專利名稱：：Ptd-sod融合蛋白在抗疲勞產品中的應用的制作方法
技術領域：
：該發明涉及融合蛋白領域，尤其涉及蛋白轉導結構域(ProteinTransductionDomain，PTD)連接超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)的融合蛋白PTD-SOD在抗疲勞產品中的應用。
背景技術：
：過量的氧自由基是導致肌肉疲勞的重要原因[']，因為過量的氧自由基能產生氧化脅迫，破壞機體內的DNA、蛋白質和脂肪等物質，抑帝噺陳代謝相關酶類的活性，造成細胞生理功能的異常、機體組織的損傷和代謝水平下降。例如，未受訓練的大鼠在固定跑臺上跑到筋疲力盡時，骨骼肌中氧自由基含量增加2-3倍；小鼠游泳至力竭時，肝臟中氧自由基含量明顯增加[2]。超氧化物歧化酶(SuperoxideDismiitase，SOD)是生物體內的一種抗氧化酶，它能特異性催化體內最主要的氧自由基一-超氧陰離子自由基將其歧化為過氧化氫和氧氣，起到消除氧自由基的作用，有助于增強機體代謝從而消除疲勞。因此適當添加的外源性SOD,可以彌補內源性消除過量氧自由基的不足的S0D，可望起到一定的抗疲勞作用。但是SOD分子量達32000，很難順利透過細胞膜，而疲勞機體的細胞產生氧自由基主要來源于細胞內部的線粒體。單純給與SOD，只能清除細胞外部的氧自由基而不能有效消除存在于細胞內部的、造成疲勞的、氧自由基。因此SOD作為有效成分添加到抗疲勞產品之中存在不足之處。
發明內容本發明目的是提供一種有利于減緩疲勞的PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產品中的應用。本發明的技術方案如下將PTD-SOD融合蛋白應用于制備抗疲勞的產品，所述的PTD-SOD為蛋白轉導結構域連接超氧化物歧化酶的融合蛋白PTD-SOD。PTD是一種新近發現的能在蛋白轉導過程中高效穿過細胞膜的蛋白質結構域，它能將與其共價連接的蛋白質和DNA等分子跨膜導入幾乎所有的組織和細胞，甚至可以通過血腦屏障，轉導效率很高而且對細胞沒有損傷。PTD系統被認為是一種很有前途的運載工具，在基礎醫學研究和臨床治療方面都有著非常廣泛的應用前景。本發明通過PTD與SOD的融合，解決SOD跨膜進入細胞內部的問題。該手段采用細胞內的自然機制，有效避免外源物質對靶細胞的損害，并且該方法能將SOD分子大量遞送進入細胞，阻斷氧自由基的連鎖反應，有助于保護細胞免于氧化損傷，并使機體疲勞得以減輕乃至恢復。圖1是與不同濃度PTD-SOD共培養的4小時的Hela細胞的胞內酶活圖。具體實施例方式在抗疲勞產品或非抗疲勞產品中加入PTD-SOD;其添加的劑量以服用的劑量范圍是1002000SOD活力單位/日Kg體重為準。所述的PTD-SOD為蛋白轉導結構域(ProteinTransductionDomain，PTD)連接超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)的融合蛋白PTD-S0D，將上述含有PTD-S0D的產品單獨使用或與現有的抗疲勞產品混合使用作為抗疲勞產品。本發明的融合蛋白PTD-SOD可采用多種給藥方式，如注射、口服、涂抹等方式進行給藥，以增強機體的抗疲勞能力。實施例l:單次服用PTD-SOD提高抗疲勞能力。經過一周運動訓練后挑選出的7組小鼠，每組8只；其中l組作為空白對照，給藥的6組分別在運動前半小時舌面喂服和腹腔注射20、40和60S0D活力單位的PTD-S0D。進行游泳運動90分鐘后，測定小鼠的血清乳酸、尿素氮和乳酸脫氫酶三項指標。結果表明，舌面喂服和腹腔注射的兩種給藥組的血清乳酸(如表l)、尿素氮(如表l)都大幅下降，而乳酸脫氫酶活力則顯著增強(如表l)，這些作用隨著給藥量增加而增強，表明PTD-S0D的抗疲勞效果顯著(如表l)。表i.游泳實驗后小鼠的加.液指標<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>舌面喂服2480±183.09±0.620.79±0.20PTD"S0D(60U)-鵬注射2480±1812.3±1.202.23±0.32實施例2:長期服用PTD-SOD提高抗疲勞能力。經過一周運動訓練后挑選出的小鼠分成兩組，每組10只，其中一組連續一個月每天舌面喂服100單位PTD-S0D(PTD-S0D組)，另一組為空白。上述兩組小鼠的耐力游泳時間的實驗結果顯示為空白組10.49分鐘，PTD-S0D組22.95分鐘，PTD-SOD組的游泳衰竭時間比空白組提高了119%。實驗一如圖1所示，本實驗說明本發明的融合蛋白PTD-S0D的跨膜轉導能力明顯高于SOD，能夠有效地提高人Hela細胞的胞內SOD活力。為了研究本發明的融合蛋白PTD-SOD是否跨入Hda細胞內部，并比較本發明的融合蛋白PTD-S0D和SOD對細胞內SOD酶活力的影響。取Hela細胞分別培養在含有700、1400、2800U/ml的PTD-SOD或者SOD溶液中4h后，收集并清洗細胞，檢測細胞裂解液的SOD活力；對照組為PBS。如圖1所示，實驗結果表明，本發明的融合蛋白PTD-S0D使Hela細胞內的SOD酶活力從對照組的20.9U/mL分別提高到23.8，26.4禾Q28.2U/mL，效果最好的一組細胞內的SOD酶活力是對照組的1.35倍(pO.Ol)，而SOD組細胞內SOD酶活力基本沒有變化。實驗證明PTO-SOD能進入細胞內并顯著提高細胞內SOD的酶活力。實驗二1.實驗方法將實驗小鼠分為三組，每組8只。其中一組為對照組，另有兩組為PTD-SOD給藥組，給藥劑量分別為100U和400U，灌胃2小時后進行負重游泳試驗。負重游泳試驗方法如下把小鼠放入水溫為(28±0.5)°C，尺寸為50cmX40cmX30cm的水箱中游泳。小鼠尾根部負荷5%體重量的鉛皮，每只水箱一次放入6只小鼠。小鼠連續3次沉入水中，每次超過10s不能浮出水面為力竭，記錄小鼠游泳時間。用秒表記錄自游泳開始至力竭死亡的時間，該時間為小鼠的負重游泳時間(min)。與游泳致疲勞有關的血液生化指標---乳酸、乳酸脫氫酶、血清尿素氮和葡萄糖的測定方法為小鼠摘眼球采血0.5mL，置4-C冰箱約3h，2000r/min離心15min，分離血清后用全自動生化分析儀測定。肝腦組織的處理方法為處死小鼠后，迅速分離肝和腦組織，用預冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重，制成P/。的勻漿液，3500r/min離心，取上清4T:保存備用上述方法分離得到的血清和肝腦組織中的SOD活力采用黃嘌呤氧化酶-黃嘌呤體系測定。實驗數據用均數標準差(±s)表示，采用單因素方差分析進行統計學處理,進t亍配對或組間t檢驗。2.實驗結果2.1SOD對小鼠游泳能力的影響PTD-S0D給藥組小鼠相對于對照組小鼠游泳時間從4.40±0.64min提高到10.36士1.79min，小鼠的游泳時間顯著提高(P〈0.01)，表明PTD-SOD有提高小鼠游泳能力的作用。2.2小鼠疲勞程度對比測定小鼠疲勞相關的血液指標(如表2)。結果發現與對照組比較，游泳前2h給予100UPTD-S0D的小鼠游泳后血清中乳酸從2.64mmol/L降低到1.64醒ol/L，乳酸脫氫酶從897.4咖ol/L升高到1385.5mmol/L，二者的變化都非常顯著(P〈0.01);而血清尿素氮從IO.83mmol/L降低到9.99mmol/L，葡萄糖水平則從3.51mmol/L增加到3.99mmol/L，二者的變化顯著(P〈0.05)。2.3小鼠運動后各器臟SOD活力對比PTD-SOD對小鼠血清、肝和腦組織中的S0D活力的影響如表3。與對照組比較,給予100UPTD-S0D的小鼠血清中的S0D活力從94.22U升高到126.20U，非常顯著地提高(P<0.01)，而肝腦組織中的S0D活力分別從220.64U提高到233.22U和從190.80U提高到203.39U，提高顯著(P〈0.05);給予400UPTD-SOD4h后，小鼠血清、肝、腦組織中的S0D活力分別增加到136.60U，343.32U和284.IOU，增加都非常顯著(P〈0.01)。實驗結論力竭運動期間，肌肉對氧的消耗量將增力C1200倍，其中有2%5°/。的氧通過電子呼吸鏈轉化成超氧陰離子自由基，這就意味著運動強度和運動持續的時間與自由基的產生成正比例。乳酸、乳酸脫氫酶、血清尿素氮和葡萄糖是與游泳致疲勞有關的血液生化指標w。以上實驗結果如表2和表3顯示，PTD-SOD可能是通過降6低運動后乳酸水平和血清尿素氮增量,提高乳酸脫氫酶活性及葡萄糖含量，從而達到抗疲勞效果，增加小鼠的游泳時間。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>"P<0.01,*P〈0.05vscontrol<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>參考文獻卩]LeonardoF.Ferreira.andMichaelB.Reid，Muscle-derivedROSandthiolregulationinmusclefatigue,Jo"wa/^Mpp/'W/%'ofogy;104:853-860,2008.侯香玉.運動對自由對戈謝的影響[J].沐,邦學U991，4:29-35.龔夢鵑，f:《為，劉新民.人小鼠游泳實驗方法的研究概況[J].屮/f比SS"學^i志2005,15:311-314。對照組PTD"SOD(100U)PTD"S0D(側)權利要求1.一種PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產品中的應用，其特征在于所述的PTD-SOD為蛋白轉導結構域連接超氧化物歧化酶的融合蛋白PTD-SOD，并將PTD-SOD應用于制備抗疲勞的產品。2、根據權利要求l所述的PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產品中的應用，其特征在于在抗疲勞產品中加入PTD-S0D，其添加的劑量以服用的劑量范圍是1002000SOD活力單位/日Kg體重為準。3、根據權利要求1或2所述的PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產品中的應用，其特征在于PTD、SOD二者以肽鍵連接，連接發生在任何不明顯影響SOD活性的部位。4、根據權利要求1或2所述的PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產品中的應用，其特征在于所述抗疲勞產品的給用方式為注射、口服或局部涂抹。全文摘要本發明涉及一種PTD-SOD融合蛋白在抗疲勞產品中的應用，所述的PTD-SOD為蛋白轉導結構域連接超氧化物歧化酶的融合蛋白PTD-SOD，并將PTD-SOD應用于制備抗疲勞的產品。本發明產品可以提高細胞內SOD的活力，能夠有效地保護和修復因疲勞產生的自由基損傷的細胞。它可用作抗疲勞食品或者藥物的有效成分，具有保護和修復自由基損傷的細胞、提高機體抵抗疲勞能力的功效。文檔編號A61K38/44GK101554474SQ200810174189公開日2009年10月14日申請日期2008年11月6日優先權日2008年11月5日發明者劉樹滔,楊元德,饒平凡申請人:武漢炎森科技股份有限公司