專利名稱：Fhl3在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及四個半LIM結構域蛋白的新醫藥用途，具體涉及四個半LIM結構域蛋 白3(FHL3)在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術：
四個半LIM結構域蛋白(Four and a Half LM domains protein,下文簡稱FHL) 家族屬于LIM超家族，其家族成員由4個半LM結構域組成。LIM結構域由約50個氨基酸 組成，富含半胱氨酸，形成2個鋅指結構。LIM結構域介導許多蛋白與蛋白之間的相互作用， 調節細胞骨架蛋白、酶以及轉錄因子的作用。已經發現FHL家族有5個成員，它們分別是 FHLl 、 FHL2、 FHL3、 FHL4和FHL5/ACT。 FHL成員的表達具有組織特異性，FHL1 、 FHL2和FHL3 主要在骨骼肌和心肌中表達，FHL4和FHL5/ACT主要在睪丸中表達。現已發現，FHL家族的 功能主要表現在三個方面第一方面，FHL家族蛋白在肌細胞的生長及分化過程具有重要 作用；第二方面，FHL家族的成員可作為轉錄因子的輔助因子發揮作用；以及第三方面，FHL 家族成員可能在腫瘤的發生發展中也具有重要功能。 腫瘤是一類嚴重危害人類生命健康的常見疾病。在西醫領域，目前腫瘤治療的傳 統模式主要有手術治療、化學治療、放射治療和生物學治療。基因治療是近年發展起來的 一類新治療方法，基因治療的主要理論依據是基于腫瘤是一類"多基因病"，目前認為腫瘤 的基本發病機理是由于基因表達調控異常、生長因子分泌功能失常、信號傳導異常、使細胞 發生惡性增殖而發生的。因此，從理論上分析，從基因水平調控細胞的基因表達過程是治療 腫瘤較為理想的手段和途徑。近年來隨著基因工程的飛速發展，基因治療法已經開始用于 腫瘤的治療。但是，即便如此，臨床上仍然需要安全、有效的腫瘤治療的新方案。
目前，FHL3在人類腫瘤中的表達情況還不清楚，FHL3是否能抑制人類腫瘤細胞的 生長及如何調節這種生長的分子機理也不清楚。
發明內容
本發明的目的是提供FHL3的新醫藥用途，例如在制備用于治療腫瘤的藥物中的 用途，或通過基因治療等方法用于治療腫瘤。 本發明人在研究中令人意外地發現，FHL3可以調節癌基因和抑癌基因在生物體內 的表達，并由此進一步抑制哺乳動物特別是人類的腫瘤細胞的生長，為腫瘤的臨床治療提 供了 一種全新的有益方案。基于該發現，本發明人完成了本發明。 —方面，本發明提供了FHL3在制備用于調節癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物細 胞內表達的藥物中的用途。 基于本發明第一方面的用途，本發明第二方面提供了FHL3在制備用于抑制哺乳 動物腫瘤細胞生長的藥物中的用途。 本發明第三方面提供了一種表達載體，其含有編碼FHL3的核苷酸序列。在一個實 施方案中，所述的載體是質粒或病毒。在另一個實施方案中，所述的病毒是腺病毒。
本發明第四方面提供了本發明第三方面所述的表達載體在制備用于調節癌基因 和/或抑癌基因在哺乳動物細胞內表達的藥物中的用途。 本發明第五方面提供了本發明第三方面所述的表達載體在制備用于抑制哺乳動
物腫瘤細胞生長的藥物中的用途。 下面進一步詳細地描述本發明。 本發明第一方面提供了 FHL3在制備用于調節癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物 細胞內表達的藥物中的用途。 本發明所述的FHL3是一種已知的蛋白質，英文全稱為four anda half LIM domains 3，其在NCBI (美國國立生物技術信息中心)給定的基因編號為BC011697。 FHL3 可以通過多種途徑獲得，例如用PCR方法從乳腺cDNA文庫(Clontech， USA)中擴增含280 個氨基酸的完整編碼區FHL3 cDNA序列。 另外，如本文使用的，術語"癌基因"是指其編碼的產物與細胞的腫瘤性轉化有關 的基因，它能促進細胞的生長和轉化。如本文使用的，術語"抑癌基因"是癌基因的反義詞， 其正常功能是抑制細胞生長和腫瘤發生。 通過本發明人的深入研究，發現FHL3可以調節哺乳動物細胞內癌基因的表達，和 /或可以調節哺乳動物細胞內抑癌基因的表達。更具體地說，本發明人發現FHL3可以抑 制哺乳動物細胞內癌基因的表達，和/或可以促進哺乳動物細胞內抑癌基因的表達。所述 的哺乳動物細胞可以是來自哺乳動物任何組織或器官的細胞。進一步地，所述哺乳動物細 胞包括但不限于來自以下組織或器官的細胞乳腺、肝臟、肺臟、胃、前列腺、腸、腎、子宮、卵 巢、皮膚。更進一步地，所述哺乳動物細胞包括但不限于來自以下組織或器官的細胞乳腺、 肝臟、肺臟。另一方面，所述的哺乳動物細胞可以是在體細胞，也可以是離體細胞，雖然本發 明是通過采用離體細胞進行試驗發現的這些結果，但是，本領域技術人員清楚，通過本發明 的方案和結果可以容易在哺乳動物的在體細胞中獲得同樣結果。此外，基于本發明的產業 用途，所述的哺乳動物細胞優選是哺乳動物的在體細胞。這些發現是實現本發明的基礎。
基于本發明第一方面的用途，本發明第二方面提供了FHL3在制備用于抑制哺乳 動物腫瘤和/或癌細胞生長的藥物中的用途。 用于本文的術語"腫瘤"和"癌"，其含義和兩者關系是本領域技術人員公知的，并 且二者在許多情況下可以互換使用。所述的腫瘤和/或癌可以是醫學上已知的任何腫瘤， 包括惡性腫瘤和/或癌癥。優選地，所述的腫瘤(包括惡性腫瘤和/或癌癥)包括，但不限 于 惡性腫瘤，包括但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、 結腸癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、子宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌(包括鱗狀細胞癌)；
中樞和周圍神經系統的腫瘤，包括但不限于星形細胞瘤和神經膠質瘤；以及
其他腫瘤，包括但不限于黑素瘤。 更優選地，所述的腫瘤(包括惡性腫瘤和/或癌癥)選自乳腺癌、肝癌、肺癌(包 括小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、胃癌、結腸癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌。
更進一步優選地，所述的腫瘤(包括惡性腫瘤和/或癌癥)選自乳腺癌、肝癌、肺 癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌)。 根據本發明的第二方面，所述的哺乳動物的腫瘤和/或癌細胞可以是在體細胞，也可以是離體細胞，雖然本發明采用了離體細胞進行試驗，但是，本領域技術人員清楚，通 過本發明的方案和結果可以容易在哺乳動物的在體細胞中獲得同樣結果。此外，基于本發 明的產業用途，所述的哺乳動物的腫瘤和/或癌細胞優選是罹患腫瘤和/或癌癥的哺乳動 物的在體細胞。 用于本文的術語"哺乳動物"是指罹患本發明所述腫瘤和/或癌癥的受試者，其包
括但不限于豬、狗、貓、牛、羊等家畜和人類。優選地，所述的哺乳動物是人類。 本發明第三方面提供了一種表達載體，其含有編碼FHL3的核苷酸序列。進一步
的，所述的載體包括但不限于可以作為表達載體使用的任何質粒、病毒和噬菌體。優選的，
所述的載體是質粒和病毒。更進一步的，所述的病毒可以是本領域已知的可用作載體的病
毒，優選的，所述的病毒是腺病毒。 本文所述的術語"表達載體"，其含義是本領域技術人員公知的，并且通常是指含 有一個啟動子順序，能有效地促使插入的目的基因進行轉錄，進而翻譯出該插入基因編碼 的蛋白產物的載體。 本發明第四方面提供了本發明第三方面所述的表達載體在制備用于調節癌基因 和/或抑癌基因在哺乳動物細胞內表達的藥物中的用途。所述的表達載體可以作為所述藥 物的一種組成部分。 本發明第五方面提供了本發明第三方面所述的表達載體在制備用于抑制哺乳動 物腫瘤細胞生長的藥物中的用途。所述的表達載體可以作為所述藥物的一種組成部分。
根據本發明，含有FHL3的藥物，或者含有編碼FHL3的核苷酸序列的表達載體的 藥物，其可以通過本領域已知的任何途徑給予有治療需求的受試者，例如哺乳動物特別是 人類。所述的給藥途徑包括但不限于全身給藥、皮膚局部給藥、病灶區局部給藥等。特別 地，所述的給藥途徑包括但不限于靜脈內、動脈內、肌內、經口、經皮、腹膜內、腫瘤病灶區、 經肺吸入或吹入、胃腸外、經粘膜、經鼻、經直腸。更特別地，所述的給藥途徑包括但不限于 靜脈內和腫瘤病灶區。例如，非限制性地，根據本發明的含有FHL3的藥物或者含有編碼 FHL3的核苷酸序列的表達載體的藥物，其可通過腫瘤病灶區局部注射或者通過靜脈注射給 藥。具體而言，可以參考有關重組質粒和腺病毒的本領域公知的給藥方式給予有治療需求 的受試者，例如參考Clayman GL et al. J Clin Oncol， 1998， 16 :2221-2232和Martin B et al. Cancer Res，1999，59 :1391-1399中的方法通過腫瘤部位局部注射給藥，或者參考Reid T et al. Cancer Gene Ther， 2002， 9 :979-986中的方法通過靜脈注射給藥。以上文獻以其 全部內容通過引用并入本文。 根據本發明，所述的藥物可以是本領域公知的任何可用于給藥的藥物形式，包括 藥物組合物、藥物制劑等。具體地說，例如是用于局部給藥的制劑例如栓劑、軟膏劑、乳膏劑 等；例如是用于胃腸外給藥的制劑，例如局部注射用制劑和全身注射用制劑，具體劑型可以 例如是注射用溶液劑、注射用粉針劑等。對于本發明的實施而言，本發明的藥物優選是用于 胃腸外給藥的制劑，包括但不限于局部注射用制劑和全身注射用制劑，具體劑型包括但不 限于注射用溶液劑和注射用粉針劑。更優選的，所述的藥物是無菌的注射用含水溶液劑，或 者是無菌的用于臨床使用前用注射用水復溶配制的粉針劑，特別是冷凍干燥粉針劑。
另外，根據下文中提供的研究結果，本領域技術人員可以容易地確定在哺乳動物 中使用時有效劑量。通常，治療有效量按受試者的體重計，例如可以是1 X 109至1 X 1014VP/kg體重/天，優選1 X 101Q至1 X 1013VP/kg體重/天，更優選1 X 1011至1 X 1012VP/kg體重/天。所述劑量單位中的"VP"是指病毒顆粒數(Viral Particle)的縮寫。可以將一天的劑量在一天中一次性全部給與受試者，也可以在一天內將需要的劑量分成兩個、三個、四個或更多個小劑量以合適的間隔給藥。所述小劑量可以配制成單元劑量形式，例如每個單元劑量形式含有日總劑量細分適宜次數的相應量。當然，也可以以一定的時間周期給藥，例如一天給藥一次、兩天給藥一次、一周給藥一次、一月給藥一次等。 另一方面，本發明提供的藥物在具體的臨床案例中，它們的具體使用量可因多種因素而可能需要作相應的變化，這些因素包括但不限于受試者病況的嚴重程度，受試者的年齡、性別、體重，給藥途徑，藥物劑型等等。 根據本發明的研究結果，已經發現，通過載體特別是腺病毒獲得的FHL3表達載體能夠有效抑制多種人類腫瘤細胞的生長，并且可以通過調節癌基因和抑癌基因的表達從而抑制多種人類腫瘤細胞的生長。
圖1顯示FHL3哺乳動物細胞表達載體酶切鑒定結果，其中1為DNA標記物；2為pcDNA3 ;3為pcDNA3-FHL3。 圖2顯示FHL3重組腺病毒載體酶切鑒定結果，其中1為DNA標記物；2為pAdeasy-1 ;3為pAdeasy-FHL3。 圖3顯示FHL3重組腺病毒感染ZR75-1細胞后高表達FHL3，其中l為pAdeasy-l ;2為pAdeasy-FHL3。 圖4顯示FHL3重組腺病毒感染腫瘤細胞可抑制該腫瘤細胞的生長，其中A為H印G2 ;B為MCF-7 ;C為H460。 圖5顯示FHL3重組腺病毒感染H印G2細胞抑制其集落形成，其中A為集落形成圖；B為集落形成數比較圖。 圖6顯示FHL3重組腺病毒注射能抑制肝癌細胞株H印G2植入的腫瘤生長。
圖7顯示FHL3重組腺病毒注射的瘤塊中高表達FHL3蛋白，其中l為pAdeasy-l ;2為pAdeasy-FHL3。 圖8顯示FHL3重組腺病毒感染H印G2細胞影響癌基因及抑癌基因的表達，其中1為pAdeasy-1 ;2為pAdeasy-FHL3。 圖9顯示FHL3重組腺病毒注射的瘤塊中影響癌基因及抑癌基因的表達，其中1、pAdeasy-1;2、pAdeasy-FHL3。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施例僅僅是
用于更詳細具體地說明之用，而不應理解為用于以任何形式限制本發明。 本部分對本發明試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性的描述。雖然為
實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡
可能詳細描述。本領域技術人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作
方法是本領域公知的。
實施例1、 FHL3哺乳動物細胞表汰載體和FHL3重組腺病毒載體
(一)、方法 1、FHL3哺乳動物細胞表汰載體的構建 按常規方法從乳腺cDNA文庫(購自美國Clontech公司)中PCR擴增FHL3基因的完整編碼區序列，PCR引物為5' -CGGGATCCATGAGCG AGTCATTTGAC-3'和5' -GCTCTAGATTAGGGCCCTGCCTGGAA-3' ，PCR反應條件為94。C 5min后，94。C lmin，60。C lmin，72。C lmin進行30次循環，最后72°C 7min。分別用BamHI和Xba I酶(購自英國Biolabs公司)在37t:下酶切PCR產物和相應哺乳動物細胞表達載體(pcDNA3，購自美國Invitrogen公司)，酶切后的PCR產物和載體用T4 DNA連接酶(購自美國Promega公司)在12-16t:下進行連接，得到重組載體(其含有CMV啟動子/增強子、FHL3基因的完整編碼區序列、BGH polyA終止信號、氨芐青霉素抗性基因)，將該重組載體轉化大腸桿菌DH5a ，獲得轉化子。提取重組載體，用BamHI和Xba I酶酶切鑒定重組載體；DNA序列測定確定FHL3基因的完整編碼序列是否完全正確；Western印跡分析重組FHL3蛋白是否表達，即用常規方法將蛋白進行SDS-PAGE后，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用兔抗人FHL3抗體(購自美國ProteinTech公司)進行反應，然后用羊抗兔IgG抗體(購自美國Santa Cruz Biotech公司)進行反應和顯色。FHL3是本領域已知的。其中，FHL3基因的完整編碼區DNA序列以及FHL3基因編
碼的氨基酸序列參見下文序列表部分的描述。 2、FHL3重組腺病毒表達載體的構建 按常規方法PCR擴增FHL3基因的完整編碼區序列，PCR引物為5' -GGGGTACCATGAGCGAGTCATTTGAC -3'和5' -CCCAAGCTT TTAGGGCCCTGCCTGGCT-3'，PCR反應條件為94 °C 5min后，94t: lmin，6(TC lmin，72°C lmin進行30次循環，最后72°C 7min。分別用Kpn I和Xbo I酶(購自英國Biolabs公司)在37。C下分別酶切PCR產物和相應腺病毒表達載體(pShuttle-CMV，購自美國Stratagene公司)，酶切后的PCR產物和載體用T4 DNA連接酶(購自美國Promega公司)在12-16"C下進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a ，獲得轉化子。提取重組載體，用Kpn I和Xhol酶酶切鑒定重組質粒是否構建成功；DNA序列測定確定FHL3基因的完整編碼序列是否完全正確；Western印跡分析重組FHL3蛋白是否表達。 獲得上述重組質粒后，用Pmel(購自英國Biolabs公司)在37。C下酶切含有FHL3基因完整編碼序列的pShuttle-CMV載體，切膠回收線性化的片段，回收產物常規轉化含有pAdEasy-l的BJ5183細胞(購自美國Stratagene公司)，涂卡那平板，37。C孵育16-20小時。觀察卡那平板，長出大、小兩種菌落，挑取較小的5個菌落于卡那抗性的培養基中，37t:，200rpm搖床中過夜，提取質粒，PacI(購自英國Biolabs公司)在37"下酶切，0. 7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，含有3. 0kb或4. 5kb大小片段的即表明重組成功。由于BJ5183細胞目的載體產量較低，故將成功重組的載體常規轉化XL-10 Gold感受態細胞(購自美國Stratagene公司)以擴增載體，涂卡那平板，37"C孵育16-20小時，挑取單克隆，所得菌液即為高擴增目的載體的XL-10 Gold細胞。
3、FHL3重組腺病毒載體的包裝和鑒定 Pacl(購自英國Biolabs公司)酶切重組好的腺病毒載體以暴露出pShuttle-CMV載體上的左右末端重復序列(ITR)，等體積酚氯仿抽提以去除酶等雜質，用乙醇沉淀回收DNA，測定濃度后，按公司提供的說明書用轉染試劑1 ipof ectamine 2000 (購自美國Invitrogen公司)轉染AD293細胞(AD293細胞是購自美國Stratagene公司的一種哺乳動物細胞株，由HEK293細胞衍生而來，用常規細胞培養基培養，貼壁能力強，用于產生感染性病毒顆粒)，轉染前一天將AD293細胞接種至24孔板，轉染時細胞密度為70-80 % ，轉染后4-6小時換成5%血清的培養基，繼續培養7-10天，每3-4天更換一次培養基，直到出現明顯的細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)，即細胞腫脹、變圓、漂浮。繼續培養，待完全CPE時收獲病毒輕輕吹打使細胞脫壁，將細胞和上清一并收集于EP管中，在-S(TC和37°C之間反復凍融3次以釋放病毒，2500rpm離心15分鐘以去除細胞碎片和雜質，將上清轉移至新的EP管中，作為種子病毒存于-8(TC備用。同時，快速CPE法測定種子病毒液的感染滴度，具體方法如下將AD293細胞接種于24孔板，培養24小時，細胞密度達到90%時，細胞數為5 X 105細胞/孔，將各孔中的培養液吸出，每孔加入0. 5ml的101至109倍稀釋的病毒液(用完全培養基稀釋)，2小時后換成正常的培養基，培養48小時后觀察CPE情況，選出發生100% CPE的最高稀釋倍數，用以下公式計算病毒滴度
》丄 a (5xl()5細胞/孔)xl0x稀釋倍數
感染滴度(pfuZml)--— -
病毒液體積 取上述病毒液感染ZR75-1等乳腺癌細胞，感染強度(multiplicityofinfection,簡寫為MOI)為50個噬斑形成單位(plaque forming unit,簡寫為pfu) /細胞，前一天將細胞接種于24孔板，感染時細胞密度為80-90% ，感染后2小時換成無病毒的新鮮培養基，48小時后收集細胞，用兔抗人FHL3的特異性抗體(購自美國ProteinTech公司)Western免疫印跡方法檢測FHL3基因的表達情況。表達成功后進行下一步的擴增與純化。
4、FHL3重組腺病毒載體的擴增與純化 將AD293細胞接種于15cm平皿，待細胞密度達到80-90%時，加入病毒液，M0I為2-5pfu/細胞。感染48小時左右細胞出現明顯CPE時，棄上清，用細胞刮輕輕刮下細胞凍存于-80°C 。累積到50-60個平皿時統一純化病毒。 將收集的AD293細胞于-8(TC和37"之間反復凍融3次，2500rpm離心15分鐘去除細胞碎片。配制CsCl密度梯度溶液取30g的CsCl，加PBS(每升水溶液中含NaCl 8g、KC1 0. 2g、Na2HP04 1. 44g、KH2P040. 4g， pH7. 4)至終體積42. 5ml，得密度為1. 5g/ml的CsCl溶液；取15mll. 5g/ml的CsCl，加PBS至終體積21ml，得密度為1. 35g/ml的CsCl溶液；取llml的1. 5g/ml的CsCl，加PBS至終體積20ml，得密度為1. 25g/ml的CsCl溶液。依次將0. 5ml的1. 5g/ml的CsCl溶液、2. 5ml的1. 35g/ml的CsCl溶液、2. 5ml的1. 25g/ml的CsCl溶液加入到12ml超速離心管中，將待純化病毒液加于各管CsCl梯度液上，35000rpm， l(TC，離心1. 5小時，在1. 35g/ml的CsCl溶液和1. 25g/ml的CsCl溶液之間可觀察到白色霧狀病毒帶，收集病毒帶，并與1. 35g/ml的CsCl溶液混合，35000rpm， l(TC ，離心5. 5小時，進一步純化病毒，以Hanks液為透析液在4t:下透析病毒，每2小時更換一次透析液，共更換5次，取出純化的病毒液，即含有FHL3重組腺病毒載體的溶液，加無菌甘油至終濃度為10%，分份包裝，在-7(TC下保存。
5、FHL3重纟目腺病毒純度和滴度的測l定
取24 ill純化的病毒，加入84 ill的PBS禾P 12 的10% SDS，混勻，以108 的PBS加12iU的0% SDS為空白對照，測定260nm和280nm波長處的光吸收值，即0D260nm和OD，，值，據此估算病毒的純度。病毒的純度=0026。 值/0028。 值，該比值> 1.3時，表明病毒純度較高。然后計算病毒顆粒滴度(VP/ml)。以1個0026。 值相當于1. 1X10"病毒顆粒(VP)計算病毒顆粒滴度。病毒顆粒滴度(VP/ml) = OD邪。咖值XI. 1X1012X稀釋倍數。
有限稀釋法測定病毒的感染滴度(IU/ml):取10 iil純化的病毒，加至990 iil含有5% FBS的DMEM培養基中(102稀釋)，混勻后取出100 y l，稀釋于900 y 1含有5% FBS的匿EM培養基中(103稀釋)，以此類推直到1012稀釋。同時將AD293細胞接種于96孔板，50 ii 1/孔，細胞數為1 X 104細胞/孔。然后加入50 iil的105至1012稀釋的病毒液，共做8個稀釋梯度，每個梯度做10個復孔。感染后第10至12天觀察CPE，計數發生CPE的最高稀釋倍數下的CPE孔數，根據以下公式計算病毒的感染滴度
發生CPE的最高稀釋倍數下的孔數
感染滴度(IU/ml戶-x稀釋倍數
此稀釋倍數下感染病毒液總體積 6、哺乳動物細胞的轉染在HEK293細胞(HEK293細胞是購自美國ATCC細胞庫的一種永生化的人胚腎細胞，用常規細胞培養基培養，貼壁能力差)轉染前24h，用含10X新生牛血清的匿EM培養基將細胞接種在細胞培養皿中。接種細胞密度以轉染時細胞密度達90%為宜。按公司提供的說明書用細胞轉染試劑Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen公司)進行轉染。
7、 Western免疫印跡分析 (1) SDS-PAGE電泳將變性的細胞總蛋白離心后以每孔20 y g的總蛋白進行SDS-PAGE電泳；電壓120V，約1. 5h。
(2)轉膜電泳結束后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上；電壓15V，轉移約2h。
(3)封閉5%脫脂奶粉(用TBST溶液配制，TBST溶液為每升水溶液中含Tris2. 42g、 NaCl 8g、 Tween-2010ml， pH7. 6)室溫封閉硝酸纖維素膜lh或4。C封閉過夜。
(4) —抗結合在硝酸纖維素膜上，加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的一抗(兔抗人FHL3抗體，購自美國ProteinTech公司)，室溫輕搖lh， TBST溶液洗膜3次，每次7min。 (5) 二抗結合在硝酸纖維素膜上，加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的辣根過氧化物酶偶聯的IgG(羊抗兔IgG抗體，購自美國Santa Cruz Biotech公司)，室溫輕搖lh，TBST溶液洗膜3次，每次7min。 (6)顯影按公司提供的說明(美國Pierce公司)，用化學發光法顯色5min，壓片顯影。
( 二 )結果 1、FHL3哺乳動物細朐表汰載體和FHL3重纟目腺病毒載體的鑒定
FHL3哺乳動物細胞表達載體和FHL3重組腺病毒載體經酶切、DNA序列測定表明，插入到載體中的FHL3基因的完整編碼區序列完全正確，即FHL3哺乳動物細胞表達載體(pcDNA3-FHL3)經BamHI和Xbal酶切后，可切出大小約840bp的FHL3完整編碼區序列，而相應空載體(pcDNA3)不能切出此條帶(參見圖1);類似地，FHL3重組腺病毒載體(pAdeasy-FHL3)經PacI酶切后，可切出大小約4. 5kb的條帶(參見圖2)，而相應的空載體(pAdeasy-l)不能切出此條帶，表明已重組成功。
2、FHL3重纟目腺病毒的純度和滴度測l定 快速CPE法測定FHL3重組腺病毒和相應對照重組腺病毒的滴度分別為4. 2X 108pfu/ml和4. OX 108pfu/ml。 FHL3重組腺病毒和相應對照重組腺病毒經擴增純化后的純度分別為1. 33和1. 34，說明純度較高。純化后的重組腺病毒和相應對照重組腺病毒的顆粒滴度分別為1. OX 1012VP/ml和1. 2X 10"VP/ml，用有限稀釋法測定的感染滴度分別為3. 2X 10lclIU/ml和4. 3X 1010IU/ml。 3、FHL3哺gUM勿細朐表汰載體或重會目腺病毒介導的FHL3蛋白的表汰將FHL3哺乳動物細胞表達載體轉染HEK293細胞或用50M0I重組腺病毒感染人
乳腺癌ZR75-1細胞，用FHL3抗體進行Westernblot，結果表明轉染或感染后的細胞均能表
達FHL3蛋白(參見圖3，其中代表性地顯示FHL3重組腺病毒感染ZR75-1細胞后能高表達
FHL3， FHL3哺乳動物細胞表達載體轉染HEK293細胞后有類似結果，但數據未列出)。 實施例2、 FHL3抑制體外培養的多種腫瘤細朐的牛長( 一 )方法 用結晶紫實驗測定FHL3對多種腫瘤細胞生長的影響，步驟如下用0. 25%胰酶(購自美國Sigma-Aldrich公司)消化多種腫瘤細胞，包括乳腺癌細胞株(MCF7、 ZR75-1)、肝癌細胞株(H印G2、 S匪C7721)、肺癌細胞株(H460)。細胞計數后，稀釋至合適的濃度，將0. 5ml細胞液放入24孔板中，使每孔中的細胞數約為10， 000個。按實施例1中所述方法將FHL3哺乳動物細胞表達載體轉染這些腫瘤細胞或用20-100M0I的FHL3重組腺病毒感染這些腫瘤細胞，培養1-4天后，除去培養基，每孔加入0. 5ml的1 %戊二醛(固定液)，靜止15-20min，去掉戊二醛。每孔加入O. 5ml結晶紫(購自美國Sigma-Aldrich公司)，放置15min (結晶紫儲存于室溫)，用自來水浸沒并沖洗幾次，蒸餾水室溫浸沒15min，棄盡蒸餾水，在空氣中干燥24孔(需要時過夜)，每孔加入0. 5ml的sorenson's溶液(每升水溶液中含有:枸櫞酸鈉8. 967g、0. IN HC1 0. 195L、90%乙醇0. 5L)，在水平搖床上搖動30min，每孔取100 iil至96孔板，在590nm的波長處測定OD值，以OD值代表細胞相對生長速率。
(二)結果 結果表明，FHL3的表達能抑制上述所有腫瘤細胞的生長(參見圖4，其代表性地顯示FHL3重組腺病毒感染乳腺癌細胞株MCF7、肝癌細胞株H印G2和肺癌細胞株H460能抑制這些細胞的生長，其它細胞株有類似結果，但數據未列出)。
實施例3、 FHL3抑制多種腫瘤細胞的錨定不依賴生長
( 一 )方法 用軟瓊脂實驗測定FHL3對腫瘤細胞錨定不依賴生長的影響。首先，按實施例1中所述方法將FHL3哺乳動物細胞表達載體轉染腫瘤細胞或用20-100M0I的FHL3重組腺病毒感染腫瘤細胞，包括乳腺癌細胞株(MCF7)、肝癌細胞株(H印G2)、肺癌細胞株(H460)，然后采用60mm2細胞培養皿，在培養皿中加入3ml含0. 7%瓊脂的DMEM培養基(購自美國Invitrogen公司)，凝固后在其上加入3ml含上述20， 000個腫瘤細胞和0. 25%瓊脂的DMEM培養基，每組細胞設3個平行樣，培養3周后在倒置顯微鏡下計數每組細胞的集落形成數。
(二)結果
結果表明，FHL3的表達能抑制上述所有腫瘤細胞的集落形成(參見圖5，其代表性地顯示FHL3重組腺病毒感染肝癌細胞株H印G2能抑制細胞的錨定不依賴生長，其它細胞株有類似結果，但數據未列出)。 實施例4、 FHL3抑制裸鼠腫瘤細朐'的牛長
( 一 )方法 按實施例1中所述方法將FHL3哺乳動物細胞表達載體轉染肝癌細胞株H印G2。
將1 X 107個上述轉染的細胞或未轉染的細胞分別接種于5周齡雌性BALB/c裸鼠背部右后側，共分4組，即FHL3哺乳動物細胞表達載體轉染的腫瘤細胞組和相應的空載體轉染的腫瘤細胞組；注射FHL3重組腺病毒的腫瘤細胞組和注射相應對照病毒的腫瘤細胞組。每組各10只裸鼠。對于腺病毒組而言，待腫瘤生長到長約lcm時，在腫瘤部位直接注射腺病毒，注射劑量為1X1(TVP。觀察接種部位有無滲出、腫瘤生長及裸鼠狀況。測量腫瘤的最大直徑L(cm)和最小直徑D(cm)，按如下公式計算各組腫瘤體積V(cm3)的大小腫瘤體積(cm3) =L2XD Xl/2。待細胞移植約10周，處死各組動物，取部分瘤塊，用冰冷的0. 9%生理鹽水沖洗干凈，放入5ml離心管中，立即加入lml預冷至0t:的裂解液(1XPBS，1% NP-40，0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS， 1/1000的蛋白酶抑制劑)，在冰浴中勻漿，按實施例1中的Western免疫印跡方法分析瘤塊中FHL3蛋白的表達。
(二)結果 裸鼠開始出現瘤塊后，每周測量瘤塊大小，計算瘤塊體積。結果表明，FHL3能抑制裸鼠中上述腫瘤細胞的生長(參見圖6，其代表性地顯示FHL3重組腺病毒注射能抑制肝癌細胞株H印G2植入的腫瘤生長)。Western免疫印跡分析表明，注射FHL3重組腺病毒的瘤塊中高表達FHL3蛋白，而注射相應對照腺病毒的瘤塊中低表達FHL3蛋白(參見圖7)。
實施例5、FHL3能抑制腫瘤細胞中癌基因的表達而促進抑癌基因的表達
( 一 )方法 將1 X 106個細胞接種到細胞培養板中，然后將FHL3哺乳動物細胞表達載體轉染腫瘤細胞株或用100M0I的FHL3重組腺病毒感染腫瘤細胞株，這些腫瘤細胞株包括乳腺癌細胞株MCF7和ZR75-1、肝癌細胞株H印G2和S匪C7721、肺癌細胞株H460。將這些腫瘤細胞接種到細胞培養板中，培養24小時后，收集細胞，按實施例1中的方法分別用FHL3抗體(兔抗人FHL3抗體，購自美國ProteinTech公司)、p21(兔抗人p21抗體，購自美國Santa CruzBiotech公司)和pl5抑癌蛋白抗體(兔抗人pl5抗體，購自美國Santa Cruz Biotech公司)、c-myc癌蛋白抗體(鼠抗人c-myc抗體，購自美國Santa Cruz Biotech公司)進行Western免疫印跡分析，檢測上述腫瘤細胞中相應蛋白的表達情況。 另外，取實施例4中的裸鼠腫瘤組織，用Western免疫印跡分析檢測腫瘤組織中p21和c-myc蛋白的表達情況。
(二)結果 結果表明，FHL3均在上述腫瘤細胞中表達，FHL3的過量表達抑制了 c-myc癌蛋白的表達，但升高了 p21和p15抑癌蛋白的表達(參見圖9，其代表性地顯示FHL3重組腺病毒感染肝癌細胞株H印G2后FHL3、 c-myc、 p21和p15蛋白的表達情況，其它細胞株有類似結果，但數據未列出)。 另外，將裸鼠腫瘤組織用Western免疫印跡分析檢測p21和c-myc蛋白的表達情況，結果與上述體外實驗結果一致(參見圖10)。 盡管本發明已進行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發明的精神和范圍的條件下，可進行各條件的適當變化。可以理解，本發明不限于所述實施方案，而歸于權利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。
序列表
〈110〉中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所〈120〉FHL3在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途〈210〉1〈211〉843〈212〉DNA〈220〉
〈223〉FHL3基因的完整編碼區〈400〉1
60
120
180
240
300
360
420
■
540
600
660
720
780
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cagggcttcg taccggatgg agaccaagtg ctctgccagg gctgtagcca ggcagggccc840 ta a
843 〈210>2 〈211>280 〈212>PRT 〈220〉 〈223〉FHL3基因編碼的氨基酸序列 〈400>2 MSESFDCAKC NESLYGRKYI QTDSGPYCVP CYDNTFANTC AEC亂IGHD SRELFYEDRH60 FHEGCFRCCR CQRSUVDEPF TCQDSE1XCN DCYCSAFSSQ CSACGETVMP GS肌EYGGQ120 TWHEHCFLCS GCEQPLGSRS FVPDKGAHYC VPCYENKFAP RCARCSKTLT QGGVTYRDQP180 WHRECLVCTG CQTPLAGQQF TSRDEDPYCV ACFGELFAPK CSSCKRPIVG LGGGKYVSFE240 DRHWHHNCFS CARCSTSLVG QGFVPDGDQV LCQGCSQAGP280
權利要求
FHL3在制備用于調節癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物細胞內表達的藥物中的用途。
2. 根據權利要求1所述的用途，其中所述的藥物用于抑制哺乳動物細胞內癌基因的表 達和/或促進哺乳動物細胞內抑癌基因的表達。
3. 根據權利要求1或2所述的用途，其中所述的哺乳動物細胞選自在體細胞和離體細胞。
4. FHL3在制備用于抑制哺乳動物腫瘤細胞生長的藥物中的用途。
5. 根據權利要求4所述的用途，其中所述的腫瘤選自惡性腫瘤，包括但不限于乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細 胞肺癌)、卵巢癌、胃癌、子宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌(包括鱗狀細胞癌)；中樞和周圍神經系統的腫瘤，包括但不限于星形細胞瘤和神經膠質瘤；以及 其他腫瘤，包括但不限于黑素瘤。
6. 根據權利要求5所述的用途，其中所述的腫瘤選自乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結腸 癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌。
7. —種表達載體，其含有編碼FHL3的核苷酸序列。
8. 根據權利要求7所述的表達載體，其中所述的載體選自質粒、病毒和噬菌體。
9. 根據權利要求8所述的表達載體，其中所述的載體是病毒。
10. 根據權利要求9所述的表達載體，其中所述的載體是腺病毒。
11. 權利要求7至10任一項所述的表達載體在制備用于調節癌基因和/或抑癌基因在 哺乳動物細胞內表達的藥物中的用途。
12. 權利要求7至IO任一項所述的表達載體在制備用于抑制哺乳動物腫瘤細胞生長的 藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及FHL3在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。具體地說，本發明涉及FHL3在制備用于調節癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物細胞內表達的藥物中的用途，以及FHL3在制備用于抑制哺乳動物腫瘤細胞生長的藥物中的用途。本發明還涉及一種含有編碼FHL3的核苷酸序列的表達載體，以及所述表達載體在制備用于調節癌基因和/或抑癌基因在哺乳動物細胞內表達的藥物中的用途，和表達載體在制備用于抑制哺乳動物腫瘤細胞生長的藥物中的用途。本發明的表達載體能夠有效抑制多種人類腫瘤細胞的生長，并且可以通過調節癌基因和抑癌基因的表達從而抑制多種人類腫瘤細胞的生長。
文檔編號A61K48/00GK101744848SQ20081018243
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月5日 優先權日2008年12月5日
發明者丁麗華, 嚴景華, 葉棋濃, 楊曉, 牛暢, 秦璽, 程龍, 黃翠芬 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所