一種建立多發性硬化動物模型的方法

專利名稱：一種建立多發性硬化動物模型的方法
技術領域：
本發明屬于醫藥動物模型技術領域，具體涉及一種建立多發性硬化動物 模型的方法。
背景技術：
多發性硬化(multiple sclerosis, MS)是一種以炎癥、脫髓鞘、軸索 破壞為特點的神經系統疾病，它的起因和病理尚不完全清楚。實^r性自身免 疫性腦脊il炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)為研 究MS普遍應用的動物模型，在許多方面模擬了人類MS的特點。
EAE可以由多種抗原誘導，如髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)、蛋白脂蛋白(proteolipid protein, PLP )、髓鞘少突膠質細胞糖蛋 白(myel in ol igodendrocyte glycoprotein, M0G)等,然而以往大多數EAE 模型僅模擬出MS的急性期表現，僅很少試驗真正模擬出具有典型慢性期的 MS。 MOG的含量在中樞神經系統中只占0. 05-0. 1%,卻能誘導出具有多相病程 的EAE模型，且能在模型腦內產生大片脫髓鞘斑塊，這與以往MBP、 PLP等誘 導的以炎性病灶為主的EAE模型明顯不同，更加近似的模擬了MS，為后續的 臨床治療提供了有利的參考，但是利用M0G建立的EAE模型，與利用其他抗 原建立的EAE模型相比，M0G誘導的EAE模型臨床表型多樣，發病率也不同， 文獻報道從不發病到100%發病非常不一致，非常不穩定，是其缺點，所以建 立一個穩定的EAE動物模型，對于后續的免疫學、影像學、病理學的研究都 有很大實用價值。
MR影像作為臨床和病理的一個重要的輔助工具，可以對MS動物模型中 新舊病灶進行觀察，對整個發病過程進行全程監測，是臨床表現的一個重要 補充。而目前用于MRI研究EAE病理改變的大鼠模型以急性炎癥為主，脫髓 鞘輕微，僅適用于急性炎癥期研究，無法開展MTI等新技術在髓鞘損傷方面 的研究。由于大鼠中樞神經系統的體積很小，進行大鼠MRI研究通常選用超 高場強(>4. 7T)設備及專用小孔徑動物線圈，但這些設備普及率很低，使之應用受到很大限制。有學者嘗試在臨床型MRI設備上應用特殊小孔徑動物線 圈進行大鼠的MRI研究，結果僅能獲得腦組織及其病灶的MRI圖像，無法獲 得質量滿意的脊髓圖像，而且這些小孔徑線圏由研究者自制，使其普及應用 受到限制。有報道應用豚鼠進行1.5TMR成像，但其圖像組織分辨率差，僅能 粗略估計病灶形態，對于精細解剖結構的顯示非常不理想。

發明內容
針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的是提供一種建立多發性硬化 動物模型的方法，通過該方法制得的EAE模型，穩定性好，對于后續的免疫 學、影像學、病理學的研究有非常實用的臨床價值，為研究人類的多發性硬 化疾病提供了有利的支持。
為達到以上目的，本發明采用的技術方案是 一種建立多發性硬化動物 模型的方法，包括以下步驟
步驟一、準備動物，健康雄性Lewis大鼠，普通級；
步驟二、準備誘導劑MOG35.55肽段；
步驟三、制備動物模型
將MOG35.55溶于生理鹽水，然后與等體積的佐劑混合成乳化物，然 后將上述乳化物注射Lewis大鼠，注射次數為兩次以上，9-12周后即 制得多發性硬化動物模型；
步驟三中，將MOG35-55溶于生理鹽水時，每pl生理鹽水中MOG35-55 的用量為3-6pg,生理鹽水的用量為30-lOOpl;
更進一步，步驟三中，每pl生理鹽水中MOG35.55的用量為3 - 6jig, 生理鹽水的用量為50jxl;
進一步，步驟三中，分次注射時，分為2-3次注射，每次注射的間 隔時間為3-6周；再進一步，如果分2次注射，每次注射的間隔時間為6周，如果分3次注射，每次注射的間隔時間為3周；
進一步，步驟三中，分次注射時，每次注射乳化物0.6-0.20ml;更 進一步，每注射乳化物的劑量為0.10ml;
進一步，步驟三中，對Lewis大鼠注射時，選擇Lewis大鼠尾根部 皮下注射。
本發明的效果在于采用本發明所述方法制備的多發性硬化動物模型， 該模型的穩定性好，非常適合于臨床對多發性硬化的研究，并且能夠為影像 學、病理學的研究提供滿意的圖像質量，為人們更好的認識和研究多發性硬 化提供了良好的模型。


圖1是三種臨床表型的EAE大鼠發病進程圖，其中，圖1A是單純急性 型大鼠發病進程；圖1B是慢性進展型的大鼠發病進程；圖1C是復發緩解 型的大鼠發病進程；
圖2是急性期的EAE模型大鼠病灶的MR影像表現，其中，圖2A是 T2WI見腦橋大片云霧狀高信號示意圖，圖2B是雙側丘腦病灶,并可見USPIO 強化示意圖3.是EAE模型大鼠病灶的組織病理學表現，其中，圖3A是LFB染 色，(光鏡xlOO),實施例1中的大鼠的丘腦病灶，內嚢部分受累，可見大 片脫髓鞘斑塊；圖3B是HE染色，(光鏡xlOO),實施例2中的大鼠的左 頂葉皮層病灶，炎癥細胞圍繞小血管周圍，伴有小膠質細胞和巨噬細胞浸潤 示意圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的描述 實施例1
本實施例意在建立一種急性重度EAE模型，該方法建立的EAE模型的 發病臨床表現以中重度為主，發病時間一致，病灶相對較大，脫髓鞘病灶重，
5適合典型急性期研究，建立該模型的具體方法如下
步驟一、準備健康雄性Lewis大鼠10只，普通級，體重為300士10g;
步驟二、準備誘導劑MOG35.55肽段，該物質可以在生物用品試劑公司
購買到，也可以自己合成，本實施例中的MOG35-55肽段為宣武醫院自己合成
的；
步驟三、制備動物模型
本實施例中，每次注射時均先將MOG35.55溶于50^1的生理鹽水中，
然后與等體積的佐劑50)^1混合成乳化物O.lml,然后對Lewis大鼠進行 乳化物注射，注射部位為尾根部皮下注射；本實施例中，注射次數為 2次，2次注射的間隔時間為6周，第一次注射時，乳化物中含有150嗎 MOG35_55、添加含結核分枝桿菌(H37RA型)200pg的完全福氏佐劑 (complete Freund' s adjuvant, CFA) 50pl;第二次注射時，乳化物 中含有300jag的MOG35.55、不完全福氏佐劑(incomplete Freund' s adjuvant, IFA)5(^1，第2次注射后即制成急性重度EAE模型；
本實施例中所用的佐劑IFA購自Sigma公司，IFA (不完全福氏佐 劑)添加MT后即為CFA(完全福氏佐劑)，MT即結核分枝桿菌(H37RA 型)，在佐劑中的濃度為4mg/ml,生理鹽水與佐劑的量是等量的，可以 根據需要適當改變，保證MT的濃度即可；生理鹽水的作用是溶解 MOG35-55，佐劑的目的是包裹抗原小顆粒，使之緩慢釋放并產生最大量 的抗體。
本實施例制得的急性重度EAE模型，其臨床表現、MR影像及組織 病理學表現如圖1A 、 2A、 3A所示。
實施例2
本實施例意在建立一種多相病程的慢性期EAE模型，通過本發明所述的 方法建立的模型其臨床表現以輕中度為主，發病時間不一，發病持續時間不 同，具有急性、慢性進展、慢性復發和隱匿型多個病程，其病灶大小與方法 一無明顯差別，但病灶范圍更加廣泛，脫髓鞘程度相對方法一為輕，適合慢性期的研究，建立該模型的具體方法如下
步驟一、準備健康雄性Lewis大鼠10只，普通級，體重為300士10g; 步驟二、準備誘導劑MOG35.55肽段，該物質可以在生物用品試劑公司
購買到，也可以自己合成，本實施例中的MOG35.55肽段為宣武醫院自己合成
的；
步驟三、制備動物模型
本實施例中，每次注射時均先將MOG35-55溶于50^il的生理鹽水中， 然后與等體積的佐劑50^1混合成乳化物O.lml，然后對Lewis大鼠進行 乳化物注射，注射部位為尾根部皮下注射；本實施例中，注射次數為 3次，每次注射的間隔時間為3周，第一次注射時，乳化物中含有150嗎 MOG35-55、添加含結核分枝桿菌(H37RA型)200pg的完全福氏佐劑 (complete Freund' s adjuvant, CFA) 50^1;第二次及第三次注射時， 乳化物中均含有150(xg的MOG35.55、不完全福氏佐劑(incomplete FreuruT s adjuvant, IFA)50pl，第3次注射后即制得慢性期EAE模 型。
本實施例中所用的佐劑IFA同樣購自Sigma公司。
本實施例制得的多病程EAE模型，其臨床表現、MR影像及組織病 理學表現如圖1A、圖IB 、圖1C、 2B、 3B所示。
上述兩個實施例中，對Lewis大鼠分次注射的用量可總結為如下表
格
注射劑量 乳化物0. 1ml第一次注射第二次注射第三次注射
實施例1含有150U gM0G35-55的生 理鹽水50 u 1 +含有 MT200 u g的CFA 50 u 1含有300U gM0G35-55的生 理鹽水50 y 1 +IFA 50 u 1
實施例2含有150U gM0G35-55的生 理鹽水50 u 1 +含有 MT200 u g的CFA 50 u 1含有150U gM0G35-55的生 理鹽水50 u 1 +IFA 50 u 1含有150y gM0G35—55的生 理鹽水50 u 1 +IFA 50 u 1
通過上述兩個實施例可以看出，本發明所述方法建立的EAE才莫型，其優
7點在于兩種方法都模擬了 MS典型的脫髓鞘病灶，病灶范圍大，方法二更 加模擬了 MS的臨床不均一性。兩種模型在3.0TMR設備上成像清晰，無論 是腦還是脊髓都有清晰的組織分辨率，病灶邊界清楚，無論是Gd-DTPA或 是USPIO造影劑強化，都可見明確的強化效果，非常有助于臨床進行研究。
上述實施例只是對本發明的舉例說明，本發明也可以以其它的特定方式 或其它的特定形式實施，而不偏離本發明的要旨或本質特征。因此，描述的 實施方式從任何方面來看均應視為說明性而非限定性的。本發明的范圍應由 附加的權利要求說明，任何與權利要求的意圖和范圍等效的變化也應包含在 本發明的范圍內。
權利要求
1、一種建立多發性硬化動物模型的方法，包括以下步驟步驟一、準備動物，健康雄性Lewis大鼠，普通級；步驟二、準備誘導劑MOG35-55肽段；步驟三、制備動物模型將MOG35-55溶于生理鹽水，然后與等體積的佐劑混合成乳化物，然后將上述乳化物注射Lewis大鼠，注射次數為兩次以上，9-12周后即制得多發性硬化動物模型。
2、 如權利要求1所述的一種建立多發性硬化動物模型的方法，其特征在于步驟三中，將MOG35.55溶于生理鹽水時，每H1生理鹽水中MOG35.55的用量為3-6pg，生理鹽水的用量為30- 100^1。
3、 如權利要求2所述的一種建立多發性硬化動物模型的方法，其特征在 于步驟三中，每pl生理鹽水中MOG35.55的用量為3 - 6pg,生理鹽水的 用量為50^1。
4、 如權利要求1或2所述的一種建立多發性硬化動物模型的方法，其特 征在于步驟三中，分次注射時，分為2-3次注射，每次注射的間隔時間為 3-6周。
5、 如權利要求4所述的一種建立多發性硬化動物模型的方法，其特征在 于如果分2次注射，每次注射的間隔時間為6周，如果分3次注射，每次 注射的間隔時間為3周。
6、 如權利要求2所述的一種建立多發性硬化動物模型的方法，其特征在 于步驟三中，分次注射時，每次注射乳化物0.6-0.2ml。
7、 如權利要求6所述的一種建立多發性硬化動物模型的方法，其特征在 于每次注射乳化物的劑量為0.10ml。
8、 如權利要求1所述的一種建立多發性硬化動物模型的方法，其特征在 于步驟三中，對Lewis大鼠注射時，選擇Lewis大鼠尾根部皮下注射。
全文摘要
本發明屬于醫藥動物模型技術領域，具體涉及一種建立多發性硬化動物模型的方法。本發明所述的方法，將MOG_35-55肽段與佐劑形成的乳化物分2-3次注射Lewis大鼠，采用尾根部皮下注射，每次注射的間隔時間為3-6周，從而成功得到EAE動物模型。采用本發明所述的方法制得的多發性硬化動物模型，穩定性好，非常適合于臨床對多發性硬化的研究，并且能夠為影像學、病理學的研究提供滿意的圖像質量，為人們更好的認識和研究多發性硬化提供了良好的模型。
文檔編號A61B19/00GK101564320SQ20081010496
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月25日 優先權日2008年4月25日
發明者于春水, 張海琴, 李坤成, 文 秦, 佳 馬 申請人:首都醫科大學宣武醫院