專利名稱：：人參皂甙作為制備治療次聲性損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人參皂甙在制備治療次聲性損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：次聲是頻率在0.0001~20Hz之間的聲波，人耳一般聽不到，它在各類工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境、交通環(huán)境、軍事環(huán)境及自然環(huán)境中都廣泛存在。次聲作為公共噪聲和生產(chǎn)噪聲的重要組成部分之一，已日益受到人們重視。次聲對(duì)機(jī)體的基本作用原理是生物共振，即其原發(fā)性作用機(jī)制是引起器官、組織的共振反應(yīng)。人體器官可看做是一系列多支點(diǎn)、多重心的彈簧模型。其固有振動(dòng)頻率在次聲頻率范圍內(nèi)。當(dāng)次聲作用于人體時(shí)，一方面它全方位地引起機(jī)體各部分及臟器的生物共振，使之吸收能量；另一方面，它同時(shí)刺激軀體本體感受器和內(nèi)臟器官感受器，將次聲的刺激傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相應(yīng)部位，最終引起一系列形態(tài)和功能的改變，最終影響生物氧化過程和能量的代謝合成。可見，次聲對(duì)機(jī)體的作用是全方位、多層次的，作用途徑較為復(fù)雜。次聲對(duì)人體的危害，有一些是可恢復(fù)的，有一些是不可恢復(fù)的，可以造成精神損害，也可以造成器質(zhì)性損害，損害是彌漫性的，身體的各個(gè)部分都會(huì)受到影響，有的傷害較輕，有的傷害較重，甚至有的是致命性的。次聲的損傷作用包括即期、近期、中期、遠(yuǎn)期效應(yīng)。而且急性暴露和慢性暴露有一定差別，急性損害一般是一過性的，大部分是可逆的，有的也是不可逆的。次聲的急性損傷對(duì)精神和心血管系統(tǒng)影響較明顯。人參是傳統(tǒng)的名貴中藥材，在中國(guó)已有上千年的應(yīng)用歷史。主要活性成分人參皂甙一直倍受研究者的關(guān)注。GS屬三萜皂甙，結(jié)構(gòu)上與類固醇相似，基本結(jié)構(gòu)均含有17個(gè)碳原子的淄核(見圖1)。迄今為止，人們已從人參中提取出30余種GS單體，按其在硅膠薄層色譜Rf值的大小順序?qū)⒏鱾€(gè)組分命名為R0、Ra、Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rgl、Rg2、Rg3、Rhl、Rh2、Rh3等，這些組分按化學(xué)結(jié)構(gòu)又分為兩類①達(dá)瑪烷型，包括二醇型如Rbl、Rb2、Rc、Rd、Rh2等，及三醇型，如Re、Rf、Rgl、Rg2、Rhl等；②齊墩果烷型，如R0。其中達(dá)瑪烷型占絕大多數(shù)，是GS最主要活性組分。人參皂甙Rd化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2所示。中國(guó)發(fā)明專利ZL01803432.2公開了人參皂甙Rd可用于制備治療缺血性腦血管疾病的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供人參皂甙作為制備治療次聲性損傷藥物中的應(yīng)用。所述人參皂甙為人參皂甙R0、Ra、Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rgl、Rg2、Rg3、Rhl、Rh2、Rh3，優(yōu)選為人參皂甙Rd。有效成分含有人參皂甙的藥物可采用片劑、膠囊劑、散劑、丸劑、顆粒劑、注射劑或乳劑。上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和其它常用的添加劑，如乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸鎂、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、抗壞血酸、甘露醇等。上述的制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。說明書附圖圖l人參皂甙各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2人參皂甙Rd的結(jié)構(gòu)式。圖3ssDNA標(biāo)記陽性細(xì)胞的變化，A.人參皂甙30mg/kg;B.人參皂甙10mg/kg;C.人參皂甙2mg/kg;D.次聲對(duì)照組；E.空白對(duì)照組。具體實(shí)施例方式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)l:人參皂甙Rd由廣州泰禾生物藥業(yè)有限公司提供，依照中國(guó)專利ZL01803432.2公開的方法制備。1材料與方法1.1儀器與藥物次聲聲源及檢測(cè)系統(tǒng)釆用本校在中國(guó)科學(xué)院聲學(xué)研究所和航空工業(yè)總公司第41所的指導(dǎo)和協(xié)作下建成的，聲源為電動(dòng)揚(yáng)聲器的次聲壓力倉(cāng)系統(tǒng)及檢測(cè)系統(tǒng)。1.2動(dòng)物分組及模型制作雄性SD大鼠50只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，6~7周齡，體重190~210g，實(shí)驗(yàn)前3天領(lǐng)回，分籠飼養(yǎng)于安靜環(huán)境中。動(dòng)物室溫度控制在20°C~24°C,濕度控制在50%左右，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，正常曰光周期。釆用Y型電迷宮評(píng)估方法去除學(xué)習(xí)記憶力異常的大鼠后，將迷宮成績(jī)相同的大鼠隨機(jī)區(qū)間法分組正常對(duì)照組、次聲對(duì)照組(注射生理鹽水0.5ml)以及3個(gè)次聲藥物組(30mg/kg、10mg/kg、2mg/kg)，每組各有10只動(dòng)物。次聲對(duì)照組及次聲藥物組每天暴露于16Hz，130dB的次聲4h，空白對(duì)照組動(dòng)物每天在次聲壓力倉(cāng)內(nèi)無次聲作用放置4小時(shí)。3個(gè)次聲藥物組于次聲作用前3天開始給藥、每天一次，共10天。次聲作用7天后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行Y型電迷宮評(píng)估及Anti-ssDNAMAb標(biāo)記染色。1.3學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)估采用Y型電迷宮測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力:迷宮內(nèi)3條臂中除亮燈的一側(cè)臂不通電流其余兩側(cè)均有低壓電流，大鼠從起始有電區(qū)直接跑向亮燈無電區(qū)為正確。訓(xùn)練3天后,記錄連續(xù)9次正確跑到終點(diǎn)時(shí)間，按成績(jī)隨機(jī)區(qū)間分組。次聲作用7天后再次記錄連續(xù)9次正確跑到終點(diǎn)時(shí)間，作為最后學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。1.4免疫組織熒光染色凋亡細(xì)胞的原位標(biāo)記在凋亡過程中由于蛋白酶作用誘導(dǎo)DNA蛋白質(zhì)熱變性后而暴露的單鏈的DNA片斷(single-strandedDNAapoptosis)。過程大鼠經(jīng)10g/L戊巴比妥鈉(20mg/kg)麻醉，用40%多聚甲醛行心內(nèi)灌注l-2h，剝離出腦組織后固定2h，轉(zhuǎn)入經(jīng)0.1mol/LPB配制的207。蔗糖中脫水。待組織沉底后，經(jīng)海馬齒狀平面行冠狀切面冷凍切片，取1套切片在O.Olmol/L磷酸鉀鹽緩沖液(PBSpH7.4)中漂洗三次，每次10分鐘；入50%甲酰胺液加溫至58°C20分鐘；緩沖液漂洗三次入含1%蛋白酶K液20秒；緩沖液漂洗三次入含0.3%TritonX-100的0.01mol/LPBS浸泡25分鐘(室溫50mlPBS+3%TritonX-100溶液500^1);再次用緩沖液漂洗三次后入Anti-ssDNAMAb抗體(MouseAnti-single-strandedDNAMonoclonalAntibody,l:200)購(gòu)自Chemicon公司，孵育24h(室溫)；入生物素?zé)晒鈽?biāo)記抗體(1:500，Sigma)放置2h(室溫)，甘油封片。胎牛血清購(gòu)自Sigma公司。1.5結(jié)果觀察和圖象釆集在光鏡下(Bx-51,Olympus,Japan)觀察大鼠海馬的切片，應(yīng)用軟件(LeicaQ570c圖像分析系統(tǒng)，Germany)釆集圖像20倍并用Image-ProPlus分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析在相同條件下測(cè)量大鼠海馬齒狀回區(qū)和CA3區(qū)一個(gè)視野一定范圍內(nèi)，取灰度值代表其陽性結(jié)果。2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，學(xué)習(xí)記憶成績(jī)與Anti-ssDNAMAb標(biāo)記染色結(jié)果釆用LSD-t、Dunnett-t檢驗(yàn)分析。3結(jié)果3.1記憶功能的改變次聲作用7天后再次記錄連續(xù)9次正確跑到終點(diǎn)時(shí)間(單位分鐘)，作為最后學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。單純次聲組和正常組相比，大鼠達(dá)到連續(xù)9次正確的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(戶<0.05)。人參皂甙各劑量組的大鼠達(dá)到連續(xù)9次正確時(shí)間較單純次聲組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.05)。中劑量組與空白對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(^=0.75),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。人參皂甙各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表1)表l16Hz、130dB次聲對(duì)大鼠記憶功能的影響及人參皂甙的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注*與單純次聲組相比戶<0.05;△與空白組相比i><0.05.3.2免疫組織熒光染色經(jīng)16Hz、130dB次聲照射7天后光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬，ssDNA標(biāo)記陽性細(xì)胞呈細(xì)胞核深染，在CA1、CA3、齒狀回均有陽性細(xì)胞，其中齒狀回陽性細(xì)胞較多。選擇海馬齒狀回區(qū)顯微鏡下20倍采圖，每組選10張切片在相同大小3個(gè)區(qū)域圖取灰度值。單純次聲組和空白組相比陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.05)。人參皂甙大劑量組與中劑量組的陽性細(xì)胞較單純次聲組陽細(xì)胞數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.05);人參皂甙小劑量組與次聲組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(&0.107);人參皂甙大劑量組與中劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(iM).79)。(表2、圖3)表216Hz、130dB次聲后海馬齒狀回ssDNA標(biāo)記陽性細(xì)胞的表達(dá)及人參皂甙作用后ssDNA標(biāo)記陽性細(xì)胞表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注*與單純次聲組相比PO.05;△與空白組相比P<0.05.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2:按照中國(guó)專利01803432.2公開的的方法獲得人參總皂甙，實(shí)驗(yàn)方法與條件與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)l相同。研究發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rd和人參總皂甙均能夠減少次聲后大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量，提高大鼠空間記憶能力。人參阜武Rd及人參總皂甙對(duì)于次聲性腦損傷具有保護(hù)作用。此外，根據(jù)清除自由基作用機(jī)理的原則，這一保護(hù)作用也適用于心血管系統(tǒng)、聽覺系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病。權(quán)利要求1.人參皂甙在制備治療次聲性損傷藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述用途，其特征在于所述人參皂甙為人參皂甙RO、Ra、Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rgl、Rg2、Rg3、Rhl、Rh2、Rh3。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用途，其特征在于所述人參皂甙為人參皂甙Rd。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意之一所述的用途，其特征在于制備的藥物釆用片劑、膠囊劑、散劑、丸劑、顆粒劑、注射劑或乳劑。全文摘要本發(fā)明涉及人參皂甙在制備治療次聲性損傷藥物中的應(yīng)用。所述人參皂甙為人參皂甙R0、Ra、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh3，最好為人參皂甙Rd。人參皂甙制備的藥物可采用片劑、膠囊劑、散劑、丸劑、顆粒劑、注射劑或乳劑，上述制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。文檔編號(hào)A61P25/00GK101361748SQ20081015117公開日2009年2月11日申請(qǐng)日期2008年9月28日優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日發(fā)明者孫曉莉,范富林,鋼趙申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);廣東泰禾生物藥業(yè)有限公司