專利名稱：法舒地爾誘導成年腦內源性神經干細胞再生的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及法舒地爾用于誘導成年腦內源性神經干細胞再生的用途，特別地，涉及法舒 地爾用于保護神經損傷和治療與神經元損傷和死亡相關的疾病的用途。
背景技術：
法舒地爾為異喹啉磺胺衍生物，化學名稱為六氫-l-(5-異喹啉磺酰基)-lH-l,4-二氮雜卓或 l-(5-異喹啉磺酰基)高哌嗪，英文名稱為Fasudil，分子式為C,4HnN302S。其常用鹽有鹽酸鹽、 硝酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽，法舒地爾鹽酸鹽是最通常使用的一種鹽。2002年，法舒地爾在 中國上市，適應癥為蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣等引起的缺血性腦血管疾病癥狀的改善。 腦內的血管破裂出血后血液流入蛛網膜下腔，稱為蛛網膜下腔出血，其為出血性腦血管病的 一個類型，分原發性和繼發性兩種。頭痛、嘔吐和頸項強直是蛛網膜下腔出血的主要癥狀。 腦血管痙攣是指動脈在一段時間內的異常收縮狀態，常見于顱內動脈瘤破裂的蛛網膜下腔出 血病人。腦血管痙攣是蛛網膜下腔出血的致殘與死亡的主要原因。已經表明法舒地爾為一種 新型、高效的血管擴張藥(其為一種蛋白激酶抑制劑，即細胞內鈣離子拮抗劑)，能有效緩解 腦血管痙攣，改善蛛網膜下腔出血后引起的腦血管痙攣。目前已有許多臨床報告證實鹽酸法 舒地爾治療蛛網膜下腔出血后引起的腦血管痙攣的有效性和安全性。
已有體內試驗研究了鹽酸法舒地爾藥代動力學和代謝活性產物。鹽酸法舒地爾進入體內 很快轉變為具有相同活性的代謝產物一羥基法舒地爾(hydroxyfasudil)，其濃度可達母藥的86 %，并具有較長的半衰期(鹽酸法舒地爾半衰期0.78小時，而羥基法舒地爾半衰期4.66小時)。 羥基法舒地爾的12小時峰谷值為0.077 nM，并且具有與鹽酸法舒地爾相同的生物活性，可 在有效濃度范圍內(0.025 —1.6 pM)抑制Rho激酶。
腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、帕金森病、視網膜疾病等神經系統疾病在其發生和發 展過程中會導致神經元的損傷和死亡。對于這組疾病，人們一直都在積極地尋求有效的治療 藥物。過去20年來，人們研究和觀察了大量的神經保護劑，試圖可以預防和治療這些神經系 統疾病的發生和發展，包括鈣通道拮抗劑、自由基清除劑、谷氨酸拮抗劑、細胞膜穩定劑和 神經營養因子等，但由于腦損傷后多種因素同時或先后參與了神經元的損傷與死亡，單純作 用于單個耙點的藥物難以取得令人滿意的療效，上述神經保護劑的臨床治療效果并不理想。神經系統損傷后的再生修復問題一直是神經科學領域關注的重點。隨著神經干細胞研究 不斷深入，人們嘗試利用神經干細胞修復受損神經元成為近年來神經科學領域研究的熱點之 一。祌經干細胞在修復受損神經組織中發揮重要作用，是修復和代替受損組織的有效方法， 能夠重建部分環路和功能。目前，研究較廣泛的移植物主要還是胚胎干細胞和神經干細胞。 但因來源有限、倫理障礙及免疫排斥等問題，這些細胞的實用性受到極大限制。近來研究表 明，骨髓間充質干細胞具有分化為神經元和神經膠質細胞的能力。但是，骨髓源細胞如骨髓 間充質干細胞有較高的病毒感染危險，且隨著其來源個體的年齡增長其細胞數量和增殖、分 化能力也顯著下降，較難滿足臨床的需求。
1992年，Reynolds等首先從成年鼠紋狀體中分離出神經干細胞，從而突破了成年組織不 可再生的觀點。該實驗充分證明成年神經千細胞產生的新生祌經元不僅在形態上與成熟神經 元相同，而且對突觸刺激有動作電位反應，并且可以有效地整合到神經環路中，從而為臨床 應用神經干細胞奠定了基礎，為我們利用成年神經干細胞進行腦修復治療指明了一個方向。 但是，到目前為止，該研究領域仍然沒有找到一種能夠有效地在體內作用于成年神經干細胞， 誘導其再生，從而修復受損神經細胞以達到治療神經系統疾病的藥物。因此，尋找一種能夠 自由通過血腦屏障的、相對穩定的、可以誘導內源性成年腦神經干細胞再生的物質一直是人 們努力尋找的方向。
發明內容
本發明人經過長期認真地研究，出人意料地發現法舒地爾還具有神經保護功能和具有促 進成年腦神經干細胞分化、誘導成年腦神經干細胞再生的功能，從而完成了本發明。 因此，在一個方面，本發明提供法舒地爾保護神經功能的用途。
在一個方面，本發明提供法舒地爾誘導成年腦神經干細胞再生的用途，即誘導成年腦內 源性神經干細胞的用途。
在另一個方面，本發明提供法舒地爾治療與神經元損傷和死亡相關的疾病的用途，即治 療神經系統疾病的用途。
在一個方面，本發明提供法舒地爾在制備用于誘導成年腦神經干細胞再生的藥物中的用 途。特別地，本發明提供法舒地爾在制備用作神經保護劑的藥物中的用途。
在另一個方面，本發明提供法舒地爾在制備用于治療神經系統疾病的藥物中的用途。
在還一個方面，本發明提供一種治療神經系統疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的 法舒地爾或鹽酸法舒地爾。本發明所述的法舒地爾，包括其鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽、甲磺酸 鹽、檸檬酸鹽等藥學上可接受的鹽形式，其可以為任意形式，包括結晶形式(包括帶有結晶水 的和不帶有結晶水的)、水合物形式等藥學上可接受的形式，優選法舒地爾鹽酸鹽。這些鹽及 不同的形式可以按照本領域熟知的方法制備。
本發明所述的有效量為法舒地爾在用于神經保護或治療神經系統疾病中所可能產生醫學 上認可的功效的量。本發明人經多次研究發現，適于誘導成年腦神經干細胞再生，即適于可 能治療神經系統疾病的法舒地爾的有效量為0.5-8mg/kg，優選l-6mg/kg,更優選3-5mg/kg， 最優選5mg/kg。對于上述法舒地爾的各種鹽及包含法舒地爾的藥物組合物的用量，以相當于 能提供上述法舒地爾有效量的相應法舒地爾鹽的量即為相應鹽的有效量。
本發明所述的與神經元損傷和死亡相關的疾病，即所述神經系統疾病包括，但不限于腦 缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、視網膜疾病等。
可以按照本領域已知的常規技術，將木發明所述的法舒地爾或包含有效量的法舒地爾的 藥物組合物制成適于給藥的任何劑型，包括但不限于腸道給藥制劑或非腸道給藥制劑，例如 片劑、膠囊、口服液、注射劑、粉針劑等，優選注射劑，更優選靜脈注射劑。
本發明所述制劑的給藥途徑可以是本領域已知的任何給藥途徑，優選腹腔注射。
本發明所述制劑可以每天給藥3次，每次給藥量為法舒地爾可以治療所述疾病的有效量， 即上述給出的有效量。
應當理解，對于本發明中提及但沒有詳細說明的方法、步驟、裝置、儀器、材料等，普 通技術人員可以采用本領域熟知的相應方法、步驟、裝置、儀器、材料等，或者按照本領域 的常規知識和技術獲得。
圖1為顯示體外原代培養的海馬神經元MAP — 2和HOCHEST雙染色圖。紅色為MAP-2神經 元，而藍色為HOCHEST核染色，用以檢驗本研究所用祌經元的形態和純度。
圖2為顯示小鼠在正常氧和腦缺氧(8%氧)6小時后，復氧72小時后海馬不同部位神經 元染色圖。CA1、 CA2和CA3分別為海馬CA1、 CA2和CA3區。
圖3為顯示小鼠在腦缺氧(8%氧)不同時間腦組織勻漿后免疫印染法測定Rho激酶的亞型 RockII蛋白的表達的圖。
圖4為顯示小鼠在腦缺氧不同的時間腦組織切片免疫組化染色Rho激酶的亞型ROCK II 的表達的圖，紅黃箭頭均為綠色熒光的ROCK II表達。圖5為顯示小鼠腦缺氧(8%) 6小時后注射生理鹽水和法舒地爾(mg/kg) ， 24小時后側腦 室下區(SVZ)后角(A和B)，前角(C和D)和海馬DG區(E和F) Brdu陽性細胞數的圖。
圖6為顯示小鼠腦缺氧(8%)6小時后注射法舒地爾，24小時后側腦室下區(SVZ)后角 DCX和Brdu雙陽性細胞數的圖。A)紅色為Brdu陽性，細胞，B)綠色為DCX染色，C)二種 顏色的重疊。重疊復染細胞為增生的神經千細胞。
圖7為顯示生理鹽水組和法舒地爾組的小鼠腦組織勻漿上清液G-CSF和VEGF的濃度水 平圖。采用進口標準的檢測試劑盒測定。
圖8為顯示體外原代神經元培養后和PBS對照的Brdu陽性細胞數的圖。
圖9為顯示法舒地爾抑制缺氧后祌經元死亡而導致培養上清液LDH釋放減少和PI陽性 細胞數減少的圖。
具體實施例方式
本發明將結合下述試驗例或實施例做進一歩詳細闡述，但應當理解，下述實施例僅僅用 于闡述和解釋本發明，而并不限制本發明的范圍。
試驗例l:法舒地爾體外促進腦神經干細胞增生試驗
1. 試驗細胞及其制備
將孕17—18天KM孕鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。脫頸法處死孕鼠， 75%酒精消毒皮膚。在無菌條件下剝出胎鼠，置于冰預冷的DMEM培養液中。仔細分離胎鼠 腦組織，剝除腦膜及血管，去除小腦、腦干和基底節，取出海馬組織，置于冰預冷的DMEM 中輕輕吹打，使其形成單細胞懸浮液。收集細胞懸液，在4oC下，以1000轉/分鐘離心5分 鐘。棄去上清液，用新鮮配制的神經元培養液重新懸浮。計數細胞，計算細胞懸液中細胞的 密度。以2><105/0112種植在多聚賴氨酸包被的玻片上，在37。C下、5%(:02培養箱內培養，7 天后更換l/2培養液。14天后進行神經元特異性標記微管相關蛋白-2(MAP-2)染色鑒定，同 時用熒光染色劑HOCHEST33342標記細胞核。熒光顯微鏡下觀測結果(見圖1)。 MAP—2陽 性細胞為紅色，提示為神經元，藍色為細胞核。鑒定后的神經元細胞供建立缺糖缺氧損傷 (oxygen-glucose deprivation, OGD)模型。
2. 缺糖缺氧細胞損傷模型
'無糖型DMEM培養液，用前通入5%<:02、 10%H2、 85%>42混合氣體飽和15min，去處
培養液中的氧氣，制備缺糖缺氧神經元培養液。取培養10天左右，生長良好的神經元，棄去培養液，用PBS液沖洗3次，加入無糖型DMEM培養液。將培養板置于厭氧培養箱內，向 箱內通入5%<:02、 10%H2、 85XN2混合氣體，將培養箱密封保持37°C，并使箱內氧濃度低 于1%。在一定缺氧時間(例如6小曰寸)后將培養板取出，吸除無糖培養液，分別加入原神經 元培養液，放置于37'C、 5%C02和95%空氣的培養箱中繼續培養。
3. 給藥
隨后，給藥缺糖缺氧神經元法舒地爾注射液(母藥濃度為30mg/2ml=15mg/ml)。實驗濃 度設定為高，中和低三個濃度，分別為l ^tg/ml， 10 pg/ml和100 ng/ml。分別在當天、第 2天和第3天分三次加入。第5天收集細胞和上清液做進一步檢測用。
4. 對照試驗
實驗模型確定后，采用加入相同體積的PBS代替法舒地爾注射液，在完全相同的實驗 條件下作為法舒地爾的對照。正常氧狀態下培養的細胞作為缺氧細胞的基線。
5. 神經元BrdU檢測
加入法舒地爾第3天后，分別在第3和第4天加Brdu (1 ug/ml)。第5天收集細胞PBS 漂洗細胞10minX2次，4%多聚甲醛室溫固定20min， 1 XPBS漂洗細胞10minX2次，3%羊 血清室溫封閉15min。 BrdU—抗(l: 200)稀釋于含1 %羊血清PBS中，4°C，過夜。羊抗小鼠 CY3標記二抗(l: IOO)稀釋于PBS中，室溫避光1小時。1XPBS漂洗細胞5minX3次，50 %甘油封片，熒光顯微鏡下觀測結果。
6. 結果和分析
圖8顯示比較PBS組，加入法舒地爾組神經元形成較為明顯的神經球。Brdu陽性的增生 神經元細胞明顯多于PBS對照組。結果清楚地表明法舒地爾可在體外促進腦神經干細胞增生。 多次試驗得到相同的結果。
試驗例2:法舒地爾體內促進腦神經干細胞增生試驗
1. 試驗動物
KM小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。動物到達實驗室后給與清潔級 飼養，自由飲食和飲7]C，靜養5 — 7天。
2. 小鼠缺氧模型
將32只小鼠分成4組，每組8只，在缺氧系統中給予8%氧氣+92%氮氣混合氣體中分 別缺氧2小時、4小時、6小時、8小時。在缺氧箱中放置缺氧儀，動態檢測缺氧箱中氧濃度保證小鼠缺氧程度的可控性。箱體可容納30 — 40只小鼠，將32只小鼠一次放入可以保證缺 氧條件的可比性。復氧72小時后生理鹽水灌注，取腦液氮速凍后一8(TC保存，待免疫印染和 免疫組化時腦組織切片后，海馬神經元和ROCK II染色。
3. 給藥
法舒地爾注射液，母藥濃度為30mg/2ml = 15mg/ml。依據體外實驗的結果，體內試驗濃 度設定為小鼠在缺氧系統中缺氧6小時后腹腔注射鹽酸法舒地爾(5 mg/kg)和Brdu(50 mg/kg)， 24小時后再重復注射一次；對照組注射相同體積生理鹽水和Brdu。法舒地爾組8只 鼠，而生理鹽水對照組7只鼠。復氧24小時后生理鹽水灌注，取腦液氮速凍后一80'C保存， 待免疫印染和免疫組化時腦組織切片后，進行Brdu和DCX染色。
4. 對照試驗
進行實驗模型的同時，采用注射相同體積的生理鹽水代替法舒地爾注射液，在完全相同 的實驗條件下作為法舒地爾的對照。另外設定正常氧動物8只在完全相同的條件下進行作為 對照。
5. 免疫印染測定
經10% SDS-PAGE不連續凝膠電泳分離后，轉膜于PVDF膜上15-30 min，轉移后的硝酸 纖維膜置于麗春紅染色液中顯色，標記蛋白質Marker及譜帶位置后，轉移緩沖液洗至脫色。 封閉硝酸纖維膜置于膜封閉液中，搖床上緩慢搖動，室溫封閉lh。抗ROCKII抗體用5。/o的 小牛血清稀釋(l: 500)4。C過夜。采用二抗1: 1000稀釋，室溫孵育lh。用化學發光法顯色， X光片顯影。免疫印跡的圖譜由數碼相機拍照,經Image-pro Plus 5.0圖像處理軟件，以(3-actin 為內參。
6. 免疫組化測定
小鼠斷頭后沿中線切開頭皮并沿矢狀縫剪開顱骨，取出大腦，浸入20。/。庶糖中4。C脫水， 沉底后再置于30Q/。蔗糖中4。C脫水至組織下沉。用濾紙吸干腦組織表面的蔗糖溶液，用OCT 在液氮中包埋，以8pm的厚度作冠狀位冰凍連續切片，按照先后順序存放備用。免疫熒光染 色用5%羊血清室溫下封閉10min， 一抗4'C孵育24小時后，熒光燃料488標記的二抗室溫 避光作用l小時，lxPBS洗滌5minx3次后，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
7. 結果和分析
結果顯示我們建立的缺氧模型可以引起海馬不同區域，特別是CA1和CA2區內神經元的 丟失(參見圖2)。用免疫印染和免疫組化的方法證明腦缺氧6小時后R0CK n的表達增加，為使用Rho激酶抑制劑提供了依據(圖3和圖4)。結果表明缺氧后注射法舒地爾可以明顯增 加腦SVZ區前角和后角位置Brdu陽性的細胞再生(圖5)。進一步的研究發現這些Brdu陽性 的增生細胞同時表達神經干細胞標志DCX(圖6)，說明法舒地爾誘導的SVZ區增生細胞是神經 干細胞。
試驗例3:法舒地爾對神經元的保護作用
1. 試驗細胞
同試驗例1的1.試驗細胞及其制備中所述的方法制備試驗細胞。
2. 缺糖缺氧損傷模型
同試驗例1的2.缺糖缺氧損傷模型所述的方法制備缺糖缺氧損傷模型。
3. 給藥
根據試驗例1中法舒地爾不同濃度比較預實驗，在本實驗中我們選擇了中間的濃度， 即10ng/ml。其余與試驗例1中完全相同。
4. 對照試驗
試驗模型確定后，采用加入相同體積的PBS在完全相同的實驗條件下作為法舒地爾的對照。
5. 細胞LDH釋放率測定
為確定給予神經元不同時間處理后，在不同的復糖復氧的時間內神經元損傷的情況，通 過測定乳酸脫氫酶(LDH)檢測細胞損傷的程度。神經元受到損傷后細胞內的LDH將釋放到細 胞培養液內。因而檢測損傷后細胞上清液內的LDH值，反應了細胞受損情況。將正常細胞給 予反復凍溶，其上清液內為全部細胞死亡后釋放的LDH量。將所檢測的細胞上清液LDH值 與細胞完全死亡總釋放的LDH值相比，得到細胞LDH釋放率。LDH測定依據試劑盒說明書 操作。在酶標儀上波長490nm檢測每孔的OD值。細胞LDH釋放率以檢測組OD值/細胞 總釋放的OD值X100X來表示。
6. PI染色流式細胞儀檢測
碘化丙啶(propidine iodide， PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中 晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此，利用流式細胞儀檢測PI 陽性細胞代表死亡神經元細胞數。
7. 結果和分析
9圖9顯示用LDH試劑盒檢測發現法舒地爾處理可以減少神經元細胞培養上清液中LDH濃 度(p〈0. 05)，用流式細胞儀檢測發現法舒地爾處理可以減少PI細胞數(P〈0. 01)。我們采用不 同的方法(LDH釋放和流式細胞儀檢測)均證實法舒地爾可以保護缺氧后神經元的損傷。
試驗例4:法舒地爾誘導神經干細胞的作用機理
1. 試驗動物
同試驗例2的1.試驗細胞及其制備中所述的方法制備試驗細胞。
2. 小鼠缺氧模型
16只小鼠分別在缺氧系統中給予8%氧氣+ 92%氮氣混合氣體中分別缺氧6小時。在缺 氧箱中放置缺氧儀，動態檢測缺氧箱中氧濃度，保證小鼠缺氧程度的可控性。法舒地爾組和 生理鹽水組分別為8只。
3. 給藥
法舒地爾注射液(母藥濃度為3()〖iiK/2ml = 15iTig/ml)。依據體外實驗的結果，體內試驗濃 度設定為小鼠在缺氧系統中缺氧6小時后腹腔注射鹽酸法舒地爾(5 mg/kg)和Brdu (50 mg/kg)， 24小時后再重復注射一次，對照組注射相同體積生理鹽水和Brdu。法舒地爾組8只 鼠，生理鹽水對照組8只鼠。復氧24小時后生理鹽水灌注，取腦液氮速凍后一80'C保存，進 行腦組織勻漿上清液細胞因子測定。
4. 對照試驗
進行實驗模型的同時，采用注射相同體積的生理鹽水在完全相同的實驗條件下作為法舒 地爾的對照。
5. 細胞因子測定
為進一步深入研究法舒地爾誘導內源性神經干細胞的細胞分子機理，我們采用商售的試 劑盒檢測腦組織勻漿上清液中G-CSF和VEGF濃度。檢測步驟參照說明書。
6. 結果和分析
試驗結果顯示缺氧后法舒地爾處理顯著地增加了腦組織中G-CSF的濃度(pO.Ol)，而減 少了 VEGF的水平(p0.05)(參見圖7)。大量實驗己經證明G-CSF可以誘導內源性神經干細 胞動員，表明法舒地爾誘導內源性神經T細胞可能與G-CSF增加和VEGF減少有關。
權利要求
1.法舒地爾在制備用于誘導成年腦神經干細胞再生的藥物中的用途。
2. 權利要求1的用途，其中所述成年腦神經干細胞為腦內源性神經干細胞。
3. 法舒地爾在制備用于保護神經功能的藥物即神經保護劑中的用途。
4. 法舒地爾在治療神經系統疾病的藥物中的用途。
5. 權利要求l-4中任一項的用途，其中所述法舒地爾選自法舒地爾鹽酸鹽、硝酸鹽、硫 酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽、甲磺酸鹽或檸檬酸鹽。
6. 權利要求5的用途，其中所述法舒地爾為法舒地爾鹽酸鹽。
7. 權利要求4或6的用途，其中所述神經系統疾病選自腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、 帕金森病、癡呆或視網膜疾病。
8. 權利要求5的用途，其中所述神經系統疾病選自腦缺血、腦損傷、阿爾茨海默病、帕 金森病、癡呆或視網膜疾病。
9. 權利要求7的用途，其中所述神經系統疾病選自腦缺血或腦損傷。
全文摘要
本發明公開了法舒地爾及包含法舒地爾的藥物組合物用于誘導成年腦內源性神經干細胞再生的用途，特別地，本發明公開了法舒地爾用于保護神經損傷和治療與神經元損傷和死亡相關的疾病的用途。
文檔編號A61K31/551GK101612157SQ20081012635
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月26日 優先權日2008年6月26日
發明者晶 丁, 呂傳真, 姚小青, 孫長海, 肖保國 申請人:天津紅日藥業股份有限公司