專利名稱：：抗樹突細胞的人單克隆抗體的制作方法抗樹突細胞的人單克隆抗體本申請是申請日為2002年11月7日、申請號為02826794.X、發明名稱為"抗樹突細胞的人單克隆抗體"的發明專利申請的分案申請。
背景技術：
：樹突細胞是克疫系統的特化細胞，具有觸發源發性和繼發性T淋巴細胞和B淋巴細,胞反應的獨特能力。樹突細胞作為專門的抗原-遞呈細胞(APC)，能表達MHC和致敏原初T淋巴細胞所必需的共同刺激分子。樹突細胞的這種獨特性質也被稱為"自然之佐劑"，使得人們對其在自身免疫病中的可能作用及其在開發針對各種疾病的克疫療法中的潛力產生了濃厚的興趣。樹突細胞培養的最新進展已大大地提高了我們對這種復雜類型的細胞的認識樹突細胞有兒種類型，可按其譜系、在組織中的位置、耒現型和功能進行區分。最顯著地與T淋巴細胞相關聯以觸發免疫應答的樹突細胞類型來源于骨髓。骨髓來源的樹突細胞可進一步分為l)胸腺樹突細胞，耒源于淋巴腺組織，似乎特異性地與成熟T淋巴細胞的缺失有關，2)朗罕氏細胞，屬骨髓i脊系，在皮膚中有特化的APC功能，和3)骨髓譜系來源的樹突細胞，尤其出現在血液、脾臟和淋巴結中.骨釀譜系來源的樹突細胞(包括朗罕氏細胞)的標志是l)抗屈攝取、加工以供遞呈的能力，2)在組織中選擇性遷移的能力，和3)直接刺激T淋巴細胞(原初T淋巴細胞和致敏T淋巴細胞)的能力，.盡管在樹突細胞的姿定方面有最新進展，但對樹突細胞特異性受體或分子卻知之甚少。存在多種與樹突細胞有關的分子，它們見為其它骨髓和非骨髓細胞所共用>但樹突細胞特異性試劑十分有限，.能與樹突細胞特異性和優先反應的試劑、尤其是抗體在作為粑向劑以誘導對腫瘤或傳染病抗原的有M疫應答方面具有極大的潛力。這些細胞特異性靶向劑也可進行改造，以傳遞毒素，從而清除骨髄和器官移植或其它自身免疫病中的強力APC(如樹突細胞).因此，樹突細胞特異性結合劑將具有重大的治療和診斷價值.發明概述本發明提供能結合抗原逸呈細胞(APC)、特別是人樹突細胞的分離的人單克隆抗體，還提供包含這樣的抗體的疫苗綴合物、雙特異性分子、克疫毒素和治療性組合物.因此，本發明抗體和組合物能用于多種針對樹突細胞的治療方法，例如以增強抗原遞呈或治療APC介導的疾病.在某些實施方案中，人抗體的特征在于其與樹突細胞的高親和結合力，以及其通過將具有確定功能的分子或細胞(例如腫瘤細胞、細菌、病毒、效應細胞)導向樹突細胞來影響樹突細胞的生長和/或功能的能力，因此，本發明人單克隆抗體可用作體內和體外診斷或治療劑.在其它實施方案中，人抗體的特征在于其能結合樹突細胞上的特定新裝位(例如受體).例如，本發明特異性抗體包括含有SEQIDNOS:4和2分別所示的重鏈和輕鏈M酸序列的人單克隆抗體Bll,其能結合人巨噬細胞甘露糖受體(本文中也稱為'"人B11抗原")，用SDS-PAGE測得所述受體分子量約180kp，舍有犯QIDNO:7所示的氨基酸序列.本發明的另一個特異性抗體為人單克隆抗體E21,其能與人樹突細胞E21抗原結合，用SDS-PAGE測得所述抗原分子量約30-40kD.本發明分離的人抗體包括多種抗體同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、1gD和IgE.通常它們包括IgGl(.例如IgGljc)和IgM同種型.抗體可以是全長的(例如IgGl和IgG4抗體)，也可以只包括抗原結合部分(例如Fab、F(ab')2、Fv和單鏈Fv片段)。在一個實施方案中，人抗體為重組人抗體.在另一個實施方案中，人抗體由B細胞與無限增殖化細胞融合的雜交瘤產生，所迷B細胞從具有含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基閎的基因組的轉基因非人動物如轉基因小鼠獲得。本發明的特定人抗體包括由在本發明稱為A3、A5、A23、A24、A33、B9、Bll、B33、B47、C8、C10、C20、C28、C29、C30、C35、El、E8、E10、E18、E20、E21、E24、I0F7、28-6、24-3、25-14、17-6、19-2和19-4的雜交瘤產生的那些抗體。在另一個實施方案中，本發明人抗體的特征在于與人樹突細胞特異性結合及一個或多個以下性質a)與人樹突細胞上的甘露糖受體結合的能力，結合平衡締合常數(Ka)為至少約.107M";.:b)調理人樹突細胞的能力；c)與A^f突細胞結合后的內化能力；和d)阻斷與人樹突細胞上的甘受體結合的能力因此，本發明的分離人抗體通常與樹突細胞結合，結合平衡締合常數(Ka)為至少約107M"，優選約10SM"，更優選約109M",還優選約101(>至K)UM^或更高。另一方面，本發明提供編碼本發明抗體或抗原結合部分的核酸分子。因此，本發明還包括含本發明抗體編碼核酸的重組表達載體及這樣的載體轉染的宿主細胞，本發明還包括通過培養這些宿主細胞制備本發明抗體的方法。又一個方面，本發明提供來自轉基因非人動物如轉基因小鼠的分離的B細胞，所迷B細胞能夠表達特異性結合樹突細胞的人單克隆抗體的各種同種型(如IgG、IgA和/或IgM)。沐選分離的B細胞得自用純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品克疫的轉基因非人動物如轉基因小鼠。優選轉基因非人動物如轉基因小鼠具有包括人重鏈.轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。然后使分離的B細胞無限增殖化，以提供抗樹突細胞人單克隆抗體的來源(如雜交瘤)。因此，本發明也提供能夠產生特異性結合樹突細胞的人單克隆抗體的雜交瘤。在一個實施方案中，所迷雜交瘤包括與無限增殖化細胞融合的B細胞，其中B細胞得自非人動物如轉基因小鼠，其具有含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。轉基因非人動物可用純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品免疫以獲得產抗體雜交瘤。本發明的特定雜交瘤包括在此稱為A3、A5、A23、A24、A33、B9、Bll、B33、B47、C8、CIO、C20、C28、C29、C30、C35、EI、E8、EIO、E18、E20、E21、E24、10F7、28-6、24-3、25-14、17-6、19-2和19-4的雜交瘤。又一個方面，本發明提^^表達特異性結合樹突細胞的人單克隆抗體的轉基因非人動物如轉基因小鼠(本發明也稱為"HuMab")。在一個特定的實施方案中，所迷轉基因非人動物為具有包括人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組的轉基因小鼠。轉基因非人動物可用純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品免疫。優選轉基因非人動物如轉基因小鼠能夠通過進行V-D-J重組和同種型轉換產生抗樹突細胞的人單克隆抗體的多同種型(如IgG、IgA和/或IgM),同種型轉換可通過如經典或非經典同種型轉換來進行，另一方面，本發明提供制備能特異性與樹突細胞反應的人單克隆抗體的方法。在一個實施考案中，所述方法包括用純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品免疫具有包括人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組的轉基因小鼠。然后可得到所述動鉤的B細胞(如脾B細胞)，將其與骨髓細胞融合以形成無限增殖化的能分泌抗樹突細胞的人單克隆抗體的雜交瘤細胞。本發明分離的抗樹突細胞的人單克隆抗體或其抗原結合部分可被衍生化或連接到另一個功能分子如另一個肽或蛋白(如另一個抗體、抗體片段、腫瘤配體或抗原)，形成分子綴合物(免疫綴合物)。侗如，本發明抗體或抗原結合部分可功能性地蜂接(例如通過化學偶聯、基因融合、非共價締合或其它方法)到一種或多種抗原，例如腫瘤抗原、自體抗原或病原抗原上，從而形成疫苗綴合物，以增強樹突細胞介導地免疫應答。本發明人抗樹突細胞抗體也可連接到其它治療劑如細胞毒素藥物、具有酶活性的毒素、放射性同位素及小分子，如免疫調節(如抗炎)化合物和抗癌藥物。.本發明特定疫苗綴合物包括人抗樹突細胞單克隆抗體或其片段與黑素瘤特異性抗原或前列腺癌特異性抗原綴合組成的那些綴合物。包括例如由連接到Pme117、Gp100、前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺特異性膜抗原(PSMA)的人抗樹突細胞抗體如抗體Bll組成的分子綴合物。在實施例6中描述的特定實施方案中，所述綴合物由人抗體Bll與Pmel17連接(例如基因融合)組成，如由SEQIDNO:8所示核酸序列編碼的MMV4綴合物。本發明+提供包含這樣的分子綴合物的治療性組合物。因此，在又一個實施方案中，本發明提供將抗原(例如腫瘤抗原，如黑素瘤相關抗原或前列腺相關抗原、微生物抗原或病毒抗原)導向樹突細胞(例如這樣樹突細胞內化、加工并將其表面的抗原遞呈給其它克疫細胞以誘導或增強針對抗原的克疫應答)的方法。這可以通過在體外或體內使樹突細胞與本發明疫苗綴合物如含上述pme117、GP100、PSMA或PSA的綴合物接觸來實現。另外，抗樹突細胞抗體也可在不需要的.耙細胞如腫瘤細胞的表面上表達，這樣可將所迷靶細胞導向樹突細胞。在再一個實施方案中，本發明提供通過給予患者其量足以誘導或增強免疫應答的本發明疫苗綴合物在患者體內誘導或增強針對抗原(如腫瘤細胞抗原、孩史生物抗原或病毒抗原)的免疫應答的方法。這復合體成分的抗原的T細胞介導的那些克疫應答，因此，本發明進一步提供通過給予患者有效量的上述疫苗綴合物來免疫患者的方法。本發明進一步提供雙特異性和多特異性分于，其包括至少一種的第二種結合特異性。扭細胞是其消除對宿主有益的細胞，如腫瘤細胞、微生物病原體或病毒或病毒感染細胞。合適的靶抗原包括例如腫瘤相關抗原、病原抗原、自身抗原和Fc受體(如FcyFL或FcciR)。本發明多特異性分子也包括三特異性、四特異性和其它多特異性分子。在一個實施方案中，多特異性分子包括抗增強因子(EF)部分,如結合涉及細胞毒素活性的表面蛋白的分子。另一方面，本發明提供包括藥學上可接受的載體和至少一種結合樹突細胞的本發明人單克隆抗體或其抗原結合部分的組合物，如藥用組合物或診斷組合物。在一個實施方案中，所述組合物包括各種人抗體或其抗原結合部分的結合，優選每種抗體或其抗原結^分結合不同的表位。因此，所迷結合提供了適于提供最大治療好處的多重療法。包括至少一種本^^明人單克隆抗體、或雙特異性分子、多特異性分子、疫苗綴合物或包括至少一種本發明人單克隆抗體的克疫毒素的組合物如藥用組合物與一種或多種其它.治療劑(如細胞毒性劑或細胞因子)一起，也在本發明的范圍內。又一個方面，本發明提供抑制樹突細胞的增殖和/或分化的方法，所述方法通過使用本發明抗體或其抗原結合部分(或雙特異性或多特異性抗體)，抑制樹突細胞的生長和/或誘導對樹突細胞的吞噬作用和/或人效應細胞如人多形核細胞(PMN)、.單核細胞和巨噬細胞對樹突細胞的殺滅作用來實現。在一個實施方案中，所述方法包括在體外或體內在人效應細胞的存在下將樹突細胞與一種本發明人單克隆抗體或其抗原結合部分、或多種本發明人單克隆抗體或其抗原結合部分的組合接觸。所迷方法可用于如體外或來自體內(如包括樹突細胞和效應細胞的培養物)的培養。例如，含有樹突細胞和效應細胞的樣品分子或多特異性分子)混合。另外，所迷方法可例如作為體內(如治療性或預防性)方案的一部分在患者身上實施。對于體內方法，抗體和其抗原結合部分(或本發明雙特異性分子或多特異性分子)可給予患有樹突細胞介導的疾病的人類患者。這些疾病包括例如自體免疫病、炎癥疾病、移植物抗宿主病。可用本發明方法和組合物治療(如減輕)或預防的示例性自體免疫病包括但不限于類風濕性關節炎、多發性硬化、糖尿病、重癥肌無力、'惡性貧血、愛迪生氏病、紅斑狼瘡、菜特爾綜合征和甲狀腺機能亢進，在一個實施方案中，患者另外可用調節(如增強或抑制)Fc受體如Fcy受體或Fccx受體的表達或活性的藥物治療，例如用細胞困子治療患者。在用雙特異性和多特異性分子治療過程中優選應用的細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-GSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-GSF)、干擾素i(IFN-力和胂瘤壞死因子(TNF)。本發明分離的人卑克隆抗體組合物也可與其它已知療法如抗炎和克疫抑制療法或細胞毒素組合施用。又一個方面，本發明提供在體外或體內檢測樣品中樹突細胞的存在情況以例如診斷樹突細胞相關疾病的方法。在一個實施方案中，這通過在可形成抗體和樹突細胞復合體的條件下將待測樣品和對照樣品與本發明人單克隆抗體或其抗原結合部分(或雙特異性分子或多特異性分子M矣觸來實現。然后檢測兩個樣品中的復合體形成(如采用ELISA法)，兩個樣品之間復合體形成的任何統計學顯著差異都表示測試樣品中存在樹突細胞，本發明的其它特點和優點將清楚明白地見于以下詳細說明和權利要求。附圖簡迷舒7表示用流式細胞計量術評定的人單克隆抗體B11、C20和E21與樹突細胞和iiii細胞系U9"、CEM、THP-1和L540的反應性。結合程度通過平均熒光強度測定。廚2表示用流式細胞計量術評定的人單克隆抗體Bl1、C20和E21與樹突細胞的劑量依賴性結合。結合程度通過平均熒光強度測定。^3表示用流式細胞計量術評定的人單克隆抗體B1與CD34+10.干細胞衍化樹突細胞的劑量依賴性反應性。結合程度通過平均熒光強度測定。^4表示用流式細胞計量術評定的人單克隆抗體Bl1與樹突細胞和巨噬細胞的結合。慰5表示用流式細胞計量術評定的人單克隆抗體Bl1與被誘導分化成樹突細胞表現型的THP-1的結合。癡6表示用流式細胞計量術評定的人單克隆抗體BU與短尾猴樹突細胞的結合。結合程度通過平均熒光強度測定。^7表示37'C下隨著時間推移人單克隆抗體B11被樹突細胞內化的百分比，^S表示通過刺激破傷風類毒素特異性T細胞測得的通過抗體Bll增加的抗原遞呈(與單獨抗原比較)。.萄P表示通過將人單克隆抗體B1I的VJSEQEDNO:l和2)結構域和VH(SEQIDNO:3和4)結構域連接構建的Bl1ScFv構建物。忽川表示用FACS分析測得的完整的人單克隆抗體Bll和Bll的F(aV)2片段之間與樹突細胞結合的比較。.恩〃表示樹突細胞進行的FITC右旋糖苷內化百分比。^".表示抗原與BU綴合增強了抗原遞呈，因為與單獨的破傷風類毒素相比，達到同等水平的T細胞刺激作用所需的與抗體B11綴合的破傷風類毒素的量可減少IO倍至IOO倍。溶"表示抗體Bll的可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VL)的核苷酸序列和相應的tt酸序列...^"表示編碼包含與Pmel-17抗原連接的抗體B11的融合蛋白(分子綴合物)的質粒MMV4(SEQIDNO:8)圖譜。織〃表示用流式細胞計量術評定的Bll-Pmei-n分子綴合物與樹突細胞的結合。結合程度用山羊抗人IgG(Fc特異性)檢測。恩W表示用流式細胞計量術評定的BU-Pmel-17分子綴合物與樹突細胞的結合。結合程度用兔抗Pmd-17血清檢測，然后用山羊抗兔IgG檢測。發明詳述本發明提供新型的基于抗體的療法,以調節針對抗原的免疫應答及治療和診斷疾病，包括樹突細胞介導的疾病.本發明療法應用能結合抗原遞呈細胞(APC)、尤其是樹突細胞及其相關細胞上的表位的分離的人單克隆抗體和其抗原結合部分。盡管人抗體可用多種已知技術生產，本發明第一次例示了所述人抗體在非人轉基因動物如轉基因小鼠中的生產。所述轉基因動物通過進行V-D-J重組和同種型轉換能夠生產人抗樹突細胞單克隆抗體的多種同種型(如IgG、IgA和/或IgE)。因此，本發明的各個方面包括人抗體、抗體片段、抗體模擬物、雙特異性和多特異性分子、疫苗綴合物、免疫毒素及其藥用組合物，以及非人轉基因動物及制備這樣的單克隆抗體的B細胞和雜交瘤。使用本發明抗體在體外或體內檢測樹突細胞或能表達樹突細胞抗原的相關細胞類型、或抑制樹突細胞的生長、分化和/或活性的方法也包括在本發明中。為^f吏本發明更加容易理解，首先定義一些術語。另外的定義在本發明詳細說明的全文中提到.本文所用的術語"樹突細胞"，包括未成熟和成熟樹突細胞及能分化成樹突細胞的相關骨髄祖細胞，或能表達樹突細胞性抗原的相關抗原遞呈細胞(如單核細胞和巨噬細胞)。本文所用的術語"相關"包括衍生自共同祖細胞或細胞譜系的細胞。在優選的實施方案中，本發明抗體與樹突細胞的結合抑制樹突細胞的生長。在另一個優選實施方案中，本發明抗體與樹突細胞的結合通過將具有確定功能的分子或細胞(如胂瘤細胞、效應細胞、微生物病原體)導向樹突細胞來介導對樹突細胞生長和/或功能的效應。在進一步的實施方案中，本發明抗體與樹突細胞的結合導致抗體被樹突細胞內化。本文所用的術語"抗體"是指包括由二疏鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。各重鏈由重鏈可變區(本丈簡寫成HCVR或VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文簡寫成LCVR或VL)和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可進一步被細分為稱為互補決定區(CDR)的高變區，其中散布有稱為框架區(FR)的更保守的區段。各VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從氨基末端到羧基末端按以下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白結合宿主組織或各種因子，包括免疫系統的各種細胞(如效應細胞)和經典補體系統的第一個成分(Clq),本文所用的術語抗體的"抗原結合部分"(簡稱"抗體部分")是指保留特異性地結合抗原(如樹突細胞上的抗原)的能力的抗體的一個或多個片段。巳經表明，抗體的抗原結合功能可通過全長抗體的片段執行。術語抗體的"抗原結合部分"所包括的結合片段的例子包括(i)Fab片段，這是由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(aV)2片段，這是包括由鉸鏈區的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHl結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(v)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等，(1989)^toweMl:544-546);和(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由不同基因編碼，但可使用重組方法通過合成接頭將它們接合在一起，使它們被制成其中VL和VH區段配對形成單價分子的單條蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv);參見如Bird等(19S8)Scz'e"ce242:423-425;和Huston等(1988)尸wc.Wa/L^W.&:/.M:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也有意包括在術語抗體的"抗原結合部分"中。這些抗體片段可采用本領域技術人員z^知的常關見技術獲得，且可采用與完整抗體一樣的方式篩選這些片段的效用。術語"雙特異性分子"有意包括具有能與例如(a)樹突細胞和(b)效應細胞表面上的,Fc受體結合或相互作用的兩個不同的結合特異性的任何物質，如蛋白質、肽、或蛋白質或肽復合體。在另一個實施方案中，本發明雙特異性分子具有能與(a)樹突細胞和(b)靶細胞(如腫瘤細胞)上的抗原結合或相互作用的兩個不同的結合特異性。術語"多特異性分子"或"異特異性分子"有意包括具有能與例如(a)樹突細胞、(b)效應細胞上的Fc受體和(c)至少一個其它成分結合或相互作用的兩個以上的不同的結合特異性的任何物質，如蛋白質、肽、或蛋白質或肽復合體。因此，本發明包括但不限于針對細胞表面抗原如樹突細胞抗原和針對效應細胞上的Fc受體或靶細胞(如腫瘤細胞)上的抗原的雙特異性分子、三特異性分子、四特異性分子和其它多特異性分子。術語"雙特異性抗體"進一步包括雙特異性抗體。雙特異性抗體是其中VH和VL結構域在單條多肽^Ji表達的二價雙特異性抗體，但其表達釆用短得不足以容可同一條鏈上的兩個結構域之間進行配對'的接頭，從而迫使所述兩個結構城與另一條鏈的互補結構域配對并造成兩個抗原結合部位(參見例如Holliger,P.等(l993)尸racA^"cMSc/.WSL4迎:6444-6448;R丄等(994)2:1121-1123)。本文所用的術語"多特異性抗體"是指連在一起的兩個和多個抗體、抗體結合片段(如Fab)及其衍生物或抗原結合區，其中至少有兩個具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對樹突細胞的結合特異性和對效應細胞上的Fc受體或靶細胞如腫瘤細胞上的抗原或表位的結合特異性。本文所用的術語"人抗體"有意包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。本發明人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如體外隨機誘變和位點特異性誘變或體內體細胞突變所引入的突變)。但是，本文所用的術語"人抗體"不包括其中凈汙生自另一哺乳動物物種如小鼠的種系的CDR序列已被移殖入人框架序列的抗體。本文所用的術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一抗體分子組成的制品。單克隆抗體組合物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和性。因此>術語"人單克隆抗體"是指表現出單一結合特異性、具有衍生自人種系克疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體，在一個實施方案中，人單克隆抗體由包括來自轉基因非人動物如轉基因小鼠的B細胞與無限增殖化細胞融合的雜交瘤產生，所述轉基因動物具有包括人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。本文所用的術語"重組人抗體"有意包括通過重組手段制備、表達、構建或分離的所有人抗體，如從轉有人免疫球蛋白基因的動物(如小鼠)分離的抗體(在以下第I節中進一步描i^);用重組表達載體轉染到宿主細胞表達的抗體、從重組組^^人抗體文庫分離的抗體或通過包括將人克疫球蛋甴基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它手段制備、表達、構建或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區。但是在某些實施方案中，這樣的重組人抗體經受體外誘變(或當使用轉有人Ig序列的動物時，體內發生體細胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區的氨基酸序列雖然衍生自人種系VH和VL序列并與其有關，但可能不屬于體內人抗體種系存在成分。本文所用的"異源抗體"的定義關系到產生這種抗體的轉基因非人生物體。該術語是指這樣的抗體，所述抗體具有的氨基酸序列對應，而且通常所述序列來自轉基因非人動物物種以外的物種。本文所用的"異源雜種抗體"是指具有來源于不同生物體的輕鏈和重鏈的抗體。例如，同時具有人重鏈和鼠輕鏈的抗體即是異源雜種抗體。如前所述，異源雜種抗體的例子包括嵌合抗體和人源化抗體《本文所用的"分離(的)抗體"意指基本上不含其它具有不同抗原特異性的抗體的抗體(例如，特異性結合樹突細胞和相關骨髓來源的抗原遞呈細胞(如單核細胞和巨噬細胞)且基本上不含特異性結合樹突細胞之外的細胞類型的抗體的分離抗體)。但是，特異性結合樹突細胞的分離抗體對其它細胞(例如能表達與樹突細胞上的關聯抗原相關的抗原的細胞類型)具有交叉反應性。此外，分離抗體可實質上無其它細胞物質和/或化學物質。在本發明的一個實施方案中，具有不同特異性的"分離"單克隆抗體的組合物為組成明確的組合物。本文所用的術語"特異性結合"或"特異性地結合"是指抗體結合預定的抗原或細胞類型的特異性。"特異性地結合"或"特異性地針對"特定批原或細胞類型的抗體能相對于其它抗原和細胞類型有選擇性地結合抗原或細胞類型。雖然本發明的每一種抗體特異性結合特定扭表位(例如樹突細胞表面上的表位)，但在某些實施方案中，本發明的特異性抗體可表現出與其APC的交叉反應性。在其它的實施方案中，特異性抗體只與樹突細胞反蟲。通常，抗體以至少約1x107M"的親和力結合，.其與預定抗原結合的親和力比其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA、酪蛋白)結合的親和力至少高兩倍。詞組"識別抗原的抗體"和"特異性地針對抗原的抗體"在本文中可與術語"特異性地結合抗原的抗體"互換使用。'本文所用的術語IgG抗體的"高親和力"是指結合親和力至少約1(TM'、優選至少約109M、更優選至少約lOWM—UoUM^lCPM-1或更高，例如高達10"M"或更高，但是，對于其它抗體同種型，"高親和力"結合可能會變化。例如，對于IgM同種型，"高親和力"結合是指結合親和力至少為約1x107M^本文所用的術語."K蜂合"意指特定抗體-抗原相互作用的締合常數。本文所用的術語"K解離"意指特定抗體-抗原相互作用的解離常數。本文所用的"同種型，，是指由重鏈恒定區基因編碼的抗體類別(如IgM或IgGl)'本文所用的"同種型轉換"是指抗體的類別或同種型從一種Ig類別變成另一種其它的Ig類別的現象。本文所用的"非轉換同種型"是指沒有發生同種型轉換時產生的重鏈同種型類別；編碼非轉換同種型的CH基因通常是緊接在功能性重排的VDJ基因下游的第一個CH基詞。同種型轉換分為典型或非典型同種型轉換。典型同種型轉換通過重組活動進行，所述重組活動涉及轉基因中至少一個轉換序列區。非典型同種型轉換可通過例如人和人；(S-相關性缺失)之間的同源重組進行。另外的非典型轉換機制，其中如轉基因間和/或染色體間重組可進行并實現同種型轉換。本文所用的術語"轉換序列"是指負責轉換重組的那些DNA序列。"轉換供體"序列，通常為口轉換區，在轉換重組過程中待缺失的構建物區的5'方向(即上游)。"轉換接納體"區在待缺失構建物區和置換恒定區(如Y、s等)之間。由于沒有其中重組經常發生的特異性位點，最終基因序列通常不能從構建物預測到。本文所用的"糖基化模式"定義為碳水化合物單位共價連接到蛋白質、更具體而言連接到免疫球蛋白的模式。異源抗體的糖基化模式的特征實質上與在非人轉基因動物物種產生的抗體上天然存在的糖基化模式類似，同時本領域一般技術人員知道，異源抗體的糖基化模式與衍生自轉基因的CH基因的物種的糖^^化模式相比，更類似于非人轉基因動物物種中的所i^l&化模式。本文所用的應用于某個對象的術語"天然存在(的)"是指這祥的事實，即該對象可在自然界中發現。例如，存在于可從自然界分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷^列即是天然存在的。本文所用的術語"重排(的)"是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構型，其中V區段以基本上分別編碼完整VH或VL結構域的構象直接位于D-J或J區段鄰近。重排免疫球蛋白的基因座可通過與種系DNA比較來鑒別；重排基因座具有至少一種重組的七聚體/九聚體同源性成分。本文所用的涉及V區段的術語"非重排(的)"或"種系構型"是指這樣的構型，其中V區段不被重組以直接鄰近D或J區段。本文所用的術語"核酸分子"意指包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈DNA也可以是雙鏈DNA,但優選雙鏈DNA。本文所用的涉及編碼能結.合樹突細胞的抗體或抗體部分(如VH、VL、CDR3)的核酸的術語"分離的核酸分子"意指這才羊的核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含其它核芬酸序列，所述其它核苷酸序列編碼能結合除樹突細胞外的細胞的抗體或抗體部分，且天然位于人基因組DNA中核酸的旁側。對于核酸，術語"基本同源性"表示兩種核酸或其指定序列當以最佳方式進行序列對比和比較時，雖發_現有適當的核普酸插入或缺失，但至少有約80。/。的核苷酸是相同的，通常至少約90%至95%,更優選至少約98%至99,5%的核苷酸是相同的。另外，當區段在選擇性雜交條件下與核酸鏈的互補體雜交時，也存在基本同源性。兩個序列之間的百分相同性是它們共有的相同位置數目的函數(即％同源性=相同位置數目/總位置數目x100),其中考慮了缺口的數目及各缺口的長度，為達到兩個序列的最佳對比是需要引入所述缺口的。兩條序列之間的序列比較和百分相同性確定可用數學算法實現，這在以下非限制性實施例中有描述。hap:〃ww.geg.com獲得)的GAP程序，采用NWSgapdna.CMP矩陣,以及40、50、60、70或80的缺口權重和1、.2、3、4、5或6的長度4又重來確定。兩個核苷酸或氨基酸序列的百分相同性也可應用18E.Meyers和W.雄ler(Ow^wf.4;^萬/osc/.,4:ll-17(1988》的算法(所述算法已合并到ALIGN程序中0M^2，0)),采用PAM120加權殘基表、缺口長度罰分12及缺口罰分4來確定。此外，兩個氨基酸序列之間的百分同源性可應用Needleman和Wunsch(/.Mo/.及'o/.(48):444-453(i970))算法(已合并到GCG軟件包(可A^flp:〃www.geg.cooi獲得)的GAP程序)，采用BlossumM矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重和1、2、3、4、5或6的長度^又重來確定。本發明的核酸和蛋白質序列可進一步用作"詢問序列"，對公共數據庫進行搜索，以例如鑒別相關序列。這樣的搜索可用Aitschul等(l990)7.Mo/,歷o/.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)來進行。可用NBLAST程序(計分-.IOO、字節長度-12)進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序(計分-50、字節長度.-3)進行BLAST蛋白質搜索，以荻得與本發明蛋白質分子同源的M酸序列4可如Altschu等(1997)i^c/e/cA^A饑25(17):3389-3402中所描述應用缺口BLAST,獲得缺口對比結果。當應用BLAST和缺口BLAST程序時，可使用各程序的默認參數(如XBLAST和NBLAST)。參見核酸可存在于完整細胞、細胞裂解物中，或為部分純化或實質上純凈的形式。當采用標準技術將核酸從其它細胞成分或其它污染物，如其它細胞核酸或蛋白質中純化出來時，所述核酸即是"分離的"或"變得實質上是純凈的"，所述標準技術包括^/SDS處理、CsCl分帶、柱色鐠、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領域公知技術。參見F.Ausiibd等編輯CurrentProtocolsinMdecuarBiology:GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)。本發明核酸組合物，雖然經常為cDNA、基因組或其混合物的天然序列(修飾的限制位點等除外)，但可按照標準技術進行突變，以提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可按需影響氣基酸序列。尤其，設想了獲得實質上同源于或衍生自本文所述天然V、D、J、恒定區、轉換區和其它類似序列的DNA序列(其中"衍生自"表示某序列與另一序列相同或從后者修飾得到)。術語"有效連接"意指分子功能性地互相偶合在一起，這樣一個分子的活性或狀態的變化受到其它分子的活性或狀態的影響。當使一核酸與另一核酸序列處于功能性關系時，所述核酸即是"有效連接"的。例如啟動子或增強子如果能影響序列的轉錄，即是"有效連接"到編碼序列。對于轉錄調節序列，有效連接指被連接DNA序列是毗鄰的，且當需要連接兩個蛋白質編碼區時，所述DNA序列是毗鄰的并位于讀框中。對于轉換序列，.有效連接表示序列能夠實現轉換重組.通常，兩個有效連接在一起的多肽通過肽鍵共價連接。本文所用術語"栽體"意指能夠轉運其連接的另一種核酸的核酸分子，栽體的一種類型是"質啦"，它指環狀雙鏈DNA環，另一DNA區段可連接到其上。另一種栽體是病毒栽體，其中另一DNA區段可連接到病毒基團組。某些載體能夠在其引入的宿主細胞中進行自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(如非附加型哺乳動物載體)可在引入到宿主細胞時整合到宿主細胞基因組中，從而與宿主基因組一起復制。此外，某些栽體能夠指導其有效連接的基因的表達。這樣的栽體在本發明稱為"重組表達載體"(簡稱"表達載體")。一般而言，在重組DNA技術中有用的表達載體通常以質粒的形式出現。在本說明書中，"質粒"和"載體"互換使用，因為質粒時最常用的載體形式。但是，本發明有意包括能提供等同功能的其它類型的表達載體，如病毒載體(如復制缺陷型反轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本文所用術語"重組宿主細胞."("簡稱:，宿主細胞")意指其中引入了重組表達載體的細胞。應該理解，這樣的術語不但意指特定細胞，也指這樣的細胞的后代。因為由于突蓉或環境影響，在以后4^&中可能發生某些修飾作用，這樣的后代可能實際上與親代細胞不相同，但仍包括在本文所用的術語"宿主細胞"的范圍內。本發明的各個方面在以下各部分中進行進一步的詳細描述。I.抗樹突細胞人抗體的制備雖然本文描述了生產本發明人單克隆抗體(mAb)特別優選的方法>但也可使用多種其它方法，包括常規單克隆抗體方法，如Kohler和MlsteinJtMurs256:495(1975)的標準體細胞雜交技術。雖然優選體細胞雜交程序，但也可應用其它生產單克隆抗體的技術，如B淋巴細胞的病毒轉化或癌性轉化。優選的制備雜交瘤^r動物系統是鼠系統。用鼠系統生產雜交瘤是一種成熟的程序。分離用以融合的免疫脾細胞的免疫方案和技術為本領域所公知.融合伙伴(如鼠骨髓瘤細胞)和融合程序也為人們所熟知。在優選的實施方案中，針對樹突細聘的人單克隆抗體可使用攜帶部分人免疫系統的轉基因小鼠而不是小鼠系統來生產。這些轉基因小鼠在本文稱為"HuMAb"小鼠，含有編碼非重排人重鏈((i和力和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白微小基因座，以及使內源)l鏈基因座和k鏈基因座失活的定向突變(Lonberg,N;等(1994)Ateww368(6474):856-859)。因此，所述小鼠表達小.鼠IgM或k減少，克疫應答時，其中引入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞變異，以產生高親和性人IgGK單克隆。(Lonberg，N.等，文獻同上；Lonberg,N.(1994)。/5，由e她/尸/iara"co/卿113:49-101中綜速；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)J"&m.iev./加w朋o.Vol.13:65-93,及Harding,F.和Lonberg，N.(1995)』朋.乂a7d764:536_546)。HuMab小鼠的培育在本文以下笫二節及以下文獻中詳細描述:Taylor,L.等(1992)M^/e/c爿dAi^earc/j20:6287-6295;Chen，1等(1993)/"&;2加'0"(7//加附1/"0/0^5:647-656;Tuaillon等(1993)Prac.Ato/.&it/&4卯3720-3724;Choi等(1993)Atow,eGe""/a4:117-123;Chen,J.等(1993)5MBC^.12:821-830;Tuaillon等(1994),/附7朋0/.152:2912-2920;Lo油erg等(1994)Mrtwre368(6474):856-859;Lonberg,N.(1994)Zf""必ooA^/^x,i鵬咖/尸to,o)/鄉113:49-101;Taylor,L.等(1994)她，"o加〃mmw"o/ogy6:579-591;Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)/"tew.iev./wmww/.Vol.13:65-93;Harding,F,和Lonberg,N.(1995)爿肌W764:536-546;Hshwild,D.等(1996)A^wre萬/ofec/mo/ogy14:845-851,上述所有文獻的內容通過引用^p結合到本文中。進一步參看美國專利笫5,545,806號、笫5，569，825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、笫5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號和第5,770，429號;以上專利均屬于Lonberg和Kay及GenPharmInternational;Surani等的美國專利第5,545,807號;國際公開號W098/24884(1998年6月11日公開)；WO94/25585(1994年11月10曰公開);WO93/1227(1993年6月24日公開);WO92/22645(1992年12曰23曰公并》WO92/03918(1992年3月19曰公開)，上述所有專利的公開內容通過引用全部結合到本文中。.為產生抗樹突細胞的完全人單克隆抗體，HuMab小鼠可用純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品免疫，如Lo油erg，N.等(1994)W。加'e368(6474):856-859;Fishwild,D.等(1996)Atowe所orecA加/ogv14:845-851和W098/24884所述優選小鼠第一次免疫時鼠齡在6-16個星期.例如純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品(一百萬至一千萬個細胞)可用以從腹膜內免疫HuMab小鼠。如果用純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品免疫不能導致抗體產生，也可用樹突細胞裂解物免疫小鼠，以促進免疫應答。關于各種抗原的累積經驗表明，當HuMAb轉基因小鼠初次用抗原配以弗氏完全佐劑從內(IP)免疫，然后每兩星期用抗原配以弗氏不完全佐劑進行IP免疫(共6次)時，應答效果最佳。免疫應答可在免疫方案過程中用通過眶后取血荻得的血漿樣品進行監測，血漿可例如用ELISA或流式細胞術(如下所描迷)進行篩選，具有足夠滴度的抗樹突細胞人免疫球蛋白的小鼠可用于融合目的，小鼠在處死并摘出脾臟前3天用抗原經靜脈進行刺激。據認為，對于每種抗原，可能需要進行2至3次融合。用每種抗原免疫幾只小鼠。例如，共有12只HC07和HC012系HuMAb小鼠被克疫。.,賄炎滅乂拋發戎斜^it顛4:,小鼠脾細胞可按照標準方隸分離并用PEG與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然后篩選所得雜交瘤，找出產抗原特異性抗體的雜交瘤。例如，采用50。/。PEG，將免疫小鼠脾臟淋巴細胞的單細胞懸浮液融合到六分之一數量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL15S0)。細胞以約2乂105的濃度加入平底艱￡量滴定板中，然后在選擇性培養基中溫育兩個星期，所迷培養基含有20。/。胎克隆血清、18%"653"條件培養基、5%origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、lmML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、5MmHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、SO單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、SOmg/ml慶大霉素和IXHAT(Sigma;HAT在融合后24小時加入)。兩個星期后，細胞在其中HAT用HT代替的培養基中培養，然后通過ELISA篩選板上各個孔，找出抗樹突細胞人單克隆IgM和IgG抗體。一旦出現雜交瘤大量生長的情況，通常在10至14天后就觀察培養基。.再次接種和篩選抗體分泌雜交瘤，如果人IgG抗樹突.細胞單克隆抗體仍為陽性，雜交瘤可通過有限稀釋亞克隆至少兩次。然后將穩定的亞克隆進行體外培養，在組織培養基中產生少量抗體以供鑒定。乂卓乂發絲趁荷,勿廁毅為鑒t本發明人單克隆樹突細胞抗體的結合，可例如通過流式23細胞術篩選雜交瘤，找出與樹突細胞的陽性反應。筒而言之，收集樹突細胞并洗滌，然后加入％孔板，在4'C下與雜交瘤上清液稀釋液(或者含0.1%Tween80和20%小鼠血清的單克隆抗體PBS液)溫育1小時，然后將板洗滌，并進一步在4'C下與第二抗體(如FITC或PE標記的抗人IgG)溫育1小時。細胞洗滌后，用1%多聚甲醛固定，然后分析。樣品可通過FACScan儀器，利用對單個細胞閘門的光及側散射特性進行分析.除流式細胞術試驗法夕卜，也可使用另一釆用熒光顯微術的試l^法，或該法可替代流式細胞術試驗法。細胞恰好如上所描述那樣染色，并通過熒光顯微術檢測。用這個方法可看見單個細胞，但取決于抗原的密度，靈敏度可能降低。.將與樹突細胞高親合力結合的雜交瘤進行亞克隆并進一步鑒定。可從每個雜交瘤中選出一個保留親代細胞反應性(由流式細胞術測定)的克隆，以制成5至10小管細胞庫保藏于-140。C,以及用于抗體純化目的。為純化人抗樹突細胞抗體r選出的單克隆可在兩升旋動燒瓶中生長，以供單克隆抗體純化。在用蛋白質A-瓊脂糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)進行親和色譜前，可將上清液過濾并濃縮。洗脫的IgG可用凝膠電泳和高效液相色諳檢測，以確保純度。^復沖溶液可換成PBS,而濃度可用1.43消光系數通過OD28o確定。可將單克隆抗體等分并保藏于-80。C。為確證選出的人抗樹突細胞單克隆抗體是否結合到單一表位，各抗體可用市售試劑(Pierce,Roddbrd,IL)進行生物素酰化。可用如上所描述的流式細胞術，使用未標記的單克隆抗體和生物素酰化的單克隆抗體進行竟爭性研究。可用鏈霉親和素堿性磷酸酶探針檢測生物素酰化的單克隆抗體。..為確定純化抗體的同種型，可進行同種型ELISA。微量滴定板孔可在4。C下包被10|ig/ml抗人Ig過夜。所^1用5%BSA封閉后，在環境溫度下與10|xg/ml單克隆抗體或純化同種型對照反應兩小時。然后板孔可與綴合人IgGl或人IgM特異性堿性磷酸酶的探針反應.所述板洗滌后，用pNPP底物(lmg/ml)顯.色，在OD值405450下分析。可通過蛋白質印跡法，進一步測試抗樹突細胞人IgG與樹突細胞的反應性.概括地講，可制備樹突細胞的細胞提取物，并進行十二烷基-危酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后，分離的抗原被轉移到硝酸纖維素膜上，用20%小鼠血清封閉，并用待測單克隆抗體探測。人IgG的結合可用抗人IgG堿性磷酸酶檢測，并用BCIP/NBT底物片劑(SigmaChem.Co.,St.Louis,MO)顯色。^#,勿^人^^發戎#^#逸養*^殺又承遂除可檢測人單克隆抗樹突細胞抗體與樹突細胞的特異性結合外，還可以檢測其介導呑噬和殺滅樹突細胞的能力。單克隆抗體活性的體外檢測可在體內模型檢測前提供初始篩選。概括地講，來自健康供體的多形核細胞(PMN)或其它效應細胞可通過FicollHypaque密度離心法純化，然后裂解污染性紅血細胞。洗滌后的PMN可懸浮于補充10%熱滅活胎牛血清的RPMI，并與"Cr標記的樹突細胞以可加入不同濃度的純化人抗樹突細胞IgG。非相關人IgG可用作陰性對照.試驗可在"。C下進行0至120分鐘。通過測量培養物上清液中"Cr釋放量，可分析樣品的細胞裂解情況。.私時突細胞單克隆也可互相組合進行試驗，以確定用多種單克隆抗體是否可提高細胞裂結<^樹突細胞的人單克隆抗體也可在體內模型中(如在小鼠中)進行試l^，以確定其介導呑噬和殺滅樹突細胞的效力。這些抗體可例如按照以下標準進行選擇，所迷標準并是唯一的。1.)與活樹突細胞的結合；l合。然后2.)與樹突細胞結合的高親和力；3.)與樹突細胞上單一表位的結合(以排除這樣的可能性，即具有互補活性的單克隆抗體組合使用時會竟爭結合到同一表位)；4.)樹突細胞的調理作用；5.)在人效應細胞存在下介導對樹突細胞的生長抑制、吞噬作用和/或殺滅；6.)結合到樹突細胞后的內化；7.)與樹突細胞的原位結合(例如在人組織中)；S.)樹突細胞的活化(例如誘導細胞因于釋放、克疫調節表面分子的表達(例如CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40和CD54(ICAM));9.)與樹突細胞上人甘露糖受體的結合；和10.)與靈長類動物中保守的樹突細胞抗原的結合。本發明優選的人單克隆抗體符合這些標準中的一個或多個，優選符合全部標準。在特定實施方案中，人單克隆抗體可組合使用，例如作為包括兩種或多種抗樹突細胞單克隆抗體或其片段的藥用組合物。例如，具有不同但互補的活性的人抗樹突細胞單克隆抗體可組合到單一療法中，以達到所需的治療或診斷效果。這方面的一個例證是這樣的一種組合物，其含有能被樹突狀細胞迅速內化的抗樹突細胞人單克隆抗體，所述抗體與另一種能誘導樹突細胞的抗原遞呈細胞活性(如釋放免疫刺激細胞因子)的人抗樹突細胞單克隆抗體組合。n.產生人單克隆抗樹突細胞抗體的轉基因非人動物的培育本發明又一方面提供轉基因非人動物，如轉基因小鼠，所述轉基因非人動物能夠表達能特異性結令樹突細胞(優選以高親和力結合)的人單克隆抗體。在優選的實施方案中，轉基因非人動物如轉基因小鼠(HuMab小鼠)具有包括人重鏈轉基因和輕錄轉基因的基因組。在一個實施方案中，轉基因非人動物如轉基因小鼠用純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品和/或樹突細胞裂解物免疫。優選轉基因非人動物如轉基因小鼠通過進行V-D-J重組和同種型轉換，能夠產生抗樹突細胞人單克隆抗體的多種閎種型(如IgG、.IgA和/或IgE)。同種型轉換可通過如典型或非典型同種型轉換進行。要設計能用異源抗體庫對外來抗原刺激作出應答的轉基因非人動物，需要轉基因動物中含有的異源免疫球蛋白轉基因在B細胞發育的途徑中正確地發揮其功能。在優選的實施方案中，異源重鏈轉基因的正確功能包括同種型轉換。因此，這樣構建本發明轉基因，以產生同種型轉換及一種或多種下列功能(l)高水平及細胞類型特異性表達，(2)J力能性基因重排，(3)活化和應答等位基因排斥，(4)足夠的初級庫的表達，(5)信號轉導，(6)體細胞高突變，和(7)免疫應答過程中轉基因抗體基因座的支配作用'。不需要符合以上所有標準.例如，在其中轉基因動物的內源免疫球蛋白基因座被功能性地^^壞的那些實施方案中，轉基因不需要激活等位基因排斥。此外，在其中轉基因包括功能性重排重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基園的那些實施方案中，第二個標準即功能性基因重排是不需要的，至少對已重排的那個轉基因是不需要的。有關分子克疫學的背景知識參看FundamentalImmunology,第二版，(1989),PaulWilliamE.編輯RavenPress,N.Y.,其內容通過引用結合到本文中。在某些實施方案中，用以產生本發明人單克隆抗體的轉基因非人動物在其種系中含有重排、非重排異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因，或既含有重排又食有非重排異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因。各重鏈轉基因包括至少一個CH基因，此外，重鏈轉基因可含有功能性同種型轉M列，其能夠支持編碼轉碁因動物B細胞中多種Cn基因的異源轉基因的同種型轉換。這樣的轉換序列可以是天然存在于作為轉基因CH基因來源的物種的種系免疫球蛋白基因座中的那些序列，或這樣的轉換序列可衍生自存在于接受轉基因構建物的物種(轉基因動物)的那些轉換序列。例如，用以生產轉基因小鼠的人轉基因構建物，如果它加入了與天然存在于小鼠重鏈基因座的那些轉換序列相類似的轉換序列，可發生更高頻率的同種型轉換事件，因為據推測，小鼠轉換序列可被優化以與小鼠轉換重組酶系統一起發揮其功能，而人轉換序列卻不能這樣。轉換序列可用常規克隆方法分離并克隆，或可從重疊合成寡核苷酸從頭合成。所述重疊合成寡核苷酸可在有關免疫球蛋白轉換區序列的公開序列信息的基礎上加以設計(Mills等，他c/.爿cz必M15:7305-7316(1991);Sideras等，廁./m加/"o/.1:631-642(1989)，其通過引用結合到本文中)。對于上述各轉基因動物，功能性重排異'源重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉基因可見于很大一部分的轉基因動物B細胞(至少百分之十)。用以產生本發明轉基因動物的轉基因包括一個這樣的重鏈轉基因，其包含編碼至少一個V基因區段、一個D基因區段、一個J基因區段和至少一個C區基因區段的DNA。免疫球蛋白輕鏈轉基因包含編碼至少一個V基因區段、一個J基因區段和至少一個C區基因區段的DNA。編碼輕鏈和重鏈基因區段的基因區段異源于轉基因非人動物，因為它們衍生自或對應于來自轉基因非人動物之外的物種的編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因區段的DNA。在本發明的一個方面，轉基因這樣構建，使得各個基因區段是非重排的，即不進行重排以編碼功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈。這樣的非重排轉基因支持V、D和J基因區段的重組(功能性重排)，并優選支持當接觸樹突細胞時，在轉基因非人動物中產生的重排免疫球蛋白重鏈中加入整個D區基因區段或部分D區基因區段。在替代實施方案中，轉基因包括非重排"小基因座"。這樣的轉基因通常包括相當.部分的C、D和J區段以及V基因區段的亞組。在這樣的轉基因構建物中，各種調節序列，如啟動子、增強子、類28別轉換區、RNA加工的剪接供體和剪接受體序列、重組信號等，包括來源于異源DNA的相應序列。這樣的調節序列可被摻入到來自與本發明非人轉基因動物相同或相關物種的轉基因中。例如，人克疫球蛋白基因區段可結合于攜帶嚙齒動物免疫球蛋白增強子序列的轉基因，以用于轉基因小鼠4另外，合成調節序列可摻入到轉基因，其中這樣的合成調節序列與已知天然存在于哺乳動物基因組的功能性DNA序列不同源。合成調節序列可按照普遍的規則進行設計，例如規定剪接受體位點或啟動子/增強子基序的允許序列。例如，小基因座包括基因組克疫球蛋白基因座的一部分，所述基因座與天然存在的種系Ig基因座相比，具有至少一個非必需DNA部分(如間插序列、內含子或其部分)的內部(即不在部分末端)缺失。,在本發明優選實施方案中，用以生產抗樹突細胞人抗體的轉基因動物含有至少一個、通常為2至10個、有時為25至50個或更多的在WO98/24884的實施例12中描述的轉基因(如pHCl或pHC2)拷貝，所述轉基因動物是用含有一個拷貝輕鏈轉基因(W098/24884實施例5、6、S或'14介紹的轉基因)的動物配種獲得的，子代是W098/24884實施例IO介紹的jh缺失動物配適種荻得的，所述專利的內容通過引用特意結合到本文中。動物配種使得上迷三種性狀均為純合型。這樣的動物具有以下表現型人重鏈非重排小基因座的單拷貝(每個半倍體染色體組)(W098/24884的實施例12中描述)、重排人K輕鏈構建物的單拷貝(每個半倍體染色體組)(WO98/24884的實施例14中描述)及各內源小鼠重鏈基因座中去除所有功能性Jh區段的缺失(WO98/24884的實施例10中描述)。將這樣的動物與所述jh區段的缺失純合小鼠配種(WO98/24884的實施例10),以產生^缺失純合、人重鏈構建物和輕鏈構建物半合后代。所得動物用抗原注射，并用以生產抗這些抗原的人單克隆抗體。從這種動物分離的B細胞對于人重鏈和輕鏈是單特異性的，因為它們只舍有單拷貝的各個基閎。此外，它們對于人或小鼠重鏈將是單特異性的'因為由于引入的跨越JH區的缺失(如WO98/24884的實施例9和12所描述)，內源小鼠重鏈基因的兩份拷貝都是非功能性的，此外，相當部分的B細胞對于人或小鼠輕鏈將是單特異性的，因為重排人K輕鏈基因的單拷貝表達會以等位的方式和同種型的方式排除很大部分的B細胞中內源小鼠K和X鏈基因的重排，優選實施方案中的轉基因小鼠會產生相當數量的所有組成成分免疫&艮蛋白，理想情況下實質上與天然小鼠類似。因此，例如在其中內源Ig基因已失活的實施方隸中，總免疫球蛋白水平占血清的約0.〗-10mg/ml、優選0.5-5mg/ml、理想情況下至少約1.0mg/ml。當能夠實現從IgM向IgG轉換的轉基因已被引入轉基因小鼠時，成體小鼠中血清IgG與IgM之比優選為約10:1。IgG與IgM之比在非威熟小鼠中會很低。一般來說，高于約10%、優選高于40%至80%的脾臟和淋巴結B細胞專門表達人IgG蛋白質。所述所有組成成分理想情況下接近非轉基因小鼠中出現的所有組成成分，通常至少約占10%,優選占25至50%或更高。一般而言，至少生產出約1千個不同免疫球蛋白(理想情況下是IgG),優選104至106個或更多的免疫球蛋白，這主要取決于引入到小鼠基因組的不同V、J、和D區的數量。這些免疫球蛋白通常能識別約一半和更多的高度抗原性蛋白質，如樹突細胞蛋白質。通常，免疫球蛋白對預先選擇的抗原的親和力至少約1071^1、優選至少約1C^M-1、更優選至少約W。JVT1、10"M"、10。M。或更高,例如高達1(^M"或更高。在一些實施方案中，優選產生具有預先確定的所有組成成分的小鼠，以限制體現在抗體對預定抗原類型應答中的V基因的選摔。具有預先確定的所有組成成分的重鏈轉基因可包括例如人VH基因，所述人VH基因優選用于抗體對人體中預定抗原類型的應答。另外，由于多種原因，一些VH基因被排除在確定的所有組成成分之外(例如，編碼針對預定抗原的高親和力V區的可能性小；進行體細胞突變和親和力強化(sh邵ening)的傾向低；或對一些人來說是免疫源性的)。因此，在含有各種重鏈或輕tt因區段的轉基因重排之前，可例如通過雜交或DNA測序容易地鑒別出，這樣的基因區段是來自轉基因動物之外的某生物物種-的。本發明轉基因小鼠如上所迷用純化樹突細胞制品或富集樹突細胞制品和/或樹突細胞裂解物免疫4所述小鼠能產生B細胞，后者通過轉基因內轉換重組(順式轉換)進行類別轉換，并表達能與樹突細胞反應的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以是人序列抗體>其中重鏈和輕鏈多肽由人轉基因序列編碼，所^A轉基因序列可包括衍生自體細胞突變和V區重組的序列以及種系編碼性序列；這些人序列免疫球蛋白可稱作實質上等同于人VL或VH基因區段和人L和A區段編碼的多肽序列，即使其它非種系序列可由于體細胞突變和差別V-J和V-D-J重組連接而存在.對于這些人序列抗體，各鏈的可變區通常至少有80%由人種系V、.J基因區段編碼，在重鏈情況下由D基因區段編碼；常常至少有8"/。的可變區由存在于轉基因的人種系序列編碼；經常有卯％或95%或更多.的可變區序列由存在于轉基因的>^種系序列編碼。但是，因為非種系序列通過體細胞突變及VJ和VDJ連接引入，人序列抗體常常具有一些不是由在小鼠種系的人轉基因中存在的人V、D、或J基因區段編碼的可變區序列沐時也有恒定區序列)。通常，這樣的非種系序列(或單個核苷酸位置)在CDR中或其附近群集，或在其中已知體細胞突變群集的區域群集。結合預定抗原的人序列抗體可從同種型轉換獲得，這樣包含人序列Y鏈(例如yl、丫2a、Y2B或y3)和人序列輕鏈(例如K)得以產生。這IO個殘基內經常舍有一種或多種體細胞突變，所述突變由于親和力成熟和抗原對B細胞的選擇而發生，尤其在笫二(或后續)抗原攻擊后發生。這些高親和力人序列抗體的結合親和力至少為lxlOSM—1、通常至少5x幽4、常常高于lxl0101^1、有時為5xlO'I"至1xlO"M-!或更高。本發明的另一方面涉及來自這樣的小鼠的B細胞，所述小鼠可用于產生表達能以高親和力(例如高于^10^"結合樹突細胞的人單克隆抗體的雜交瘤。因此，在本發明的另一個實施方案，這些雜交瘤可用以生產包括免疫球蛋白的組合物，所述免疫球蛋白結合樹突細胞的親和常數(Ka)至少為2xl09]^1,它們包括以下i且成的人序列輕鏈(l)具有實質上與人Vl基因區段和人Jl區段編碼的多肽序列等同的多肽序列的輕鏈可變區，和(2)具有實質上與人Cl基因區段編碼的多肽序列等同的多肽序列的輕鏈恒定區；以下組成的人序列重鏈(l)具有實質上與人Vh基因區段(任選D區)和人JH區段編碼的多肽序列等同的多舦序列的重鏈可變區，和(2)具有實質上與人&基因區段編碼的多肽序列等同的多肽序列的恒定區。抗樹突細胞的高親和力人單克隆抗體的產生由以下方法推動，所述方法用以增加轉基因小鼠(具有包括整合的人免疫球蛋白轉基因的基因組)中人可變區基因區段的所有組成成分，所述方法包括在基因組中引入包括V區基因區段(在上述整合的人免疫球蛋白轉基因中不存在)的V基因轉基因。通常，V區梓基因是包括一部分人Vh或V"Vk)基因區段陣列的酵母人工染色體，所述基因區段陣列可在人基因組中天然存在，或可通過重組方法分別剪接在一起，且可包括無序的或遺漏的V基因區段。經常有五個或更多的功能性V基因區段包括在YAC上。在這種變異中，有可能造出通過V所有組成成分擴展方法產生的轉基因小鼠，其中小鼠表達包括由V區轉基因上的V區基因區段編碼的可變區序列和在人Ig轉基因上編碼的C區的免疫球蛋白鏈。通過V所有組成成分擴展方法，可產生具有至少5個不同V基因的轉基因小鼠；也可產生具有至少約24個V基因或更多的轉基因小鼠。一些V基因區段可能是非功能性的(例如假基因等)；這些區段可保留，需要時也可通過熟練技術人員公知的重組方法選擇性地缺失.一旦小鼠種系已經過工程改造，含有功能性YAC，所述YAC擴展的V區段所有組成成分，該性狀可增殖并配種到其它遺傳背景中，包括其中具有擴展的V區段所有組成成分的功能性YAC被配種到具有不同人Ig轉基因的小鼠種系中的遺傳背景。具有擴展的V區段所有組成成分的多功能性YAC可配種到種系中，以與某個人Ig轉基因沐多種人Ig轉基因)一M作用。雖然在本文中稱為YAC轉基因，這樣的轉基因當整合到基因組時，可能基本上沒有酵母序列，如酵母自主復制所需的序列；這樣的序列在酵母中復制不再有必要之后(即在引入到小鼠ES細胞或小鼠前合子(prozygote)之前)，可任選用遺傳工程方法(例如限制酶切消化和脈沖場凝膠電泳或其它合適方法)去除。人序列免疫球蛋白表達的性狀的增殖方法包括繁殖具有人Ig轉基因、還任選具有帶有擴展的V.區段所有組成成分的功能性'YAC的轉基因小鼠。Vh和Vl基因區段都可能存在于YAC。轉基因小鼠可繁殖到專業人員想要的任何遺傳背景，包括帶有其它人轉基因(包括人Ig轉基因和/或編碼其它人淋巴細胞蛋白質的轉基因)的背景。本發明也提供由具有擴展的V區所有組成成分YAC轉基因的轉基因小鼠產生的高親和力人序列免疫球蛋白。雖然上文描迷了本發明轉基因動物的優選實施方案，但也設想了其它實施方案，它們分為四類I.含有非重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；II.含有非重排重鏈和非重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；III.含有重排重鏈和非重排輕鏈免疫球齊白轉基固的轉基因動物；IV.含有重排重,重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；.在轉基因動物的這些分類中，優選的優先順序如下在內源輕鏈基因(或至少k基因)已通過同源重組敲除的情況下為n〉i>ni>iv,在內源輕鏈基因未敲除且必須為等位基因排斥所支配的情況下為I>II>UI>IV。m.結合樹突細胞的雙特異性/多特異性分子在本發明的又一個實施方案中，抗樹突細胞人單克隆抗體或其抗原結合部分可被衍生化或連接到另一種功能性分子，如另一種肽、蛋白質或其它結合物質(如抗體、抗體片段或其它配體)，以產生既能結合樹突細胞又能結合一種或多種其它結合部位或靶表位的雙特異性或多特異性分子。例如，本發明的人抗體或其片段可功能性地連接(例如通過化學偶聯、遺傳融合、非共價締合或其它方法)到一種或多種結合樹突細胞之外的病原體或細胞(如胂瘤細胞)的其它抗體、抗體片段、肽(如配體，例如腫瘤配體)或結^^莫擬物，使得病原體或細胞被導向樹突細胞，因此，本發明包括雙特異性和多特異性分子，它們包含至少一個針對樹突細胞的笫一結合特異性和針對笫二個耙表位的笫二結合特異性。在本發明的優選實施方案中，第二個把表位是扭細胞上的抗原，如腫瘤細胞抗原、微生物抗原、病毒抗原或自身抗原。這些雙特異性和多特異性分子將樹突細胞導向靶細胞，^吏得樹突細胞能調節針對這樣的靶細胞和靶細胞抗原的免疫應答。在本發明的另一個實施方案中，第二個耙表位是Fc受體，如人FcyRI(CD64)或人Fccx受體(CD89)。因此，本發明包括既能結合FcYR、FcdEl或FcsR表達效應細胞(如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))又能結合樹突細胞的雙特異性和多特異性分子。這些取特異性和多特異性分子將樹突細胞導向效應細胞，且如同本發明人單克隆抗體一樣，可觸發Fc受體介導的效應細胞活動，如對樹突細胞的吞噬作用、抗體儂賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、細胞因子釋放和過氧化物陰離子的產生。'本發明雙特異性和多特異性分子除具有抗Fc結合特異性或抗靶細胞抗原及抗樹突細胞結合特異娃外，還可進一步包括第三個結合特異性。在一個實施方案中，所述第三個結合特異性是抗增強因子(EF)部分，如結合涉及細胞毒性活性的表面蛋白、從而增強針對靶細胞的免疫應答的分子。"抗增強因子部分"可以是抗體、功能性抗體片段或配體，其能結合特定分子，如抗原或受體，從而導致結合Fc受體、扭細胞抗原或樹突細胞決定簇的效應增強。"抗增強因子部分"可結合Fc受體、靶細胞抗原或樹突細胞。另外，抗增強因子部分可結合與第一和第二結合特異性所結合的實體不同的實體。例如，抗增強因子部分可結合能導致針對靶細胞的免疫應答增強的細胞毒性T細胞(如通過CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1)或其它免疫細胞。在一個實施方案中，本發明雙特異性和多特異性分子包含作為結合特異性的至少一種抗體或抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv。抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或其最小片段，如1990年8月7日授于Ladner等的美國專利第4,9A6,778號中所描述的Fv或單鏈構建物，其內容通過引用專門結合到本文中。在另一個實施方案中，本發明雙特異性和多特異性分子包含針對耙細胞上的抗原，如腫瘤細胞抗原、微生物抗原、病毒抗原和自身抗原的結合特異性,以及針對樹突細胞的笫二個結合特異性。在另一個實施方案中，本發明雙特異性和多特異性分子包含針對位于效應細胞表面的FccxR或FcyR的結合特異性，以及針對樹突細胞的第二個結合特異性。針對Fc受體的結合特異性可例如通過另—個單克隆抗體，包括另一個人抗體來提供。例如，抗體能結合Fcy受體，優選在不被人克疫球蛋白G(IgG)封閉的位點結合。本文所用的術語"IgG受體"指位于染色體1上的八個Y鏈基因之任何一個。這些基因共編碼十二種跨膜或可溶性受體同種型，所迷同種型可分為三類Fq受體FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)。在一個優選的實施方隸中，Fcy受體是人高親和力FcyRI。人FcyRI是一種72kDa分子，對單體IgG顯示出高親和力(108-1091^')。這樣的抗Fc丫R單克隆抗體的生產和鑒定由Fanger等在PCT申請WO88/00052和美國專利號4，954，617中描述，其內容通過引用全部結合到本文中'。這些抗體在與受體的FcY結^^位點不同的位點結合到FcyRI、FcyRII或FcyRIII的表位，因此，它們的結合基本上不受生理水平的IgG阻斷。適用于本發明的具體的抗FcyRI抗體是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAbl97。生產mAb32的雜交瘤獲自美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),ATCC保藏號為HB9469。抗FcyRImAb22和mAb22的F(ab')2片l殳可獲自Medarex,Inc.(Aonandale,N.J,)。在其它實施方案中，抗Fey受體抗體為單克隆抗體22的人源化形式(H22)。H22抗體的生產和鑒定在Graziano,R.F.等(1995)J.Immunol155(10):4996-5002和PCT/US93/10384中描述。產H22抗體細胞系于1992年11月4日保藏于在美國典型培養物保藏中心，名稱為HA022CU,保藏號為CRL11177。在又一個特定實施方案中，對Fc受體的結合特異性由結合人IgA受體如Fc-a受體(FcoRI(CD89))的抗體提供。術語"IgA受體"包括位于染色體19上的一個a基因(FcaRI)的基因產物。.i知該基因編碼幾個可變剪接的55、110kDa的跨膜同種型。FcaRI(CDS9)在單核細胞/巨喧細胞、嗜曙紅粒細胞和嗜中性粒細胞上進行組成型表達，但不在非效應細，體上進行組成型表達。FcoRI對IgAl和IgA2均具有中等親和力5x1071^1)，當暴露于細胞因子如G-CSF和GM-CSF時所述親和力提高(Morton,H.C.等(19%)CriticalReviewsinImmunology16:423-440)。已描迷了四個能在IgA配體結合結構域外結合FcaRI的FcocRI特異性單克隆抗體，它們分別被標示為A夂A59、A62和A77(Monteirc,R.C.等，1992,丄/ww朋o/.148:1764)。FcccRI和FcyRI是優選用于本發明的觸發受體，因為它們(l)主要在免疫效應細胞，如單核細胞、PMN、巨噬細胞和樹突細胞上表達；(2)表達水平高(如5,000-1003000/細胞)；(3)是細胞毒性活性(如ADCC、吞噬作用)的中介體；(4)介導針對它們的抗原，包括自身抗原的增強的抗原遞呈。在所有的實施方案中，本發明雙特異性和多特異性分子包括至少一種識別(如結合)樹突細胞的結合特異性。本文所用的"效應細胞特異性抗體"是指結合效應細胞的Fc受體的抗體或功能性抗體片段。優選用于本主題發明的抗體在不被內，源免疫球蛋白結合的位點上結合效應細胞的Fc受體。本文所用的術語"效應細胞"是指涉及免疫應答的效應階段而不是識別和激活階段的免疫細胞。示例性免疫細胞包括源自骨髓或淋巴的細胞>如淋巴細胞(如B細胞和T細胞，包括溶細胞T細胞(CTL))、殺傷細胞、自然殺傷細胞、巨p藍細胞、單核細胞、嗜曙紅細胞、嗜中性細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿細胞。一些效應細胞表達特異性Fc受體并發揮特異性免疫功能。在優選的實施方案中，效應細胞能夠誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC),如嗜中性細胞能夠誘導ADCC。例如，表達FcR的單核細胞、巨遵細胞對乾細胞進行特異性殺傷和將抗原遞呈到免疫系統的其它成分，或結合遞呈抗原的細胞。在其它實施方案中，效應細胞能吞噬靶抗原、靶細胞或微生物。效應細胞上特珠FcR的表達能被體液因素如細胞因子調節。例如，已發現Fc丫RI的表達被干擾素Y(IFN-力正調節。這種增強的表達提高攜有FcyRI的細胞針對靶標的細胞毒性活性。效應細胞能吞噬或溶解耙抗原或靶細胞。"耙細胞"是指主體(如人或動物)內不需要的細胞，其為本發明組合物(如人單克隆抗體、雙特異性或多特異性分子)靶。在一個實施方案中，靶細胞是樹突細胞，在其它實施方案中，靶細胞包括胂瘤細力包、存t生物病原體、病毒或病毒感染的細胞。37雖然優選人單克隆抗體，能用于本發明雙特異性或多特異性分子的其它抗體是鼠抗體、嵌合抗體和人源化單克隆抗體。嵌合小鼠-人單克隆抗體(即嵌合抗體)可通過本領域公知的重組DNA技術生產。例如，編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子的Fc恒定區的基因用限制酶消化，以除去編碼鼠Fc的區，且編碼人Fc恒定區的基因的相應部分取代，(參見Robinson等，閨際專利公開PCT/US86/02269;Akim等，歐洲專利申請184,187;Taniguchi,M.,歐洲專利申請171,496;Morrison等,歐洲專利申請173,494;Neuberger等，國際申請WO86/01533;Cabilly等，美國專利笫4,816,567號;CaMly等，歐洲專利申請125,023;Better等(1988Science240:1041-1043);Liu等(1987)PNAS84:3439-3443;Liu等,1987，J.Immunol,139:3521-3526;S皿等(19S7)PNAS84:214-21S;Nishimura等,1987,Canc.Res.47:999-1005;Wood等(19S5)Nature314:446-449;和Shaw等，1988,J.NatlCancerInst肌1553-155"。嵌合抗體可如下進一步人源化將不直接涉及抗原結合的Fv可變區序列用等價的人Fv可變區序列取代。有關人源化嵌合抗體的綜述由Morrison,S丄.，1985，S"》Mce229:1202-1207和Oi等,19S6，BioTechniques4:214提供。有關方法包括分離、操縱和表達編碼免疫球蛋白至少一奈重鏈或輕鏈的Fv可變區的全部或部分的核酸序列。這樣的核酸的來源對于本領域技術人員來說是乂>知的，例如獲自7E3(—種抗GPIIbffla抗體產生雜交瘤)。然后編碼嵌合抗體或其片段的重組DNA可克隆到適當的表達載體。合適的人源化抗體可另外通過CDR取代生產，參見美國專利笫5,225,539號；Jones等1986Nature321:552-525;Verhoeyan等1988Science239:1534;和Beidler等1988丄Immunol.141:4053-4060。特定的人抗體的所有CDR可用至少一部分非人CDR置換，或只有一些CDR可用.非人CDR.置換。只需要置換人源化抗體結合到Fc受體所需的CDR的數目。38抗體可通過能夠用衍生自非人抗體的CDR替換至少一部分人抗體CDR的任何方法進4亍人源化。Winter描迷了一種可用于制備本發明人源化抗體的方法(英國專利申請GB2188638A,1987年3月26日申請)，該專利的內容通過引用專門結合到本文中。人CDR可采用寡核苷酸定點誘變用非人CDR替換，這描述于標題為Hw/^"&WMwo"wc/ear尸力"goc;^y(結合人單核吞逸細胞上的免疫球蛋白G的Fc受體的人源化抗體)的國際申請WO94/10332。.其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加的嵌合抗體和人源化抗體也在本發明的范圍內..尤其，優選的人源化抗體在框架區具有氨基酸取代，以改進對抗原的結合。例如，在具有鼠.CDR的人源化抗體中，位于人框架區的氨基酸可用位于小鼠抗體相應位置的氨基酸替換。已知在一些情況下，這樣的取代可改進人源化抗體對抗原的結合。其中氨基酸已被添加、缺失或取代的抗體在本文稱為修飾抗體或改變的抗體。術語修飾抗體也包括已通過如缺失、添加或取代抗體的某些部分而被修飾的抗體，如單克隆抗體、.嵌合抗體和人源化抗體。例如，抗體可如下修飾缺失恒定區，并用另一用以提高抗體的半壽期如血清半壽期、穩定性和親和力的恒定區替換。只要雙特異性和多特異性分子具有至少一個對FcR特異的抗原結合區且觸發至少一種效.應分子功能，則任何修飾都在本發明的范圍內。本發明的雙特異性和多特異性分子可用多種已知技術制備，包括但不限于化學技術(參見如D.M.Kranz等(i兆l)尸roc.Ato/.Zo^.USA78:5807)、"po3ydoma"4支術(參見Reading的美國專利4,474,893)和重組DNA技術。....尤其，可使用本領城公知方法和以下提供的實施例所描述的方法，通過綴合組分結合特異性如抗FeR和抗樹突細胞結合特異性，可制^^本發明的雙特異性和多特異性分子，例如,雙特異性和多特異性分子的各結合特異性可單獨產生，然后互相綴合。當結合特異性為蛋白質或肽時，多種偶聯劑或交聯劑可用于共價綴合。交聯劑的實例包括蛋白質A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二疏代雙(2-賄基苯甲酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡"絲二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-l-甲酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-SMCC)(參見如Karpovsky等(1984)J,Exp.Med.160:1686;LiuMA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sd.USA82:8648)。其它方法包括Paulus(BehrjngIns.Mitt,(1985)No.78,118-132);Bre皿an等(Science(1985)229:8l-83)和Gle皿ie等(J.I腿unol.(1987)139:2367-2375)描述的那些方法。優選的綴合劑為SATA和磺基-SMCC，兩者均可荻自PierceClieroicalCo.(Rockford,IL)。當結合特異性為兒種抗體(如兩種人源化抗體)時，它們通過兩條重鏈的C末端鉸鏈區的巰基鍵合綴合。在特別優選的實施方案中，鉸鏈區被修飾，以在綴合前包含奇數個巰基殘基，優選一個巰基殘基。另外，兩個結合特異性可在同一載體中編碼，在同一宿主細胞中.表達裝配。這種方法特別適用于當雙特異性和多特異性分子為mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab')2或配體xFab融合蛋白時。本發明雙特異性和多特異性分子>雙特異性分子可為單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體、包括一單鏈抗體和結合決定簇的單鏈雙特異性分子、或包括兩個結合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性分子也可為單鏈分子或可包括至少兩個單鏈分.于。制備雙和多特異性分子的方法描述于例如美國專利號5>260,203;美國專利號5,455,030;美國專利號4,881，175;美國專利號5，132,405;美國專利號5，091,513;美國專利號5,476,786;美國專利號5，013，653;美國專利號5,258,498;和美國專利號5,482,858雙特異性和多特異性分子結合到其特異性靶標可通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物檢定(如生長抑制)或蛋白質印跡測定來確證。每一個方法通常通過應用對特定蛋白質-抗體復合體特異的標記試劑(如抗體)，來檢測所述目的復合體的存在。例如，可使用如識別并特異性地結合抗體-FcR復合體的酶聯抗體和抗體片段檢測FcR-抗體復合體。另外，可用多種其它免疫測定法之任一種4企測所述復合體。例如，抗體可進fl^i:射性標記并用于放射免疫測定(RIA)中(參見例如Weiatraub，B,，PrinciplesofRadioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,1986年3月，其內容通過引用結合到本文中)。可通過使用y計數器和閃爍計數器之類的方法，或通過放射自顯影術檢測放射性同位素。IV.抗體疫苗綴合物/免疫喜素在另一方面，本發明提供多種治療性綴合物，其包括一種或多種連接到第二種物質的人抗樹突細胞抗體(或其片段)。可連接到抗體的特定物質包括但不限于抗原(從而形成疫苗)、放射性同位素、細胞毒素(從而形成免疫毒性)和其它藥物。細胞毒素和細胞毒性劑包括任何對細胞有害(如殺滅細胞)的物質。其實例包括泰素、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、.放線菌素D、1-脫氫睪丸甾酮、糖皮質激素、普魯卡因、四卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其類似物或同系物.治療劑包括但不限于抗代謝物(如曱氨蝶呤、6-頸基嗜呤、6-硫鳥噤呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶decarbazine)、烷基化劑(如二氯曱基二乙胺、thioepa苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷酰胺、百消安、二澳甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順-二氨鉻二氯鉑(n)(DDP)順鉑)、蒽環類抗生素(如柔紅霉素(以前稱道諾霉素)、多柔比星)、抗生素(如放線菌素D(以前稱放線菌素)、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC)及抗有絲分裂劑(如長春新堿和長春堿)。本發明的抗體也可綴合到放射性同位素，如放射性碘，以產生細胞毒性的放射性藥物，用以治療樹突細胞相關疾病，如自體免疫病或炎癥疾病，或移植物抗宿主病。因此，本發明抗體綴合物可用來改變特定的生物應答，其藥物部分不能理解為限于經典化學治療劑.例如，藥物部分可為具有需要的生物活性的蛋白質或多肽。這樣的蛋白質可包括例如具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思子毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質如腫瘤壞死因子或干擾素；或生物反應調節物，如淋巴因子、白細胞介素-l("IL-l".)、白細胞介素-2("IL-2")、白細胞介素-6("IL-6'，)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子("GM-CSF，，)、粒細胞集落刺激因子("G-CSF")或其它生長因子。將這些治療性部分綴合到抗體的技術是公知的，參見如Arnon等"MonoclonalAntibodiesForImmunotarge.tingOfDrugsInCancerTherapy(癌癥治療中.用以對藥物進行兔疫導向的單克隆抗體)"，MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等(編輯)，第243-56頁(AlanR.Liss,Inc.1985);Hellstrom等"AntibodiesForDragDelivery(用于藥物遞送的抗體)，，，ControlledDrugDelivery(第二版)，Robinson等(編輯)，第623-53頁(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview(癌癥治療中細胞毒性劑的抗體栽體綜述)"，MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等(編輯)，第475-506頁(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseofRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy(方文射寸生才示記抗體在癌癥治療中的治療性應用的分析、結果和未來前景)"，MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等(編輯)，第303-16頁(AcademicPress1985),和Thorpe等，"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates(抗體-毒素綴合物的制備和細胞毒性性質)"，Immunol.Rev.62:11^58(脆)。本發明人抗樹突細胞抗體(及其片段)也可連接到一種或多種抗原，如胂瘤或病毒抗原>以形成疫苗緣合物。這使得可以將很多種抗原導向樹突細胞，以增強對抗原的加工和遞呈，并最終增強對抗原的免疫庫答。本發明抗體-抗原疫苗綴合物也可用遺傳方法或化學方法制備。在任何一種情況下，綴合物的抗體部分可由整個抗體或抗體的一部分組成，如Fab片段或單鏈Fv。此外，可將多于一種抗原加到單抗體構建物。用遺傳方法構建的抗樹突細胞抗體-抗原疫苗綴合物(如那些表達為單一重組融合蛋白的綴合物)可通過在多個位置上將選擇的抗原連接到批體來制備。.本發明的特定的用遺傳法生產的.綴合物(融合構建物)包括例如在本文中稱為MMV4的構建物，其在圖14中顯示。融合構建物MMV4包括融合到Pmell7(—種腫瘤相關抗原)的人抗樹突細胞抗體Bll。編碼MMV4的核苷,列在SEQIDNO:8中顯示。如遺傳融合構建物MMV4所例示，抗原(如Pmell7)可融合到人抗體重鏈的CH3結構域的末端。在Fab融合構建物中，抗原也可在抗體重鏈的鉸鏈區融合，或在單鏈融合構建物(ScFv構建物)中，抗原也可在可變區輕鏈和重鏈(Vjj和VJ的序列融合。另外，抗原可融合到抗體輕鏈而不是抗體重鏈，化學法構建的抗體-抗原綴合物可用多種公知易得的交聯劑制備。這些交聯劑可為同功能型化合物或異功能型化合物，如SPDP、SATA、SMCC、DTNB,其可與抗樹突細胞抗體和選擇的抗原上不同反應性M酸或碳水化合物側鏈形成共價鍵。任何可被克隆、'表達或純化的抗原可選用于本發明抗體-抗原疫苗綴合物。獲得這樣的抗原的技術在本領域是zi^知的.例如，腫瘤相關抗原可直接從癌細胞純化，用生理化學技術如串連質譜儀進行鑒定。另外，用已通過用質粒DNA克隆轉染荻得抗原的抗原陰性細胞，來檢測胂瘤特異性T細胞克隆，可分離表達抗原的克隆。然后可構建合成的肽，以精確地鑒別抗原位點和表位。本發明抗體-抗原綴合物的一個顯著優點是，它們能夠快速地引起疫苗的強烈免疫應答，/t人而改進預防、接種的效力。因此，傳染病抗原和胂瘤抗原(針對其的免疫應答是保護性的和治療性的)可綴合到本發明人抗樹突細胞抗體，如抗體Bll，以形成高效的疫苗。傳染病抗原的實例包括但不限于病毒蛋白、細菌蛋白和碳水化合物、真菌蛋白和碳7JC化合物，本發明抗體-抗原綴合物也可用以.提高針對旅游或生物戰中可能遇到的傳染性生物體及其毒素的預防接種的效力。這樣的抗原的實例包括例如炭疽抗原、.肉毒中毒毒素、癡疾抗原、馬腦炎和鼠疫耶爾森氏菌抗原。用于本發明抗體-抗原.綴合物的甚它合適的抗原包括用以預防和治療癌癥的腫瘤相關抗原。腫瘤相關抗原的實例包扭但不限于HER2/iieu、CEA、部100、MART1、丁RP-2、mdan-A、OT-ESQ-1、MN(gp250)、獨特型、MAG&1、MAGE-3、酪氨酸酶、端粒酶和MUC-1抗原。肺瘤相關抗原也包括血型抗原，如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-l、B-2抗原，在另一個優選的實施方案中，多于一種抗原被融合到單抗樹突細胞抗體構建物例如，MAGE抗原可與其它抗原如黑色素A、酪氨酸酶和gplOO，.以及佐劑如GM-CSF或IL-12結合，并融合到抗樹突細胞抗體構建物，如Bll。其它合適的抗原包括用以預防和治療病毒性疾病的病毒抗原。病毒抗原的實例包括但不限于HIV-lgag、HIV-1env、HIV-liief、HBV核心抗原、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。在另一個優選的實施方案中，選擇的抗原為黑素瘤特異性抗原，包括但不限于gplOO或Pme117。在另一個優選的實施方案中，選擇的抗原為前列腺特異性癌抗原，如PSMA.在又一個實施方案中，選擇的抗原為細菌抗原，包括但不限于鼠弓形體(rox印/ww"gO"^Z')抗原和蒼白密螺旋體(7Vepcwemfifpa/"血m)抗原。本發明的抗體-細菌抗原綴合物可用于治療或預防各種細菌性疾病，如炭疽、'肉毒中毒、破傷風、.衣原體、'霍亂、白喉、萊姆病、梅毒和結核，另一方面，.對樹突細胞特異的人抗體也可用來直接將完整細胞，如胂瘤細胞、效應細胞和微生物病原體導向樹，細胞。抗樹突細胞抗體和其抗原結合部分可直接在細胞的表面上表達，例如通過用包括編碼本發明人樹突細胞特異性抗體或其抗原結合片段的核酸序列的栽體轉染或轉導軔胞來表達。這可通過例如用編碼包含跨膜結構域和人抗樹突細胞抗體或其抗原結合片段的融合蛋白的核酸轉染扭細胞來實現。制備這樣的核酸、融合蛋白及能表達這樣的融合蛋白的細胞的方法在例如美國專利申請系列號09/203,958中描述，其內容通過引用^結合到.本丈中。另外，批樹突細胞抗體或其抗原結合片段可通過使用化學接頭、脂質標記或其它有關方法結合到細胞或病原體上(deKruif,J.等(2000)7/饑MW.6:223-227;Nizard,P.等(1998)433:83-8.8)。其表面鋪著抗樹突細胞抗體或其抗原結合片段的細胞可用以讒導針對細胞如腫瘤細胞或孩史生物病原體的特異性克疫應答。V.藥用組合物另一方面，.本發明提供治療性組令物，如藥用組合物，其包含本發明一種人單克隆抗體或其抗原結合部分,或多種單克隆抗體或其抗原結合部命的組合,并與藥學上可接受的載體一起配制。這樣的組合物還可^外包括其它治，劑，如其它抗體、細胞毒素或藥物(如免疫抑制劑)，并可單獨應用或與其它療法如方支射療法組合應用。在一個實施方案中，幾種具有互補活性的人抗樹突細胞單克隆抗體可組合使用，如作為包括兩種或多種人抗樹突細胞單克隆抗體的藥用組合物。例如，在效應細胞存在下介導對樹突細胞的高效殺45滅作用的人單克隆抗體可與另一種抑制樹突細胞生長的人單克隆抗體組合。在另一個實施方案中，被樹突細胞快速內化的人單克隆抗體可與另一種誘導樹突細胞的抗原遞呈細胞活性(如免疫刺激細胞因子的釋放)的人單克隆抗體組合。在另一個實施方案中，組合物包括一種本發明雙特異性或多特異性分子或幾種雙特異性或多特異性分子的組合(例如包含至少一種針對Fc受體的結合特異性和至少一種針對樹突細胞的結合特異性)。在又一個實施方案中，組合物包括至少一種針對功能性地連接到另一分子實體如細胞毒素或抗原(如靶細胞上的抗原)的樹突細胞的結合特異性。.本文所用的"藥學上可接受的載體".包括任何和所有生理上兼容的溶劑、分散介質、包衣料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。優選載體適用于靜脈、肌內、皮下、胃腸外、脊髓或表皮給藥(如通過注射或輸注)。取決于.給藥途徑，活性化合物(即抗體、雙特異性和多.特異性分子)可包被以某種材料，以包括所迷化合物免受可能^f吏其失去活性的酸和其它奈件的作用。."藥學上可接受的鹽"指保留所需的母體化合物的生物活性且不舍引入任何不需要的毒理效應的鹽(參見例如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm,Sci.66:1-19)。這樣的鹽的實例包括酸力n成鹽和減加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無4幾酸以及無毒有機酸的鹽，其中無毒無機酸如鹽酸、硝酸、磷酸、辟b酸、氫溴酸、氬缺酸、亞磷酸等，無毒有機酸如脂族一元羧酸和二無羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等，堿加成鹽包括衍生自堿土金屬以及衍生自無毒有機艇的鹽，其中堿土金屬如鈉、鉀、鎂、鈣等，無毒有機胺如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。本發明組合物可通it^領域公知的多種方法給藥。技術人員會懂的，給藥途徑和/或方式將根據所需的結果而改變。活性化合物可46與能保護其不被快速釋放的載體一起制備，如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑、和微囊化遞藥系統。可^f吏用生物可降解、生物兼容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、月交原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。有許多制備這樣的制劑的方法都已申請專利，通常對本領域技術人員是公知的。參見例如Siwto/"ec/Comro//ed/e/e"wDe〃ve77辦We"W(緩釋和控釋遞藥系統)，J.R.Robinson編輯，MarceDekke;Inc.7NewYork,1978。為通過某些給藥途徑給予本發明化合物，可能有必要使所述化合物包被以某種材科，或使所述化合物與某種材一牛一起給藥，以防止其失去活性。例如，所述化合物可在適當的載體如脂質體或稀釋劑中給予患者。藥學上可接受的稀釋劑包括鹽水鍰沖溶液和含水緩沖溶液。脂質體包括水包油包水CGF乳液以及常規脂質體(Strejan.等(1984)J.Afewo/w7iw"o/.7:27)藥學上可接受的載體包括無菌含水溶液或分散劑和供臨時制備無菌注射用溶液或分散液的無菌粉末。在藥學活性物質上使用這樣的媒介和介質在本領域是公知的。除非任何常規媒介或介質真的與活性化合物不兼容，否則可以考慮在本發明藥用組合物中使用它們。輔助的活性化合物也可包括在組合物中。治療性組合物通常在生產和儲藏條件下必須無菌和穩定。組合物可配制成溶液、孩史乳、脂質體或其它適于高藥物濃度的有序結構。載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適的混合物的溶劑和^l^某介。可例如通過使用如卵磷脂的包衣、通過維持在分散劑情況下需要的粒子大小和通過使用表面活性劑，保持適當的流動性。在許多情況下，優選在組合物中包括等滲劑介質，如糖類、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可通過在組合物中包括能延遲吸收作用的介質，如單^J旨酸鹽和明膠，實現對注射用組合物的延長吸收，無菌注射用溶液可如下制備將所需量的活性化合物加入到適當的溶劑中，必要時與以上列舉的一種成分或多種成分的組合一起加入到適當的溶劑中，然后進行孩t過濾除菌。通常，如下制備分散劑將活性化合物加入到包含基本分散^某介和所需的以上列舉的其它成分的無菌介質。在用以制備無菌注射用溶液的無菌粉末的情況下，優選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥(凍干)，以Mi至預先無菌過濾的溶液中得到活性成分及任何另外所需的成分的粉末。調整劑量方案以提供最佳的所需反應(如治療性反應》例如，可給予單個大丸劑，可隨時間推移給予幾個分開的劑量，或可按照治療的緊急情況的需要按比例減少或增加劑量。將用于胃腸外的組合物配制成單位劑型以使給藥方便和劑量均勻，這是特別有利的。本文所用的單位劑型是指在物理上分立的單位，適合作為單位劑量給予需治療的患者；各單位含有經計算而預先確定量的活性化合物，以與所需的藥用載體聯合產生所需的治療效果.本發明單位劑型的規格服從于和直接取決于(a)活性化合物的獨特性質和需要達到的特別治療效果，和(b)調劑領域固有限制性，例如活性化合物在不同個體的治療敏感性不同。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括(l)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞石直酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑,如十六烷抗壞血酸、丁化幾基茴香醚(BHA)、丁基化羥曱苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、ot-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。對于治療性組合物，本發明制劑包括適于經口給藥、鼻內給藥、局部給藥(包括口腔內給藥和舌下給藥)、直腸給藥、陰道給藥和/或胃腸外給藥的那些劑型所迷制劑可方便地以單位劑型的形式提供，且可通過藥物
技術領域：
乂>知的任何方法制備。能與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量根據待治療的主體和給藥的特殊方式而變化。能與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量通常為產生治療效果的組分量。通常，以總共百分之百計，這個量為約0.0％至約99%活性成分，優選約0.1%至約70%,最優選約1°/。至約30%。適于通過陰道給藥的本發明制劑也包括陰道栓劑、衛生栓、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑，它們含有本領域公知為適當的載體。用于本發明組分的局部給藥或透皮給藥的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、霜劑、洗劑、劑、溶液劑、貼劑和吸入劑。活性化合物可在無菌條件下與藥學上可接受的載體混合，需要時也可與任何防腐劑、緩沖劑或推進劑混合。本文所用的術語"胃腸外給藥"是指除腸內和局部給藥之外的給藥方式，通常為注射方式，且非限制性包括靜脈、.肌內、動脈內、鞘內、嚢內、目艮眶內、心內、.真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、嚢下、蛛網膜下、脊柱內、^J畝膜外和胸骨內注射和專俞注。可應用于本發明藥用組合物的合適的水性和非水載體的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油如橄欖油和注射用有機酯如油酸乙酯。可例如通過使用如卵磷脂的包衣、通過維持在分散劑情況下需要的粒子大小和通過使用表面活性劑，保持適當的流動性。這些組合物也可以含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過如上所述的滅菌程序和通過加入各種抗細菌劑和抗真菌劑，如尼泊金酯類、氯丁醇、苯酚山梨酸等，確保防止存在雀吏生物。也可能適合在組合物中包括等滲劑，如糖類、氯化鈉等。此外，可通過加入能延遲吸收的介質，如單硬脂酸鋁和明膠來實現注射用藥物形式的延遲吸收.當本發明化合物作為藥物給，人和動物時，可單獨給予和作為藥用組合物給予>組合物中包含例如0.01-99.9%(優選0.1-90%)的活性成分及與其組合的藥學上可接受的載體。不管所選擇的給藥方式，本發明化合物(可以水合形式使用)和/或本發明藥用組合物可通過本領域技術人員公知的常規方法配制成藥學上可接受的劑型。本發明藥用組合物中的活性成分的實際劑量水平可加以變化，以得到能有效實現針對特定患者、組合物和給藥方式所需的治療應答作用的活性成分的量，而又不對患者產生毒性。選擇的劑量水平取決于多種藥代動力學因素，包括所用的本發明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時間、所用的特定化合物的排泄率、治療持續時間、與所用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材^K接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀態、總體健康狀況和既往病史以及醫學領域公知的類似因素。在本領域具有普通技術水平的醫師或獸醫可容易地確定和開出所需的有效量的藥用組合物。例如，醫師或獸醫開始開出的所用本發明化合物的劑量水平低于為達到所要求治療效果所而需要的劑量水平，然后逐漸增加劑量，直至達到所要求的效果。通常，合適的本發明組合物的日劑量為有效產生治療效果的最低劑量的化合物的量《這個有效劑量通常取決于上述因素。優選給藥方式為靜脈、肌內、內或皮下給藥，優選在最接近靶標位點處給藥。如需要，治療性組合物的有效日劑量可以兩個、三個、四個、五個、六個或更多分劑量的形式在一天中的合適間隔時間內分開給藥，且任選以單位劑型形式給藥。雖然本發明化合物有可能單獨給藥，優逸將所述化合物作為藥用制劑(組合物)來給藥。治療性組合物可用本領域公知的醫療裝置給予。例如，在優選的實施方案中，本發明治療性化合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在以下專利公開的注射裝置美國專利號5,399,163;5,3幻,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824;或4,596,556。適用于本發明的眾所周知的賴」入體和存儲體的實例包括美國專利第4,487,603號，其中公開了用以按可控速率分配藥物的植入式微灌注泵；美國專利第4,486,194號，其中公開了通過皮膚給予藥物的治療裝置；美國專利第4,447,233號，其中公開了按精確的灌注速率遞送藥物的藥物灌注泵；美國專利第4,447,224號，其中/^開了用以連續遞藥的可變流速植入式灌注裝置；美國專利笫4,439,196號，其中公開了具有多室容器的滲透性遞藥系統；和美國專利第4,475,196號，其中公開了一種滲透性遞藥系統。這些專利通過引用結合到本文中，許多這樣的其它植入物、遞藥系統和存儲體為本領域技術人員所公知。在某些實施方案中，配制本建;明人單克隆抗體，以確保所述抗體在體內適當分布。例如，血腦^障(BBB)排除了許多高度親水性化合物。為確保本發明治療性化合物能通過BBB(如果需要)，可將它們配制在例如脂質體中。有關制備脂質體的方法，參見例如美國專利第4,522,811號、第5,374,548號和笫5,399,331號。脂質體可包括一個和多個被選擇性地轉運到特定細胞或器官的部分，從而增強靶向遞藥(參見例如V.V.Ranade(19S9)7:a/".尸/wra^co/.29:685)。示例性的導向部分包括葉酸和生物素(參見例如Low等的美國專利第5，416,016號)；甘露糖苷(Umezawa等，(1989)S/oc/^饑_8/o//2>^./仏Cow"孤".153:1038);.抗體(P.G.Bloeman等(1995)357:140;M.Owais等(1995)^2"/^av}^4ge"&C/jewo"化尸.39:180);表面活性蛋白A受體(Briscoe等(1995)爿附.丄P/23w'0/.l34),不同種類均可包括本發明制劑以及本發明的分子組分；pl20(Schreier等(1994)乂及o/.C/7e肌269:90卯)；另參見K.Keinanen;M.L丄aukkanen(1994)i^SS力故.346:123;J丄Killion;I丄Fidler(1994)/www"ow"/wA4:273。在本發明的一個實施方案中，本發明治療性化合物配制于脂質體中，；在更優選的實施方案中，所述脂質體包括導向部分。在最優選的實施方案中，脂質體中的治療性化合物通過大劑量注射(bolusinjection)遞送到最接近腫瘤或感染的位點。組合物的流動性必須達到易于注射的程度。它在生產和儲藏的條件下必須穩定，必須防止農i生物如細菌和真菌的污染。相對于未接受治療的主體，"治療有效劑量"優選調節樹突細胞的生長和/或活性至少約20%,更優選至少約40%，甚至更優選至少約60%，還更優選至少約80%。化合物調節樹突細胞的生長和/或活性的能力可在可用預測抗原遞呈和/或免疫調節有效的動物模型系統評估。另外，可通過檢驗化合物調節樹突細胞的免疫細胞刺激作用的能力，例如在體外用本文描述的測試法和熟練從業人員公知的測試法來檢驗，以評估組合物的這種性質。在一個實施方案中，治療有效量的治療性化合物可抑制樹突細胞生長和/或活性，或通過其它方式減輕主體的癥狀，如自身免疫癥狀。在另一個實施方案中，治療有效量的治療性化合物可增強樹突細胞對抗原的加工和遞呈，從而增強針對免疫原或靶抗原的免疫應答。本領域普通技術人員可根據以下因素，即患者的體型、患者癥狀的嚴重程度、患者體內的免疫活動以及選擇的特定組合物或給藥途徑>來確定所述化合物的量。組合物必須無菌，其流動性必須達到能使組合物可通過注射遞藥的程度。除水之外，載體可為等滲緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。可例如通過使用如卵磷脂的包衣、通過維持在分散劑情況下需要的粒子大小和通過使用表面活性劑，保持適當的流動性。在許多情況下，優選在組合物中包括等滲劑，如糖類、多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇以及氯化鈉，可通過在組合物中加入能延遲吸收的介質，如單硬脂酸鋁或明膠來實現注射用組合物的長期吸收。當活性化合物如上.所述被適當地保護時，它可經口給藥，如與惰性稀釋劑或可同化的食用栽體一起給藥。VI.本發明的用途和方法
技術領域：
：本發明組合物(即抗樹突細胞人單克隆抗體及其衍生物/綴合物)具有體外和體內診斷和治療效用。例如，細胞，或給予主體(如體內)中的細胞，以治療、預防或診斷多種疾病,本文所用的術語"主體、生物個體或患者，，有意包括人和非人動物。術語本發明"非人動物"包括所有脊推動物，例如哺乳動物和非哺乳動物>如非人靈長類動物、羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。在特定的實施方案中，人抗體及其衍生物在體內使用，以治療、預防或診斷多種樹突細胞介導的或樹突細胞相關的疾病。在一個實施方案中，優選的人類動物包括患有樹突細胞介導的或樹突細胞相關的疾病的人類患者。例如，本發明的方法和組合物可用以治療患有自身免疫疾病、克疫系統疾病或炎癥疾病的主體，所述疾病例如具有與樹突細胞免疫調節有關的異常或不需要的免疫活性特征的疾病.用本發明人抗樹突細胞抗體可得以治療的自身免疫疾病、免疫系統疾病或炎癥疾病包才舌類風濕性關節炎、多發性硬化、糖尿病、重癥肌無力、惡性貧血、愛迪生氏病、紅斑狼掩、萊特爾綜合征和甲狀腺機能亢進。例如，患有自身免疫疾病的主體可受益于對樹突細胞介導的自體抗原遞呈的抑制。斥和移植物抗宿主病。移植排斥近年來，在用以移植組織和器官，如皮膚、腎臟、肝臟、心臟、肺、脾臟和骨髓的手術技術的療效方面有相當大的進步。也許還沒解決的主要問題是缺少令人滿意的藥物，以在移植接受者中誘導對所移植的同種異體移植物或器官的免疫耐受性。當同種異體細胞或器官移植到宿主(即供體和受體為同物種的不同個體)時，宿主免疫細胞很可能發起針對移植物中的外來抗原的免疫應答(宿主抗移植物病)，導致移植的組織被破壞。CD8+細胞、CD+細胞、和單核細胞都參與對移植的組織的排斥。本發明的治療劑適用于抑制受體中樹突細胞介導的、同種抗原誘導的免疫應答，從而防止這些樹突細胞參與對移植的組織或器官的破壞。移植物抗宿主病本發明治療劑的一個相關用途在于調節參與移植物抗宿主病(GVHD)的免疫應答。GVHD是一種潛在的致命疾病，具有免疫能力的細胞被轉移到同種異體接受者時會發生該疾病。在這種情況下，供體中具有克疫能力的細胞會攻擊接受者中的組織。皮膚、內臟上皮和肝臟中的組織是常見的攻擊目標，它們在GVHD發病過程中會被破壞.當移植免疫組織時，如骨髓移植，該皋病會造成特別嚴重的問題；但在其它情況下(包括心臟和肝臟移植物情況)較不嚴重的GVHD也有報道。本發明治療劑可用于抑制宿主抗原遞呈細胞如樹突細胞的活性，在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物可用以調節主體針對梯原的免疫應答。本發明的人抗樹突細胞抗體可用以將抗原導向樹突細胞，從而調節抗原遞J^和加工，這樣可誘導針對抗原的免疫應答。抗原可以是肺瘤抗原和病原體(如微生物病原體)抗原。病原體可以是病毒(如fflV)、細菌、真菌或寄生蟲。抗原也可以是患者(如患有早老性癡呆的患者)中淀粉樣蛋白沉積物的一種成分，且抗原是A(3肽'.例如，以下分子復+沐可給予主體，以誘導或增強針對抗原的-免疫應答，所述分子復合體包括至少一種對連接到抗原的樹突細胞的表面上的某種成分的結合特異性，.其中所迷分子復合體對樹突細胞的結合能介導分子復合體的內化。.產生的針對抗原的免疫應答包括作為MHC-I或MHC-n復合體成分的抗體(能結合抗原)和T細胞(能結合抗原)。因此，本發明的人抗樹突細胞抗原也可用以介導主體中導向樹突細胞的免疫作用。例如，主體可用以下分子復合體免疫，所迷分子復^沐包括至少一種對連接到抗原的樹突細胞的表面上的54某種成分的結合特異性，其中所述分子復合體對樹突細胞的結合能介導分子復合體的內化，且例如增強對抗原的加工和遞呈。在另一方面，對樹突細胞特異的人抗體可用以直接將完整細胞,如腫瘤細胞、效應細胞或孩i生物病原體導向樹突細胞。抗樹突細胞抗體或其抗原結合片段可如通過用以下栽體轉染或轉導細胞，直接在細胞的表面上表達，所迷載體含有編碼本發明A^突細胞特異性抗體的核酸序列。另外，抗樹突細胞抗原或其抗原結合片段可通過使用化學接頭、或脂質標記或其它相關方法結合到細胞或病原體。具有錨著于表面的抗樹突細胞抗體或其抗原結合片段的細胞可用以誘導針對細胞(如腫瘤細胞或微生物病原體)的特定免疫應答。因此，本發明抗體可用以刺激針對病原體、毒素和自身抗原的免疫應答。特別適合釆用這種治療手段的病原體的實例包括目前還沒有針對其的特效疫苗的病原體，或常規疫苗對其不能完全有效的病原體。它們包括但不限于mv、肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、流行性感冒病毒、皰滲病毒、賈第蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌。可首先測定本發明組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)與其體外治療或診斷用途有關的結合活性。例如，本發明組合物可用以下實施例描述的流式細胞術和內化測試法進行測試。此外，可測試這些分子觸發至少一種效應分子介導的效應細胞活性(包括樹突細胞的細胞溶解作用)的活性。測試效應細胞介.導的吞噬作用和細胞溶解作用的方案為本領域所公知，本發明組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分于)在治療和診斷樹突細胞介導的或樹突細胞相關的疾病方面具有另外的效用。例如，人單克隆抗體、多特異性或雙特異性分子可用以例如在體內或體外引起一種或多種以下生物活性調理樹突細胞；在人效應細胞存在下介導對樹突細胞的吞噬作用或細胞溶解作用；抑制樹突細胞生長；自身被樹突細胞內化；或將抗原導向樹突細胞。本發明組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)的給藥方法為本領域所公知。所用分子的合適劑量取決于主體的年齡和體重以及所用的特定藥物。所述分子可偶聯到放射性核素，如0001、卯Y、1()5Rh等，這在Goldenberg,D,M.等(1981)CancerRes.41:4354-4360和EP0365997中描迷。本發明組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可偶聯到免疫調節劑。靶標特異性效應細胞，如連接到本發明組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)的效應細胞也可用作治療劑4用以導向的效應細胞可以是人白細胞，如巨噬細胞、嗜中性細胞或單核細胞。其它細胞包括嗜曙紅細胞、自然殺傷細胞和其它攜有IgG或IgA受體的細胞。如需要,.效應細胞可得自待治療主體。.靶標特異性效應細胞可在生理上可接受的溶液中作為細胞懸液來給予。所給予的細胞的數目約108-109,但可根椐治療目的加以改變。在一個實施方案中，其數量足以在例如樹突細胞獲得定位，且足以如通過呑噬作用實現細胞殺滅。在另一個實施方案中，靶標特異性樹突細另包，如連接到本發明組合物的樹秀細胞可用作治療劑，用以在靶細胞如腫瘤細胞、孩t生物病原體、病毒或病毒感染細月包定位，或用以導向抗原，且用以通過如抗原加工和遞呈實現針對粑細胞或乾抗原的克疫應答。給藥i^5也可以不同。它用以除去導向細胞的技術一起施用。例如，使用本發明組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)和/或攜有這些組合物的效應細胞的抗樹突細胞療法，可與化學療法或免疫調節療法(如抗炎或免疫抑制療法)一起使用。此外，組合免疫療法可用以將兩種不同的細胞毒性效應細胞群體導向例如樹突細胞.例如，連接到抗:FcyRI或抗CD3的抗樹突細胞抗體可與IgG或IgA受體特異性結合劑一起使用。在另一個實施方案中，用例如本發明人抗體、多特異性和雙特異性分子導向的樹突細胞可與免疫調節療法(如免疫刺激)一起使用，56以增強針對靶細胞和靶抗原的免疫應答。樹突細胞導向療法可與其它形式的免疫療法如細胞因子治療(如干擾素、TNPouGM-CSF、G-CSF、IL-2)聯W吏用。本發明的雙特異性和多特異性分子也可用以調節樹突細胞活性，如抗原加工和遞呈，.以及如通過對細胞表面上的受體進行帽化和消除來調節樹突細胞上的關聯抗原的水平。具有補體結告—立點(如能結合#傳的IgGl、2或3或IgM的各部分)的本發明組合物(如人抗體，多特異性和雙特異性分子)在補體存在的情況下也可使用。在一個實施方案中，用本發明的結合劑和適當的效應細胞對包括靶細胞的細胞群體進行活體外(exvivo)處理時，可添加補體或含有補體的血清.對包被有本發明結合劑的耙細胞的吞噬作用可通過補體蛋白的結合而得到提高。在另一個實施方案中，包被有本發明組合物(如人抗體、.多特異性和雙特異性分子)的靶細胞也可被補體裂解。本發明組令物(如人抗體、.多特異性和雙特異性分子)也可與補體一起給藥。因此,.'包含人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物也包括在本發明范圍內。這些組合,物的有利之處在于補體極其接近人抗體、多特異性或雙特異性分子。另外，本發明抗體、多特異性或雙特異性分子與補體或血清可分開給藥。在其它實施方案中，主體可另外用能調節(如增強或抑制)免疫細胞的活性和/或Fca或Fcy受體的表達或活性的藥物來治療，如通過用細胞因子治療主體。在用多特異性分子治療過程中優選給予的細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、千擾素Y(IFN-Y)和腫瘤壞死因子(TMFa)。本發明組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可用以導向例如樹突細胞，如以對所述細胞進行標記。對于這樣的用途，結合劑可連接到能被檢測的分子。因此，本發明提供了定位體內或體外的樹突細胞的方法。可檢測標記可以是例如放射性同位素、熒光化合物、酶和酶的輔因子。在一個實施方案中，本發明提供檢測樣品中樹突細胞或樹突細胞抗原的存在的方法，或測定樹突細胞或樹突細胞抗原的數量的方法，所述方法包括在容許抗體或其部分與樹突細胞或樹突細胞抗原之間形成復合體的條件下，將樣品和對照樣品與能特異性結合樹突細胞或樹突細胞抗原的人單克隆抗體或其抗原結合部分接觸。然后可檢測出形成的所述復合體，其中樣品與對照樣品相比復合體形成的差別說明了樣品中樹突細胞或樹突細胞抗原的存在。在又一個實施方案中，本發明提供了在體內或體外檢測樹突細胞的存在或對樹突細胞進4于定量的方法。所迷方法包括(i)將綴合可檢測標記物的本發明組合物(如多或雙特異性分子)或其片段給予主體；(ii)將主體暴露于用以檢測所述可檢測標記物的手段中，以鑒別包含樹突細胞的區域。'.包括本發明組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)的試劑盒及其使用說明也包括在本發明的范圍內。所述試劑盒進一步包含至少一種另外的試劑，^細胞因子或補體，或一種或多種另外的本發明人抗體(如與笫一種人抗體不同的，具有互補活性且能結合樹突細胞上的表位的人抗體)。本發明可進一步用以下實施例進行說明，這些實施例不能理解為_是:對本發明的進一步限制。.在本申請中.引用的所有圖表和所有《I用文獻、專利和出版的專利申請書的內容通過引用專門結合到本文中。實施例實施例1抗樹突細胞人單克隆抗體的生產抗樹突細胞人單克隆抗體通過用樹突細胞制品免疫HuMAb小鼠HC07品系進行生產。HC07HuMAb小鼠如美國專利第5,770,429號和第5,545,806號所描述那樣培育，所述專利的4^M^開內容通過引用結合到本文中。具體來說，HC07小鼠用在弗氏佐劑中乳化的人樹突細胞通過腹膜內注射免疫四次。筒單地說，樹突細胞如下制備。通過密度梯度離心全血或Leukopak血小板脫落制品獲得人外周血單核細胞(PBMC)。單核細胞通過教附于組織培養瓶兩小時進行分離，然后與2ng/mlGM-CSF和10ng/mlIL4在巨噬細胞無血清培養基(Gibco)中溫育5至9天，分化成樹突細胞。用于免疫的細胞新鮮使用或在-80。C下冷藏。小鼠每2-3星期免疫一次。最后，在脾切除前靜脈注射樹突細胞的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。收集相應小鼠的脾臟并將其分散為單細胞。為產生產抗樹突細胞抗體的雜交瘤，鼠脾細胞和含有抗樹突細胞抗體的血漿一起與P2X63-Ag8.653骨髓瘤細胞(保藏于ATCC，名稱為ATCCCRL150非分泌性鼠骨髓瘤細胞)和PEG融合。在含HAT的培養基中生長，以從中選出雜交瘤。雜交瘤長出后(約10至14天)，用抗人IgGELISA篩選含有產生人IgG的雜交瘤的各孔.按以下性質篩選和選擇陽性雜交瘤(1)人IgG抗體產量，和(2)結合樹突細胞.可通過流式細胞術，測試分泌人IgG的雜交瘤與各種血細胞的反應性。通過在補充GM-CSF和IL-4的培養基中培養貼壁單核細胞5至7天，可制備樹突細胞。粒細胞(PMN)、單核細力包和淋巴細胞可獲自肝素化全血。這些細胞在4。C下與獲自IgG陽性克隆的雜交瘤上清一起溫育.用FITC標記的山羊抗人IgG(Fc)探針檢測結合情況'通過使用FACScaiibur儀器進行分析，可確定細胞相關性焚光。如下表l所示，篩得的幾種雜.交瘤產生人IgGK抗體，所述抗體通過流式細胞術測定顯示出與樹突細胞的反應性(如A3、A5、A23、A24、A33、B9、Bll、B33、B47、C8、C10、C20、C28、C29、C30、C35、El、E8、EIO、E18、E20、E21、E24、10F7、28-6、24-3、25-14、17-6、19-2和19-4)。與其它血細胞類型相比，一些人抗體對樹突細胞顯示出非常高的優先反應性。表1對樹突細胞具有反應性的人單克隆抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>+^Jh-未檢出結合+/-弱或可疑結合+^/顯著結合++高結合+++極其高結合實施例2抗樹突細胞人單克隆抗體的鑒定I.純化的抗樹突細胞人抗體的結合特異性將能分泌對樹突細胞具有特異性的人IgG抗體的幾種雜交瘤進行亞克隆和擴增，以供純化。單克隆抗體可從在置于含5。/。C02的濕潤培養培養箱中的旋轉培養瓶中生長的雜交瘤培養物上清分離。坑體在蛋白質A-瓊脂糖柱上按照生產商的說明書(Pierce，RockfordIL)進行色譜純化.然后用流式細胞術測試純化的人抗體對樹突細胞和代表各種其它造血細胞類型的細胞系的反應性。概括地"i并，如上所述，通過在補充GM-CSF和IL-4的培養基中培養貼壁單核細胞5至7天，從中制備樹突細胞。U937、CEM、THP-1和L540細胞系在補充10%月臺牛血清的培養基中培養。收集和洗滌所述細胞，然后在4。C下與飽和濃度的人單克隆抗體Bll、C20、E21或同種型對照(人IgG)—起振蕩溫育1小時。通過進一步在々。C下與FITC標記的山羊抗人IgG(Fc)探溫培育1小時，檢測抗體結合情況。將細胞洗滌，用1。/。多聚甲醛固定，然后用裝有CellQuest軟件的FACScalibur(BecktonDickinson)儀器分析與細胞相關的熒光。如圖1所示，人單克隆抗體Bll專門與樹突細胞結合。單克隆抗體C20特異性結合樹突細胞，但也顯示出與單核細胞樣細胞系U-937和THP-1及何杰金氏淋巴瘤細胞系L540的低水平反應性。同樣，61人單克隆抗體E21優先結合樹突細胞，但也與L540細胞和THP-1細胞低水平反應。這些數據表面人單克隆抗體Bll、C20和E21能識別不同抗原，且與其它造血i普系的細胞相比，它們優先結合樹突細胞。II.純化的抗樹突細胞人抗體的劑量依賴型結合純化的人抗樹突細胞單克隆抗體Bll、C20和E21與樹突細胞的劑量依賴型反應性通過流式細胞術測試，如上所述從貼壁單核細胞制備樹突細胞。收集所述樹突細胞，將其在4。C下與不同濃度的單克隆抗體B11、C20和E21或同種型對照溫育。用FITC標記山羊抗人IgG(Fc)探針檢測抗體的結合，用如圖2所示，與同種型匹配對照IgG抗體相比，各單克隆抗體表現出對樹突細胞的劑量依賴型結合。這些數據表明，純化的人單克隆抗體Bll、C20和E21以濃度依賴型方式與樹突細胞結合。抗樹突細胞抗體之間不同的結合強度說明它們識別樹突細胞上獨特的分子或表位。in.人抗體Bn與CD34+干細胞來源樹突細胞的結合從循環血單核細胞分化而來的樹突細胞由于容易獲得，是研究和臨床應用中最常用的樹突細胞類型，但是，也可使用衍生自祖干細胞的樹突細胞，且能更準確地代表人體組織中的樹突細胞。因此，在以下研究中，通過流式細胞術評價從CD34+袓細胞分化而來的樹突細胞與人單克隆抗體Bll的反應性。將純化的人單克隆抗體Bll在0.3M碳酸鈉緩沖液(pH9.5)中充分透析，以供用熒光異硫氰酸酯(FITC)標記。FITC儲液通過在lmlDMSO中溶解1mg固態FITC制備。在持續攪拌下滴加FITC儲液，其加入量使得每毫克抗體蛋白得到50pgFITC。加入FITC后，所得溶液在室溫下暗處溫育1至3小時。在用PBS平衡的SephadexG-lO柱上進行凝膠迚濾，分離FITC標記抗體。CD34+祖細胞和樹突細胞分化培養基荻自PoeticTechnologies,Inc.(Gaithersburg,MD)。按照生產商的說明書使細胞分化，收集樹突細胞，在4°C下與不同濃度的B11-FITC或同種型對照抗體(人IgG-FITC)溫育。通過用帶有CdlQuest軟件的FACScalibur儀器進行分析,測定細l包相關的熒光。結果顯示于圖3且表明，人單克隆抗體Bll以劑量依賴型的方式與從CD34+干細胞分化而來的樹突細胞結合。因此，BIl靶抗原在衍生自單核細胞和衍生自祖干細胞的樹突細胞上表達。IV.人抗體Bll與巨噬細胞和樹突細胞的結合人抗樹突細胞單克隆抗體Bll結合巨噬細胞的能力(與結合樹突細胞,的能力相比)可用流式細胞術,定.如上所迷從貼壁單核細胞制備樹突細胞。通過將貼壁單核細胞與M-CSF培養5至7天，從貼壁單核細胞制備巨噬細胞。收集所述細胞，將其在4°C下與10ug/ml單克隆抗體Bll或同種型對照抗體溫育。用FITC標記山羊抗人IgG(Fc)探針檢測人抗體的結合。通過用帶有CellQuest軟件的FACScalibur儀器進行分;f斤，測定細胞相關的熒光。結果顯示于圖4且表明，人抗體Bll結合巨噬細胞的程度比其結合樹突細胞的程度要低。因此，Bll靶抗原也可在巨噬細胞上表達,但其表達水平比在樹突細胞上觀察到的要低。由于樹突細胞和巨噬細力包之間具有相似性，單克隆抗體Bll與巨噬細胞的反應少生并不令人奇怪。由于這兩種細胞類型共有結構性質和功能性質(包括刺激T淋巴細胞應答和B淋巴細胞應答的能力)，抗體Bll與巨噬細胞的交叉反應性可能對抗原遞呈細胞的導向是有利的。V.人抗體Bll把抗原在THP-1細胞上的誘導在THP-1細胞(一種與羊核細胞相類似的細胞系，得自人單核細胞白血病)被誘導分化成樹突細胞表現型之前和之后，用流式細胞術測試人單克隆抗體Bll與THP-1細胞的結合。概括地講，THP-1細胞在標準培養基或補充GM-CSF和IL-4的培養基中生長.在4。C下與10pg/ml單克隆抗脊、B11-FITC或同種型對照抗體(人IgG-FITC)溫育。通過用帶有CellQuest軟件的FACScalibur儀器進行分析，測定細胞相關的熒光。結果顯示于圖5。這些數據表明，在正常生長條件下，THP-1細胞不表達Bll靶抗原。但是，當通過在含有GM-CSF和IL-4的培養基中培養THP-1細胞，使其轉變成樹突細胞表現型時，Bll靶抗原的表達隨之被誘導,因此，這些結果進一步確證了Bll人抗體對與樹突細胞特異性相關的靶抗原(Bn)的特異性。VI.人抗體Bll與短尾猴樹突細胞的結合獼猴短尾猴動物(猴子)模型能提供有關抗體的臨床應用的相關信息，條件是耙抗原在靈長類動物中是保守的。因此，可通過流式細胞術評價人單克隆抗體Bll與獼猴樹突細聘的交叉反應性。新鮮獼猴血獲自SierraBiomedicals,通過將貼壁單核細胞與GM-CSF和IL-4培養，從貼壁單核細胞制備樹突細胞。樹突細胞在4°C下與10pg/ml單克隆抗體B11-FITC或同種型對照抗體(人IgG-FITC)溫育.通過用FACScalibur儀器進行分析，測定細胞相關的焚光。如圖6所示，人單克隆抗體Bll結合得自獼猴短尾:^的樹突細胞，表明B11靶抗原在靈長類動物中是保守的。VII.人抗體Bll與人組織樹突細胞的結合通it免疫組織化學法，評"f介人單克隆抗體Bll與人組織樹突細胞的反應性。這些實驗也設計來評價抗體Bll與人組織的其它細胞或抗原的潛在交叉反應性。通過尸體解剖或外科活組織崧查獲取人組織的低溫切片，將其包埋于Tissue-TekO.C.T.介質中，在-70。C下凍藏。將組織切成5mm切片，用丙酮固定10分鐘，干燥過夜。栽玻片在著色前用10%中性緩沖的福爾馬林固定10秒鐘。使用間接免疫過氧化物酶技術。切片首先用溶于含有熱集合IgG的PBS的B11-FITC或同種型匹配FITC抗體著色，以封閉Fc依賴型結合。'用兔抗FITC抗體檢測第一抗體，然后用過氧化物酶標記的抗兔試劑檢測。各載玻片由經認證的病理學者審閱，其結合情況按照以下表解符號進行分級土(可疑)、l+(弱)、2+(中)、3+(強)、4+(極強)、Neg.(陰性)。下表2所示結果表明，在所有檢查的組織中都存在明顯的樹突細胞和一些巨噬細胞的著色現象。同種型對照抗體沒有觀察到特定的著色現象。iSL些^t據表明入單克r套^^休Bll鄉吉'合-入纟且^R^哭纟田^,以及人組織巨噬細胞，盡管對后者的結合程度較低。Bll對脾臟的單核細胞和骨髓的祖細胞的最低結合可反映其對不成熟樹突細胞的結合。人抗體Bll不與受試樣品中的其它細胞類型或組織發生交叉反應，這進一步表明該抗體對樹突細胞的特異性及對巨噬細胞的較低程度的特異性。表2人單克隆抗體Bll結合人組織的免疫組織化學檢測結杲<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>纟且織交叉反應性研究在PathologyAssociatesInternational:Frederick,MDstudy#IM598進行。VIII.人抗體BU的單鏈Fv(ScFv)片段與A^突細胞的結合人單克隆抗體Bl1的單鏈Fv片段與人組織樹突細胞的反應性通過流式細胞術進行評價。如圖9所示，通過將人單克隆抗體Bll的VL(SEQIDNO:l和2)和VH(SEQIDNO:3和4)結構域連接，構建BllScFv。加入EGF序列，以用抗EFG抗體檢測ScFv與樹突細胞的結合情況。在4。C下將樹突細胞與BllScFv溫育一小時，然后洗滌，再在4°(:下與抗-EFG-FITC探針溫育1小時。用FACS分4斤法分析樣品。FACS分析結果表明，人單克隆抗體Bll的BllScFv片段結合人樹突細胞。因此，可通過將ScFv分別連接到選擇的抗原或毒素，將其用作疫苗或免疫毒素'IX,人抗體Bll的F(ab。2片段與人樹突細胞的結合人單克隆抗體B〗l的F(ab')2片段與人組織樹突細胞的反應性通過流式細胞術進行評價。這些實驗也設計來薈定人抗體Bl1的Fc部分是^明顯參與Bll對樹突細胞g結合'通過在標準條件下用胃蛋白蕃消化純化的BllmAb,可制備F(ab')2片段。可用蛋白質L色譜純化F(ab，)2片段。通過在GM-CSF和IL-4中培養人單核細胞，可從人單核細胞新鮮制備樹突細胞，然后在4。C下將所述樹突細胞與完整抗體或F(ab')2抗體片段溫育1小時。將所述細胞洗滌，然后在4。C下與抗人IgG-F(ab，)2-PE探針溫育1小時。在此洗滌細胞，然后用FACScalibur儀器和Cellquest軟件分析。如圖10所示，TPACS分析結果表明，完整人單克隆抗體B11和Bll的F(ab，)2片段按類似的動力學方式結合樹突細胞，說明完整單克隆抗體的Fc部分對Bll結^^樹突細胞沒有顯著作用。實施例3Bll靼抗原的鑒定I.從樹突細胞免疫沉淀人單克隆抗體Bll-靶抗原.人單克隆抗體BU可用來使其相關靶抗原從樹突細胞發生免疫沉淀。概括地講，制備樹突細胞裂解物，將其在4。C下與單克隆抗體Bll和同種型對照IgG抗體溫育。用抗人IgG-瓊脂糖捕獲抗體-抗原復合體，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所述復合體。在來自兩個不同的樹突細胞裂解物制品的抗體Bll免疫沉淀物中，可見對應于分子量約180kd的條帶，而在3于照樣品中卻沒有。因此，這些免疫沉淀研究表明，人單克隆抗體Bll識別樹突細胞上的某種把抗原，所述抗原的分手量用SDS-PAGE分析約為180kd。II.泉自樹突細胞的人單克隆抗體Bll靶抗原的N末端測序如上進行免疫沉淀后，對所述Bli靶抗原進行N末端氨基酸測序，以確定其與已知蛋白質的同源性。用樹突細,胞制備細.胞裂解物，將所得裂解物在4°C下與單克隆抗體B11溫育。用抗人IgG-瓊脂糠捕獲抗體-抗原復合體，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所述復合體。將凝膠上的蛋白質轉移到硝酸纖維素，然后洗脫對應于單克隆抗體Bll的條帶，以供N末端氨基酸測序。N末端測序和數據庫檢索在MidwestAnalytical,Inc.(St.Louis,MO)進行。對單克隆抗體Bll靶抗原的N末端15個氛基酸殘基的測序揭示其與人巨噬細胞甘露糖受體的蛋白質序列同源性，具體如下DDXXQFLIXXEDXKR(SEQIDNO:5)Bll抗原LDTRQFLIYNEDHKR(SEQIDNO:6)巨喧細胞甘露糖受體對人蛋白質數據庫進行計算機檢索，沒有發現任何其它蛋白質與Bll抗原具有顯著的同源性。在進一步的研究中>將樹突細胞裂解物與載有抗小鼠IgG的瓊脂糖溫育過夜，以從樹突細胞裂解物中清除非特異性結合蛋白質。離心除去瓊脂糖，將清除后所得上清收集并與預先載有抗體Bll的抗人IgG-瓊脂糖溫育過夜。將所述瓊脂糖用PBS洗滌并用還原性加樣緩沖液煮沸。最后，離心除去所迷瓊脂糖，將所得上清加裁到凝膠上。抗體B11使約150-180kd的蛋白質發生免疫沉淀。將所述蛋白質印跡于PVDF膜上并送至MidwestAnalytical,Inc.進行微量測序。對單克隆抗體Bll靶抗原的N末端"^量測序結果揭示以下蛋白質序列LLDTRQ'FLIYLEDTKRCVDA(SEQH)N0:7)。而且這個序列與人巨噬細胞甘SJ睹受體(GenBank登記號NP—002429)的序列相匹配，在國家生物技術信息中心網站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLAST算法測得20多個氨基酸具有100%的同一性。這些數據表明，能被人單克隆抗體Bll識別的樹突細胞上的靶分子是巨噬細胞甘露糖受體。lit.Bll抑制樹突細胞攝取FITC-葡聚糖以下試驗設計來測試抗體Bll是否阻斷甘露糖受體，從而可例如將抗體Bll用以預防或抑制病原體與甘露糖受體之間的相互作用(如細胞感染)'將樹突細胞與FITC-葡聚糖(500^tg/ral)和同種型對照人IgG或BI1HuMAb之一(251ig/ml)在圖11所示各溫度下溫育30分鐘。已知葡聚糖分子可被樹突細胞通過甘露糖受體特異性地內化(F.Sallusto等J.E鄰，Med.1995,185:389-400)。通過FACS分析確定標記(FITC)-葡聚糖的攝取量(即用FACScalibur儀器測定樹突細胞樣品的熒光強度)。FITC-葡聚糖在37。C下的攝取百分比設定為100%,在4。C下的攝取百分比設定為0%.如圖11所示，在上述條件下，抗體Bll阻斷FITC-葡聚糖攝取達61.5%。這些結果提示人單克隆抗體Bll可用來阻斷病原體與甘露糖受體的相互作用。實施例4人抗樹突細胞抗體的活性I.樹突細胞對人單克隆抗體Bll的內化通過流式細胞術評價人抗體Bll結合樹突細胞后被內化的程度。如上所述從貼壁單核細胞制備樹突細胞。所得樹突細胞在4°C下與飽和濃度的單克隆抗體B11-FITC溫育1小時，以使抗體的表面結合最大化，接著用冷PBS洗滌以除去過量的抗體，然后在37。C下溫育不同時間，以使抗體內化。然后用冷PBS洗滌樣品^停止反應，再進一步用0.1。/。PBA(pH2.5)洗滌以從細胞表面除去結合的抗體。剩余的熒光為已被內化的抗體B11-FTIC。將對照細胞立即用0.1%PBA(pH2.5)洗滌并保持在4。C，以代表最低內化程度，或只用0.1%PBA(pH7)洗滌，以代表抗體B11-FTIC的最大加載。按照以下公式計算抗體內化百分比。內化％-(樣品平均熒光強度-酸洗滌4。C對照的平均熒光強度)/(PBS洗滌4。C對照的平均熒光強度-酸洗滌4。C對照的平均焚光強度)圖7所示結果表明，人單克隆抗體Bll結合樹突細胞后被有效內化。人抗樹突細胞單克隆抗體Bll的這個未曾預料的性質表明，該抗體可用以將物質(如抗原和毒素)通過細胞內方式遞送到樹突細胞。II.樹突細胞對B11-FITC的內化也采用顯孩O見察確證抗體Bll結合樹突細胞后被內化。在非貼壁條件下將單核細胞與GM-CSF(10ng/ml)和IL-13(50ng/ml)溫育7天，制備樹突細胞.在人IgG(600嗎)和抗CD32mAbIV.3(10貼)存在下，將所得樹突細胞與mAb-FITC(l嗎)結合，以阻斷非特異性攝取，然后在37。C下溫育。在整個過程中對照細胞在冰上培育.37。C下15至60分鐘后，將樹突細胞置于冰上，用抗CDllc-PE(ljxg)著色。用BioRadMRC1024激光掃描聚焦顯微鏡通過聚焦顯微鏡術檢查mAbBll的內化。用15mWKr/Ar激光器的488mn線和兩個光電探測器(522/35nm二色向光電探測器用于FITC熒光>605/32nm二色向光電探測器用于PE焚光)掃描細胞，以檢測熒光。用63XPlan-APO1.4NA物鏡(CaxlZeiss，Inc.，Thornwood,NY),光圍設定為2.1，容許檢測厚度約為1.0Mm的熒光影像各光學切面。將整個細胞切片后，從通過細胞中夾的切片選出代表性影像。結果確證BllmAb結合甘露糖受體后被樹突細胞迅速內化，再次提示該抗體可有效遞送抗原和毒素到抗原遞呈細胞中。與FACS數據相一致的是，內化在15分鐘內明'顯出現，在一個小時內幾乎完成》m.人單克隆抗體Bii導向性抗原遞送后樹突細胞增強抗原遞呈為確定人單克隆抗體Bl是否可用以增強樹突細胞對抗原的.加工和遞呈作用，用化學交:眹劑SMCC將Bll抗體綴合到破傷風類毒素(TT)抗原。如上所迷從貼壁單核細胞制備樹突細胞，不同的是細胞在特氟隆容器中培養。收集樹突細胞，分散于具有1%胎牛血清的巨噬細胞無血清培養基，接種于96孔微量滴定板，每孔5000個細胞。將綴合到破傷風類毒素的單克隆抗體Bll或單獨;皮傷風類毒素以不同濃度加入到樹突細胞。通過將單核細胞與破傷風類毒素溫育，然后再與IL-2溫育產生的自體破傷風類毒素特異性T細胞加入到各含50,000個樹突細胞的各孔。將所混細胞在37。C下一起培養7天，然后用基于MTT的測試法按照生產商的說明書(Promega，Madison,WI)測定活細胞的數量6將所述細胞暴露于破傷風類毒素或抗體Bll-破傷風類毒素后，比較它們誘導樹突細胞以特異性地刺激破傷風類毒素特異性T淋巴細胞的能力。結果(圖8)顯示，將破傷風類毒素作為模型抗原綴合到Bll導致明顯更加有效的抗原遞呈作用，這通過測定抗原特異性T細胞增殖得以反映。在另一個實驗中，在將樹突細胞載以與破傷風類毒素(TT)綴合的Bll或載以與Bll混合的破傷風類毒素(非綴合對照)之后，用3H-胸苷反映T細胞的增殖。作為附加對照，將抗FcyRII(CD32)、mAbIV-3的封閉性抗體加入到含有B11-TT綴合物的一些孔中，以確定此Fc受體是否有助于增強B11-TT的抗原加工和遞呈作用。第二天起，將細胞與新鮮解凍、預先建立的石皮傷風類毒素特異性T細胞結合4天6在最后一天將細胞與^-胸香在37。C下共溫育。測試結合到T細胞的3]9[的量。如同前述實驗一樣，結果(圖12)表明，將破傷風類毒素作為模型抗原綴合到Bll導致明顯更加有效的抗原遞呈作用，這可通過測定抗原特異性T細胞的增殖得以反映.加入過量的mAbIV.3并沒有明顯改變B11-TT綴合物對抗原的增強遞呈作用，表明B11-TT與FcyRII的相互作用對此活性來說并不是必需的。總體而言，圖S和圖]2所示.的這些研究結果表明，與只有破傷風類毒素相比>為到達T細胞刺激水平所需的抗體Bll綴合的破傷風類毒素的量要低10至100倍。此外，當用抗體Bll將破傷風類毒素導向樹突細胞時，圖8所示的T細胞刺激的絕對程度提高兩倍。因此，這些數據表明，抗原可綴合到人單克隆抗體Bll,且抗體導向的抗原比非導向的抗原得到更有效的加工和遞呈，導致增強的抗原特異性T細胞應答。實施例5抗樹突細胞人單克隆抗體E21的鑒定i:人抗體E2i抗原的分子量分析從培養獲得的人樹突細胞制備樹突細胞裂解物。概括地講，在4°C下將樹突細胞洗滌并重懸于含有裂解緩沖液的TritonX-IOO。將未進行分部分離的裂解物加載于4-SDS-聚丙烯酰胺凝膠，然后將蛋白質轉移到硝酸纖維上，所得印跡與10ug/mlE21溫育，然后與抗人IgG堿性磷酸酶4笨針溫育并用辣根過氧化物酶顯色。本實驗結果表明，人單克隆抗體E21抗原的分子量約為36-40kd。II.人抗體E21與人真皮和表皮人樹突細胞的結合如圖l所示，人單克隆AbE21優先結合樹突細胞。本實驗設計來通過用E21對冷凍皮膚進行免疫組織化學分析，測試人抗體E21對真皮和表皮樹突細胞的反應性。人皮膚的冷凍切片用FITC-E21和HTC-huIgG對照染色，用兔抗FITC探針;f全測。免疫組合化學分析結果表明，人抗體E21與人皮膚切片的真皮樹突細胞/巨噬細胞和表皮樹突細胞(朗罕氏細胞)均有反應。III.人抗體E21與短尾猴樹突細胞的結合獼猴短尾猴動物(猴子)模型能提供有關抗體的臨床應用的相關信息，條件是靶抗原在靈長類動物中是保守的，因此，可通過流式細胞術評價人單克隆抗體E21與獼換樹突細胞的交叉反應性。用GM-CSF和IL-4處理使獼猴單核細胞分化成樹突細胞，并用流式細胞術測試E21結合情況。所述樹突細胞在4°C下與E21溫育l小時，接著洗滌，然后在^C下與抗人IgG-FITC探針溫育1小時。用FACScalibur4義器分碎斤樣品。實施例6Bll-Pmel-17疫苗綴合物的生產和鑒定I.Bll-Pmel-17分子綴合物的重組表達如圖14所示，構建含有融合(在重鏈CH3結構域)到抗體B11的Pmel-17編碼序列(黑素瘤抗原)的質粒。然后用標準程序(Qiagenlnc,Valencia,CA)將所得質粒構建物(稱為"MMV4"(SEQE)NO:8))轉染CHO細胞。在含有抗生素G418的培養基中選出被轉染的細胞，在不斷增大甲氨蝶呤的濃度下培養細胞，進一步佳束達擴增。擴增后，通過有限稀釋克隆細胞，用穩定克隆系產生細胞庫，以供進一步研究。為確證Bl1-Pmel-17的表達，在還原條件下對經SDS-PAGE分離的蛋白質進行蛋白質印跡分析。所述蛋白質用兔抗Pmel血清或用山羊抗人IgG探出。對完整融合構建物的分析也在還原條件下進行。融合構建物在適當的分子量處發生免疫沉淀。因此，實驗結果確證被轉化的CHO細胞特異性地表達B11-Pmel-17分子綴合物，這從融合產物的適當大小和組成可以得到證明。II.Bll-Pmd-17分子綴合物的結合分析Bll-Pmel-17分子綴合物結合樹突細胞的能力可通過流式細胞術評定》如上所述從貼壁單核細胞制備樹突細胞。通過將貼壁單核細胞與M-CSF培養5至7天，從貼壁單核細胞制備巨噬細胞。收集所述細胞，將其在4。C下與10ug/ml單克隆抗體B11或同種型對照抗體溫育，用FITC標記山羊抗人IgG(Fc)探針檢測人抗體的結合。通過用帶有CellQuest軟件的FACScalibur儀器進行分析，測定細胞相關的熒光。樹突細胞在4°C下與20ug/mLBll-Pmell7分子綴合物和陰性對照溫育。用綴合到藻紅蛋白的山羊抗人IgG(Fc特異性)4企測所述綴合物的Bll部分對甘露糖受體的結合(圖15)。用兔抗Pmel-17血清，然后用綴合到藻紅蛋白的山羊抗兔IgG檢測所述綴合物的抗原(Pmd-17)部分對甘露糖受體的間接結合(通過B11)。分別如圖15-16所示的結果表明，Bll-Pmel-17分子綴合物結合樹突細胞且能有效地將Pmel-17抗原導向樹突細胞。結論前述各實施例說明了以高親和力特異性結合樹突細胞的人單克隆抗體的生產方法，尤其，人單克隆抗體Bll能特異性地識別樹突細胞上的人巨噬細胞甘露糖受體。此外；人單克隆可變Bll能有效被樹突細胞內化，且能增強樹突細胞對抗原的加工和遞呈作用。人單克隆抗體E21結合人樹突細胞上的抗原與Bll不同。E2〗抗體也能與衍生自獼猴短尾猴(猴子)的樹突細胞發生交叉反應，提示E21抗原在靈長類動物中是保守的，且因此提供了為進一步開發抗體所需的相關動物4莫型。這些結果支持以下結論本發明的全部人單克隆抗體，包括其片段、綴合物和雙特異性分子可用于樹突細胞相關疾病的診斷和治療。等同方案本領域技術人員只使用常規實驗方法，就可確認或能夠確定本文所述的本發明特定實施方案的許多等同方案。這樣的等同方案包括在以下權利要求書中。序歹IJ表<110〉Medarex,Inc.etal.<120>抗樹突細胞的人單克隆抗體<130〉MXI-166CPPC<150>USSN10/035,637<151>2001-11-07<150〉USSN09/851,614〈151〉2001-05-08<150>USSN60/203,126<151>2000-05-08<150>USSN60/230,739<151>2000-09-07<160〉9<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210〉1<211>321<212〉DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(321)<400〉1.gacatccagatgacccagAsplieGinMetThrGin15gacagagtcsecateactAspArgValThrlieThr20ttagcctggtatcagc'agLeuAlaTrpTyrGinGin35tatgetgcatec3gtttgTyrAlaAlaSerSerLeu50tctccatecteactgtctgcatctgtaggaSerProSerSerUuSerAlaSerValGly103548tgtcgg.gcgagtcagggtattageaggtggCysArgAlaSerGinlieSerArgTrp253096aaaccagagaaaLysProduLys40gccCC"tAlaProsagLys45tecSerctgLeustclie144caaagtggggtcccateaaggttcageggcGinSerGlyVaiProSerA:rgPheSerGly5560192agtggatctSerG]ySer65gaagattttGluAspPheacgttcggcThrPheGlygggacagatttcactetcaccateageggcctgcagcct240GlyThrAspPheThrLeuThrlieSerGlyLeuGinPro707580gcaacttattactgccaacagtataatagttaccctegg288AlaThrTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerTyrProArg859095caagggaccaaggtggaeiatesaaGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210〉2<211〉107.<212>PRT<213>人(Ho邁osapiens)<柳〉2AsplieAspArgLeuAlaTyrAla50SerGly65GluAspThrPheGinVal丁rp35AlaSe;rPheGlyMetThr20TyrSerG1VA]aGin100Thr5lieGinSer.ThrThr85GlyGinSerProSerThrCysArgAla25GinLysProGlu40LeuGinSerGly55AspPheThrLeu70TyrTyrCysGinThrLysValGlu105SerLeuSerAlaSerValGly1015SerGinGlylieSerArgTrp30LysAlaProLysSerLeulie45ValProSerArgPheSer.Gly60ThrlieSerGlyLeuGinPro7580Gl土TyrAsnSerTyrProArg9095lieLys<210><21〉<212〉<213〉<220〉<221><222>3348DNA人(Homosapiens)CDS(1)..(348〉<400>3gaggtgcagGluValGin1321ctggtgcagtctggagcaLeuVal.GinSerGlyAla5gaggtgaaaaagcccggggag46GluValLysLysProGlyGlu1015tctctg&ggatetectgtaagggttctggagacagttttaccacctacSerLeuArglieSerCysLys&iySerGlyAspSerPheThrThrTyr202530tggateggctgggtgcgccagatgcccgggTrplieGlyTi'pValArgMetProGly3540s&aggcctggagtggatgLysGlyLeuGluTrpMet45144gggGly3"tClie50atet3tcctggtlieTyrProGlygactctga"taccatatacageccgtecttcAspSer.AspThrlieT^rSerProSerPhe5560192caaggccaggtcacc'ateteagccgacaagtecateageaccgcctac240GinGlyGinValThrlieSerAlaAspLysSer〗leSerThrAlaTyr65707580ctgcagtggageagect.ga觀gccteggacaccgccatgtattactgtLeuGinTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095288acgagaggggaceggggcgttgactactggggccagggaaccctggtcThrArgGlyAspArgGlyValAspTYrTrpGlyGinGiyThrLeuVal100105110336accgtctecThrValSer115tceiSer348<210〉4<211>116<212>PRT<213〉人(Homosapiens)<柳〉4GluValGinLeuValGinSerGlyAlaGluValLysLysProOlyGlu151015SerLeuArglieSerCysLysGlySerGlyAspSerPheTl]rThrTyx202530TrplieGlyTrpValArgGinMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet354045Gly〗leIeTyrProGlyAspSerAspThrlieTyxSerProSerPhe505560GinGlyGinValThrlieSerAlaAspLysSerlieSerThrAlaTyr65707580LeuGinTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyr了yrCys859095ThrArgGlyAspArgGlyValAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrYalSerSer115<210〉5<211〉15〈212〉PRT<213>人(Homosapiens)<220><221〉變異體<222〉(l)...(15)<223〉Xaa-任何氮基酸<400>5AspAspXaaXaaGinPheLeulieXaaXaaGluAspXaaLysArg151015<210>6<211>15<212>PiT<213〉人(Hc<柳〉6LeuAspThrArgGinPheLeulieTyrAsnGluAspHisLysArg151015<210〉7<211〉20<212〉PRT<213>人(Homosapiens)<400>7LeuLeuAspThrArgGinPheLeulieTyrLeuGluAspThrLysArg15.1015CysValAspAla20.<210〉8<211〉23770<212>DNA<213>人(Ho邁osapiens)<220〉<221>CDS<222〉(16489)...(17094)<400>8cgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatc60aattacgggggctacatgcccggtetatatgcgcaactgtaactaataactgatcaataa]20ttatcattagttaatgcccctcattagttcstagcccatatatggagttccgcgttacat180aacttacggtaaatggcccgcctggctgacagtaatcaagtatcgggtata"tacctcasg240gcgcaatgtattgaatgccattt3ccgggcggaccgactgcgcccaacgacccccgcccs300ttgacgtcaataatgaegtatgt"tcccatagtaacgccaatagggactttgcgggt化ct360gggggcgggtaactgcagttattactgcatacaa鵬tatcattgcggttatccctgaaa420ccattgacgtcaatgggtggagtatttscggtaaactgcccacttggcagtacatcaeigt480gtatcatatgggtaactgcagttacccacctcataaatgccatttgacgggtgaaccgtc540atgtagttcacatagtatacccaagtacgccccctattg3cgtcaatgacggtaaatggc600ecgcctggca-ttatgcccagtacatgacc"tggttxatgcgggggataactgcsgttactg660ccatttaccgggcggaccgtaatacgggtcatgtactggatatgggactttccl^cttgg720cagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatg咖ttttgataccctgaa780aggatgaaccgtcatgtagatgcataatcagtagcgataatggtaccact公cgccaaaac840gcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccc900cattgacgtccgtcatgtagttacccgcacctatcgccaaactgagtgcccctaaaggtt960cagaggtggggtaactgcagaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttc1020caaaatgtcgtaacaactccgccccattgattaccctcaaacaaaaccgtggttttagtt1080gccctgaaaggttttacagcattgttgaggcg鵬taactcgcaaatgggcggt鄉cgt1140gtacggt鵬aggtctatat.aagcagagctctctggctaactagagaaccgcgtttaccc1200gccatccgcacatgccaccctccagatatattcgtctcgagagaccgattgatctcttgg1260cactgcttactggcttatcgsaattaatacgactcacta/tagggagacccaagctgatcc1320actagtaacggtgacgaatgaccgaatagctttaattatgctgagtgatatccctctggg1380"cgactaggtgatcattgcgccgccagtgtgctggaattagcttgtxgccaccatggga1440tggagctgtatcatcctgttcctcgtgg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