專利名稱：：一種能夠逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的rna干擾藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗白血病的藥物，尤其是一種能夠逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的RNA干擾藥物。
背景技術(shù)：
：多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)是惡性腫瘤化療失敗的主要原因，也是常規(guī)化療難以使白血病獲得長(zhǎng)期緩解的重要障礙。研究表明，由mdrl基因編碼的p-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)在腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞多藥耐藥主要機(jī)制。大約30%的急性粒細(xì)胞性白血病(AML)患者在初診時(shí)就有P-gp的表達(dá)，而大于50%的AML復(fù)發(fā)患者有P-gp的表達(dá)。因此，以P-gp為靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥成為提高白血病化療療效的重要手段。目前臨床應(yīng)用的耐藥逆轉(zhuǎn)劑如維拉帕米和環(huán)胞菌素A等雖然有一定效力，但它們是P-gp的底物，是P-gp較弱的抑制劑，而且在有效藥物濃度下毒性較大，產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。RNA干擾(RNAinterferance，RNAi)是高度特異的mRNA水平上的基因沉默機(jī)制，能高效特異性地抑制靶基因表達(dá)。由于RNAi有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此無(wú)論是在功能基因組研究，還是腫瘤的基因治療方面均具有廣闊的應(yīng)用前景。與其它幾種進(jìn)行功能喪失或降低突變的技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)它比反義RNA技術(shù)和同源共抑制更有效，更容易產(chǎn)生功能喪失或降低突變；與DNA技術(shù)造成的功能永久性缺失相比，RNAi技術(shù)更為安全。目前，用于RNA干擾的核苷酸片段分為兩種小干擾RNA(siRNA)和編碼小發(fā)夾RNA(shRNA)，但siRNA片段可能在轉(zhuǎn)染過(guò)程中降解或因細(xì)胞分裂而溶解消失使其不能穩(wěn)定持久地發(fā)揮作用，而編碼小發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒載體的運(yùn)用可克服這種局限，從而使得利用RNAi長(zhǎng)期封閉基因或抑制基因表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種能夠逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的RNA干擾藥物，通過(guò)構(gòu)建針對(duì)mdrl的RNA干擾載體，在mRNA水平和蛋白水平逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)針對(duì)多藥耐藥基因mdrl的RNA干擾序列，構(gòu)建表達(dá)shmdr1的載體(pGE-shmdr1)，RNA干擾序列為針對(duì)mdrlmRNA序列不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)的小發(fā)夾狀RNA片段，分別命名為shmdr1-1，shmdr1-2，shmdrl-3，shmdrl-4，將上述4個(gè)片段分別連接到pGE-1載體中，組成的RNA干擾載體為pGE-shmdrl-l，pGE-shmdrl_2，pGE-shmdrl_3，pGE-shmdrl_4，所述的RNA干擾載體藥物為pGE-shmdr1-1。關(guān)于重組DNA技術(shù)，其方法詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版黃培堂等譯p68頁(yè)。shmdrl-l，shmdrl-2，shmdrl-3，shmdrl-4四個(gè)片段的核苷酸序列為shmdrl-l:shmdrl-2:shmdrl-3:shmdrl-4:所述的shmdrl-l，shmdrl—2，shmdrl—3，shmdrl—4的耙位點(diǎn)為shmdrl-l:5-GAAACCAACTGTCAGTGTA_3508-526shmdrl-2:5-GACAGAAAGCTTAGTACCA-32453-2471shmdrl-3:5-GGCCTAATGCCGAACACAT_33491-3509shmdrl-4:5-GATCGCTACTGAAGCAATA-33103-3121將RNA干擾載體轉(zhuǎn)染白血病多藥耐藥K562/A02細(xì)胞系建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，篩選最有效的表達(dá)shmdrl的RNA干擾載體。本發(fā)明研制的RNA干擾載體藥物能夠有效抑制mdrl的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥，為白血病基因治療提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和有效新藥。圖la是本發(fā)明所用的pGE-1載體示意圖；圖lb是陰性對(duì)照載體pGE-Negative載體示意圖；圖2是PCR擴(kuò)增重組pGE-shmdr載體，1，2，3'4分別為pGE-shmdrl-l，pGE-shmdrl-2，pGE-shmdrl-3，pGE-shmdrl-4;圖3是實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果(*代表與p-N比較，p<0.001);圖4是westernblot結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的抗白血病多藥耐藥的RNA干擾藥物作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明1:設(shè)計(jì)針對(duì)mdr1基因的RNA干擾序列根據(jù)GeneBank中mdrl基因序列設(shè)計(jì)shRNA，從mRNA的AUG起始密碼開(kāi)始尋找"AA"二連序列，以其下3—端的19個(gè)堿基序列作為潛在的RNAi靶點(diǎn)。進(jìn)行BLAST分析并選取其中4個(gè)序列進(jìn)行DNA合成，分別命名為shmdrl-l，shmdrl_2，shmdrl_3，shmdrl_4。shmdrl-l，shmdrl-2，shmdrl-3，shmdrl-4四個(gè)片段的核苷酸序列為shmdrl-l:shmdrl-2:shmdrl-3:shmdrl-4:2:構(gòu)建表達(dá)針對(duì)mdrl的shRNA載體(pGE-shmdrl)(1)將合成的shmdrl的上游和下游序列經(jīng)退火連接形成雙鏈寡核苷酸片段，保存于-20。C。(2)BamHI和Xbal雙酶切pGE_l載體(見(jiàn)圖la，Stratagene公司)后，與sh-mdrl雙鏈寡核苷酸片段孵育，16t:連接過(guò)夜。取5ul連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制備的大腸桿菌(SCS-1)感受態(tài)，每種載體挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆，搖菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取菌液lul進(jìn)行PCR反應(yīng)，上游引物5-CGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3，下游引物5-GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG-3。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4。C變性3min;94。C30s，55。C30s，72。Clmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸5min。同時(shí)擴(kuò)增pGE-l載體作為參照。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。pGE-l載體的產(chǎn)物長(zhǎng)度為605bp，成功插入sh-mdrl片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度為647bp。圖2所示1，2，3，4分別為pGE-shmdrl-l，pGE-shmdrl-2，pGE-shmdrl-3，pGE-shmdrl-4，其長(zhǎng)度大于pGE-l載體的產(chǎn)物長(zhǎng)度，證明連接產(chǎn)物的正確性。(3)對(duì)于成功插入sh-mdrl片段的重組載體進(jìn)行測(cè)序鑒定(由上海生工公司完成)，以保證插入片段的準(zhǔn)確性。將成功構(gòu)建的重組載體分別命名為pGE-shmdrl-l，pGE_shmdrl_2，pGE_shmdrl_3，pGE_shmdrl_4。3:建立穩(wěn)定表達(dá)shmdr-l的腫瘤細(xì)胞株及mdrl表達(dá)量的變化(1)將構(gòu)建好的4個(gè)pGE-shmdrl載體(pGE-shmdrl-l，pGE-shmdrl-2，pGE-shmdrl-3，pGE-shmdrl-4)及陰性對(duì)照載體pGE-Negative(見(jiàn)圖lb，Stratagene公司)采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen公司)方法分別轉(zhuǎn)染白血病耐藥細(xì)胞系K562/A02，用700ug/mlG418篩選，通過(guò)有限稀釋法克隆化細(xì)胞，得到4個(gè)穩(wěn)定表達(dá)pGE-shmdrl的腫瘤細(xì)胞株以及pGE-Negative腫瘤細(xì)胞株，將它們分別命名為pshl，psh2，psh3，psh4，P-N細(xì)胞。(2)實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞mdrl表達(dá)量的變化。分別收集pshl，psh2，psh3，psh4，p-N細(xì)胞，以lmlTrizol(Invitrogen公司)裂解細(xì)胞后，通過(guò)氯仿，異丙醇抽提得到RNA，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度，取2ugRNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-2(TC保存。應(yīng)用SYBRGreenI染料法(ABI公司)檢測(cè)pshl，psh2，psh3，psh4，p-N，K562，K562/A02各組細(xì)胞mdrl的表達(dá)量，內(nèi)參P-actin上游引物5-CCTGGCACCCAGCACAAT-3，下游引物5-GGGCCGGACTCGTCATAC-3;mdrl上游引物5-ATAATGCGACAGGAGATAGG-3，下游引物5-ATGTTGCCATTGACTGAAA-3;PCR反應(yīng)條件為95°C15min，95。C15s，60。Clmin，40個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增曲線結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線反應(yīng)以驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性。以2—AAet法表示mdrl相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示與P_N細(xì)胞組比較，pshl的mdrl相對(duì)表達(dá)量為0.05±0.07，psh2的mdrl相對(duì)表達(dá)量為0.617±0.146，psh3的mdrl相對(duì)表達(dá)量為0.437±0.06，psh4的mdrl相對(duì)表達(dá)量為0.298±0.06(p<0.OOl)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中pshl組細(xì)胞降低最顯著，見(jiàn)圖3。(3)Westernblot方法檢測(cè)各組細(xì)胞P-糖蛋白的表達(dá)量。分別收集pshl，psh2，psh3，psh4，p-N，K562，K562/A02細(xì)胞，以蛋白裂解液(10mMTris-HCl(pH7.4)，1%NP-40,0.1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，O.15MNaCl，lmMEDTA-2Na)冰上裂解30min，12000rpm，4度離心10min收集上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20ug變性后的樣品，以5%濃縮膠和8%分離膠進(jìn)行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗為鼠抗人P-gP(SantaCruz公司1:1000)室溫孵育2小時(shí)，TBST洗滌，二抗為兔抗鼠IgG-HRP(SantaCruz公司1:10000)室溫孵育1小時(shí)，洗滌，ECL顯影。同時(shí)以P-ACTIN為內(nèi)參照。Westernblot結(jié)果顯示與P_N細(xì)胞組比較，pshl，psh2，psh3，psh4各組細(xì)胞P-gP蛋白的表達(dá)量均下降，其中pshl細(xì)胞組降低最顯著，見(jiàn)圖4。4:RNAi用于逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞惡性表型及藥物敏感性實(shí)驗(yàn)(1)羅丹名123蓄積實(shí)驗(yàn)用無(wú)血清，無(wú)抗生素1640培養(yǎng)基調(diào)整pshl，psh2，psh3，psh4，p-N各組細(xì)胞濃度至107ml，取各組細(xì)胞lml置于6孔板中培養(yǎng)，加入羅丹名123，終濃度為10umol/l，37度培養(yǎng)箱中孵育lh，同時(shí)以不加羅丹名123的p-N細(xì)胞作為陰性對(duì)照，孵育結(jié)束后以冰冷PBS洗滌兩次，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示與P-N細(xì)胞組(154.8±42.88)比較，各組細(xì)胞羅丹名123的平均熒光強(qiáng)度均增加，證明P-gP蛋白功能減弱，其中pshl組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(660±89.74)增加最為顯著(p<0.05)。(2)羅丹名123外排實(shí)驗(yàn)用無(wú)血清，無(wú)抗生素1640培養(yǎng)基調(diào)整pshl，psh2，psh3，psh4，p-N各組細(xì)胞濃度至107ml，取各組細(xì)胞lml置于6孔板中培養(yǎng)，加入羅丹名123，終濃度為10umol/l，37度培養(yǎng)箱中孵育30min，同時(shí)以不加羅丹名123的p-N細(xì)胞作為陰性對(duì)照，孵育結(jié)束后以冰冷PBS洗滌兩次，再以無(wú)血清，無(wú)抗生素1640重懸各組細(xì)胞，繼續(xù)孵育lh，孵育結(jié)束后以冰冷PBS洗滌兩次，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示與P-N細(xì)胞組(8.7±1.64)%比較，各組細(xì)胞羅丹名123的熒光強(qiáng)度均增加，證明P-gP蛋白外排功能減弱，其中pshl組細(xì)胞羅丹名123的陽(yáng)性率達(dá)到了(96.35±3.04)%，證明pshl組細(xì)胞的P-gP蛋白表達(dá)最低，外排能力最弱(P<0.01)。(3)CCK8法檢測(cè)化療藥物的敏感性調(diào)整pshl，psh2，psh3，psh4，p-N，K562，K562/A02各組細(xì)胞濃度至107ml，每孔100ul，加入不同濃度的阿霉素(ADM)O.01-20ug/ml，藥物濃度按5倍比增加，每孔終體積為200ul，每組細(xì)胞每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72h后加入20ulCCK8(上海同仁化學(xué)所)，37度孵育2h，在酶標(biāo)儀上450nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光值(A)。細(xì)胞存活率(％)=(實(shí)驗(yàn)孔A450-空白孔A450)/(對(duì)照孔A450-空白孔A450)。計(jì)算藥物作用的50%抑制濃度(IC50)，增敏倍數(shù)，增敏倍數(shù)=對(duì)照組IC50/實(shí)驗(yàn)組IC50。同樣的方法分別檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿(VCR)，足葉以甙(VP-16)的敏感性，并計(jì)算IC50，增敏倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示與P-N細(xì)胞組比較，pshl，psh2，psh3，psh4各組細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性均增加，其中pshl組細(xì)胞對(duì)ADM的增敏倍數(shù)為39.2，敏感性增加最顯著(p<0.01)。見(jiàn)表1-1。表1-1A面IC50(ug/ml)增敏倍數(shù)"^S5.88±0.05pshl0.15±0.007*39.2psh24.76±0.11*psh33.3±0.28*1.78psh41.7±0.25*3.46*代表與p-N比較，P<0.01表1-2顯示各組細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿(VCR)的敏感性，與P-N細(xì)胞組比較，pshl細(xì)胞組IC50為0.71±0.06ug/ml，增敏倍數(shù)為11.17，敏感性增加最顯著(p<0.01)。表1-2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*代表與p-N比較，P<0.01表1-3顯示各組細(xì)胞對(duì)足葉以甙(VP-16)的敏感性，與P-N細(xì)胞組比較，pshl細(xì)胞組IC50為0.64±0.22ug/ml，增敏倍數(shù)為31.53，敏感性增加最顯著(p<0.01)。證明pGE-shmdrl-l載體干擾效果最好。表1-3VP-16IC50(ug/ml)增敏倍數(shù)p-N20.18±0.24pshl0.64±0.22*31.53psh27.73±0.62*2.61psh35.67±0.29*3.56psh42.52±0.23*8.01*代表與p-N比較，P<0.01序列表(SEQUENCELISTING)〈110〉中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所〈120〉一種能夠逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的RNA干擾藥物〈160>5〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>57〈212>RNA〈213〉人類(Homosapiens)〈220〉〈221>stem_loop〈222〉(1)(57)〈400〉1g肌cccga朋cc朋cugucagugimuc朋gagimcacugacag皿ggu皿c皿皿皿57〈210>2〈211>57〈212>RNA〈213〉人類(Homosapiens)〈220〉〈221>stem_loop〈222〉(1).(57)〈400>2ggc皿ugg皿gac3guc3caimg皿cuc肌gugacuguca3cca朋g朋3a朋g肌c57〈210>3〈211>57〈212>DNA〈213〉人類(Homosapiens)〈220〉〈221>stem_loop〈222〉(1).(57)〈400>3gatcccgaaaccaactgtcagtgtatcaagagtacactgacagttggtttctttttt57〈210>4〈211>57<212〉DNA〈213〉人類(Homosapiens)〈220〉<221〉stem_loop〈222〉(1)(57)〈400>4ggctttggttgacagtcacategttctcatgtgactgtcaaccaaagaaaaaagatc57〈210>5〈211>19〈212>DNA〈213〉人類(Homosapiens)〈220〉〈221>exon〈222>(1).(19)〈400>5gaaaccaactgtcagtgta19GluThrAsnCysGinCys1權(quán)利要求一種能夠逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的RNA干擾藥物，針對(duì)多藥耐藥基因mdrl進(jìn)行靶點(diǎn)治療，其特征是針對(duì)mdrlmRNA序列設(shè)計(jì)的一段小發(fā)夾狀RNA片段，其序列為5-GAUCCCGAAACCAACUGUCAGUGUAUCAAGAGUACACUGACAGUUGGUUUCUUUUUU-3(SEQINNO1)3-GGCUUUGGUUGACAGUCACAUAGUUCUCAUGUGACUGUCAACCAAAGAAAAAAGAUC-5(SEQINNO2)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的RNA干擾藥物，其特征是所述的小發(fā)夾狀RNA片段相對(duì)應(yīng)的DNA序列為3)4)稱之為shmdrl-l，其靶位點(diǎn)為5-GAAACCAACTGTCAGTGTA-3mdrl基因的508-526位點(diǎn)(SEQINNO:5)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的RNA干擾藥物，其特征是由shmdrl-1與pGE-1載體重組形成的pGE-shmdrl-l載體。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種能夠逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的RNA干擾藥物，針對(duì)多藥耐藥基因mdr1進(jìn)行靶點(diǎn)治療，提供了一段針對(duì)多藥耐藥基因mdr1的干擾RNA的核苷酸序列，其序列為5-GAUCCCGAAACCAACUGUCAGUGUAUCAAGAGUACACUGACAGUUGGUUUCUUUUUU-3，3-GGCUUUGGUUGACAGUCACAUAGUUCUCAUGUGACUGUCAACCAAAGAAAAAAGAUC-5，具有逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥的功能，能夠增強(qiáng)化療藥物對(duì)于白血病腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。文檔編號(hào)A61P35/02GK101732729SQ20081015324公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日發(fā)明者劉斌,杜偉廷,楊仁池,顧東生申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所