專利名稱：雞新城疫,傳染性支氣管炎二聯疫苗的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種二聯疫苗的生產方法，具體地說，是雞新城疫， 傳染性支氣管炎二聯疫苗的生產工藝，屬于生物工程領域。
背景技術：
新城疫病毒(Newcastledisease virus, NDV)又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟 病毒或禽肺腦炎病毒。在病毒分類學中的位置屬于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)、副黏病毒屬(Pammyxovirus)中的一個種。該病毒主要危 害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強毒株可使雞群全群毀 滅。弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產蛋量下降，但可迅速康復。人類可 因接觸病禽和活毒疫苗而引起結膜炎或淋巴腺炎，但很快便康復。新城疫 病毒被O正規定為A類疫病，是一種急性、高度接觸性傳染病，發病率和 死亡率都在90%以上，1935年梁英、馬聞天等首次證實我國有該病的流行 [1]，現在本病被我國列為I類疫病。
新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜。病毒顆粒具多形性，有圓形、橢 圓形和長桿狀等。成熟的病毒粒子直徑100 400nm。包膜為雙層結構膜， 由宿主細胞外膜的脂類與病毒糖蛋白結合衍生而來。包膜表面有長12 15nm的刺突，具有血凝素、神經氨酸酶和溶血素。病毒的中心是ssRNA分 子與附在其上的蛋白質衣殼粒，纏繞成螺旋對稱的核衣殼，直徑約18nm。 成熟的病毒是以出芽方式釋放至細胞外。
新城疫病毒對外界環境的抵抗力較強，55'C作用45min和直射陽光下 作用30min才被滅活。病毒在4'C中存放幾周，在-20'C中存放幾個月或在-7(TC中存放幾年，其感染力均不受影響。在新城疫暴發后8周之內，仍可在雞舍、蛋巢、蛋殼和羽毛中分離到病毒。病毒對乙醚敏感。大多數去污劑能將它迅速滅活。氫氧化鈉等堿性物質對它的消毒效果不穩定。3% 5%來蘇爾、酚和甲酚5min內可將裸露的病毒粒子滅活。在37°C的孵卵器內，用0.1 %福爾馬林熏蒸6h便可把它滅活。
新城疫病毒的所有毒株都能凝集多種禽類和哺乳類動物的紅細胞。大多數毒株能凝集公牛和綿羊的紅細胞。在病毒的血凝試驗中；雞的紅細胞最為常用。該病毒可在9 12日齡的雞胚絨毛尿囊膜上和尿囊腔中培養，大多數毒株也可在兔、豬、犢牛和猴的腎細胞以及雞組織細胞等繼代或傳代細胞中培養。雞胚的成纖維細胞、雞胚和倉鼠的腎細胞常用于新城疫病毒的培養。
目前，雖然疫苗的使用使該病得到了有效控制,但由于疫苗免疫效果不理想，以及流行毒株的毒力增強和我國養雞業水平的參差不齊，使得該病仍然是嚴重危害我國養禽業的疾病之一，在我國經常有非典型新城疫的發生，甚至典型新城疫的爆發。
雞傳染性支氣管炎(AvianInfectiousBornchistis， IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBornchistis Virus, IBV)引起的一種急性、高度接觸性、病毒性傳染病。該病主要侵害雞的呼吸系統、泌尿生殖系統和消化系統等.其感染的主要特征是氣管鑼音、咳^、打噴嚏和腎臟腫大。此外，該病還可以引起蛋雞產蛋量下降和蛋品質下降，但死亡率通常較低，雛雞可由于呼吸道或腎臟的感染而死亡。
雞傳染性支氣管炎病毒是尼多目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Conovirus)第三群禽冠狀病毒的代表株，其毒粒呈中等多型性的球形或橢圓型，直徑約80 120nm，是有囊膜的、不分節段的、單股正鏈RNA病毒。IBV對外界環境的抵抗力不強，多數毒株56'C15min及45。C90min即被 滅活，而適應于雞胚的毒株可在此溫度存活3h以上。IBV耐酸不耐堿，在 pH6.0 6.5條件下培養較在pH7.0 O條件下穩定，在細胞培養時以pH6.0 6.5較好。IBV對乙醚、氯仿及其它脂溶劑敏感，但20%的脂溶劑只能降低病 毒的滴度而不能使其完全滅活。
IBV應避免在-20'C保存，但感染性尿囊液-3(TC保存多年仍然存活，凍 干尿囊液可保存30年，IBV本身沒有血凝作用，但經1%胰蛋白酶、卵磷酷C、 魏氏梭菌液及乙醚等處理后，常可凝集雞、家兔、倉鼠、鵝及小鼠等多種 動物及人的紅細胞。
IBV能在9 11日齡的雞胚中生長，初代分離毒接種雞胚，多數雞胚存 活，但隨傳代次數的增加，對雞胚的毒力增強，到第10代時，可引起80%的 雞胚死亡。胚體出現特征性的變化如發育受阻，胚體巻曲成球形，腳變形 壓在頭部，羊膜增厚，緊貼胚體，卵黃囊縮小，尿囊液增多，中腎尿酸鹽 沉積。IBV能在10 18日齡的雞胚腎細胞、肺細胞、肝細胞、成纖維細胞培 養物上生長，其中以雞胚腎細胞(Chick embryo kidney，CEK)和雞腎細胞 (Chicken kidney，CK)最好，IBV也能在非洲綠猴腎細胞株(Vero)中連續傳代， 有的毒株還可在BHK-21中生長，可產生細胞病變，使細胞出現空斑，產生 的空斑大小因毒株不同而有差異。
雖然疫苗的使用對IB的流行起到了一定的預防和控制作用，但由于IBV 血清型眾多，不同血清型毒株之間具有較小的交叉保護性甚至無交叉保護 性。因此，IB目前仍在免疫雞群和非免疫雞群發生和傳播，給養禽業造成 了嚴重的經濟損失。
近年來，伴隨畜禽養殖規模的不斷擴大，生物制品行業也得到了迅速 發展，尤其是生物技術的不斷更新使疫苗產品的種類顯著增加，且品種多 樣，如多聯疫苗，多價疫苗，基因工程疫苗，重組病毒載體疫苗等，而這
5其中，多聯疫苗的使用，擴大了一次接種的防病范圍，提高了接種效率， 減少了接種用器材及勞務費用，有利于免疫計劃的安排'，為廣大養殖場(戶) 所歡迎。我國現有獸用多聯疫苗品種很多，如"新城疫，傳染性支氣管炎二 聯疫苗""新城疫，傳染性支氣管炎，禽流感三聯疫苗"等等，雖然品種很多， 但很多多聯疫苗只是多種單苗的簡單組合，幾種抗原的配比混亂，相容性
不好，存在免疫反應的相互干擾的現象，并不能達到預期的目的；而且很 多多聯疫苗生產工藝簡單，生產技術粗糙，造成部分產品污染，抗原組合 物中某些抗原效價降低，不能單到生產規程的要求。"新城疫，傳染性支氣 管炎二聯疫苗"中傳染性支氣管病毒(IBV)對新城疫病毒(NDV)存在干擾，目 前在我國獸藥生物制品廠所生產的雞新城疫與傳染性支氣管炎二聯活疫苗 (以下簡稱"新支二聯苗")基本上都是采用不同雞胚培養增殖病毒,然后將收 獲感染的尿囊液混合制備而成，這樣就會費時費力，而且提高了成本，雖 然也有部分企業同胚增殖兩種病毒，但由于兩種病毒的特異性干擾作用， 使最終得抗原產量降低，還要經過濃縮等工序提高抗原濃度，這樣也就間 接地提高了成本。
因此，針對現有的雞新城疫與傳染性支氣管炎二聯活疫苗的生產方法， 需要改進"新城疫、傳染性支氣管炎"二聯疫苗的組分搭配以及生產工藝中的 缺陷，使"新城疫、傳染性支氣管炎"二聯疫苗的免疫效果達到單苗的效果， 甚至超過單苗的免疫效果，切實達到一針防多病的目的。
發明內容
本發明的目的在于提供一種雞新城疫與傳染性支氣管炎二聯活疫苗的 生產方法，步驟包括
1)在同胚培養之前，提高生產工藝中新城疫、傳染性支氣管炎種毒的 純度；2) 在同胚培養中，調整新城疫、傳染性支氣管炎二聯疫苗中兩種抗原 的濃度，使得新城疫病毒液的稀釋度為100-10000倍，傳染性支氣 管炎病毒液的稀釋度為100-10000倍，以達到合理搭配；
3) 棄去24小時以內死亡雞胚，48-120小時以內收獲所有死亡和未死 亡雞胚，經效力檢驗、無菌檢驗等后，合格半成品加凍干保護劑進 行凍干、壓帽貼簽，成品經過相關檢驗合格后，包裝、入庫，-20 TM呆存。
在一個具體實施方案中，其中雞新城疫病毒弱毒株優選是LaSota，效 檢用強毒優選是雞新城疫病毒強毒北京株(CVCCAVI611株)。
在另一個具體實施方案中，其中傳染性支氣管炎病毒株優選是H120株 或H52株。
有益效果
1、 通過改進"新城疫、傳染性支氣管炎"二聯疫苗的生產工藝，使生產工 藝簡單化；
2、 節約工時和原材料。制備過程減少了注射次數， 一次注射可獲得兩 種抗原，且每種抗原繁殖量與單獨增殖每一種抗原相當；
3、 操作更為簡便快速；
4、 可以使其進行合理搭配，并提高產品質量，降低生產成本，充分發 揮其有利效應。
5、 該疫苗接種雞群后ND、 IB免疫力同時產生，無任何干擾。
6、 疫苗毒株合理配比，有效避免雞新城疫活疫苗與傳支活疫苗同時接 種的嚴重干擾的問題，提高免疫質量，減少免疫次數。
7具體實施方案
本發明將結合具體實施例做進一步的說明，這些實例僅用于說明目的， 而不用于限制本發明范圍 實施例l:新城疫單苗的制備
雞新城疫采用LaSota株，效檢用強毒優選是雞新城疫病毒強毒北京株 (CVCCAVI611株)。毒種的標準及保存方法同"中華人民共和國獸用生 物制品規程"(以下均簡稱"規程")中"雞新城疫低毒力活疫苗制造及檢驗 規程"l項的規定。二聯苗安全試驗、檢驗用雞，均采用SPF雞或易感雞。
將LaSota株作為毒種，接種10日齡SPF雞胚，棄去24小時以內死亡 雞胚，收獲接種后72-120小時死亡且病變明顯的雞胚液，經效力檢驗、無 菌檢驗等后，合格半成品加凍干保護劑進行凍干、壓帽貼簽，成品經過相 關檢驗合格后，包裝、入庫，-201:保存。按部頒標準進行病毒含量的測定， 病毒含量〉10^EID5o/0.1ml。成品檢驗按規程P222進行。
實施例2:傳染性支氣管炎單苗的制備H120株或H52株
制造本品選用H120株或H52株，檢驗采用標準強毒M41株，均由申
請人瑞普公司提供。二聯苗安全試驗、檢驗用雞，均采用SPF雞或易感雞。 其中，檢驗用標準強毒lVLn株毒力及毒種標準如下 病毒含量1V^株毒種對1-7日齡健康易感雛雞，以IO倍稀釋的強毒
滴鼻1-2滴，觀察10日，'至少應有80%雛雞出現雞傳染性支氣管炎典型癥狀。
疫苗用種毒檢驗標準(病毒含量、安全性、免疫原性、純凈、特異性 基礎種子代數)見規程P212。
成品檢驗標準按規程P213-214進行。
其中，對于實施例1和2，雞胚接種、孵育與觀察、病毒收獲、雞胚病
8毒液的檢驗的步驟相同，可根據下列步驟實施。
雞胚接種將H120株或H52株和LaSota株毒種分別用滅菌生理鹽水 稀釋至10—2 10—4，分別接種易感雞胚尿囊腔，每胚0.1ml，接種后密封針孔， 置37"C繼續孵育，停止翻蛋。
孵育與觀察雞胚接種后，24小時照蛋1次，棄去死胚，以后每隔4 8小時照蛋一次，死亡的雞胚隨時挑出，至72小時不論死亡與否，全部取 出，氣室向上，置于2 8。C,冷卻12 24小時。
收獲分別收獲H120株或H52株和LaSota株雞胚液。將冷卻的雞胚 取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌方法剝除氣室部位卵殼，剪破絨 毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取雞胚液，每若干個胚的胚液混合為一 組，置于滅菌瓶中，每毫升加入青霉素、鏈霉素各1000單位，放2 8'C感 作4 12小時。
在收獲胚液的同時應逐個檢査雞胚，凡胎兒腐敗，胚液混濁及有任何 污染可疑者棄去不用。
實施例3:新支二聯活疫苗的制備
制造本品所用毒株為新城疫弱毒株LaSota株，效檢用強毒為雞新城疫 病毒強毒北京株(CVCCAVI611株)。制造用傳染性支氣管炎毒株為H120 株或H52株，檢驗采用標準強毒M41株，以上各毒株應符合雞新城疫低毒 力活疫苗和雞傳染性支氣管炎活疫苗制造及檢驗規程中有關毒種部分的1.2 和1.3項標準。
半成品及成品檢驗標準見規程P-224-226。
權利要求
1.一種雞新城疫與傳染性支氣管炎二聯活疫苗的生產方法，步驟包括1)在同胚培養之前，提高生產工藝中新城疫、傳染性支氣管炎種毒的純度；2)在同胚培養中，調整新城疫、傳染性支氣管炎二聯疫苗中兩種抗原的濃度，使得新城疫病毒液的稀釋度為100-10000倍，傳染性支氣管炎病毒液的稀釋度為100-10000倍，以達到合理搭配；3)棄去24小時以內死亡雞胚，48-120小時以內收獲所有死亡和未死亡雞胚，經效力檢驗、無菌檢驗等后，合格半成品加凍干保護劑進行凍干、壓帽貼簽，成品經過相關檢驗合格后，包裝、入庫，-20℃保存。
2. 權利要求1所述的方法，其中雞新城疫病毒弱毒株優選是LaSota，效檢用 強毒優選是雞新城疫病毒強毒北京株(CVCCAVI611株)。
3. 權利要求1所述的方法，其中傳染性支氣管炎病毒株優選是H120株或H52株。
全文摘要
本發明涉及一種二聯疫苗的生產方法，具體地說，是雞新城疫，傳染性支氣管炎二聯疫苗的生產方法，包括同胚培養之前，提高生產工藝中新城疫、傳染性支氣管炎種毒的純度；在同胚培養中，調整新城疫、傳染性支氣管炎二聯疫苗中兩種抗原的濃度，以達到合理搭配。本發明方法所制備的疫苗，接種雞群后同時產生ND、IB免疫力，無任何干擾。并且疫苗毒株合理配比，有效避免雞新城疫活疫苗與傳支活疫苗同時接種的嚴重干擾的問題，提高免疫質量，減少免疫次。
文檔編號A61K39/295GK101491674SQ20081015458
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月26日 優先權日2008年12月26日
發明者楊保收, 郁宏偉 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司