一種銀杏內酯注射液的質量控制方法

專利名稱：：一種銀杏內酯注射液的質量控制方法
技術領域：
：本發明屬于中藥分析領域，涉及一種中藥制劑的質量控制方法，特別涉及銀杏內酯注射液的質量控制方法，本質量控制方法有含量測定方法、限量檢查方法及指紋圖譜測定方法。
背景技術：
：銀杏內酯是銀杏葉(GinkgoLeaf)中含有的一組具有較強生物活性的萜類化合物，已分離得到的包括銀杏內酯(ginkgolide)A，B，C，J，M，K，L和白果內酯(bilobalide)，研究發現它們是很強的血小管活化因子(PAF)拮抗劑，具有較好的應用前景。國外已有BN52063(銀杏內酯混合物)和BN52021(銀杏內酯B)進入臨床實驗階段。銀杏內酯注射液是以銀杏總內酯為原料制成的注射液，主要成分為銀杏內酯A(C20H24O9)、銀杏內酉旨B(C20H24O10)、銀杏內酉旨K(C2oH2201())，含有少量銀杏內酯C。主要用于治療缺血性中風。內酯類化合物的一個特征是在堿性條件下開環生成鹽(羧酸型)；開環化合物在酸性條件下又閉合成為內酯(內酯型)。因此，銀杏內酯各成分在注射液中可能同時以兩種形式存在。目前，未見對銀杏內酯注射液中同時測定銀杏內酯A，銀杏內酯B，銀杏內酯K的質量控制方法，本發明提出了能夠有效控制銀杏內酯注射液質量的方法，包括將注射液調pH到酸性酸化使內酯全部轉化為內酯型后，同時測定銀杏內酯A，銀杏內酯B，銀杏內酯K含量的方法，還提出了不經酸化直接對游離銀杏內酯A，銀杏內酯B，銀杏內酯K進行限量檢査的方法和指紋圖譜測定的方法，本發明提供的方法能夠達到更全面、有效地控制銀杏內酯注射液制劑質量的目的。
發明內容本發明的目的在于提供一種采用高效液相色譜法控制銀杏內酯注射液質量的方法。本方法具體包含有三種方法，分別為1、含量測定方法；2、游離銀杏內酯限量檢查方法；3、指紋圖譜測定方法，可以采用以上方法中一種或幾種對銀杏內酯注射液進行質量控制。本發明的目的是通過下列方式實現的(1)含量測定①色譜條件為柱溫為20。C40。C;流動相為異丙醇-甲醇-水比例為510:1525:6575，流速為0.5ml/min1.5ml/min，檢測器為可變波長紫外檢測器，檢測波長為210nm230nm，理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于5000;②對照品溶液的制備方法為分別取銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K對照品，分別加40%60%丙酮溶解，制成lml分別含0.2mg0.8mg銀杏內酯A、0.2mg0.8mg銀杏內酯B、0.2mg0.8mg銀杏內酯K的溶液，即得對照品溶液；；③供試品溶液的制備方法為精密量取銀杏內酯注射液lm15ml置5ml20ml量瓶中，加入3mol/L9mol/L的鹽酸溶液1m15ml，放置使有結晶析出，加丙酮使溶解并稀釋至刻度，搖勻，放置，濾過，即得供試品溶液；測定分別精密吸取等量的對照品溶液與供試品溶液各5|^150|ul，注入液相色譜儀，測定；測定結果銀杏內酯注射液每毫升含銀杏內酯A為0.5mg3.0mg、銀杏內酯B為1.5mg4.0mg、銀杏內酯K為0.5mg3.0mg;含銀杏內酯以銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K的總量計，應為3.0mg6.0mg;所述的含量測定方法的優選為①色譜條件為填充劑為十八烷基硅垸鍵合硅膠，柱溫為30°C，流動相為異丙醇-甲醇-水比例為7:21:72，流速lml/min，檢測波長為220nm，理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于7000;②對照品溶液的制備方法為分別精密稱取經105。C干燥至恒重的銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K對照品適量，分別加50%丙酮溶解，制成lmL分別含0.5mg銀杏內酯A、0.5mg銀杏內酯B、O.lmg銀杏內酯K的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為精密量取銀杏內酯注射液2ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的鹽酸溶液2ml，室溫放置3.5小時使有結晶析出，加丙酮使溶解并稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘，經微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20W注入液相色譜儀，測定；⑤測定結果銀杏內酯注射劑每毫升含銀杏內酯A為1.0mg2.0mg、銀杏內酯B為2.2mg3.2mg、銀杏內酯K為0.1mg0.2mg;含銀杏內酯以銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K的總量計，應為4.1mg4.9mg。(2)游離銀杏內酯限量檢查①色譜條件為柱溫為20。C40。C，流動相為四氫呋喃-甲醇-水比例為515:2030:5080，流速為0.5ml/min1.5ml/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210nm230nm，理論塔板數按銀杏內酯B計不低于2000;②對照品溶液的制備方法為取銀杏內酯A、銀杏內酯B對照品，分別加甲醇溶解制成lml含0.2mg0.8mg的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為取銀杏內酯注射液15ml35ml，加乙酸乙酯振搖提取2次6次，每次加乙酸乙酯15ml25ml，合并乙酸乙酯液，加lg5g無水硫酸鈉脫水后水浴揮干，殘渣加2ml8ml甲醇使溶解，作為供試品溶液；④測定分別量取等量的對照品溶液與供試品溶液各5pl50^11，注入液相色譜儀，測定對照品與供試品色譜峰吸收度積分值；◎測定結果色譜圖中供試品溶液的銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值不得大于對照品溶液的銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值；所述的游離銀杏內酯限量檢査方法的優選為①色譜條件為填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，柱溫為30°C，流動相為四氫呋喃-甲醇-水比例為10:25:65，流速為lml/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為220nm，理論塔板數按銀杏內酯B計不低于3000;②對照品溶液的制備方法為取銀杏內酯A、銀杏內酯B對照品，分別加甲醇溶解制成lml含0.5mg的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為取銀杏內酯注射液25ml，加乙酸乙酯振搖提取4次，每次加乙酸乙酯20ml，合并乙酸乙酯液，加3g無水硫酸鈉脫水后水浴揮干，殘渣加甲醇5ml使溶解，作為供試品溶液；測定分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各20^1，注入液相色譜儀，測定對照品與供試品色譜峰吸收度積分值；⑤測定結果色譜圖中供試品溶液的銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值不得大于對照品溶液的銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值，即供試品中游離銀杏內酯A、銀杏內酯B的總量不得大于4%。所述銀杏內酯注射液指對游離銀杏內酯限量測定方法的色譜圖如下附圖1:游離銀杏內酯檢測的對照品溶液色譜圖；附圖2:游離銀杏內酯檢測的供試品溶液色譜圖；附圖3:游離銀杏內酯檢測的陰性供試品溶液色譜圖。(3)指紋圖譜測定①色譜條件為柱溫為20。C40。C，流動相為甲醇-異丙醇-50mmol/L乙酸銨水溶液比例為69:14:80100，流速為0.5ml/min1.5ml/min，理論塔板數按銀杏內酯B計算不低于2000;②對照品溶液的制備方法為取銀杏內酯B對照品，加1%10%葡甲胺水溶液，加熱使溶解，制成lml含0.2mg0.8mg的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為取銀杏內酯注射液直接作為供試品溶液；④測定分別量取等量的對照品溶液與供試品溶液各2pl50]dl，注入高效液相色譜儀，測定20分鐘以上的色譜◎測定結果供試品色譜圖應呈現與標準指紋圖譜保留時間相同的4個共有色譜峰，各號峰的相對保留時間為S號峰為l.OO，l號峰為0.701.50，2號峰為1.502.50，3號峰為1.803.00;S號峰為銀杏內酯B的色譜峰。所述指紋圖譜測定方法的優選為①色譜條件為填充劑為以十八烷基硅垸鍵合硅膠，柱溫為30°C，流動相為甲醇-異丙醇-50mmol/L乙酸銨水溶液比例為7.5:2.5:90，流速為1.0ml/min，檢測器為蒸發光散射檢測器，理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于3000;②對照品溶液的制備方法為取銀杏內酯B對照品，加5%葡甲胺水溶液60。C80。C加熱使溶解，制成lml含0.5mg的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為取注射液直接作為供試品溶液；測定分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各5pl，注入液相色譜儀，測定40分鐘色譜◎測定結果供試品色譜圖應呈現與標準指紋圖譜保留時間相同的4個共有色譜峰，各號峰的相對保留時間為S號峰為1.00，l號峰為0.88U2，2號峰為1.552.33，3號峰為1,902.86;其中1號峰的相對峰面積比值為0.401.40;供試品圖譜中非共有峰面積不得超過總峰面積的10%。發明人對上述
發明內容進行了研究與說明，用以證明本發明的技術效果。下述實驗用于進一步說明與解釋本發明，但不限制本發明。1、高效液相色譜法含量測定方法的研究與說明(1)色譜柱篩選經過試驗，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑的分離效果好。(2)流動相選擇經過試驗，水-甲醇-異丙醇體系為流動相洗脫分離效果好，并經實驗確定了溶劑比例。(3)工作曲線測定①銀杏內酯A工作曲線測定精密稱取銀杏內酯A對照品34.68mg，以50%丙酮為溶劑，5ml容量瓶定容，后稀釋2.5，5.0，10，20，40，80倍，制成系列標準液。吸取20^1注入液相色譜儀，測定，以進樣量(嗎)對峰面積A進行回歸，得到回歸方程。見表l。表l銀杏內酯A工作曲線相關數據mg/ml叱Area(mAUxmin)AverageA0.08581.71657.357.657.457.41.49480.17163.432115.6116.0115.8115.81.48190.34326.864229.6229.1230.4229.71.49410.686413.73466.7468.1468.1467.61.46791.47981.373027.46938,6938,3942.8939.91.46082.746068.641833.01833.51846.4837.61.49436.8640137.34524.24740.94792.84686.01.4648回歸方程WA(|ig)=0.1433+0.0293xA.相關系數r=0.99997結果表明銀杏內酯A在進樣量0.0858mg/ml6.8640mg/ml范圍內呈良好的線性關系。②銀杏內酯B工作曲線測定精密稱取銀杏內酯B對照品49.58mg，以50°/。丙酮為溶劑5ml容量瓶定容，后稀釋2.5，5.0，10，20，40，80倍，制成系列標準液。吸取20W注入液相色譜儀，測定，以濃度C(mg/ml)對峰面積A進行回歸，得到回歸方程。見表2。表2銀杏內酯B工作曲線有關數據mg/ml嗎Area(mAUxmin)A.f>l(T30.12162.43279.380.580.280.01.52000.24324.864162.4162.8163.5162.91.49590.48649.729322.5322.5323.1322.71.50730.972919.4664308656.9658.4653.01.48991.50031.946038.921293.91297.01296.81295.91.50173.892077.842581.12578.52595.82585.11.50559.7260194.56563.06548.66578.06563.21.4819回歸方程WB(ng)=0.2794+0.0296xA.相關系數r=0.99998結果表明銀杏內酯B在進樣量0.1216mg/ml9.7260mg/ml范圍內呈良好的線性關系。③銀杏內酯K工作曲線測定精密稱取銀杏內酯K對照品10.88mg,以50%丙酮為溶劑5ml容量瓶定容，后稀釋2，4，8，16，32倍，制成系列標準液。吸取20nl注入液相色譜儀，測定，以濃度C(mg/ml)對峰面積A進行回歸，得到回歸方程。見表3。表3銀杏內酯K工作曲線有關數據9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>回歸方程WK(ng)=-0.0065+0.0010xA.相關系數r=0.9998結果表明銀杏內酯K在進樣量6.75mg/ml216.0mg/ml范圍內呈良好的線性關系。(4)精密度實驗分別用取銀杏內酯A，取銀杏內酯B，取銀杏內酯K的標準溶液各連續進樣，測定，見表4。結果表明本法精密度良好。表4精密度實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(5)溶液穩定性實驗精密量取樣品溶液5.0ml置10.0ml容量瓶中，加入2ml6mol/LHC1溶液，混勻室溫放置，以丙酮溶解析出結晶，并稀釋至刻度，20^1進液相色譜儀，進樣測定，見表5。表5溶液穩定性實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結論①由上述數據看出，加入丙酮后溶液在2min120min內穩定。②在加入丙酮后立即測定，由于溶液混合產生大量氣泡，故采取定容后再放置30min使氣泡消散，溶液均勻。(6)重復性實驗精密量取同一批號注射劑5.0ml置10.0ml容量瓶中，加入6mol/LHCl溶液2ml，混勻，室溫放置3.5hr，以丙酮溶解并稀釋至刻度后，再放置30min，吸取2(V1注入液相色譜儀，分別測定。見表6。結果表明本法重復性良好。表6重復性實驗結果樣品GA(Area.)編號mAUxminGB(Area.)mAUxminGK(Area.)mAUxmin總含jCmg/ml)平均總含，〔(mg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、高效液相色譜法游離銀杏內酯限量檢査方法的研究與說明(1)銀杏內酯A、銀杏內酯B標準曲線的測定取銀杏內酯A、銀杏內酯B對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每ml含銀杏內酯A分別為0.0492mg、0.0984mg、0.1968mg、0.2952mg、0.4920mg;含銀杏內酯B分別為0.0501mg、0.1002mg、0.2004mg、0.3006mg、0.501mg的對照品溶液，分別精密吸取上述混合對照品溶液10(^1照含量測定法試驗，分別以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，測定數據見表7、表8，計算回歸方程和相關系數。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>y=522327x—131.57r=0.9999結果表明銀杏內酯A在進樣量0.0492mg/ml0.4920mg/ml范圍內呈良好的線性關系。表8銀杏內酯B標準曲線測定數據濃度(mg/ml)_峰面積_平均峰面積0.05011832419197187600.10024471245672451920.20049345792673930650.30061488201499301493750.501242558252517247538y=508729x-一6455.7r=0.9995結果表明銀杏內酯B在進樣量0.0501mg/ml0.501mg/ml范圍內呈良好的線性關系。(2)精密度試驗取上述混合對照品溶液，精密吸取iow，連續重復進樣，測定銀杏內酯A、銀杏內酯B峰面積積分值，結果見表9，結果表明本法精密度良好。表9精密度試驗序號123456平均值RSD(%)銀杏內酯A峰面積10362510112610310803575103026103327102964.50.91銀杏內酯B峰面積92983937999389890198956309345793327.51.90(3)穩定性試驗取銀杏內酯注射液樣品，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，每隔一定時間依法測定銀杏內酯A及銀杏內酯B峰面積，結果見表IO，試驗結果供試品在12小時內基本穩定。表IO穩定性試驗(批號060525)時間(h)0124812平均值RSD(%)銀杏內酯A峰面積15520160181607015335157731548715700.51.9銀杏內酯B峰面積129337127886125006127393122612126561126465,81.8(4)重復性試驗取同一批號銀杏內酯注射液樣品，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，依法試驗，測定銀杏內酯A、銀杏內酯B的含量，結果見表ll，結果表明本法重復性良好。表ll重復性試驗(批號060525)測定次數銀杏內酯平均峰平均RSD銀杏內酯平均峰平均RSD(次)A峰面積面積(%)B峰面積面積(%)1155201562515572.5119337l腦8118152.52159491558915769.0115582116362115972.0315321564415482.515442.61.5612186611340417635.0118968.21.82<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(5)對樣品的檢測取銀杏內酯注射液樣品，依法試驗，記錄供試品溶液色譜中銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值，結果均不大于對照品溶液色譜中銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值，詳細數據見表12。表12銀杏內酯A、銀杏內酯B限量測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據樣品測定結果，十批樣品中游離銀杏內酯的峰面積均小于相應對照品的峰面積。3、高效液相色譜法指紋圖譜測定的研究與說明(1)標準指紋圖譜的制定按銀杏內酯注射液工藝制備io批注射液成品，進行指紋圖譜的測定以確定標準指紋圖譜，分別精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，測定，計算。結果見表13、表14:表13十批銀杏內酯注射液樣品指紋圖譜測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表14銀杏內酯注射液指紋圖譜共有峰的確定參數的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由以上IO批樣品檢測的數據計算，確定銀杏內酯注射液標準指紋圖譜及各項參數為圖譜中有4個共有峰，各號峰的相對保留時間為S號峰為l.OO，1號峰為0.881.32，2號峰為1.552.33，3號峰為L902.86;其中1號峰的相對峰面積比值為0.501.26;非共有峰面積不得超過總峰面積的10%。銀杏內酯注射液標準指紋圖譜見附圖4:銀杏內酯注射液高效液相色譜標準指紋圖譜。(2).穩定性試驗同一批樣品，制備供試品溶液，測定，結果見表15、表16。結果表明，供試品溶液中各共有峰的相對保留時間及主要峰的相對峰面積基本沒有明顯變化，符合指紋圖譜的技術要求。表15銀杏內酯注射液供試品溶液的穩定性考察結果(共有峰的相對保留時間)\<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>同一樣品供試品溶液，連續進樣測定，測定結果見表17、表18。結果表明，供試液中各共有峰的相對保留時間及主要峰的相對峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>O駕表20銀杏內酯注射液指紋圖譜測定重復性考察結果(主要峰的相對峰面積)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>所述銀杏內酯注射液指紋圖譜測定方法的色譜圖為附圖5:對照品溶液高效液相色譜指紋圖譜；附圖6:供試品溶液高效液相色譜指紋圖譜；附圖7:陰性供試品溶液高效液相色譜指紋圖譜。本發明的有益效果1、本發明采用高效液相色譜法進行含量測定，其優點在于恰好適用于銀杏內酯注射液的測定，而且具有專屬性高，重現性好，誤差小的特點。2、本發明又提出了一種對銀杏內酯注射液中游離銀杏內酯成分的限量檢査方法，本方法的優點在于可以對銀杏內酯注射液中游離銀杏內酯成分(內酯型)的限量進行檢查，規定其限度，能夠保證游離銀杏內酯不在注射液中析出。3、本發明還提出了一種采用指紋圖譜方法進行檢測的方法，本方法的優點在于銀杏內酯注射液不經酸化，直接采用指紋圖譜方法進行檢測，能夠反映及控制注射液的實際質量和穩定性。綜上所述，本發明提供的質量控制方法達到能夠達到更全面、有效地控制銀杏內酯注射液質量的目的。1:游離銀杏內酯檢測的對照品溶液色譜圖2:游離銀杏內酯檢測的供試品溶液色譜圖3:游離銀杏內酯檢測的陰性供試品溶液色譜圖4:銀杏內酯注射液高效液相色譜標準指紋圖譜5:對照品溶液指紋圖譜；6:供試品溶液指紋圖譜；7:陰性供試品溶液溶液指紋圖譜。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步說明，下述實施例僅用于說明本發明而并非對本發明的限制。實施例l:一種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜含量測定照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適用性試驗填充劑用十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動相異丙醇:甲醇:水=6:20:70;檢測波長220nm;理論塔板數:按銀杏內酯B計應不低于6000。對照品溶液的制備取銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K對照品適量，精密稱定，分別加50%丙酮溶解制成每lmL含0.5mg、0.5mg、O.lmg的溶液，即得。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070104供試品溶液的制備精密量取本品2ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的鹽酸溶液2ml，室溫放置3.0小時使有結晶析出，加丙酮使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。圖測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1(^1，注入液相色譜儀，測定，即得。測定結果每lml含銀杏內酯A為1.2mg、銀杏內酯B應為2.4mg、銀杏內酯K為0.12mg;含銀杏內酯以銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K的總量計，為3.72mg。符合標準要求。實施例2:—種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜含量測定照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適用性試驗填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相異丙醇:甲醇:水=7:21:72;檢測波長220nm;理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于7000。對照品溶液的制備取銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K對照品適量，精密稱定，分別加50%丙酮溶解制成每lmL含0.5mg、0.5mg、O.lmg的溶液，即得。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070107供試品溶液的制備精密量取本品2ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的鹽酸溶液2ml，室溫放置3.5小時使有結晶析出，加丙酮使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20pl，注入液相色譜儀，測定，即得。測定結果每lml含銀杏內酯A為1.5mg、銀杏內酯B為2.7mg、銀杏內酯K為0.15mg;含銀杏內酯以銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K的總量計，為4.35mg。符合標準要求。實施例3:—種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜含量測定照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適用性試驗填充劑十八垸基硅垸鍵合硅膠；流動相異丙醇:甲醇:水=9:25:75;檢測波長220nm;理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于7000。對照品溶液的制備取銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K對照品適量，精密稱定，分別加50%丙酮溶解制成每lmL含0.5mg、0.5mg、O.lmg的溶液，即得。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070108供試品溶液的制備精密量取本品2ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的鹽酸溶液2ml，室溫放置3.5小時使有結晶析出，加丙酮使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20)H1，注入液相色譜儀，測定，即得。測定結果本品每lml含銀杏內酯A為1.8mg、銀杏內酯B為3.0mg、銀杏內酯K為0.18mg;含銀杏內酯以銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K的總量計，為4.98mg。符合標準要求。實施例4:一種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜法檢查游離銀杏內酯限度色譜條件與系統適用性高效液相色譜系統Waters2695液相色譜儀，全自動進樣器，柱溫箱；色譜柱ThermoHypersilODS,5pm,4.6mmx250mm;柱溫30°C;流動相四氫呋喃-甲醇-水比例為10.0:25.0:65.0;流速lml/min;檢測器2487紫外檢測器;檢測波長220nm;理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于3000。實驗中所用溶劑為色譜純，水為純凈水。系統適用性在HypersilODS柱上，流動相四氫呋喃-甲醇-水比例為10.0:25.0:65.0條件下的分離結果為:銀杏內酯A、銀杏內酯B的理論塔板數分別大于8000，10000，銀杏內酯A和銀杏內酯B的分離度大于2，分離效果良好，拖尾因子達到中國藥典定量要求。對照品來源本實驗所用對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供(銀杏內酯A批號0862-200004;銀杏內酯B批號0863-200204)。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070104對照品溶液的制備取銀杏內酯A、銀杏內酯B對照品，分別加甲醇溶解制成每lmL含0.489mg和0.517mg的溶液，即得。供試品溶液的制備取銀杏內酯注射液25ml，加乙酸乙酯振搖提取4次，每次加乙酸乙酯20ml，合并乙酸乙酯液，加3g無水硫酸鈉脫水后水浴揮干，殘渣加甲醇5ml使溶解，作為供試品溶液。測定法精密量取對照品溶液及供試品溶液各20)dl，注入液相色譜儀，記錄對照品及供試品色譜峰吸收度積分值。供試品溶液色譜圖中銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值分別為12.5禾n42.2;對照品溶液色譜圖中銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值分別為235.8和304.6。符合標準要求。實施例5:—種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜法檢查游離銀杏內酯限度色譜條件與系統適用性高效液相色譜系統Waters2695液相色譜儀，全自動進樣器，柱溫箱；色譜柱ThermoHypersilODS,5pm，4.6mmx250mm;柱溫20°C;流動相四氫呋喃-甲醇-水比例為6.0:23.0'.55.0;流速0.5ml/min;檢測器2487紫外檢測器；檢測波長220nm;理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于3000。實驗中所用溶劑為色譜純，水為純凈水。系統適用性在HypersilODS柱上，流動相四氫呋喃-甲醇-水比例為6.0:23.0:55.0條件下的分離結果為銀杏內酯A、銀杏內酯B的理論塔板數分別大于8000，10000，銀杏內酯A和銀杏內酯B的分離度大于2，分離效果良好，拖尾因子達到中國藥典定量要求。對照品來源本實驗所用對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供(銀杏內酯A批號0862-200004;銀杏內酯B批號0863-200204)。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070107對照品溶液的制備取銀杏內酯A、銀杏內酯B對照品，分別加甲醇溶解制成每lmL含0.504mg和0.497mg的溶液，即得。供試品溶液的制備取銀杏內酯注射液25ml，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次加乙酸乙酯25ml，合并乙酸乙酯液，加2g無水硫酸鈉脫水后水浴揮干，殘渣加甲醇5ml使溶解，作為供試品溶液。測定法精密量取對照品溶液及供試品溶液各15|Ul，注入液相色譜儀，記錄對照品及供試品色譜峰吸收度積分值。供試品溶液色譜圖中銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值分別為9.9和45.8;對照品溶液色譜圖中銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值分別為243.4和300.2。符合標準要求。實施例6:—種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜法檢查游離銀杏內酯限度色譜條件與系統適用性高效液相色譜系統Waters2695液相色譜儀，全自動進樣器，柱溫箱；色譜柱ThermoHypersilODS,5nm,4.6mmx250mm;柱溫30°C;流動相四氫呋喃-甲醇-水比例為14.0:28.0:70.0;流速1.5ml/min;檢測器2487紫外檢測器;檢測波長220nm;理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于3000。實驗中所用溶劑為色譜純，水為純凈水。系統適用性在HypersilODS柱上，流動相四氫呋喃-甲醇-水比例為14.0:28.0:70.0條件下的分離結果為銀杏內酯A、銀杏內酯B的理論塔板數分別大于8000，10000，銀杏內酯A和銀杏內酯B的分離度大于2，分離效果良好，拖尾因子達到中國藥典定量要求。對照品來源本實驗所用對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供(銀杏內酯A批號0862-200004;銀杏內酯B批號0863-200204)。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070108對照品溶液的制備取銀杏內酯A、銀杏內酯B對照品，分別加甲醇溶解制成每lmL含0.492mg和0.516mg的溶液，即得。供試品溶液的制備取銀杏內酯注射液25ml，加乙酸乙酯振搖提取5次，每次加乙酸乙酯15ml，合并乙酸乙酯液，加5g無水硫酸鈉脫水后水浴揮干，殘渣加甲醇5ml使溶解，作為供試品溶液。測定法精密量取對照品溶液及供試品溶液各30)Ld，注入液相色譜儀，記錄對照品及供試品色譜峰吸收度積分值。供試品溶液色譜圖中銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值分別為26.1和53.3;對照品溶液色譜圖中銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值分別為236.9和303.8。符合標準要求。實施例7:—種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜指紋圖譜測定照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適用性高效液相色譜系統waters2695液相色譜儀；色譜柱ThermoHypersilODS,5j^m,4.6mmx250mm;柱溫30°C;流動相甲醇-異丙醇-50mmol/L乙酸銨水溶液(加乙酸調PH值為6.5)比例為7.5:2.5:90;流速1.0ml/min;檢測器waters2420蒸發光散射檢測器；蒸發光散射檢測器參數N2:25Psi;噴霧器溫度37。C;漂移管溫度50°C。理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于3000;實驗中所用甲醇、異丙醇為色譜純，水為純凈水、其他試劑均為分析純。對照品來源本實驗所用對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供(銀杏內酯B批號:0863-200204)。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070102對照品溶液的制備取銀杏內酯B對照品，加5%葡甲胺水溶液70。C加熱使溶解，制成每lmL含0.510mg的溶液，即得。供試品溶液的制備取銀杏內酯注射液作為供試品溶液。測定法分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各5^1，注入液相色譜儀，測定并記錄40分鐘色譜圖。供試品指紋圖譜中與參照物峰相應的峰為S峰，計算相對保留時間與峰面積比值，結果為共有峰指紋圖譜中有4個共有峰；相對保留時間S號峰為1.00，1號峰為1.10，2號峰為1.98，3號峰為2.34;峰面積比值l號峰為0.84;總共有峰占總峰面積的94.5%。符合標準要求。實施例8:—種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜指紋圖譜測定照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適用性高效液相色譜系統waters2695液相20色譜儀；色譜柱ThermoHypersilODS，5|im,4.6mmx250mm;柱溫20°C;流動相甲醇-異丙醇-50mmol/L乙酸銨水溶液(加乙酸調PH值為6.0)比例為6.0:4.0:100.0;流速0.5ml/min;檢測器waters2420蒸發光散射檢測器；蒸發光散射檢測器參數N2:25Psi;噴霧器溫度35°C;漂移管溫度45°C。理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于3000;實驗中所用甲醇、異丙醇為色譜純，水為純凈水、其他試劑均為分析純。對照品來源本實驗所用對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供(銀杏內酯B批號0863-200204)。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070105對照品溶液的制備取銀杏內酯B對照品，加5%葡甲胺水溶液70。C加熱使溶解，制成每lmL含0.492tng的溶液，即得。供試品溶液的制備取銀杏內酯注射液作為供試品溶液。'測定法分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各3pl，注入液相色譜儀，測定并記錄25分鐘色譜圖。供試品指紋圖譜中與參照物峰相應的峰為S峰，計算相對保留時間與峰面積比值，結果為共有峰指紋圖譜中有4個共有峰；相對保留時間S號峰為1.00，1號峰為0.72，2號峰為1.84，3號峰為2.06;峰面積比值l號峰為0.62;總共有峰占總峰面積的97.8%。符合標準要求。實施例9:一種銀杏內酯注射液的質量控制方法，該方法包含如下步驟高效液相色譜指紋圖譜測定照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適用性高效液相色譜系統waters2695液相色譜儀；色譜柱ThermoHypersilODS，5pm，4.6mmx250mm;柱溫40。C;流動相甲醇-異丙醇-50mmol/L乙酸銨水溶液(加乙酸調PH值為7.0)比例為9.0:2.0:75.0;流速1.5ml/min;檢測器waters2420蒸發光散射檢測器；蒸發光散射檢測器參數N2:25Psi;噴霧器溫度40。C;漂移管溫度55°C。理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于3000;實驗中所用甲醇、異丙醇為色譜純，水為純凈水、其他試劑均為分析純。對照品來源本實驗所用對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供(銀杏內酯B批號0863-200204)。供試品來源銀杏內酯注射液，批號070102對照品溶液的制備取銀杏內酯B對照品，加5%葡甲胺水溶液70。C加熱使溶解，制成每lmL含0.515mg的溶液，即得。供試品溶液的制備取銀杏內酯注射液作為供試品溶液。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5pl，注入液相色譜儀，測定并記錄55分鐘色譜圖。供試品指紋圖譜中與對照品溶液峰相應的峰為S峰，計算相對保留時間與峰面積比值，結果為共有峰指紋圖譜中有4個共有峰；相對保留時間S號峰為1.00，1號峰為1.38，2號峰為2.42，3號峰為2.86;峰面積比值1號峰為1.19;總共有峰占總峰面積的95.8%。符合標準要求。權利要求1、一種銀杏內酯注射液的高效液相色譜質量控制方法，其特征在于采用如下含量測定、游離銀杏內酯限量檢查、指紋圖譜測定方法中的任意一種或幾種(1)含量測定①色譜條件為柱溫為20℃～40℃；流動相為異丙醇-甲醇-水比例為5～10∶15～25∶65～75，流速為0.5ml/min～1.5ml/min，檢測器為可變波長紫外檢測器，檢測波長為210nm～230nm，理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于5000；②對照品溶液的制備方法為分別取銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K對照品，分別加40％～60％丙酮溶解，制成1ml分別含0.2～0.8mg銀杏內酯A、0.2～0.8mg銀杏內酯B、0.2～0.8mg銀杏內酯K的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為精密量取銀杏內酯注射液1ml～5ml置5ml～20ml量瓶中，加入3mol/L～9mol/L的鹽酸溶液1ml～5ml，放置使有結晶析出，加丙酮使溶解并稀釋至刻度，搖勻，放置，濾過，即得供試品溶液；④測定分別精密吸取等量的對照品溶液與供試品溶液各5μl～50μl，注入液相色譜儀，測定；⑤測定結果銀杏內酯注射液每毫升含銀杏內酯A為0.5mg～3.0mg、銀杏內酯B為1.5mg～4.0mg、銀杏內酯K為0.5mg～3.0mg；含銀杏內酯以銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K的總量計，應為3.0mg～6.0mg；(2)游離銀杏內酯限量檢查①色譜條件為柱溫為20℃～40℃，流動相為四氫呋喃-甲醇-水比例為5～15∶20～30∶50～80，流速為0.5ml/min～1.5ml/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210nm～230nm，理論塔板數按銀杏內酯B計不低于2000；②對照品溶液的制備方法為取銀杏內酯A、銀杏內酯B對照品，分別加甲醇溶解制成1ml含0.2mg～0.8mg的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為取銀杏內酯注射液15ml～35ml，加乙酸乙酯振搖提取2次～6次，每次加乙酸乙酯15ml～25ml，合并乙酸乙酯液，加1g～5g無水硫酸鈉脫水后水浴揮干，殘渣加2ml～8ml甲醇使溶解，作為供試品溶液；④測定分別量取等量的對照品溶液與供試品溶液各5μl～50μl，注入液相色譜儀，測定對照品與供試品色譜峰吸收度積分值；⑤測定結果色譜圖中供試品溶液的銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值不得大于對照品溶液的銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值；(3)指紋圖譜測定①色譜條件為柱溫為20℃～40℃，流動相為甲醇-異丙醇-50mmol/L乙酸銨水溶液比例為6～9∶1～4∶80～100，流速為0.5ml/min～1.5ml/min，理論塔板數按銀杏內酯B計算不低于2000；②對照品溶液的制備方法為取銀杏內酯B對照品，加1％～10％葡甲胺水溶液，加熱使溶解，制成1ml含0.2mg～0.8mg的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為取銀杏內酯注射液直接作為供試品溶液；④測定分別量取等量的對照品溶液與供試品溶液各2μl～50μl，注入高效液相色譜儀，測定20分鐘以上的色譜圖；⑤測定結果供試品色譜圖應呈現與標準指紋圖譜保留時間相同的4個共有色譜峰，各號峰的相對保留時間為S號峰為1.00，1號峰為0.70～1.50，2號峰為1.50～2.50，3號峰為1.80～3.00；S號峰為銀杏內酯B的色譜峰。2、根據權利要求1所述的含量測定方法，其特征在于①色譜條件為填充劑為十八烷基硅垸鍵合硅膠，柱溫為30°C，流動相為異丙醇-甲醇-水比例為7:21:72，流速lml/min，檢測波長為220nm，理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于7000;②對照品溶液的制備方法為分別精密稱取經105°C干燥至恒重的銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K對照品適量，分別加50%丙酮溶解，制成lml分別含0.5mg銀杏內酯A、0.5mg銀杏內酉旨B、O.lmg銀杏內酯K的溶液，即得對照品溶液；③供試品溶液的制備方法為精密量取銀杏內酯注射液2mi置10ml量瓶中，加入6mol/L的鹽酸溶液2ml，室溫放置3.5小時使有結晶析出，加丙酮使溶解并稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘，經微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；④測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20pl注入液相色譜儀，測定；測定結果銀杏內酯注射劑每毫升含銀杏內酯A為1.0mg2.0mg、銀杏內酯B為2.2mg3.2mg、銀杏內酯K為0.1mg0.2mg;含銀杏內酯以銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯K的總量計，應為4.1mg4.9mg。3、根據權利要求1所述的游離銀杏內酯限量檢查方法，其特征在于①色譜條件為填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，柱溫為30°C，流動相為四氫呋喃-甲醇-水比例為10:25:65，流速為lml/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為220nm，理論塔板數按銀杏內酯B計不低于3000;②對照品溶液的制備方法為取銀杏內酯A、銀杏內酯B對照品，分別加甲醇溶解制成lml含0.5mg的溶液，即得對照品溶液；◎供試品溶液的制備方法為取銀杏內酯注射液25ml，加乙酸乙酯振搖提取4次，每次加乙酸乙酯20ml，合并乙酸乙酯液，加3g無水硫酸鈉脫水后水浴揮干，殘渣加甲醇5ml使溶解，作為供試品溶液；④測定分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各20^1，注入液相色譜儀，測定對照品與供試品色譜峰吸收度積分值；測定結果色譜圖中供試品溶液的銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值不得大于對照品溶液的銀杏內酯A、銀杏內酯B的吸收度積分值，即供試品中游離銀杏內酯A、銀杏內酯B的總量不得大于4%。4、根據權利要求1所述指紋圖譜測定方法，其特征在于①色譜條件為填充劑為以十八烷基硅垸鍵合硅膠，柱溫為30°C，流動相為甲醇-異丙醇-50mmol/L乙酸銨水溶液比例為7.5:2.5:90，流速為1.0ml/min，檢測器為蒸發光散射檢測器，理論塔板數按銀杏內酯B計應不低于3000;②對照品溶液的制備方法為取銀杏內酯B對照品，加5%葡甲胺水溶液60。C80。C加熱使溶解，制成lml含0.5mg的溶液，即得對照品溶液；(D供試品溶液的制備方法為取注射液直接作為供試品溶液；④測定分別精密量取對照品溶液與供試品溶液各5)11，注入液相色譜儀，測定40分鐘色譜圖；測定結果供試品色譜圖應呈現與標準指紋圖譜保留時間相同的4個共有色譜峰，各號峰的相對保留時間為S號峰為l.OO，l號峰為0.881.32，2號峰為1.552.33，3號峰為1.902.86;其中1號峰的相對峰面積比值為0.401.40;供試品圖譜中非共有峰面積不得超過總峰面積的10%。全文摘要本發明涉及一種注射劑的質量控制方法，特別涉及銀杏內酯注射液的質量控制方法。本發明提供了一種采用高效液相色譜法控制銀杏內酯注射劑質量的方法，該方法可以采用含量測定或游離銀杏內酯限量檢查或色譜指紋圖譜三種方法中的任意一種或幾種來控制銀杏內酯注射液的質量。本發明提供的質量控制方法具有良好的精密度、穩定性和重復性，能夠更全面、有效地達到控制銀杏內酯注射液質量的目的。文檔編號A61K36/16GK101647829SQ20081013082公開日2010年2月17日申請日期2008年8月12日優先權日2008年8月12日發明者婭凌,強尚,戴翔翎,畢宇安,王振中,章晨峰,偉肖,鄒艷萍申請人:江蘇康緣藥業股份有限公司