專利名稱：一種組織補片及其制備方法
技術領域：
本發明屬于組織工程的生物材料技術領域，具體涉及一種組織補片及 其制備方法。
背景技術：
覆蓋創面理想的方法是移植自體皮，但由于自體皮源常常不充足，這 樣就需要皮膚替代物。而由細胞外基質構成組織補片具有其他類材料所難 以比擬的生物相容性，是當前最有應用前景的創面覆蓋物，主要包括異體 和異種皮、羊膜類、動物腹膜、膠原膜等材料。
細胞外基質(extracellular matrix, ECM)為細胞的生存及活動提供適 宜的場所，不僅是細胞的機械支撐組織，而且是營養供給和免疫應答的場 所，參與調節胚胎發育進程，決定細胞的粘附與遷移，在創傷修復和纖維 化、細胞的生長、分化、代謝和腫瘤發生及轉移中起重要作用，并作為組 織替代材料用于臨床，在多種組織器官的修復中發揮著重要作用。其主要 成分包括膠原蛋白、非膠原糖蛋白、彈力纖維、糖胺多糖、蛋白聚糖、與 基質代謝相關的酶及細胞因子。
組織補片的促愈合作用表現在具有一定的止血促凝作用，還可誘導 多種細胞增殖分化；膠原蛋白不但可作為傷口凝血塊的基底，而且是粒細 胞、巨噬細胞、纖維母細胞的趨化性物質，為各種細胞的游走、附著、增 殖提供支架。組織補片在創面最終降解為機體修復細胞所必需的氨基酸，
為創面修復提供營養物質。
小腸粘膜下層(Small intestinal submucosa, SIS)來源于小腸,是一 種天然的細胞外基質生物材料，主要由I 、 in型膠原蛋白構成，含有少量的 IV、 V型膠原蛋白，還包含有氨基葡聚糖和糖蛋白等，所含的氨基葡聚糖主 要包括透明質酸、肝素、硫酸乙酸肝素、硫酸軟骨素A和硫酸皮膚素。SIS在 體內能引導和支持宿主細胞生長，逐漸完全降解，具有較強的機械強度，適 用于組織工程的支架材料。然而SIS來源于動物，目前的產品在植入人體后不
可避免地會產生免疫排斥反應，影響其臨床應用的效果。
羊膜是人體最厚的基膜，來源廣泛，其基底膜中含有纖維粘連素、層粘 連素和I型膠原等成分。羊膜是由羊膜上皮和含有大量膠原纖維和成纖維細 胞的基質層構成，其厚度為O. 02~0. 5mm，薄而透明，無血管。羊膜具有以下 特征(l)易于獲得，制備簡單，容易滿足臨床需求；(2)為半透膜，可允許小 分子物質通過；(3)含一定量的膠原纖維，具有一定的彈性和韌性以及抗拉力， 易于鋪展；(4)幾乎沒有免疫排斥反應。研究表明，羊膜的抗體形成及其細胞 免疫反應在各種條件下都是很低的，尚無發生嚴重排斥反應的報道。羊膜的 缺點是厚度和強度不足，用于創面后容易降解，是制約其臨床應用的瓶頸。
因此將SIS與羊膜結合可以克服兩者的缺點，形成全新的、利于臨床使 用的組織補片。經檢索，未見有此類產品的應用和文獻報道。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提出一種組織補片及其制備方 法，所制備的組織補片具有良好的機械強度、較高的生物活性和生物相容性, 無明顯免疫排斥反應，對細胞無毒性，同時制備方法具有原料來源不受限制，脫細胞效果好，無細胞殘留，去除抗原成分的優點。
本發明所提出的組織補片，其特征在于是以脫細胞小腸粘膜下層為內 層，其兩面裹覆有脫細胞羊膜層所構成，各膜層分別為l-4層結構。所述的 脫細胞羊膜為人羊膜經脫細胞處理后所形成的膜狀材料；所述的脫細胞小腸 粘膜下層為哺乳動物小腸粘膜下層經脫細胞處理后所形成的膜狀材料。
本發明所述組織補片的制備方法，包括有脫細胞羊膜和脫細胞小腸粘膜 下層的制備，以及組織補片的構建，具體步驟如下
步驟一，脫細胞羊膜的制備取健康產婦胎盤，在無菌操作下剝離羊膜， 用生理鹽水沖洗干凈，分離羊膜和絨毛膜獲取羊膜，將其浸泡于含有l 4g/L 胰蛋白酶和O. 1-0.4 g/L乙二胺四乙酸二鈉的混合消化液中，消化不少于l小 時，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，再置入含有30 50U/ml的DNA酶溶液中 浸泡25分鐘以上，去除殘留的DNA成分，降低免疫原性，用PBS漂洗后備用；
步驟二，脫細胞小腸粘膜下層的制備將哺乳動物的空腸用水沖洗干凈， 切成片段，置于含有過氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不少于1小時，用 磷酸鹽緩沖液漂洗；刮除小腸粘膜、肌層和漿膜，用PBS漂洗干凈；再將其 置入0. 1 ~ 1M的NaOH溶液中，于2 ~ 8。C條件下浸泡8分鐘以上，達到溶解 細胞、滅活病毒的目的，用PBS漂洗至中性；再置入含有DNA酶和a-半乳 糖苷酶的混合溶液中浸泡25分鐘以上，去除殘留的DNA和a-gal天然抗原 成分，降低免疫原性，最后用PBS漂洗干凈備用；其中，所述過氧乙酸的終 濃度(V/V)為0.1~0. 5%，乙醇的終濃度(V/V)為2%~10%;所述DNA酶 的終濃度為30~50U/ml， a-半乳糖苷酶的終濃度為10~25U/ml;
步驟三，組織補片的構建將制備的脫細胞羊膜鋪開展平，把制備的脫
細胞小腸粘膜下層鋪展于其上，再于其上覆蓋所制備的脫細胞羊膜鋪展，壓 緊使其緊密結合，干燥后滅菌，形成多層組織補片。所述的脫細胞小腸粘膜
下層可以是l-4層疊加；任一面的脫細胞羊膜也可以是1~4層疊加；各層 之間可以使用生物膠(包括膠原蛋白、纖維蛋白膠、透明質酸、硫酸軟骨素、 水凝膠、骨膠、明膠、果膠的任一種或是幾種的混合)涂刷粘結，再用機械壓 緊的方法使各層間緊密黏附。
本發明所制備組織補片的主要用途有U)充當組織加強物，修復機體 軟組織的強度不足或缺損(疝、瘺等)；(2)修復皮膚缺損創面(燒燙傷、 潰瘍、供皮區、營養不良和感染創面等)；(3)用于顏面部凹陷畸形的修復， 如顳部、頰部凹陷；(4)做為生物支架材料用于其他組織工程器官的制備， 如組織工程化角膜、組織工程化耳鼓膜、組織工程化肌腱、組織工程化牙周 膜、組織工程化周圍神經等。
本發明制備的組織補片，以脫細胞羊膜包裹脫細胞小腸粘膜下層可以隔
離脫細胞小腸粘膜下層的免疫毒性；而脫細胞小腸粘膜下層在內層起支撐作
用，能補償脫細胞羊膜機械強度的不足。本發明的制備方法簡單、原料來源 不受限制，不產生倫理道德問題，無細胞殘留，使用強堿環境可有效地去除 病毒，無化學物質殘留，提高了產品的生物相容性。本發明的組織補片，具 有較高的生物活性和生物相容性、無明顯免疫排斥反應、對細胞無毒性的優
點；具有一定的機械強度和韌性，其形狀大小及厚度易于改變，便于臨床縫 合固定，可覆蓋創面、充填軟組織缺損、促進創周細胞的生長和增殖，滿足 創面修復的需要；也可做為生物支架材料用于其他組織修補材料的制備。
具體實施例方式
以下結合實例詳細說明本發明技術方案的具體實施方式
。
實例一
1、 脫細胞羊膜制備羊膜取自剖宮產健康產婦胎盤，在無菌操作下剝離 羊膜，用生理鹽水沖洗干凈后，分離羊膜和絨毛膜獲取羊膜，將其浸泡于含 有1.25g/L胰蛋白酶和0. 2g/L乙二胺四乙酸二鈉的混合消化液中，37。C條件下 振搖消化l小時，用PBS漂洗后，再將其置入含有30U/ml的DNA酶溶液中，于 37。C條件下浸泡30分鐘，用PBS漂洗后備用；
2、 脫細胞小腸粘膜下層的制備將豬小腸用水沖洗干凈，切成片段，置 于含有0. 2%過氧乙酸和10%乙醇的水溶液中浸泡消毒2小時，用PBS漂洗； 刮除小腸粘膜層、肌層和漿膜，用PBS漂洗干凈；將其置入1M的NaOH溶液 中，于4。C條件下浸泡IO分鐘，用PBS漂洗至中性；再將其置入含有40U/ml 的DNA酶和10U/ml的or半乳糖苷酶的混合溶液中，于37'C條件下浸泡30 分鐘，用PBS漂洗干凈備用；
3、 組織補片的構建將制備的脫細胞羊膜和脫細胞小腸粘膜下層修剪 成同樣大小，把雙層脫細胞羊膜鋪開展平，將單層脫細胞小腸粘膜下層鋪展 于其上，再于其上覆蓋雙層脫細胞羊膜鋪展，通過機械壓緊使其緊密結合， 將其伸展自然干燥后環氧乙垸消毒滅菌，形成多層組織補片。
本實例制備的組織補片具有厚度相對較薄，降解相對較快，可用于修復 表淺的皮膚缺損創面；也可作為生物支架材料，開發其他組織工程產品。 實例二
1、脫細胞羊膜制備羊膜取自健康產婦胎盤，無菌操作下剝離羊膜，用 生理鹽水沖洗干凈后，分離羊膜和絨毛膜獲取羊膜，將其浸泡于含有2. 5g/L
胰蛋白酶和0.4g/L乙二胺四乙酸二鈉的混合消化液中，37。C振搖消化1.5小 時，用PBS漂洗后，再將其置入含有40U/ml的DNA酶溶液中，于37。C條件下 浸泡30分鐘，用PBS漂洗干凈備用；
2、 脫細胞小腸粘膜下層的制備將牛小腸用水沖洗干凈，切成片段，置 于含有0. 4%過氧乙酸和5%乙醇的水溶液中浸泡消毒4小時，用PBS漂洗；刮
除小腸粘膜層、肌層和漿膜，用PBS漂洗干凈，獲得小腸粘膜下層；將小腸 粘膜下層置入O. 5M的NaOH溶液中，于4。C條件下浸泡30分鐘，用PBS漂 洗至中性；再將其置入含有50U/ml的DNA酶和20U/ml的a-半乳糖苷酶的 溶液中，于37。C條件下浸泡30分鐘，用PBS漂洗后備用；
3、 組織補片的構建將制備的脫細胞羊膜和脫細胞小腸粘膜下層修剪 成同樣大小，把三層脫細胞羊膜鋪開疊加展平，將二層脫細胞小腸粘膜下層 疊加鋪展于其上，再于其上覆蓋三層脫細胞羊膜疊加鋪展，各層之間使用膠 原蛋白進行涂刷粘結，再通過機械壓緊使其緊密結合，最后將其冷凍干燥后 鈷60滅菌消毒，形成多層組織補片。
本實例制備的組織補片具有厚度相對較厚，機械強度較高，降解相對較 慢，可用于充當組織加強物，修復機體軟組織強度不足或缺損；修復皮膚缺 損較深的創面。
權利要求
1.一種組織補片，其特征在于是以脫細胞小腸粘膜下層為內層，其兩面裹覆有脫細胞羊膜層所構成，各膜層分別為1～4層結構；所述的脫細胞羊膜為人羊膜經脫細胞后所形成的膜狀材料；所述的脫細胞小腸粘膜下層為哺乳動物小腸粘膜下層經脫細胞后所形成的膜狀材料。
2、 制備權利要求1所述組織補片的方法，包括有脫細胞羊膜和脫細胞 小腸粘膜下層的制備，其特征在于，具體步驟如下步驟一，脫細胞羊膜制備將獲取的羊膜浸泡于含有1 4 g/L胰蛋白酶 和O. 1~0. 4 g/L乙二胺四乙酸二鈉的混合消化液中，消化不少于l小時，用磷 酸鹽緩沖液漂洗后，再置入含有30 50U/ml的DNA酶溶液中浸泡25分鐘以 上，用磷酸鹽緩沖液漂洗后備用；步驟二，脫細胞小腸粘膜下層的制備將哺乳動物的空腸用水沖洗干凈， 切成片段，置于含有過氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不少于1小時，用 磷酸鹽緩沖液漂洗；刮除小腸粘膜、肌層和漿膜，用磷酸鹽緩沖液漂洗干凈； 再將其置入O. 1 1M的NaOH溶液中，于2-8。C條件下浸泡8分鐘以上，用 磷酸鹽緩沖液漂洗至中性；再置入含有DM酶和a-半乳糖苷酶的混合溶液 中浸泡25分鐘以上，最后用磷酸鹽緩沖液漂洗干凈備用；步驟三，組織補片的構建把制備的脫細胞羊膜鋪開展平，將制備的脫 細胞小腸粘膜下層鋪展于其上，再于其上覆蓋所制備的脫細胞羊膜鋪展，壓 緊使其緊密結合，干燥后滅菌，形成多層組織補片。
3、 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于在步驟二中，所述過 氧乙酸和乙醇的最終體積濃度分別為0. 1~0. 5%和2%~10%;所述DNA酶和 a-半乳糖苷酶的終濃度分別為30~50U/ml和10~25U/ml。
4、 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于在所述步驟三中的各 膜層間使用生物膠涂刷粘結，再用機械壓緊的方法使各層間緊密黏附。
全文摘要
一種組織補片及其制備方法，本發明是以脫細胞小腸粘膜下層為內層，其兩面包裹覆有脫細胞羊膜所構成；所制備的組織補片以脫細胞羊膜隔絕了脫細胞小腸粘膜下層的免疫毒性；而脫細胞小腸粘膜下層補償了脫細胞羊膜機械強度的不足，與現有產品相比，具有較高的生物活性和生物相容性，無明顯免疫排斥反應，對細胞無毒性；同時制備方法具有原料來源不受限制，無細胞殘留，能有效滅活病毒，不產生倫理道德問題的優點。所制備的產品適用于充當組織加強物，修復機體軟組織強度不足或缺損；作為組織充填材料，用于顏面部凹陷畸形的修復。
文檔編號A61L27/26GK101366979SQ20081015079
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月3日 優先權日2008年9月3日
發明者王愛軍 申請人:陜西瑞盛生物科技有限公司