專利名稱：：雞血藤提取物在制備抗流感病毒及抗腸道病毒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及雞血藤提取物的用途，特別是涉及雞血藤提取物在制備抗病毒藥物中的應用。
背景技術：
：許多病毒性疾病嚴重威脅著人類的生命安全，如腸道病毒(EV)類型眾多，引發的感染更是多種多樣，并且發病又多以綜合征出現，病情輕重懸殊，嬰幼兒患者可爆發嚴重心肌炎或重癥肺炎，尤其新生兒期的爆發流行可致死亡。一種綜合征可由不同的病毒所引起、同一種(型)病毒可以導致不同的綜合征，是腸道病毒屬病毒感染中的普遍現象。患者感染腸道病毒后多數為亞臨床型表現，不易被發現，因此有效而及時作出病原學診斷難度較大。腸道病毒又是通過糞-口和(或)呼吸道等較易散布的途徑而傳染，同時該屬病毒耐酸(pH3.0)、耐乙醚，通過人的胃時仍能存活，在潮濕的環境中存活較長時間，可從污水和污泥中分離到，在水、土壤、蔬菜、貝類可以檢測出病毒，接觸受污染的水源、食物、海產品、食具可能會引起社區的傳播，常造成散發性流行或大面積流行。目前腸道病毒除脊髓灰質炎病毒外，尚無疫苗可供預防。因此，腸道病毒是當前嚴重影響人類健康的重要病原之一。此外，流感病毒(IV)引起的流行性感冒同樣嚴重威脅著人類健康。它屬于正粘病毒科，為包膜的RNA病毒，包括人流感病毒和豬、馬等家畜和雞、鳥等禽類的甲型流感病毒。人流感病毒根據核蛋白抗原性不同可分為甲、乙、丙三型，其抗原性極易發生變異。人類的流行性感冒就是由流感病毒引起的急性上呼吸道傳染病，具有傳染性高、傳播迅速、易發生流行等特點。這是由于病毒只能在活細胞生長的特殊性以及流感病毒的亞型變異速度很快，使得化學藥物和流感病毒疫苗難以發揮其最佳治療和預防效果。尤其甲型流感病毒每隔IO年左右就暴發一次世界性大流行。目甜，流感的威脅依然存在，據統計，全世界平均每年有50-100萬人死于流感。由此可見，流感作為一種病毒性傳染病不僅嚴重威脅著公眾健康，而且給國家和社會帶來了沉重的經濟負擔。流感作為嚴重危害公眾健康的病毒性傳染病，始終伴隨著人們的生活。雖然已知的流感病毒已經得到控制，但是，由于流感病毒的抗原變異能力極強且相當頻繁，疫苗的研制和生產相對滯后，對于易感人群的保護率不高，因此，新的流感大流行隨時都有可能爆發。在這種情況下，尋找具有預防和治療作用的抗流感藥物就顯得尤為重要和緊迫。目甜，對腸道病毒、流感病毒等引起的疾病尚缺乏專一性的特異性治療藥物，主要采用對癥治療的手段，所采用的治療藥物多是廣譜性抗病毒藥物如利巴韋林、金剛烷胺等，亟需尋求有效的治療藥物。雞血藤是一味沿用千年的活血化淤中藥，古代多篇本草論著中都記載了其"去淤血，生新血"的功效，并稱之為"血分之圣藥"(江蘇新醫學院.雞血藤[M].中藥大詞典(上冊).上海上海科技出版社，1997.120)。中醫認為其有補血活血、舒筋活絡的功能，用于治療月經不調、血虛萎黃、麻木竣瘓、風濕痹痛等癥(中藥現代研究與應用.雞血藤[M].北京學苑出版社，第三巻2539)。現代臨床常用雞血藤(單用或以雞血藤為主組方)治療各種原因(如放化療、血液系統疾病)引起的白細胞、血小板、紅細胞等全血象減少疾病。近年來對雞血藤化學成分和藥理學研究證明，在抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等方面具有較好的作用。雞血藤抗病毒作用的研究目甜僅局限于皰疹病毒和艾滋病毒等，還沒有關于其它病毒的報道。
發明內容本發明的目的是提供一種雞血藤提取物在制備抗流感病毒及抗腸道病毒藥物中的應用。本發明的技術方案概述如下雞血藤提取物在制備抗流感病毒及抗腸道病毒藥物中的應用。本發明的優點實驗證明雞血藤提取物具有顯著的抗流感病毒及抗腸道病毒的作用。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一歩的說明。、實施例1雞血藤提取物采用下述方法制備(1)將粉碎后的1000g的雞血藤加入2000ml水浸泡2小時，加熱至8(TC，浸泡2小時提取，過濾，提取3次，濾液濃縮至1000ml。實施例2雞血藤提取物采用下述方法制備(1)將粉碎后的1000g的雞血藤加入1000ml水浸泡3小時，加熱至60°C，浸泡3小時提取，過濾，提取4次，濾液濃縮至1000ml。實施例3雞血藤提取物采用下述方法制備(1)將粉碎后的1000g的雞血藤加入3000ml水浸泡1小時，加熱至IO(TC，浸泡1小時提取，過濾，提取2次，濾液濃縮至1000ml。實施例1-3所采用的中藥材雞血藤，選國產優質中藥材雞血藤，產地我國南方主要產區。參照中華人民共和國國家標準GB15193.3-94、GB15193.5-94、GB15193.8-94、GB15193.7隱94、GB15193.4-94、GB15193.14-94和GB15193.13-94，進行大鼠急性毒性試驗、小鼠急性毒性試驗、小鼠骨髓微核試驗(雄性)、小鼠骨髓微核試驗(雌性)、小鼠精子畸形試驗、小鼠睪丸染色體畸變試驗、Ames試驗、大鼠系統致畸試驗和大鼠30天喂養實驗，結果顯示大、小鼠LD50〉30.0g/kg;小鼠口服本發明實施例1制備的雞血藤提取物(1000mg/kg)，一天1次，連服15天，在清醒狀態下觀察其精神神經系統、心血管系統和4呼吸系統，結果均無異常表現。實施樹4雞血藤提取物抗腸道病毒作用一、雞血藤提取物體外抗腸道病毒作用研究1、雞血藤提取物在VeroE6細胞培養內對腸道病毒的抑制作用(1)細胞培養長滿VeroE6細胞的培養瓶加0.25%胰酶(Hanks液配制)，37'C消化5分鐘，加RPMI-1640培養液(含胎牛血清10%，3%谷氨酰胺1%)吹打，1:3傳代，2-3d長滿，加入細胞計數板計數，配置成105cells/ml，接種細胞培養板，96孔板每孔0.2ml，24孔板每孔lml，37°C、5y。C0二,培養24h，細胞長成單層后進行實驗。(2)雞血藤提取物對細胞毒性試驗將對腸道病毒易感的VeroE6細胞分別用0.25%胰酶lml加Versene消化液4ml消化后，加生長液吹落、混勻，100^1/孔接種于96孔細胞培養板，37°C、5%C02中培養24h48h后生長成單層細胞，棄去培養液，待用。將受試樣品高壓滅菌后用RPMI-1640維持液按不同濃度進行稀釋，做2倍連續稀釋6個濃度進行粗篩。每一濃度接種事先準備好的細胞3孔，每孔100pl。將陽性對照藥病毒哞注射液(不過濾)，按不同的濃度稀釋，每濃度4孑L，每孔100^。同時設正常細胞VeroE6，37°C，5%C02中培養。第二R起，在倒置顯微鏡下逐閂觀察細胞形態，以每孔小于25%，病變為+;25%50%為++;50%75%為+++;75%100°/。為++++(以病變++++為終點，觀察時間為4d)。根據ReedMuench法計算最大無毒濃度CCo和半數有毒濃度CC50。(3)雞血藤提取物對腸道病毒復制的抑制作用接種細胞VeroE6于96孔板長成70%80%單層后，吸去培養液，用100XTCID5。病毒100pl吸附VeroE6細胞，37。C孵育2h，洗去游離病毒，加入用維持液倍比稀釋的雞血藤樣品液ioow，37°C、5%<:02培養箱中繼續培養，觀察細胞病變，記錄病變孔數，計算樣品對病毒的抑制率，計算半數有效濃度(IC50)和治療指數(TI)。(4)雞血藤提取物對腸道病毒吸附細胞的抑制作用接種細胞于96孔板長成70%80%單層后，吸去培養液，100XTCID5o病毒100W和10(^1雞血藤樣品稀釋液同時加入(體積比為h1)，37。C孵育2h，去除液體，加入100pl維持液，37°C、5%<:02培養箱中繼續培養96h，觀察細胞病變，記錄病變孔數，計算樣品對病毒的抑制率，計算半數有效濃度(IC5Q)和治療指數(TI)。(5)雞血藤提取物預處理細胞對腸道病毒感染的阻滯作用(保護作用)接種細胞于96孔板長成70%80%單層后，吸去培養液，加入100^1樣品稀釋液，細胞與樣品37。C孵育2h，棄掉樣品液，加入IOOXTCIDm)病毒液10(^1，37'C孵育2h，洗去游離病毒，加入維持液孵育200W，37°C、5。/。C02培養箱中繼續培養96h，觀察細胞病變，記錄病變孔數，計算樣品對病毒的抑制率，計算半數抑制濃度(IC5Q)和治療指數(TI)。(6)雞血藤提取物對腸道病毒的滅活作用取50嗎/ml和30昭/ml的實施例1制備的雞血藤提取物分別與病毒原液于37'C孵育2h，用維持液將作用后的混合病毒液作10倍梯度稀釋，接種于長滿單層細胞的96孔培養板進行病毒滴定，每個稀釋度重復4孔，以同等稀釋倍數的病毒液做對照，37°C、5%(202培養箱繼續培養96h，觀察細胞病變，計算病毒效價和樣品對病毒的滅活率。2、實驗結果(1)雞血藤提取物對5種腸道病毒的復制抑制作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)雞血藤提取物不能抑制病毒的吸附作用。(3)雞血藤提取物具有較強的滅活腸道病毒作用，能使所試驗5種病毒滴度降低24個數量級。二、雞血藤提取物抗流感病毒作用1、接種MDCK細胞于96孔細胞板培養至70%80%單層，棄培養液，用Hank's液洗1遍，加入稀釋至100XTCID5o的病毒液，每孔IOOW，35'C吸附2h。將樣品液從半數中毒劑量丌始做倍比稀釋共8個濃度。吸附后棄去病毒液，用Hank's液洗1遍，.加入稀釋好的藥液，每個濃度加4個孔，同時設病毒對照及細胞對照，37。C培養5d，每天觀察有無CPE并記錄結果。以細胞50%發生病變(++)的藥物稀釋度作為該藥物最小有效濃度的終點判定，計算半數有效濃度(IC5Q)和治療指數(TI),以上實驗至少重復三次，每次都記錄結果。-2、抗流感病毒作用則需要在完成以上CPE觀察后，將培養板收入-2(TC，對每個實驗組進行血凝滴度實驗，判定藥物對該流感病毒的最小有效濃度取96孔圓底聚乙烯塑料板，從第二排起每孔加入50pl生理鹽水，第一排每孔加入待檢藥物10(^1，從第一排孔內取出50nl向后做倍比稀釋；加入1%豚鼠紅細胞lOOpl，置室溫3060min后觀察結果。以紅細胞50%凝集(++)為最終判定結果。3、試驗結果(1)雞血藤取物對流感病毒抗病毒效果較好，對H1NI的抑制效果最好，EC5o為3.19ng/ml，TI為28.4。對另兩種流感病毒H3N2和乙型流感病毒的抗病毒作用也比較明顯雞血藤取物及病毒唑體外抗流感病毒的藥效<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)將50昭/ml和30嗎/ml的雞血藤提取物分別于35。C與流感病毒InfluenzavimsAl(H1N1)、InfluenzavirusA3(H3N2)、InfluenzavirusB作用2h后，分別檢測作用后混合液與對照病毒的血凝滴度，如下表所示50嗎/ml和30叱/ml的雞血藤提取物均能有效降低流感病毒的血凝滴度。雞血藤提取物對流感病毒血凝滴度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3)不同給藥途徑下雞血藤的抗病毒效果不同。可知，雞血藤對流感病毒復制的抑制作用>對流感病毒吸附細胞的抑制作用〉對流感病毒的滅活作用〉預處理細胞對流感病毒感染的阻滯作用。在流感病毒侵染后加入樣品的治療法效果最好。三、雞血藤提取物體內抗腸道病毒作用1、小鼠CoxsackievirusB3病毒感染昆明小鼠50只，共分為5組，每組10只，雌雄各半。各組小鼠注射部位常規消毒后，(除A組iH常對照組外)腹腔注射CoxsackievirusB3病毒液0.1ml(105XTCID5Q)，注射2h后進行第一次灌胃給藥。2、藥物治療試驗腹腔注射CoxsackievimsB3病毒液后2h后進行第一次灌胃給藥。A組為IH常對照組，感染病毒時注射同等劑量的細胞維持液0.1ml，灌胃時灌服生理鹽水；B組為病毒感染對照組，灌服生理鹽水；C組為抗病毒雞血藤提取物低劑量(lmg/ml)治療組；D組為抗病毒雞血藤提取物中劑量(10mg/ml)治療組；E組為抗病毒雞血藤提取物高劑量(100mg/ml)治療組。每天一次，每次0.2ml。觀察動物感染后的發病癥狀。各組動物分別于第5d和第10d各處死一半，摘除眼球后取血分離血清，并無菌操作取動物心臟。每個心臟樣品的1/2用于感染性病毒分離，剩余心臟樣品1/2的用于CoxsackievirusB3病毒核酸的檢測。3、檢測方法(1)心臟中感染性CoxsackievirusB3病毒的分離、鑒定取上述CoxsackievirusB3感染后第15d和第30d的小鼠心臟1/2勻漿，用含有100U/ml青霉素、100嗎/ml鏈霉素的RPMI—1640細胞培養液制成懸液，取0.1ml感染VeroE6細胞，37'C.、5%C02吸附2h(每隔30min振蕩一次)，棄上清，加細胞維持液，37°C、5%C02培養箱培養。于倒置顯微鏡下連續觀察6d，出現CPE者為陽性，凍融3次后進行病毒滴定，并采用RT-PCR進行鑒定。未出現CPE者經盲傳3代仍無CPE者視為分離陰性，棄之。(2)心臟組織中CoxsackievirusB3病毒核酸檢測取上述CoxsackievirusB3感染后第5d和第10d的小鼠心臟1/2勻漿后，抽提組織總RNA及其中的病毒RNA，同法抽提CoxsackievirusB3，分別進行RT-PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，紫外燈下觀察，與分子量標準品對照，在300bp處出現條帶者為陽性。4、實驗結果分別于第15d和第30d各處死一半，無菌操作取小鼠心臟，每個心臟樣品的1/2用于感染性病毒分離，1/2的臟器用于CoxsackievirusB3病毒核酸的檢測。VeroE6細胞分離病毒結果顯示，接種于培養板的各組小鼠組織病毒提取液均不能使細胞發生病變，將細胞&傳3代，細胞生長狀態良好，無病變發生。而將另外樣品的1/2臟器提取總認A，通過RT-PCR檢測CoxsackievirusB3的特異性核酸片段，結果顯示，病毒對照組、中劑量組和低劑量組結果呈陽性，空白對照組、高劑量組結果呈陰性，在高濃度下(100mg/ml)，雞血藤提取物樣品能夠抑制CoxsackievirusB3在小鼠心肌細胞中的感染和繁殖。四、雞血藤提取物體內抗流感病毒作用1、小鼠HIN1病毒感染昆明小鼠50只，共分為5組，每組10只，雌雄各半。各組小鼠(除A組[H常對照組外)分多次經鼻腔滴注HIN1病毒液0.05ml(105XTCID5())，滴注2h后進行第一次灌胃給藥。2、藥物治療試驗經鼻腔滴注HIN1病毒液0.05ml(105XTCID5。)，滴注2h后進行第一次灌胃給藥。A組為正常對照組，感染病毒時注射同等劑量的細胞維持液0.1ml，灌胃時灌服生理鹽水；B組為病毒感染對照組，灌服生理鹽水；C組為抗病毒雞血藤提取物低劑量(lmg/ml)治療組；D組為抗病毒雞血藤提取物中劑量(10mg/ml)治療組；E組為抗病毒雞血藤提取物高劑量(100mg/ml)治療組。每天一次，每次0.2ml。觀察動物感染后的發病癥狀。各組動物分別于第5d和第10d各處死一半，并無菌操作取動物肺。每個肺樣品的1/2用于感染性病毒分離，剩余肺樣品1/2的用于H1N1病毒核酸的檢測。3、檢測方法(1)肺中感染性H1N1病毒的分離、鑒定取上述H1N1感染后第5d和第10d的小鼠肺1/2勻漿，用含有100U/ml青霉素、100昭/ml鏈霉素的RPMI—細胞培養液制成懸液，取0.1ml感染MDCK細胞，37°C、5%C02吸附2h(每隔30min振蕩一次)，棄上清，加細胞維持液，37°C、5%<:02培養箱培養。于倒置顯微鏡下連續觀察6d，出現CPE者為陽性，凍融3次后進行病毒滴定，并采用RT-PCR進行鑒定。未出現CPE者經盲傳3代仍無CPE者視為分離陰性，棄之。(2)肺組織中H1N1病毒核酸檢測取上述H1N1感染后第5d和第10d的小鼠肺1/2勻漿后，抽提組織總RNA及其中的病毒RNA，同法抽提H1N1，分別進行RT-PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳、EB染色，紫外燈下觀察，與分子量標準品對照，在110bp處出現條帶者為陽性。4、實驗結果分別于第5d和第10d各處死一半，無菌操作取小鼠肺，每個肺樣品的1/2用于感染性病毒分離，1/2的臟器用于H1N1病毒核酸的檢測。MDCK細胞分離病毒結果顯示，接種于培養板的各組小鼠組織病毒提取液均不能使細胞發生病變，將細胞盲傳3代，細胞生長狀態良好，無病變發生。而將另外樣品的1/2臟器提取總RNA，通過RT-PCR檢測H1N1的特異性核酸片段，結果顯示，病毒對照組和低劑量組結果呈陽性，空白對照組、中劑量組和高劑量組結果呈陰性，在這兩個濃度下(10mg/ml，100mg/ml)，雞血藤提取物樣品能夠抑制H1N1在小鼠肺細胞中的感染和繁殖。通過對不同產地來源的雞血藤提取物樣品、不同批次雞血藤提取物樣品和不同提取方法的提取物進行了抗病毒試驗，結果顯示不同產地來源和不同的提取批次對提取物抗病毒活性無明顯差異。權利要求1.一種雞血藤提取物在制備抗流感病毒及抗腸道病毒藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種雞血藤提取物在制備抗流感病毒及抗腸道病毒藥物中的應用。實驗證明雞血藤提取物具有顯著的抗流感病毒及抗腸道病毒的作用。文檔編號A61K36/185GK101474247SQ200810154600公開日2009年7月8日申請日期2008年12月26日優先權日2008年12月26日發明者佶龐,李君文,王新為,諶志強,郭金鵬,敏金申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所