蕩10~60分鐘；c) 制備聚陽(yáng)離子膜層首先將步驟b)制備的包裹有聚陰離子膜層的金納 米棒水溶液在5000 ~ 14000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 ~ 30分鐘，去掉上清液；然后 將離心處理后的包裹有聚陰離子膜層的金納米棒浸入由氯化鈉和聚陽(yáng)離子化 合物組成的混合水溶液中，其中氯化鈉濃度為0.001-O.lmol/1，聚陽(yáng)離子化 合物濃度為1-100mg/ml;最后在4 ~ 35"C進(jìn)行搖床振蕩10 ~ 60分鐘；d) 制備hTERT基因反義寡聚核苷酸層首先將步驟c)制備的包裹有聚 朋離子膜層及聚陽(yáng)離子膜層的金納米棒水溶液在5000- 14000 rpm轉(zhuǎn)速下離心 10~30分鐘，去掉上清液，然后用pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行分散，控制溶 液中包裹有聚陰離子膜層及聚陽(yáng)離子膜層的金納米棒的濃度為0.001 ~ O.lmol/1;最后將分散在pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中的hTERT基因反義寡聚核 苷酸加入到上述溶液中，控制hTERT基因反義寡聚核苷酸的終濃度為5~ 150,ol/l,再靜置10 60分鐘，在5000- 14000rpm轉(zhuǎn)速下離心10~30分鐘，去掉上清液，重新分散在pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液中即可。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的金納米棒基藥物載體的制備工藝，其特征在于, 步驟b)中所述的聚陰離子化合物為聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸或透明質(zhì)酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的金納米棒基藥物載體的制備工藝，其特征在于, 所述的聚陰離子化合物為聚苯乙烯磺酸鈉。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的金納米棒基藥物載體的制備工藝，其特征在于， 步驟c)中所述的聚陽(yáng)離子化合物為聚二烯丙基二甲基氯化銨、殼聚糖、聚乙烯 亞銨、聚酰胺胺及聚丙烯胺中的任意一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的金納米棒基藥物載體的制備工藝，其特征在于, 所述的聚陽(yáng)離子化合物為聚乙烯亞銨。
9. 一種權(quán)利要求1所述的金納米棒基藥物載體的應(yīng)用，其特征在于，所述 金納米棒基藥物載體用于制備惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶的抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種金納米棒基藥物載體，該載體特征是在金納米棒上由內(nèi)至外依次包裹有聚陰離子膜層、聚陽(yáng)離子膜層及hTERT基因反義寡聚核苷酸層。本發(fā)明的金納米棒基藥物載體是利用基團(tuán)之間的靜電作用力進(jìn)行層層自組裝原理制備而得，可應(yīng)用于制備惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶的抑制劑。本發(fā)明首次將hTERT基因反義寡聚核苷酸負(fù)載在金納米棒上，解決了裸露的反義寡聚核苷酸存在轉(zhuǎn)染率低的問(wèn)題，所制備的金納米棒基藥物載體不僅具有轉(zhuǎn)染率高、靶向性強(qiáng)、抑制惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的效果明顯等優(yōu)點(diǎn)，而且安全、無(wú)毒，為金納米棒在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了一條新途徑；另外，本發(fā)明的制備工藝操作簡(jiǎn)單，成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK101380473SQ20081020113
公開(kāi)日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日
發(fā)明者賈能勤, 陳守慧 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)