專利名稱：血根堿的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血根堿的新用途。
背景技術(shù)：
端粒DNA是位于染色體末端并對(duì)染色體具有保護(hù)作用的富含鳥嘌呤(G)的 DNA序列，它由一段雙鏈重復(fù)區(qū)域和一段單鏈重復(fù)區(qū)域構(gòu)成，人類和哺乳動(dòng)物的 重復(fù)序列單元為TTAGGG。富含G的DNA單鏈在陽離子的誘導(dǎo)下可以通過G堿 基間Hoogsteen氫鍵形成四鏈體(G4)。研究表明，85~90%惡性腫瘤的發(fā)病都與 端粒酶的活性有關(guān)，而DNAG4結(jié)構(gòu)的形成可以有效抑制端粒酶的活性，進(jìn)而達(dá)到 抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的。因此，能夠誘導(dǎo)DNA G4形成并使之穩(wěn)定的化合物有望 成為抗腫瘤的先導(dǎo)化合物，成為目前研究的熱點(diǎn)。
大量研究表明，單鏈DNA (序列為TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG， 簡稱為Hum24)在Na+溶液中形成反平行結(jié)構(gòu)G4，在K+溶液中形成平行和反平行 共存的G4混合結(jié)構(gòu)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供血根堿的一種新用途。
本發(fā)明所提供的血根堿的用途是血根堿或其藥學(xué)上可接受得鹽在制備預(yù)防和/
或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述血根堿的結(jié)構(gòu)式如下
式(I )。
所述血根堿藥學(xué)上可接受的鹽具體可為氯鹽。
所述血根堿或其藥學(xué)上可接受的鹽，適合于制備預(yù)防和/或治療人肝癌和皮膚癌 藥物，優(yōu)選為制備預(yù)防和/或治療人肝癌藥物。
所述預(yù)防和/或治療腫瘤藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物 理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。
以血根堿或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分的抗腫瘤藥物，需要的時(shí)候，在上 述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī) 的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、 吸附載體、潤滑劑等。
用血根堿或其藥學(xué)上可接受的鹽制備的預(yù)防和/或治療腫瘤藥物可以制成注射 液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N形式。上述各種劑型 的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
血根堿體外抗癌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明血根堿對(duì)癌細(xì)胞有很好的抑制作用。5|ig/ml 血根堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG-2的抑制率為98%。
血根堿抑瘤機(jī)理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血根堿是通過誘導(dǎo)人和哺乳動(dòng)物端粒DNA形 成反平行G4結(jié)構(gòu)來抑制腫瘤細(xì)胞生長。
圖1為人體端粒DNAHum24在未加入血根堿和加入血根堿的條件下構(gòu)象變化 的圓二色譜圖(a)Hum24; (b)加入血根堿，使Hum24與血根堿的摩爾比為1 : 6; 每個(gè)譜圖的摩爾橢圓度為-4_10 (mdeg)。
圖2 (a)為血根堿誘導(dǎo)單鏈Hum24形成反平行G4結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)曲線圖；(b) 為Na+誘導(dǎo)單鏈Hum24形成反平行G4結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、 MTT還原法檢測血根堿體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)
MTT法的基本原理為四甲基偶氮唑鹽[MTT, 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide](購自北京化學(xué)試劑公司)是一種能接受氫原子的 染料。活細(xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不 溶性的藍(lán)紫色的formazon，而死細(xì)胞則無此功能。用DMSO溶解formazon后，在 一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，即可定量測出細(xì)胞的存活率。按照公式可計(jì)算 腫瘤細(xì)胞生長抑制率(％) = (OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn))/OD艦x 100%。
具體操作步驟如下
1)選用對(duì)數(shù)生長期的貼壁人肝癌細(xì)胞HEPG-2，用0.25 %胰酶消化后，用含IO % 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制成5000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分別接種在96孔培養(yǎng)板 中，每孔接種lOOitil， 37°C， 5。/。C02培養(yǎng)24h。
42) 每孔加入血根堿(成都思科華有限公司，純度為98%)溶液10pl，用RPMI 1640 培養(yǎng)液補(bǔ)充至每孔終體積為20(^1，使每孔中血根堿終濃度為5pg/ml。設(shè)對(duì)照組， 加入200^1 RPMI 1640培養(yǎng)液。設(shè)空白組，每孔未接種細(xì)胞，只加入200 ul RPMI 1640 培養(yǎng)液。37°C， 5。/oC02培養(yǎng)3d。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。
3) 棄上清液，每孔加入100^1新鮮配制的0.5 mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)液，37 。C 繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200^1 DMSO溶解MTTformazon沉淀，用微型 超聲振蕩器混勻，在酶標(biāo)儀上測定波長544nm處的光密度值。按照下述公式計(jì)算 腫瘤細(xì)胞生長抑制率，腫瘤細(xì)胞生長抑制率(％) = (OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn))/OD對(duì)照 xl00% (其中OD對(duì)照、OD實(shí)驗(yàn)為已經(jīng)扣除OD空白的實(shí)驗(yàn)數(shù)值)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明血根堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG-2的抑制率為98%。
實(shí)施例2、血根堿抑瘤機(jī)理
在無金屬離子存在的條件下，溶液中Hum24呈單鏈構(gòu)型存在，這種構(gòu)型在圓 二色譜(CD)中有明顯的特征在256nm附近出現(xiàn)一個(gè)正峰，在240nm附近出 現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰。當(dāng)單鏈Hum24溶液中加入一定濃度血根堿時(shí)，Hum24由單鏈轉(zhuǎn)化為 一種反平行的G4結(jié)構(gòu)，在CD譜中有明顯的特征為在290nm附近出現(xiàn)一個(gè)正峰， 在260 nm附近出現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰。
具體的實(shí)驗(yàn)方法如下緩沖溶液為由如下終濃度的物質(zhì)組成的水溶液10 mM Tris-HCl， lmM EDTA; pH 7.4。將30 OD單鏈Hum24 (上海英俊生物技術(shù)有限公 司)(其序列如序列表中序列1所示)溶解在所述緩沖溶液中得到濃度為250 ^M的 Hum24母液。將0.5mg血根堿溶解在所述緩沖溶液中得到濃度為180 血根堿 母液。將血根堿母液用所述緩沖溶液稀釋成濃度分別為0.2pM、 0.6pM、 lpM、 2pM、 4pM、 8pM、 12pM、 14pM、 16pM、 18pM、 20|iM、 22(iM的血根堿溶液。取250 pM的單鏈Hum24溶液分別加入上述濃度的血根堿溶液，使混合溶液中單鏈Hum24
與血根堿的摩爾比分別為i : o.i， i : 0.3， i : 0.5， i : i， i : 2， i : 4， i : 6， i : 7， l:8， l:9， i : io， i : 12。將上述混合溶液，均在25 。c孵育12h，采用圓二色
譜儀測定其構(gòu)象的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單鏈Hum24與血根堿的摩爾比大于 等于1 : 1時(shí)都可以明顯看到G4反平行結(jié)構(gòu)的特征峰，當(dāng)單鏈Hum24與血根堿的 摩爾比為1 : 6時(shí)已經(jīng)能夠完全形成反平行G4結(jié)構(gòu)。其中，單鏈Hum24與血根堿 摩爾比為1 : 6時(shí)形成的反平行G4結(jié)構(gòu)的圓二色譜圖如圖1中b所示。
通過變溫CD表征由血根堿誘導(dǎo)形成的反平行G4結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。DNA的熔點(diǎn)(Tm)反映了它的熱穩(wěn)定性。熔點(diǎn)越高說明該DNA越穩(wěn)定，反之，熔點(diǎn)越低該 結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。Hum24G4的熔點(diǎn)是指G4結(jié)構(gòu)分解50y。時(shí)的溫度。通過檢測此反 平行G4結(jié)構(gòu)在2卯nm的CD信號(hào)隨著溫度升高的降低來得到它的熔點(diǎn)。
具體的實(shí)驗(yàn)方法如下將以單鏈Hum24與血根堿摩爾比為1 : 6時(shí)形成的反平 行G4結(jié)構(gòu)通過圓二色譜變溫測定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行熔點(diǎn)的測定。采用的儀器為Jasco815圓 二色譜儀，CD實(shí)驗(yàn)中采用的CD吸收池光程為lcm。在進(jìn)行CD實(shí)驗(yàn)前用高純N2 除氧5分鐘，而且實(shí)驗(yàn)中也一直用高純N2作為保護(hù)氣以保證沒有臭氧出現(xiàn)，CD實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)采集前，用緩沖溶液進(jìn)行基線校對(duì)。在近紫外區(qū)220nm-320nm采集CD光 譜，掃描速度為500 nm/min，采集次數(shù)為4次。在變溫實(shí)驗(yàn)中采用JascoPTC-423S 控溫儀，升溫速度為2°C/min，通過監(jiān)控2卯nm CD信號(hào)來進(jìn)行G4熔點(diǎn)的測定， 結(jié)果如圖2所示。變溫CD結(jié)果表明，此反平行G4結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)為43'C (熔點(diǎn)圖如 圖2a所示)，比Na+誘導(dǎo)形成的反平行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(熔點(diǎn)圖如圖2b所示)，說明血 根堿誘導(dǎo)形成的反平行G4結(jié)構(gòu)是比較穩(wěn)定的。
說明血根堿是通過誘導(dǎo)人和哺乳動(dòng)物端粒DNA形成反平行G4結(jié)構(gòu)來抑制腫 瘤細(xì)胞的生長。序列表
<160>1
<210>1 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223> <400>1
ttagggttag ggttagggtt aggg
權(quán)利要求
1、血根堿或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述血根堿的結(jié)構(gòu)式如式(I)所示式(I)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述血根堿藥學(xué)上可接受的鹽 為氯鹽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為人肝癌。
4、 一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，它的有效成分為下述式(I)所示的血根堿 或其藥學(xué)上可接受的鹽<formula>formula see original document page 2</formula>式(I)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于所述血根堿藥學(xué)上可接受的鹽 為氯鹽。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的藥物，其特征在于所述腫瘤為人肝癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了血根堿的一種新用途。該用途是血根堿或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，特別是在制備預(yù)防和/或治療人肝癌藥物中的應(yīng)用；所述的血根堿，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示?？拱┗钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明血根堿對(duì)癌細(xì)胞有較好的抑制作用。5μg/ml的血根堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG-2的抑制率為98％。
文檔編號(hào)A61K31/4741GK101564392SQ20081010501
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者向俊鋒, 唐亞林, 徐廣智, 舒 楊 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所