一種同步浸提、分項制取丹皮中各活性成分的制備方法

專利名稱：一種同步浸提、分項制取丹皮中各活性成分的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種提取中草藥中活性成分的方法，具體地說是一種同步浸提、分項制取丹 皮中丹皮酚、丹皮多糖和丹皮總苷的制備方法。
二背景技術：
中國傳統的中醫藥學是中華民族大家庭的瑰寶。21世紀，全球正興起"綠色食物"、"綠 色藥物"的熱潮，發展中華傳統中藥，實現中藥現代化，更具有重大的意義和價值。此外， 從化學合成物中發現新藥的難度大、成本高、周期長，且毒副作用明顯，使得國際市場對天 然藥物的需求日益擴大，中藥和天然藥物產業蘊含著巨大的市場潛力與商機。
中藥丹皮(Moutan Cortex)是毛茛科(Ranunculaceae)植物牡丹CPaeo"z'a ra^h^coas Andr) 的干燥根皮，為安徽省的四大名藥之一，種植歷史己有千年，其性微寒，味辛，苦，涼，入 心、肝、腎經，具有清熱，涼血，和血，消淤的功效。丹皮炮制最早見于我國梁代陶宏景所 撰《集注》中"皆促破，去心。"《本草綱目》等醫書記載"丹皮木心不入藥，需去之。"
丹皮中的有效活性成分中藥包括丹皮酚(又稱牡丹酚)、丹皮多糖和丹皮總苷(主要包
括芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮苷、丹皮原苷、丹皮新苷等)。牡丹酚具有活血化瘀、清
熱涼血、消炎收斂、鎮痛解痙等多方面的藥理作用，在醫藥、日化、香料領域有著廣泛的用
途。例如牡丹酚做成霜劑外涂，對急性濕疹、臘溢性皮炎、接觸性皮炎有明顯療效；在牙膏 中添加牡丹酚能起到消炎殺菌、抗牙齦過敏的作用；牡丹酚還能消除面部粉刺，對蚊蟲叮咬、 夏季皮炎、痱子、頭皮瘙癢，具有殺菌、祛痱、止癢的作用；此外，其對心血管系統和中樞 神經系統等具有多方面的藥理作用，可用于開發抗心血管系統疾病的藥物。丹皮多糖具有較 高的降血糖活性，可用于開發治療糖尿病藥物，具有重要的臨床實踐價值；此外丹皮多糖還 具有增強機體免疫功能及抗炎作用等，有效安全，無藥理毒性。丹皮總苷包括芍藥苷、苯甲 酰芍藥苷、丹皮苷、丹皮原苷、丹皮新苷等，具有較好的清除氧自由基和肝保護作用，可用 于治療肝炎；其免疫調節和抗炎作用，為其開發成為治療類風濕性關節炎的新藥提供可能。 目前，對于丹皮的開發應用絕大部分局限于其中的某一種活性成分，所使用的技術手段 較為陳舊繁瑣，生產效率較低，能源消耗大，也浪費了原料丹皮，限制了在工業生產上的應 用，且至今尚無報道從丹皮中同時綜合提取丹皮酚、丹皮多糖和丹皮總苷三種活性物質的方 法。因此，建立一種能夠同時提取丹皮中三種活性物質的、經濟高效的、節能環保的方法對 實現中藥現代化具有現實意義。

發明內容
本發明目的在于綜合利用丹皮以充分發揮其藥用價值，所要解決的技術問題是自從丹皮 中同步提取、分項獲得丹皮酚、丹皮多糖和丹皮總苷各活性成分。
本發明所稱的丹皮同步提取是指丹皮生藥用溫水浸提后分離，得到主要含丹皮酚的固相 (藥渣)和主要含丹皮多糖和丹皮總苷的液相(水浸提液)；分項制取是指自固相中制取丹 皮酚，自液相中分別制取丹皮多糖和丹皮總苷。工藝流程見圖l。
本制備方法包括浸提、分離以及固相和液相的處理，所述的浸提是指丹皮生藥于25~45 'C水中浸泡至少4小時，丹皮與水的重量比不小于1: 5，然后分離得到固相藥渣和液相水 浸提液；所述的固相處理是藥渣加水室溫浸泡至少3小時，藥渣與水的重量比不小于l: 5， 然后用2.0 2.5kg/cm3壓力的蒸氣進行水蒸氣蒸餾，控制釜溫110~120°C，收集蒸餾液并冷 卻，分離、得到的沉淀便是丹皮酚；所述的液相處理是根據丹皮多糖和丹皮總苷分子量大小 不同，選擇截留分子量5kDa或10kKDa或30kDa的超濾膜對浸提液于壓力25~35psi和25~45 'C條件下進行超濾分離，大分子丹皮多糖被截留，小分子丹皮總苷及少量丹皮酚則通透，也 就是說丹皮多糖存在于截留液中，用醇沉法制取丹皮多糖；丹皮總苷等存在于透過液中，用 大孔樹脂吸附分離法制備丹皮總苷；醇沉法是向截留液中加入至少兩倍體積濃度50~90%(重 量百分比，下同)的乙醇溶液，攪拌均勻后靜置、沉淀，待沉淀析出完全后分離，收集沉淀 凍干便是丹皮多糖；對透過液減壓濃縮，濃縮液用大孔樹脂吸附分離，水洗脫4~10柱體積 (BV)除雜后用濃度20 50。/。的乙醇溶液洗脫3 10BV，收集乙醇洗脫液，經真空脫溶、干燥 后得到丹皮總苷；減壓濃縮時的餾出液返回固相中回收丹皮酚，因為丹皮酚不溶于冷水，但 在溫水中有一定的溶解度，實驗表明，約有總量的15%~20%溶在溫水中。
優選丹皮生藥于30 45'C水中浸泡至少6小時，丹皮與水的重量比不小于l: 8，進一步 優選于35 40。C水中浸泡8小時，丹皮與水的重量比l: 10。
優選截留分子量lOKDa的超濾膜于壓力30psi和35'C條件下進行超濾膜分離。
所述的大孔樹脂選自型號為D201或寶恩3號或ASD-8或AB-8或HP16等大孔樹脂。
優選型號為AB-8型大孔樹脂。
濃縮液用大孔樹脂吸附分離時，優選先水洗脫5 8BV，再用30~50°/。乙醇洗脫3~5BV，進 一步優選水洗脫6BV，再用30%乙醇洗脫4BV。
分項制取時得到的各活性成分可通過重結晶等公知的方法進一步純化。比如丹皮酚可用 70%乙醇溶液重結晶，即85t:水浴加熱溶解，冷凍結晶至少一次。經重結晶后得到純品如圖 2所示。
本發明的優點是
(1) 本方法能從中藥丹皮中綜合提取獲得丹皮酚、丹皮多糖和丹皮總苷，實現了對藥 材的最大程度的利用。
(2) 本方法使用水蒸氣蒸餾法獲得丹皮酚，設備簡單，成本較低，此過程中使用間歇 加熱、循環加水的方法，提高了丹皮酚的得率。純化精制過程中采用乙醇多次洗滌和速凍結 晶技術，縮短結晶時間，減少乙醇消耗，大大提高產品的純度與品質。
(3) 根據丹皮多糖與丹皮總苷分子量大小的差異(丹皮多糖分子量在10kDa以上，丹 皮總苷分子量小于1000Da)，使用切向流超濾技術進行分離，設備簡單、可連續生產、速度 快，大大提高分離效率，減少能量與乙醇等試劑的消耗，生產成本大幅降低，克服了傳統多 糖生產過程使用的水提醇沉法乙醇消耗大、成本高以及色譜法載樣量小，效率低等缺點，適 合工業化應用。
(4) 丹皮總苷純化過程中使用AB-8大孔樹脂，吸附量大、再生簡單、效果可靠，取 代了傳統的乙醚、正丁醇等有機試劑萃取，大大提高了產品的質量與安全性，同時降低成本 并減輕對環境的污染。
(5) 本發明可以使用中藥丹皮出口加工或飲片加工產生的邊角料、細毛須、皮屑、細 莖碎末作原料進行提取，從而進一步實現對中藥材的充分利用，降低成本，獲得更大的經濟 效益。.
(6) 原藥廢渣處理使用后的廢渣可以制成高檔蚊香，(提取后的原藥廢渣主要成份是 碳和一些樹脂類膠原，是制作蚊香最理想的原料)，把提取后的殘液參入燃燒后的粉煤灰吸 收后可以制作成特殊用途的粘土磚，既提高了原材料的綜合利用率，也符合循環經濟的環保 要求。
(7) 本發明首次建立了從中藥丹皮中綜合提取丹皮酚、丹皮多糖和丹皮總苷的方法， 設計合理，成本低、易操作、得率高，適合工業化生產，應用前景廣泛。
四

' 圖l為中藥丹皮同步浸提、分項制取各活性成分工藝路線圖
圖2為丹皮酚在HPLC-UV色譜圖 圖3為丹皮多糖HPLC-ELSD色譜圖 圖4為丹皮總苷HPLC-UV色譜圖
五具體實施方式
實施例一
取丹皮生藥500g，洗凈烘干，加入5L水，35'C溫水浸提8小時。過濾得到藥渣和浸 提液。浸提液(濾液)使用截留分子量10kDa的超濾膜，在壓力30psi，溫度35'C條件下切 向流超濾分離，得含大分子丹皮多糖的截留液和含小分子丹皮總苷的透過液。丹皮多糖截留 液使用3倍體積70°/。乙醇沉淀12小時，收集沉淀冷凍干燥，得丹皮多糖部分。丹皮總苷透 過液減壓濃縮，餾出液保留，濃縮液上大孔樹脂柱AB-8 (3.5g芍藥苷/kg濕樹脂)，先用水 沖洗6個柱體積(6BV)除雜，再用30。/。乙醇洗脫4BV，收集洗脫液并減壓蒸餾至無醇味， 冷凍干燥，即得丹皮總苷部分。藥渣加入9.5倍水室溫浸泡5小時后，于蒸餾罐內用2. 3kg/cm3 壓力的蒸氣進行水蒸氣蒸餾，控制釜溫115°C (并入上一步濃縮透過液時的餾出液)，間歇 加熱，循環加水，至罐內排出的原藥液體澄清并伴有少量珠點油花止，收集蒸餾液，冷卻后 沉淀得丹皮酚粗品。粗品使用3倍體積70y。乙醇于85"C水浴中溶解，完全溶解后移至冷柜中 結晶，第一次結晶時間較短，至剛有晶體析出，再重復以上操作3次至徹底結晶，得丹皮酚 純品。經液相色譜測定，丹皮多糖的得率為3.0%，純度為80%;丹皮總苷的得率為3.3%， 純度為(以芍藥苷計)82.3%，其中芍藥苷含量為47. 5%;丹皮酚的提取率為2. 47%，純度為 99%。
實施例二 .
取丹皮生藥500g，洗凈烘干，加入5L水，35'C溫水浸提8小時。過濾，得到藥渣和浸 提液。浸提液(濾液)使用截留分子量30kDa的超濾膜，在壓力25psi，溫度3(TC條件下切 向流超濾分離，得含大分子丹皮多糖的截留液和含小分子丹皮總苷的透過液。丹皮多糖截留 液使用3倍體積80%乙醇沉淀12小時，收集沉淀冷凍干燥，得丹皮多糖部分。丹皮總苷透 過液減壓濃縮后上大孔樹脂柱AB-8 G.5mg芍藥苷/g濕樹脂)，先用水沖洗6BV除雜，再用 50%乙醇洗脫3BV，收集洗脫液并減壓蒸餾至無醇味，冷凍干燥，即得丹皮總苷部分。藥渣 加入9.5倍水浸泡5小時后，于蒸餾罐內用2.4kg/cm3壓力的蒸氣進行水蒸氣蒸餾，控制釜 溫115°C (并入上一步濃縮透過液時的餾出液)，至罐內排出的原藥液體澄清并伴有少量珠 點油花止，收集蒸餾液，冷卻后沉淀得丹皮酚粗品。粗品使用3倍體積70y。乙醇于85。C水浴 中溶解，完全溶解后移至冷柜中結晶，得丹皮酚純品。經液相色譜測定，丹皮多糖的得率為 2.3%,純度為84%;丹皮總苷的得率為3.6%，純度(以芍藥苷計)為71.8%，其中芍藥苷 含量為41.7%;丹皮酚的提取率為2. 16%，純度為95%。 實施例三
(1)實施例一中丹皮酚純度的測定(紫外檢測-高效液相色譜法)
色譜條件色譜柱Restek pinnacle d8柱(4.6x250mm,5pm);檢測器Waters2487紫外檢
測器(美國Waters公司)；Waters515色譜泵(美國Waters公司)；檢測波長274nm;流 動相甲醇水45:55(v/v);流速lmL/min;進樣量20pL。
供試品溶液的制備精密稱取相同質量的實施例一中丹皮酚樣品和標準品適量，分別用 甲醇溶于容量瓶中，搖勻，即得。
測定方法分別精密吸取樣品溶液和標準品溶液，注入液相色譜儀，以峰面積歸一化法
計算，測定，結果參見圖2。
分析結果圖2中，丹皮酚峰的相對保留時間為14.018，峰形單一對稱，'峰面積占總峰 面積的99%，幾乎不含其他雜峰，說明此方法制備的丹皮酚純度很好。
(2) 實施例一中丹皮多糖純度的鑒定(蒸發光散射-高效液相色譜法)
色譜條件色譜柱TSK-GELG4000PWxL凝膠色譜柱(7.8x300mm)(日本TOSOH公司)； 檢測器Waters 2420 ELS Detecter (美國Waters公司)；Waters515色譜泵(美國Waters公司)； 流動相超純水；噴霧器級別60%;漂移管溫度55'C;氣壓25psi;流速lmL/min;進樣量20pL。
供試品溶液的制備精密稱取一定量實施例一中丹皮多糖樣品，用超純水溶于容量瓶中，
搖勻，即得。
測定方法精密吸取樣品溶液，注入液相色譜儀，測定，結果參見圖3。
分析結果圖3中，丹皮多糖主要含有三個活性組分——組分l、組分2和組分3，為
進一步純化開發提供依據。
(3) 實施例一中丹皮總苷純度的測定(紫外檢測-高效液相色譜法)
色譜條件色譜柱Restek pinnacle C18(l8下標)柱(4.6x250匪,5jam);檢測器Waters2487 紫外檢測器(美國Waters公司);Waters515色譜泵(美國Waters公司);檢測波長230nm; 流動相乙腈超純水磷酸(85%) =100:400:1 (v/v);流速lmL/min;進樣量20pL。
供試品溶液的制備精密稱取相同質量的實施例一中丹皮總苷樣品和芍藥苷標準品適 量，分別用甲醇溶于容量瓶中，搖勻，即得。
測定方法分別精密吸取樣品溶液和標準品溶液，注入液相色譜儀，以峰面積歸一化法
計算，測定，結果參見圖4。 .
分析結果圖4中，芍藥苷峰的相對保留時間為6.937，峰形單一對稱，峰面積占總峰 面積的70%。
權利要求
1、一種同步浸提、分項制取丹皮中各活性成分的制備方法，包括浸提、分離以及固相和液相的處理，其特征在于所述的浸提是丹皮生藥于25～45℃水中浸泡至少4小時，丹皮與水的重量比不小于15，然后分離得到固相藥渣和液相水浸提液；所述的固相處理是藥渣加水室溫浸泡至少3小時，藥渣與水的重量比不小于15，然后用2.0～2.5kg/cm3壓力的蒸氣進行水蒸氣蒸餾，控制釜溫110～120℃，收集蒸餾液并冷卻，分離、收集沉淀得到丹皮酚；所述的液相處理是使用截留分子量5kDa或10kDa或30kDa的超濾膜對浸提液于壓力25～35psi和25～45℃條件下進行超濾分離得到截留液和透過液，向截留液中加入至少兩倍體積濃度50～90wt％乙醇，攪拌均勻后靜置、沉淀，收集沉淀凍干得到丹皮多糖；透過液減壓濃縮，濃縮液用大孔樹脂吸附分離，先水洗脫4～10BV，后用濃度20～50wt％的乙醇洗脫3～10BV，收集乙醇洗脫液，真空脫溶、干燥后得到丹皮總苷。
2、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于丹皮生藥于30 45'C水中浸泡至少6 小時，丹皮與水的重量比不小于l: 8。
3、 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于丹皮生藥于30 4(TC水中浸泡8小時， 丹皮與水的重量比為1: 10。
4、 根據權利要求1或2或3所述的制備方法，其特征在于使用截留分子量10kDa的超 濾膜對浸提液于壓力30psi和溫度35'C條件下進行超濾膜分離。
5、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂選自D201或寶恩3 號或ASD-8或AB-8或HP16型大孔樹脂。
6、 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂為AB-8型大孔樹脂。
7、 根據權利要求1或5或6所述的制備方法，其特征在于先用水洗脫5~8BV，再用 30~50討％乙醇洗脫3~5BV，收集乙醇洗脫液，真空脫溶、干燥后得到丹皮總苷。
8、 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于先用水洗脫6BV，再用30wt。/。乙醇洗 脫4BV，真空脫溶、干燥后得到丹皮總苷。
全文摘要
一種同步浸提、分項制取丹皮中各活性成分的制備方法，是丹皮生藥于25～45℃水中浸泡至少4小時，分離得到固相藥渣和液相水浸提液；固相加水室溫浸泡后用水蒸氣蒸餾法制取丹皮酚，液相水浸提液用截留分子量5kDa或10kDa或30kDa的超濾膜對浸提液于壓力25～35psi和25～45℃條件下進行超濾分離，分別得到截留液和透過液，截留液用醇沉法制取丹皮多糖，透過液用大孔樹脂吸附分離制取丹皮總苷。本方法從中藥丹皮中綜合提取得到丹皮酚、丹皮多糖和丹皮總苷，實現了對藥材最大程度的利用，所得到的丹皮多糖純度80～84％，丹皮總苷純度71.8～82.3％，其中芍藥苷含量為41.7～47.5％，丹皮酚經純化后純度達95～99％。
文檔編號A61K36/71GK101390962SQ200810195489
公開日2009年3月25日 申請日期2008年10月15日 優先權日2008年10月15日
發明者孫文秀, 王子堯, 祝慶軍, 彥 陳 申請人:安徽大學;安徽益康生物科技有限責任公司