專利名稱：：一種三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用。
背景技術：
：近年來，隨著免疫學基礎理論研究的深入，以及抗原提純技術和基因工程技術的迅速發展，出現了多種DNA重組疫苗、合成肽疫苗等，這些新型疫苗具有純度高、分子量小、特異性強，安全性好等優點。但迄今為止，開發成功的相關疫苗卻為數甚少。其原因主要是純化后的抗原免疫原性弱，單獨使用難以誘導機體產生有效的免疫應答。解決這一關鍵問題的有效途徑是使用佐劑。自上世紀20年代Glenny應用氫氧化鋁(明礬)作為免疫佐劑以來，鋁膠佐劑因其低毒性而仍是至今唯一通過FDA批準的能用于人的佐劑。但是它存在一些無法克服的缺點(1)對人免疫缺陷病毒(fflV)、丙型肝炎病毒(HCV)、單純皰滲病毒(HSV)、流感病毒以及吸血蟲病、百曰咳和傷害的抗原無免疫佐劑性效果；(2)鋁膠制備過程，質量標準難以標化；(3)只能誘導體液免疫，不能誘導細胞介導免疫反應后者對于機體<特別是對細胞內寄生病原體(病毒、原蟲等)以及腫瘤產生免疫力>尤為必要，遠遠不能滿足新型疫苗的發展要求。為此，近年來各國科研工作者為尋找新的免疫佐劑開展了廣泛的研究，并取得了一定的進展。30年代佐劑的研究達到了第一個高潮，以白油為佐劑的研究風靡全世界，但是，隨之而來的是副作用之強烈、致癌物質的危害。20世紀卯年代，以蜂膠為代表的新型佐劑盡管能全面啟動細胞免疫系統，減少應激，但存在著免疫期較短，在常溫下保存易發生變色、沉淀、形成結塊、副作用大等一系列缺點。近年來，各國科研工作者對免疫刺激復合體(ISCOM)、細胞因子、天然物質等免疫佐劑作用開展了廣泛的研究，并取得了一定的進展。但由于存在不同程度的毒副作用或安全隱患等一些不可避免的缺點，限制了它們的實際應用。因此，迫切需要開發安全、高效的新型免疫佐劑。
發明內容本發明提供了一種三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用，釆用三七莖葉總皂苷為主要有效成分制備的免疫佐劑可以顯著地增強抗原的免疫原性，對機體免疫功能有廣泛的調節作用，能誘導Thl和Th2免疫應答，免疫佐劑活性優于至今唯一人用的免疫佐劑氫氧化鋁膠，而且具有生產成本低、無毒的效果。本發明釆用了以下技術方案一種三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用。所述的三七莖葉總皂苷是從五加科植物三七"otog/"^wg(Burk.)F.H.Chen的干燥莖葉中提取、分離得到。本發明三七莖葉總皂苷的制備過程如下步驟一，將五加科植物三七尸朋ox"otogiraewg(Burk,)F.H.Chen的莖葉粉碎后形成三七莖葉粗粉；步驟二，將三七莖葉粗粉通過乙醇進行回流提取，然后將乙醇提取液進行減壓回收乙醇，濃縮；步驟三，將濃縮后的乙醇提取液浸膏用水進行混懸，然后用極性較小的有機溶劑進行萃取，萃取體積為水懸液的1/3,當萃取后的萃取液I接近無色時合并萃取液I，減壓回收極性較小的有機溶劑，濃縮萃取液l;再用極性較大的有機溶劑進行萃取，當萃取后的萃取液n接近無色時合并萃取液n，減壓回收極性較大的有機溶劑，濃縮萃取液n,將濃縮后的極性較大的有機溶劑萃取液n的浸膏在大孔樹脂柱中進行色譜分離，用水洗去水溶性雜質，再用醇溶液為洗脫劑進行洗脫，收集醇洗脫液，減壓回收醇溶液，濃縮，并干燥，得到三七莖葉總皂苷。本發明步驟二中乙醇的濃度為80%,回流提取三次，第一次提取2小時，第二次和第三次均提取1.5小時。本發明步驟三中極性較小的有機溶劑為石油醚、乙醚或氯仿。本發明步驟三中極性較大的有機溶劑為正丁醇或正戊醇。本發明步驟三中大孔樹脂柱為D101或AB-8大孔樹脂柱，醇溶液為濃度75%-95°/的甲醇或乙醇。本發明具有以下有益效果(1)本發明的三七莖葉總皂苷是從五加科植物三七wotog/raewg(Burk.)F.H.Chen的干燥莖葉中提取、分離得到，由于莖葉價格便宜，而且比較常見，因此采用三七干燥莖葉制備的三七莖葉總皂苷的價格也比較便宜，這樣應用三七莖葉總皂苷制備免疫佐劑，可以有效地降低制備免疫佐劑的成本。(2)三七莖葉總皂苷藥理作用廣泛，毒副作用較小。本發明中三七莖葉總皂苷是從五加科植物三七的干燥莖葉中分離得到的，其分離得到的總皂苷具有鎮痛、降血脂、抗心律失常、抗炎、抗衰老、增強力等作用，且毒副作用較小。長期毒性試驗表明，大鼠按lg/kg、3g/kg、5g/kg連續用藥6個月，一般狀態無明顯影響，血液學檢査無明顯影響，病理組織學檢查各臟器未見明顯病理變化。溶血性試驗表明，三七莖葉總皂苷引起兔紅細胞50%溶血濃度大于2mg/mL,其在臨床應用濃度下基本沒有溶血作用。(3)三七莖葉總皂苷與氫氧化鋁佐劑比較還有如下優點1)三七莖葉總皂苷對注射動物的部位刺激性較小。例如，用含三七莖葉總皂苷的卵清白蛋白(OVA)溶液后腿皮下注射小鼠，未見局部刺激反應和全身不良反應。而用含氫氧化鋁的OVA溶液后腿皮下注射小鼠，大部分小鼠都出現局部刺激反應，嚴重者注射部位由于小鼠的抓咬等還會出現潰爛和全身不良反應。2)三七莖葉總皂苷可以增強機體的細胞免疫應答反應，而氫氧化鋁卻無此特性。3)三七莖葉總皂苷和氫氧化鋁均能誘導機體的體液免疫應答反應，但氫氧化鋁只能誘發Th2免疫應答，不能誘發Thl免疫應答，三七莖葉總皂苷即能誘發Th2免疫應答，又能誘發Thl免疫應答，具有更廣泛的體液免疫作用。4)三七莖葉總皂苷在水、醇溶液中均能完全溶解，長期保存也無沉淀產生，其各種劑型穩定性較好，因此以三七莖葉總皂苷為佐劑有效成分制備疫苗的方法簡便，所制備疫苗的質量容易控制，可低溫保存，延長疫苗的有效期。而以氫氧化鋁為佐劑的疫苗則不能低溫凍結，否則會被破壞膠態，因此，疫苗的有效期較短，儲藏條件嚴格，質量不易控制。5)三七莖葉總皂苷藥理作用廣泛，除了有免疫佐劑作用外，還有抗衰老、抗炎、增強免疫力等作用。因此三七莖葉總皂苷制備成免疫佐劑作用于機體后，除了具有免疫佐劑作用，還對機體起到保健作用，對于體質虛弱的機體非常有利。而氫氧化鋁只能起到免疫佐劑作用，無保健功能。圖1為三七莖葉總皂苷體外對分裂原誘導小鼠脾細胞增殖反應影響的條形圖圖2為三七莖葉總皂苷對分裂原誘導OVA免疫小鼠脾細胞增殖反應影響的條形圖(*尸<0.05，**P<0.01，***/><0.01vsOVA對照組);(a戶<0.05，aa戶<0.01，aaaJ°<0.01vsAlum/OVA組)圖3為三七莖葉總皂苷對OVA免疫小鼠血清中特異性抗體IgG、IgGl和IgG2b抗體水平影響的條形圖(><0.05，"P<0.01，*"<0.01vsOVA對照組)；(ai><0.05，aai><0.01，aaai><0.01vsAlum/OVA組)具體實施例方式本發明所述的三七莖葉總皂苷是從五加科植物三七"otog/"""g(Burk.)RH.Chen的干燥莖葉中提取、分離得到，它的具體的制備過程如下步驟一，將五加科植物三七"otog/"se"g(Burk.)F.H.Chen的莖葉粉碎后形成三七莖葉粗粉；步驟二，將三七莖葉粗粉通過濃度為80%乙醇進行回流提取提取三次，第一次提取2小時，第二次和第三次均提取1.5小時，然后將乙醇提取液進行減壓回收乙醇，濃縮；步驟三，將濃縮后的乙醇提取液浸膏用水進行混懸，然后用極性較小的有機溶劑進行萃取，極性較小的有機溶劑為石油醚、乙醚或氯仿，萃取體積為水懸液的1/3，當萃取后的萃取液I接近無色時合并萃取液I,減壓回收極性較小的有機溶劑，濃縮萃取液l;再用極性較大的有機溶劑進行萃取，極性較大的有機溶劑為正丁醇或正戊醇，當萃取后的萃取液n接近無色時合并萃取液n，減壓回收極性較大的有機溶劑，濃縮萃取液n，將濃縮后的極性較大有機溶劑萃取液n的浸膏在大孔樹脂柱中進行色譜分離，大孔樹脂柱為D101或AB-8大孔樹脂柱，用水洗去水溶性雜質，再用濃度為75%-95%的甲醇或乙醇為洗脫劑進行洗脫，收集醇洗脫液，減壓回收醇溶液，濃縮，并干燥，得到三七莖葉總皂苷。下面通過實驗來進一步說明三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用。實施例一三七莖葉總龜苷中龜苷含量的測定(1)對照品和供試品溶液制備精密稱取在6(TC減壓干燥至恒重的人參皂苷Rbl對照品2.48mg于25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，制備成每mL含0.992mg的對照品溶液。精密稱取三七莖葉總桌苷25.6mg于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，制備成每mL含1.024mg的供試(2)線性關系的考查精密吸取0.5，1,1.5，2,2.5,3.0mL的對照品溶液，分別置于10mL具塞試管中，揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，在60。C水浴中加熱15min，立即置冷水中冷卻，加入冰醋酸5.0mL搖勻，放置15min，相應試劑隨行空白對照，在波長560nm處測定吸收度A，以光吸收度為橫坐標，以相應具塞試管人參皂苷Rbl的濃度(mg/mL)為縱坐標，繪制標準曲線。求回歸方程為Y=0.03865X-0.00015,r=0.9994。結果表明人參皂苷Rbl含量在0.0083mg/mL-0.0496mg/mL之間，有良好線性關系。(3)精密度和加樣回收率試驗吸取供試品溶液lmL，按本實例(2)中所述方法顯色，連續測定A值六次，RSD=0.43%,說明精密度良好。精密稱取同一批次的三七莖葉總皂苷6份，制備成供試品溶液，精密加入不同體積的對照品溶液，進行加樣回收率試驗，平均回收率為99.3%,RSD為3.4。/。。(4)穩定性和重現性試驗吸取供試品溶液lmL，按本實例(2)中所述方法顯色，每隔5分鐘測定一次A值，共測定6次，RSD=0.49%，說明在30分鐘內穩定性良好。取同一批次的三七莖葉總皂苷6份，制備成供試品溶液，按本實例(2)中所述方法顯色，測定吸光度，并用回歸方程計算含量，計算得變異系數RSD《。/。，符合要求，該方法重現性好。(5)樣品含量測定精密稱取三七莖葉總皂苷樣品6份，按本實例(1)中所述方法制備供試品溶液，精密吸取lmL的供試品溶液，按本實例(2)中所述方法顯色，依法測定吸光度，并用回歸方程計算含量，結果見表l。表l三七莖葉總皂苷中皂苷的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(6)含量限度因三七莖葉總皂苷的免疫佐劑活性與其不同成分的復合作用及皂苷的含量密切相關，提取工藝不同、藥材在釆收過程中的不確定性等均能影響其藥效的發揮，為確定其藥效的穩定性，以6份樣品平均含量的80%為下限，120%為上限，限定其含量范圍為45%-67%。實施例二溶血性測定以真空釆血管從兔心臟采血，置盛有玻璃珠的三角瓶中，輕輕振搖15min，去除纖維蛋白，加二倍量的生理鹽水進行洗滌，2000r/min離心10min，洗滌3次，紅細胞懸浮液用生理鹽水稀釋成2%。取上述三七莖葉總皂苷，用0.45|im微孔濾膜過濾后，用生理鹽水倍比稀釋制成0.25mg/mL-5mg/mL稀釋液，并設四個重復，將不同濃度供試品溶液各取2mL，分別加2mL2。/。的紅血球懸浮液于試管中，混勻，并以生理鹽水和蒸餾水分別做最大和最小溶血對照。將上述各試管置37。C恒溫水浴鍋培養lh后，離心，取上清，在412nm測定吸光度，各組的吸收值減去生理鹽水對照組的吸收值就可以表示溶血性，按下面的公式計算其溶血率。公式:溶血率氣T廣To)/(T腿-T。)x100。Tmax:陽性對照蒸餾水作用組的吸光度；To:生理鹽水作用組吸光度；TV.不同濃度的三七莖葉總皂苷作用時測得的吸光度。結果見表2。表2三七莖葉總皂苷對兔紅細胞的溶血活性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表2可見，三七莖葉總皂苷濃度為2.0mg/mL和l.Omg/mL時兔紅細胞的溶血百分率分別為14.66%和0.16%。說明三七莖葉總皂苷的溶血性很小。本發明利用三七莖葉總皂苷的溶血性很小的特性在制備免疫佐劑時可以降低免疫佐劑的溶血性。實施例三體外淋巴細胞轉化試驗取IOO^iL脾細胞懸液(1x10"個/mL)加96孔板內，每份樣品12孔，其中4孑L力口ConA(終濃度為5ng/rnL),4孔力口LPS(終濃度10pg/mL),4孔加100nLRPMI1640液，各孔再加入不同濃度的三七莖葉總皂苷稀釋液(終濃度分別為0pg/mL，0.1^ig/mL,lfig/mL,10pg/mL,100|xg/mL)，37°C、5%C02培養48h。結束前4h，各孔加入MTT(2mg/mL)50pL/孔，繼續培養4h。棄去各孔內液體，各加二甲基亞砜150jaL，置暗處室溫15min，以酶標儀于578nm波長測定OD值，結果見圖l。由圖1可見，三七莖葉總皂苷在0.1pg/mL~lOO^g/mL的濃度范圍內對刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)三種分裂原誘導小鼠脾細胞增殖反應呈濃度依賴性的雙向免疫調節作用，濃度1.0ng/mL和lO.Ojag/mL時能顯著或極顯著促進這兩種分裂原誘導小鼠脾細胞增殖反應。本發明可以利用實施例三中三七莖葉總皂苷的實驗所得出的特性在制備免疫佐劑中可以提高免疫佐劑的雙向免疫調節作用以及提高細胞的增殖反應。實施例四三七莖葉總皂苷對OVA免疫小鼠細胞免疫的影響本實施例中將三七莖葉總皂苷生理鹽水溶液和OVA生理鹽水溶液混合后在37。C的溫度下以每分鐘100轉的轉速振搖30分鐘后得到三七莖葉總皂苷生理鹽水溶液和OVA生理鹽水溶液的混合液；將氫氧化鋁的生理鹽水溶液和OVA生理鹽水溶液混合后在37'C的溫度下以每分鐘100轉的轉速振搖30分鐘后得到氫氧化鋁生理鹽水溶液和OVA生理鹽水溶液的混合液。將30只小鼠隨機分組，每組5只。生理鹽水對照組每只注射生理鹽水0.2mL;OVA對照組每只注射0.2mL的OVA生理鹽水溶液(0.5mg/mL);氫氧化鋁(ALum)對照組每只注射O.lmLOVA生理鹽水溶液(lmg/mL)和O.lmL氫氧化鋁(Alum)生理鹽水溶液(2mg/mL)的混合液；三七莖葉總皂苷試驗組每只注射O.lmLOVA生理鹽水溶液(lmg/mL)和O.lmL含100jig、200pg、400pg三七莖葉總皂苷生理鹽水溶液的混合液。各組皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫間隔14天，在第二次免疫后的14天，取小鼠放血處死，無菌取脾，磨碎、過濾，力口Hank，s液，1500rpm離心3分鐘，棄上清液，重復洗滌2次，以RPMI1640培養液混懸細胞。取0.1mL脾細胞懸液加白細胞稀釋液3.9mL,臺盼蘭染色計數，活細胞數不少于95%;取lmL脾細胞懸液，用PRMI1640液稀釋、調整細胞濃度至1xl07+/mL。取lOOpL脾細胞懸液加96孔板內(重復12孔)，其中4孔加ConA液lOOpL(5jag/mL)，4孔加LPS液100jiL(10pg/mL),4孔加100jaLRPMI1640培養液。37°C、5%C02培養68h。結束前4h，各孔加入50nLMTT溶液(2mg/mL),繼續培養4h。棄去各孔內液體，加二甲基亞砜溶液150pL,置暗處室溫15min,以酶標儀于578nm波長測定OD值。計算刺激指數(SI)氣有絲分裂原培養物的OD值)/(無有絲分裂原培養物的OD值)，結果見圖2。從圖2可見，三七莖葉總皂苷三個劑量組均能顯著或極顯著促進刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)兩種分裂原誘導OVA免疫小鼠脾細胞增殖反應，而鋁膠組與OVA組無顯著性差異。說明三七莖葉總皂苷能顯著增強OVA受免小鼠的細胞免疫反應，而鋁膠則無此活性。本發明利用實施例四中三七莖葉總皂苷的實驗所得出的特性在制備免疫佐劑中能顯著增強細胞免疫反應。實施例五三七莖葉總皂苷對OVA免疫小鼠體液免疫的影響本實施例中將三七莖葉總皂苷生理鹽水溶液和OVA生理鹽水溶液混合后在37'C的溫度下以每分鐘100轉的轉速振搖30分鐘后得到三七莖葉總皂苷生理鹽水溶液和OVA生理鹽水溶液的混合液；將氫氧化鋁生理鹽水溶液和OVA生理鹽水溶液混合后在37'C的溫度下以每分鐘100轉的轉速振搖30分鐘后得到氫氧化鋁生理鹽水溶液和OVA生理鹽水溶液的混合液。將30只小鼠隨機分組，每組5只。生理鹽水對照組每只注射生理鹽水0.2mL;OVA對照組每只注射0.2mL的OVA生理鹽水溶液(0.5mg/mL);氫氧化鋁(ALum)對照組每只注射O.lmLOVA生理鹽水溶液(lmg/mL)和O.lmL氫氧化鋁(Alum)生理鹽水溶液(2mg/mL)的混合液；三七莖葉總皂苷試驗組每只注射O.lmLOVA生理鹽水溶液(lmg/mL)和O.lmL含100嗎、200pg、400pg三七莖葉總皂苷生理鹽水溶液的混合液。各組皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫間隔14天，在第二次免疫后14天分離血清，在96孔酶標板每孔加入100uL包被液，置4'C孵育24h后，用洗滌液洗滌3次，每次3min。每孔加150pL封閉液，于37。C孵育2h后用洗滌液洗滌3次，每次3min。每孔加待檢血清稀釋液100pL，每個樣品3復孔，重復3次。37。C孵育2h,用洗滌液洗滌3次，每次3min。每孔加入辣根過氧化物酶標兔抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標羊抗小鼠IgGl或IgG2b抗體稀釋液100pL，37'C孵育2h后用洗滌液洗滌3次，每次3min。每孔加lmg/mL鄰苯二胺底物溶液100pL，37。C顯色10min，每孔加2M硫酸50pL終止反應。置酶標儀于490nm處測定OD值，結果見圖3。由圖3可見，三七莖葉總皂苷三個劑量均能顯著提高OVA免疫小鼠血清中特異性IgG、IgGl和lgG2b抗原水平，且三七莖葉總皂苷三個劑量組小鼠血清中IgG2b抗體水平顯著高于Alum/OVA對照組。說明三七莖葉總皂苷能顯著增強OVA受免小鼠的體液免疫反應，其制得的免疫佐劑性效果優于鋁膠。權利要求1、一種三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用。2、根據權利要求1所述的三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用，其特征是所述的三七莖葉總皂苷是從五加科植物三七尸awoxwotog/me"g(Burk.)F.H.Chen的干燥莖葉中提取、分離得到。3、根據權利要求1所述的三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用，其特征是它的制備過程如下步驟一，將五加科植物三七MotogzVwe"g(Burk.)F.H.Chen的莖葉粉碎后形成三七莖葉粗粉；步驟二，將三七莖葉粗粉通過乙醇進行回流提取，然后將乙醇提取液進行減壓回收乙醇，濃縮；步驟三，將濃縮后的乙醇提取液浸膏用水進行混懸，然后用極性較小的有機溶劑進行萃取，萃取體積為水懸液的1/3，當萃取后的萃取液I接近無色時合并萃取液I,減壓回收極性較小的有機溶劑，濃縮萃取液I;再用極性較大的有機溶劑進行萃取，當萃取后萃取液n接近無色時合并萃取液n，減壓回收極性較大的有機溶劑，濃縮萃取液n,將濃縮后的極性較大有機溶劑萃取液n的浸膏在大孔樹脂柱中進行色譜分離，用水洗去水溶性雜質，再用醇溶液為洗脫劑進行洗脫，收集醇洗脫液，減壓回收醇溶液，濃縮，并干燥，得到三七莖葉總皂苷。4、根據權利要求3所述的三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用，其特征是所述的步驟二中的乙醇的濃度為80%,回流提取三次，第一次提取2小時，第二次和第三次均提取1.5小時。5、根據權利要求3所述的三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用，其特征是所述的步驟三中極性較小的有機溶劑為石油醚、乙醚或氯仿。6、根據權利要求3所述的三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用，其特征是所述的步驟三中極性較大的有機溶劑為正丁醇或正戊醇。7、根據權利要求3所述的三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用，其特征是所述的步驟三中大孔樹脂柱為D101或AB-8大孔樹脂柱，醇溶液為濃度75%_95%的甲醇或乙醇。全文摘要本發明公開了一種三七莖葉總皂苷在制備免疫佐劑的應用。本發明采用三七莖葉總皂苷為主要有效成分制備的免疫佐劑可以顯著地增強抗原的免疫原性，對機體免疫功能有廣泛的調節作用，能誘導Th1和Th2免疫應答，免疫佐劑活性優于至今唯一人用的免疫佐劑氫氧化鋁膠，而且具有生產成本低、無毒的效果。文檔編號A61K39/39GK101380472SQ20081015531公開日2009年3月11日申請日期2008年10月27日優先權日2008年10月27日發明者于生蘭,孫紅祥,成張,方希修,朱善元,洪偉鳴,王妲妲,楓秦,葛竹興,杰郁,義鄭,陳玉勇申請人:楓秦