專利名稱：：人干擾素α衍生物及其聚乙二醇化修飾物的制備和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學
技術領域：
，具體涉及人干擾素a衍生物及其聚乙二醇化修飾物的制備和用途。
背景技術：
：人干擾素(interferon,簡稱IFN)是一類體內存在的具有廣譜抗病毒、抗增殖和免疫調節機能的活性蛋白質，是最早用于臨床治療的細胞因子之一，人干擾素可分為三型，即人干擾素-a,人干擾素-p,人干擾素-Y,還可根據各型IFN的氨基酸序列不同再分為若干亞型。經大量臨床研究證明，人干擾素-ot是一種重要的抗腫瘤和抗病毒治療藥物。目前我國在臨床使用最廣泛的主要是重組人干擾素a-la、cc-2a和oc-lb。目前已發現人干擾素cc的I型家族有20多個基因成員，其中大部分編碼功能蛋白，^波此在核苷酸水平上有大約90y。的同源性。人干4尤素oc由165個氨基酸組成，分子量在19000道爾頓左右。現有的人干擾素a制劑的臨床治療效果尚不理想，其抗病毒比活性僅為lx108IU/mg，存在著大劑量時副作用較大的缺點。但是，無論是人干擾素a-2a、人干擾素a-lb和人干擾素a-1a，作為蛋白質性藥物，由于穩定性差，血漿清除率高，體內半衰期短，易產生抗原抗體反應等，在臨床治療上受到很大限制。基因工程技術使大規模合成人重組蛋白成為可能，很大程度上解決了異源蛋白引起的免疫原性問題，卻仍然無法克服血漿清除快和生物利用度低等缺點。這些缺點造成的結果是需頻繁注射人干擾素才能達到有效的血漿治療濃度；而且，每次注射后均會導致血藥濃度的較大波動，形成藥物濃度的"峰一谷，，效應。這樣就可能增加了治療費用以及給藥不便和不良反應的風險。聚乙二醇修飾蛋白質的技術是近十年來發展起來的一種用于改進蛋白質類藥物體內藥動學性質的新技術。它是將活化的聚乙二醇分子(PEG)鍵合到蛋白質分子表面上，從而影響蛋白質的空間結構，最終導致蛋白質各種生物化學性質的改變，如化學穩定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，體內半衰期延長，血漿清除率降低等等。PEG組分是由氧乙烯單體聚合而成的惰性長鏈的兩性分子。現在已有多種不同的PEG分子可供利用。被活化的PEG其活性功能基因可以被聯結到治療分子的某特殊部位(比如氨基、巰基或其他親核物質)。N末端修飾則可獲得高特異性修飾產物，可以有效控制修飾產物的純度，使工藝更簡單并且產品質量也更易評價。
發明內容本發明的目的之一是提供一種新的人干擾素a衍生物，是通過對人干擾素a進行修飾獲得，該人干擾素a衍生物具有比活性高，抗病毒比活性達5-10xl()8lU/mg，比人干擾素a強510倍，以及聚乙二醇化修飾率高的優勢。本發明的目的之二是提供一種人干擾素oc衍生物的聚乙二醇修飾物，是對本發明提供的人干擾素a衍生物進行定點修飾，獲得高特異性的人干擾素a衍生物的聚乙二醇修飾物，這種聚乙二醇修飾物具有生物活性高和不含非N端修飾異構體的特點，以及體內半衰期延長，血漿清除率降低等優點。本發明的目的之三是提供上述人干擾素oc衍生物的聚乙二醇修飾物的制備方法。修飾物的制藥用途。本發明的技術方案如下人干擾素oc衍生物，在人干擾素cc的N末端接上3個氨基酸，其結構式如下R3-R2-R1-interferon式中，interferon為人干擾素cx，人干擾素a的N末端連接的第一位氨基酸R1為含硫氨基酸或甘氨酸；第二位氨基酸R2為芳香族氨基酸或甘氨酸；第三位氨基酸R3為酸性氨基酸或甘氨酸。其中，所述的人干擾素a,包括人干擾素a-2a(IFNcc-2a)、人干擾素a-la(IFNa-la)、人干擾素a-lb(IFNcc-lb)。此外，還包括IFNa-2a、IFNoc-lb、IFNa-la三種蛋白的書亍生物、類4以物、生物活性或藥用活性片段。其中，人干擾素a的N末端接上的第一位氨基酸Rl為含硫氨基酸或甘氨酸，含硫氨基酸包含曱硫氨酸、半胱氨酸，Rl優選曱硫氨酸或甘氨酸；N末端接上的第二位氨基酸R2為芳香族氨基酸或甘氨酸，芳香族氨基酸包含苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸，R2優選苯丙氨酸或甘氨酸；N末端接上的第三位氨基酸R3為酸性氨基酸或甘氨酸，酸性氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸，R3優選谷氨酸或甘氨酸。其中，人干擾素a衍生物包括Glu-Phe-Met-IFNoc-2a、Glu-Phe-Met-IFNa-lb、Glu-Phe-Met-IFNa-la、Gly-Gly-Gly-IFNa-2a、Gly-Gly-Gly-IFNa-lb、Gly-Gly-Gly-IFNoc-la、Glu-Tyr-Met-IFNa-2a、Glu-Tyr-Met-IFNa-lb、Glu-Tyr-Met-IFNoc-la、Glu-Gly-Met-IFNoc-2a、Glu-Gly-Met-IFNa-lb或Glu-Gly-Met-IFNa-la。本發明還提供了編碼上述人干擾素a衍生物的核苷酸序列，該核苷酸序列式在人干擾素a的N末端具有核苷酸修飾序列，該修飾序列能夠依次編碼上述R3、R2和Rl所述的氨基酸。上述核苷酸序列的制備可以通過基因重組技術或人工全基因合成獲得。如實施例1中用于構建含有Glu-Phe-Met-IFNcc-2a(IFN-D)的酵母表達載體的cDM序列(SEQIDNO:2)是經全基因合成獲得。本發明還提供了含有編碼上述人干擾素oc衍生物的核苷酸序列的表達載體。優選的表達載體是酵母表達載體，也可以選擇其它常規的表達載體。該表達載體的構建可通過常規分子克隆技術將目的片段插入載體中構建表達載體。該表達載體可以在表達工程菌中有效表達，經分離純化能夠得到上述的人干擾素a衍生物。本發明還提供了上述人干擾素a衍生物的聚乙二醇化修飾物，是在所述人干擾素a衍生物的N末端的氨基上通過酰胺鍵連接活化的聚乙二醇分子(PEG),其結構式如下0IImPEG-0-C-NH-R3-R2-R1-interferon其中，聚乙二醇具有直鏈或分支結構，平均分子量為10000-40000道爾頓。制備上述人干擾素cc衍生物的聚乙二醇化修飾物的方法，包括以下步驟(a)利用含有表達載體的工程菌制備人干擾素a衍生物溶液；(b)聚乙二醇與人干擾素a衍生物偶聯反應；(c)聚乙二醇人干擾素oc衍生物的純化。本發明還提供了上述人干擾素a衍生物及其聚乙二醇修飾物在制備治療或預防病毒性感染或腫瘤疾病的藥物中的用途，上述人干擾素a衍生物及其聚乙二醇修飾物可以與醫學上可接受的載體配制成液體制劑聯合應用于惡性腫瘤的放療和/或化療，也可以用于治療或預防病毒性感染。本領域技術人員可根據實際情況按給藥劑量0.5~3yg/kg通過注射給予聚乙二醇化人干擾素a衍生物。本發明是在人干擾素OC原有氨基酸序列不變的情況下，在多肽分子的N末端接上3個氨基酸，形成人干擾素oc衍生物。經重組后的人干擾素oc衍生物具有比活性高，抗病毒比活性達510xio8iu/mg,比人干擾素a強510倍，以及聚乙二醇化修飾率高的優勢。發明人經序列分析發現人干擾素oc族的a-la、cc-2a及a-lb的第1位N末端為半胱氨酸殘基，其-SH與29位Cys的-SH之間形成二硫鍵，從而使人干擾素a的多肽分子變成巻曲的空間構型，若用PEG對這樣的多肽N端殘基進行修飾，其修飾率非常低，僅達2~5%。經基因重組技術在人干擾素oc的N端接上一個曱硫氨酸或甘氨酸，并成線性依次在其延伸的第2位連接上芳香族氨基酸或甘氨酸，第3位連接上酸性氨基酸或甘氨酸。因芳香族氨基酸具有較大的空間位阻，阻止了末端3個氨基酸向分子內巻曲，從而充分暴露了N端的游離-NH2，有利于PEG對重組衍生后的人干擾素ot的N端的游離-冊2進行修飾，完成PEG對N末端進行定點修飾，獲得高特異性的人干擾素cc衍生物的聚乙二醇衍生物。這種衍生除具有譬如穩定、水溶性好、抗原性低等PEG化蛋白的一般性優點之外，尤其具有生物活性高和不含非N端修飾異構體的特點，以及體內半衰期延長，血漿清除率降低等優點，并為以后的臨床應用打好基礎。本發明提供了新的人干擾素a衍生物及其聚乙二醇人干擾素a衍生物，為科學研究和臨床治療提供了新的藥物分子，可以治療或預防病毒性感染或腫瘤疾病。圖1為實施例1中IFN-D畢節酵母表達載體構建示意圖。圖2為實施例2中IFN-D的SDS-PAGE4全測結果。圖中1、Marker:SDS-PAGE低分子量標準蛋白質；2、過CM柱目標物；3、過DEAE柱目標物；4、發酵液濃縮物。圖3為實施例3中IFN-D經ALD-PEG201OH奮飾后SDS-PAGE;f全測結果。圖中1、Marker:SDS-PAGE低分子量標準蛋白質；2、mPEG(20KD)-IFN-D目標物；3、IFN-D經ALD-PEG201OH奮飾后的樣品；4、IFN-D樣品。具體實施例方式以下通過實施例詳細說明本發明。在下面的實施例中所涉及的實驗3曰付。實施例1Glu-Phe-Met-IFNot-2a在曱醇酵母中的分泌表達1、目的基因獲得及設計Glu-Phe-Met-IFNoc-2a(以下稱為IFN-D)的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，序列長度為168個氨基酸。通過Genebank獲知IFNcc-2a的CDNA后將相應密碼子改成酵母偏愛性。并在N末端加入Glu-Phe-Met相應核苷酸序列。該CDNA序列用于畢節酵母的PIC9K表達質粒構建。構建的表達質粒轉化GS115宿主菌后實現分泌表達。因此在設計中加入KEX2的酶識別位點CTCGAGAAAAGA，其中CTCGAG為Xhol酶切位點。同時3'端引入雙終止密碼子TGATAA和Notl酶切序列GCGGCCGC。SEQIDNO:2是用于構建IFN-D的酵母表達載體的cDNA序列。所述的IFN-DcDNA序列是委托上海生物工程有限/>司全人工基因合成。該序列經測序后平端插入pUC57質粒中，命名為pUC-IFN-D。2、表達質粒pPIC9-IFN-D、pPIC9K-IFN-D的兩種不同載體的構建。把pUC57-IFN-D中的目的基因用Xhol和Notl核酸內切酶雙酶切膠回收目的片段，以備連接。將表達載體pPIC9質4立用核酸內切酶Xho1和NotI雙酶切回收大片賴二作為載體，與上述IFN-D片段用T4連接酶連接，16°C,30min,再用CaCl2法轉化到E.coliDH5oc中，用酶切法篩選陽性克隆，命名為pPIC9-IFN-D。把表達載體pPIC9K質粒用SalI和SacI雙酶切后回收大片l殳作為載體，再4巴pPIC9-IFN-D質粒用SalI和SacI雙酶切后回收小片l殳作為目的基因，與上述pPIC9K人片段用T4連接酶連接，用CaCl2法轉化到EcoliDH5cc中，用酶切法篩選陽性克隆，命名為pPIC9K-IFN-D。3、表達工程菌的獲得pPIC9K-IFN-D質粒用SacI線形化后曱醇酵母GS115中及陽性重組子的選擇過程是(1)制備感受態GS115;(2)加入線形化的質粒pPIC9K-IFN-D;(3)混勻后加入到轉化杯中；(4)電擊轉化條件0.5kv,2.5Uf,1500hm;(5)用1.Oml,1,OM山梨醇洗出；(6)涂布于MD/His平板上，3(TC,24小時后長出單菌落；(7)挑取單菌落分別涂布于葡萄糖選擇培養基(MD)或曱醇選擇培養基(MM)上，在腿平板上生長迅速的是mut+,其他的是mutsc甲醇緩慢利用型；(8)重新接種到含有氨基糖戒類抗生素G418不同濃度的平板上，篩選拷貝數量高的單菌落，保存備用。4、pPIC9K-IFN-D工程菌的表達在MD平板上挑取單克隆工程菌于25mlBMGY在500ml搖瓶中培養，30°C,300rpm培養過夜。OD6。。=4.0-6.0時，用無菌離心管3000rpm，4。C離心去上清，用25mlB醒培養基懸浮菌體，轉入含有250mlB薩培養液中誘導表達，每24小時補加100%甲醇，終濃度為0.5%，30°C,300rpm培養96小時。發酵液離心保留上清和沉淀。經電泳和HPLC分析表達結果為重組Glu-Phe-Met-IFNa-2a在上清液中表達量達到50mg/L。實施例2IFN-D的純化1、陽離子凝膠柱(如CMSepharoseF.F.凝膠)層析采用pH3.8~4.6醋酸鹽緩沖液進行上柱、洗脫，電泳監測收集目標物。然后使用pH7.5~8.5Tris-HCl緩沖溶液對目標物進行透析。2、陰離子凝膠柱(如DEAES印haroseF.F.凝膠)層析采用pH7.5~8.5Tris-HCl緩沖溶液進行上柱、洗脫，收集目標物。再用pH7.5~8.5磷酸鹽緩沖溶液對目標物進行透析。3、SDS-PAGE片企測取上述CM柱與DEAE柱的穿過液與目標峰進4亍檢測，試驗結果表明，發酵液通過以上柱層析純化，獲得了純度達95%以上的IFN-D。結果見附圖2所示。實施例3PEG偶聯修飾樣品的制備與純化工藝1、將IFN-D樣品用磷酸鹽緩沖液進行透析，然后加入等摩爾的ALD-PEG2OKD在2~15°C進行修飾，反應時間為24~36小時。將得到的修飾樣品進行SDS-PAGE纟全測，試一驗結果表明，經PEG偶聯修飾后，分子量提高，由原來的19000道爾頓提高到近40000道爾頓，修飾率達40%以上，得到目標物mPEG(20KD)-IFN-D。結果如附圖3所示。2、mPEG(20KD)-IFN-D陽離子凝膠柱(如SPSepharoseF.F.凝膠)的純化將修飾樣品使用調節電導率為4.0~5.Q以終止反應，上SP柱進行純化。使用醋酸鹽緩沖液進行洗脫，收集目標物。用磷酸鹽緩沖溶液對目標物進行透析，即可。實施例4通過WISH-VSV系統測定人干擾素ot衍生物IFN-D及聚乙二醇化人干擾素ct衍生物mPEG(20KD)-IFN-D的體外抗病毒活性采用細胞病變抑制法通過WISH-VSV系統測定人干擾素的體外抗病毒活性，是本
技術領域：
公知的方法，具體參照2005版《中華人民共和國藥典》三部附錄XC"人干擾素的生物活性測定"。本實施例測定了人干擾素a衍生物IFN-D及聚乙二醇人干擾素cx衍生物mPEG(20KD)-IFN-D的體外抗病毒活性，其體外抗病毒活性測定結果見表l(以上為三次測定結果的平均值)。表lIFNoc-2a、IFN-D和mPEG(20KD)-IFN-D的體外抗病毒活性＝名稱比活性(IU/mg)活性保留(％)IFNoc-2a1±0.28x108—IFN-D5.86±0.16x108100mPEG(20KD)-IFN-D1.17±0.35x10s20.1實驗結論經重組后的人干擾素a衍生物具有比活性高，抗病毒比活性達5x108IU/mg,比人干擾素a強5倍。經聚乙二醇化修飾后活性下降，活性保留20°/。。實施例5、用ELISA法測小鼠體內聚乙二醇人干擾素a衍生物mPEG(20KD)-IFN-D才羊品的血藥濃度1、實—險目的測小鼠體內mPEG(20KD)-IFN-D、IFN-D樣品不同天數代謝后的血藥濃度。2、實一發沒計和實驗方法取昆明種小鼠98只，雌雄性各半，體重在22-25g左右，隨機分為高、低兩個劑量組，每組42只，空白組14只。高劑量組給藥劑量為mPEG(20KD)-IFN-D50微克/kg和低劑量組給藥劑量為IFN-D10微克/kg,低劑量組在實驗的第一天腹腔注射濃度為10微克/kg的樣品，并每日按此劑量給藥，給藥7天。高劑量組在實驗的僅第一天腹腔注射濃度為50微克/kg的mPEG(20KD)-IFN-D樣品。兩個給藥實驗組在實驗的第1、2、3、4、5、6、7天各從小鼠目艮部采血六只，同時采空白組血樣做空白。2000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，照ELISA試劑盒上的說明書測血漿中樣品的含量。根據標準管的吸光度值求出對數方程式(y=1.3229Ln(x)-0.0449,R2=0.9637)，再根據樣品的吸光度代入方程求出濃度值。3、實驗結果見表2。表210)ig/kg低劑量給藥組和50Pg/kg高劑量給藥組血藥濃度比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、實驗結論經檢測小鼠體內mPEG(20KD)-IFN-D、IFN-D樣品不同天數代謝后的血藥濃度數值比較說明了人干擾素ot衍生物聚乙二醇化修飾物可以延長體內半衰期。以上對本發明所提供的人干擾素a衍生物及其聚乙二醇化修飾物的制備方法和用途做了詳細介紹。需要指出的是，具體實施方式所描述的內容是為更好的實施本發明而優選的實施方式，本發明的保護范圍不限于上述實施方式所述的技術方案，而應以權利要求書所述的實質內容為準，本領域技術人員所作的任何可能的改變只要不脫離本發明權利要求的實質內容均屬于本發明所保護的范圍。序列表<110>1、海南四環心腦血管藥物研究院有限^^司；2、北京四環制藥有限^^司；3、海南四環醫藥有限乂^司<120>人干擾素ot衍生物及其聚乙二醇化修飾物的制備和用途<130>MP081195<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>168<212>PRT<213>Homosapiens<權>1GluPheMetCysAspIxuProGinThrHisSerLeuGlySerArgArg151015ThrLeuMetLeuLeuAlaGinMetArgLyslieSerIxuPheSerCys202530LeuLysAspArgHisAspPheGlyPheProGinGluGluPheGlyAsn354045GinPheGinLysAlaGluThrlieProValLeuHisGluMetlieGin505560GinliePheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAsp65707580GluThrLeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGinGinUuAsn859095AspLeuGluAlaCysVallieGinGlyValGlyValThrGluThrPro100105110LeuMetLysGluAspSerlieLeuAlaValArgLysTyrPheGinArg115120125lieThrLeuTyrLeuLysGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGlu130135140ValValArgAlaGlulieMetArgSerPheSerLeuSerThrAsnUu145150155160GinGluSerLeuArgSerLysGlu165<210>2<211>504<212>DM<213>Homosapiens<400>2gaattcatgtgtgatttgcctcaaactcattctttgggttctagaagaactttgatgttg60Uggctcaaatgagaagaatttctttgttttcttgtttgaaggatagacatgattttggt120tttcctcaagaagaatttggtaaccaatttcaaaaggctgaaactattcctgttttgcat180gaaatgattcaacaaatttttaacttgttttctactaaggattcttctgctgcttgggat240gaaactttgttggataagttttacactgaattgtaccaacaattgaacgatttggaagct300tgtgttattcaaggtgttggtgttactgaaactcctttgatgaaggaagattcUttttg360gctgttagaaagtactttcaaagaattactttgtacttgaaggaaaagaagtactctcct420tgtgcttgggaagttgtUgagctgaaattatgagatctttttctttgtctactaacttg480caagaatctttgagatctaaggaa50權利要求1、人干擾素α衍生物，其特征在于，在人干擾素α的N末端接上3個氨基酸，其結構式如下R3-R2-R1-interferon式中，interferon為人干擾素α，人干擾素α的N末端連接的第一位氨基酸R1為含硫氨基酸或甘氨酸；第二位氨基酸R2為芳香族氨基酸或甘氨酸；第三位氨基酸R3為酸性氨基酸或甘氨酸。2、根據權利要求1所述的人干擾素a衍生物，其特征在于，人干擾素a包括人干擾素a-2a、人干擾素oc-la、人干擾素a-lb或所述三種蛋白的衍生物、類似物、生物活性或藥用活性片段。3、根據權利要求1所述的人干擾素a衍生物，其特征在于，所述含硫氨基酸包含甲硫氨酸、半胱氨酸。4、根據權利要求l所述的人干擾素a衍生物，其特征在于，所述芳香族氨基酸包含苯丙氨酸、酪氨酸。5、根據權利要求1所述的人干擾素a衍生物，其特征在于，所述酸性氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸。6、根據權利要求1所述的人干擾素oc衍生物，其特征在于，Rl為甲石克氨酸或甘氨酸。7、根據權利要求l所述的人干擾素a衍生物，其特征在于，R2為苯丙氨酸或甘氨酸。8、根據權利要求1所述的人干擾素a衍生物，其特征在于，R3為谷氨酸或甘氨酸。9、根據權利要求1所述的人干擾素cc衍生物，其特征在于，人干擾素oc彩f生物包4舌Glu-Phe-Met-IFNa-2a、Glu-Phe-Met-IFNoc-lb、Glu-Phe-Met-IFNa-la、Gly-Gly-Gly-IFNa-2a、Gly-Gly-Gly-IFNoc-lb、Gly-Gly-Gly-IFNa-la、Glu-Tyr-Met-IFNa-2a、Glu-Tyr-Met-IFNa—lb、Glu-Tyr—Met—IFNa-la、Glu-Gly—Met—IFNoc-2a、Glu-Gly-Met-IFNa-lb或Glu-Gly-Met-IFNa-la。10、編碼權利要求1-9任一項所述人干擾素cc衍生物的核香酸序列。11、含有權利要求10所述核苷酸序列的表達載體。12、根據權利要求11所述的表達載體，所述表達載體是酵母表達載體。13、權利要求1-9任一項所述的人干擾素oc衍生物的聚乙二醇化修飾物，其特征在于，在所述人干擾素cc衍生物的N末端的氨基上通過酰胺鍵連接活化的聚乙二醇分子(PEG),其結構式如下mPEG-0-C-NH-R3-R2-Rl-interferon14、根據權利要求13所述的聚乙二醇化修飾物，其中聚乙二醇分子具有直鏈或分支結構，平均分子量為10000-40000道爾頓。15、制備權利要求13所述的聚乙二醇化修飾物的方法，其特征在于包括以下步驟(a)利用含有表達載體的工程菌制備人干擾素ct衍生物溶液；(b)聚乙二醇與人干擾素oc衍生物偶聯反應；(c)聚乙二醇人干擾素a衍生物的純化。16、權利要求1所述的人干擾素a衍生物及其聚乙二醇修飾物在制備治療或預防病毒性感染或腫瘤疾病的藥物中的用途。全文摘要本發明涉及人干擾素α衍生物及其聚乙二醇化修飾物的制備和用途。其中，人干擾素α衍生物是在人干擾素α的N末端接上3個氨基酸，其結構式為R3-R2-R1-interferon。式中，interferon為人干擾素α，人干擾素α的N末端連接的第一位氨基酸R1為含硫氨基酸或甘氨酸；第二位氨基酸R2為芳香族氨基酸或甘氨酸；第三位氨基酸R3為酸性氨基酸或甘氨酸。本發明還提供了上述人干擾素α衍生物的聚乙二醇衍生物及其制備方法，以及其在制備治療或預防病毒性感染或腫瘤疾病的藥物中的用途。本發明人干擾素α衍生物具有比活性高，聚乙二醇化修飾率高的優勢，其聚乙二醇修飾物具有生物活性高和不含非N端修飾異構體的特點，具有體內半衰期延長，血漿清除率降低等優點。文檔編號A61P31/12GK101671390SQ200810149510公開日2010年3月17日申請日期2008年9月10日優先權日2008年9月10日發明者丁成剛,夏中寧,張麗杰,軍舒申請人:海南四環心腦血管藥物研究院有限公司;北京四環制藥有限公司;海南四環醫藥有限公司