專利名稱：神經細胞保護劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有鹽酸多奈哌齊的神經細胞保護劑。
背景技術：
鹽酸多奈哌齊是通過可逆地抑制分解乙酰膽堿的酶乙酰膽堿酯酶而使腦內的乙酰膽堿量增加，激活腦內膽堿能神經系統的物質。該物質作為阿耳茨海默氏型老年癡呆、阿耳茨海默病的治療藥而被廣泛應用(日本專利第2578475號公報)，各研究機構對鹽酸多奈哌齊進行著研究。Jin Zhou等發表了乙酰膽堿酯酶抑制劑對于大鼠PC12細胞(腫瘤細胞)的缺血性細胞損傷具有保護效果的論文，使用鹽酸多奈哌齊作為乙酰膽堿酯酶抑制劑的一例(Zhou，J，.Fu，Y.，Tang，X.C.，2001.Huperzine A and donepezil protect rat pheochromocytoma cellsagainst oxygen-glucose deprivation.Neurosci.Lett.306，53-56))。
但是，鹽酸多奈哌齊對神經細胞損傷的保護效果的詳細情況尚不明確。
上述文獻中使用的PC12細胞是嗜鉻細胞瘤(褐色細胞腫)，也稱為嗜鉻性細胞瘤，是由腎上腺髓質或交感神經節細胞等嗜鉻細胞產生的兒茶酚胺生成腫瘤。因此，已知PC12細胞不是腦神經細胞，在細胞間不形成突觸，此外也沒有對興奮性物質反應的功能(Sucher，N.J，1993.Expression of Endogenous NMDAR1 Transcripts withoutReceptor Protein Suggests Post-transcriptional Control in PC12 Cells.The journal of Biological Chemistry.Vol.268，No.30，22299-22304.)。即，上述文獻中僅對于癌變的細胞進行了研究，但完全沒有進行使用通過腦神經細胞新制備的原代培養神經細胞的研究。因此，證明鹽酸多奈哌齊對實際的神經細胞中的缺血性傷害的保護效果的數據尚不為人所知。
發明內容
本發明的目的為提供保護神經細胞(尤其是中樞神經系統的神經細胞)的藥物。
本發明人為了解決上述課題進行了刻苦研究，結果意外地發現鹽酸多奈哌齊具有保護神經細胞(尤其中樞神經系統的神經細胞)的作用，從而完成了本發明。即，本發明如下。
(1)含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的中樞神經系統的神經細胞保護劑(包括日本特開平1-79151號公報所述的化合物)。優選這些化合物的鹽為鹽酸鹽。
(i)以下述化學式表示的1-芐基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚滿酮)-2-基]甲基哌啶或其可藥用鹽。
(特許2578475號權利要求項(以下稱為[c1.])1) (ii)以下的通式(I)表示的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J表示選自以下式
茚滿酮基
茚基
茚滿二酮基
亞茚滿酮基(インダノリテニル)
(式中，S表示碳原子數1～6的低級烷基、碳原子數1～6的低級烷氧基、鹵原子或羥基。t表示0或1～4的整數。(S)t可以在所結合的苯環的相鄰碳原子間形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。式(1)中的Y表示氫原子或碳原子數1～6的低級烷基，式(k)中V表示氫原子或碳原子數1～6的低級烷氧基，式(n)中W1及W2相互獨立、相同或不同，表示氫原子、碳原子數1～6的低級烷基或碳原子數1～6的低級烷氧基，W3表示氫原子或碳原子數1～6的低級烷基。式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯環A可以被碳原子數1～6的烷基或碳原子數1～6的烷氧基取代。)表示的基團的一價或二價基團。B為以式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整數，R2分別獨立地表示氫原子或甲基)表示的基團、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數)表示的基團、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數)表示的基團、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數)表示的基團。K表示可以具有可以被鹵代的碳原子數1～6的烷基、碳原子數1～6的烷氧基、硝基、鹵原子、羧基、芐氧基、碳原子數1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子數1～6的單烷基氨基、碳原子數1～6的二烷基氨基、氨基甲酰基、碳原子數1～6酰氨基、環己基氧基羰基、碳原子數1～6的烷基氨基羰基、碳原子數1～6的烷基羰基氧基、羥基、甲酰基或烷氧基(碳原子數1～6)烷基(碳原子數1～6)作為取代基的苯基烷基。
表示單鍵或雙鍵。
(iii)選自下式表示的化合物組的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
(特許2733203號c1.7) (iv)選自下式表示的化合物組的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
(特許2733203號cl.8) (v)以下通式(I-1)表示的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J1-1表示碳原子數1～6的低級烷基(以下簡稱為低級烷基)；環己基；可以具有低級烷基、碳原子數1～6的低級烷氧基(以下簡稱為低級烷氧基)、硝基、鹵素、羧基、低級烷氧基羰基、氨基、單低級烷基氨基、二低級烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子數1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環己基氧基羰基、低級烷基氨基羰基、低級烷基羰基氧基、鹵代低級烷基、羥基、甲酰基或低級烷氧基低級烷基作為取代基的苯基、吡啶基或吡嗪基(ピラジル基)；式
(式中，G表示式
表示的基團、式
表示的基團、式-O-表示的基團、式
表示的基團、式-CH2-O-表示的基團、式-CH2-SO2-表示的基團、式
表示的基團或式
表示的基團。B表示碳原子或氮原子。) 表示的基團；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氫原子或低級烷氧基羰基)表示的基團。B表示式-(CH2)n-表示的基團、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氫原子、低級烷基、苯基或低級烷基磺酰基)表示的基團、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氫原子、低級烷基、可以具有低級烷基、低級烷氧基、鹵素或羥基作為取代基的苯基、芐基或吡啶基)表示的基團、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基團、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基團、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基團、式-CO-(CH2)n-表示的基團、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基團或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基團(以上的式中，n表示0或1～10的整數)。T1表示碳原子。K表示苯基可以具有低級烷基、低級烷氧基、硝基、鹵素、羧基、低級烷氧基羰基、氨基、單低級烷基氨基、二低級烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子數1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環己基氧基羰基、低級烷基氨基羰基、低級烷基羰基氧基、鹵代低級烷基、羥基、甲酰基或低級烷氧基低級烷基作為具代基的苯基烷基(烷基的碳原子數1～2)；肉桂基；低級烷基；吡啶基甲基；環烷基(環烷基的碳原子數3～6)烷基；金剛烷甲基；糠基；碳原子數3～6的環烷基或酰基。q表示1或2(特許3078244號cl.1) (vi)以下通式(I-2)表示的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J1-2表示可以具有碳原子數1～6的低級烷基或碳原子數1～6的低級烷氧基作為取代基的茚滿酮基。T2表示氮原子。B、K以及q含義如上所述。](特許3078244號cl.2) (vii)選自下式表示的化合物組的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
(特許3078244號cl.4) (2)含有以下(i)～(vii)表示的任一化合物的，中樞神經系統的神經細胞障礙的預防劑和/或治療劑。
(i)以下述化學式表示的1-芐基-4-[(5，6-二甲氧基-1-茚滿酮)-2-基]甲基哌啶或其可藥用鹽。鹽優選鹽酸鹽。
(特許2578475號cl.1) (ii)以下的通式(I)表示的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J表示選自下式
茚滿酮基
茚基
茚滿二酮基
亞茚滿酮基(インダノリテニル)
(式中，S表示碳原子數1～6的低級烷基、碳原子數1～6的低級烷氧基、鹵原子或羥基。t表示0或1～4的整數。并且(S)t也可以在所結合的苯環的相鄰碳原子間形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。式(1)中的Y表示氫原子或碳原子數1～6的低級烷基，式(k)中V表示氫原子或碳原子數1～6的低級烷氧基，式(n)中W1及W2相互獨立，相同或不同，表示氫原子、碳原子數1～6的低級烷基或碳原子數1～6的低級烷氧基，W3表示氫原子或碳原子數1～6的低級烷基。式(a)～(e)、(g)、(j)、(l)以及(q)中的苯環A可以被碳原子數1～6的烷基或碳原子數1～6的烷氧基取代。)表示的基團的一價或二價基團。B為式-(CHR2)n-(式中，n表示0或1～10的整數，R2分別獨立地為氫原子或甲基)表示的基團、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數)表示的基團、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數)表示的基團、或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數)表示的基團。K表示可以具有可以被鹵代的碳原子數1～6的烷基、碳原子數1～6的烷氧基、硝基、鹵原子、羧基、芐氧基、碳原子數1～6的烷氧基羰基、氨基、碳原子數1～6的單烷基氨基、碳原子數1～6的二烷基氨基、氨基甲酰基、碳原子數1～6酰氨基、環己基氧基羰基、碳原子數1～6的烷基氨基羰基、碳原子數1～6的烷基羰基氧基、羥基、甲酰基或烷氧基(碳原子數1～6)烷基(碳原子數1～6)作為取代基的苯基烷基。
表示單鍵或雙鍵。(特許2733203號cl.1) (iii)選自下式表示的化合物組的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
(特許2733203號c1.7) (iv)選自下式表示的化合物組的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
(特許2733203號cl.8) (v)以下通式(I-1)表示的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J1-1表示碳原子數1～6的低級烷基(以下簡稱為低級烷基)；環己基；可以具有低級烷基、碳原子數1～6的低級烷氧基(以下簡稱為低級烷氧基)、硝基、鹵素、羧基、低級烷氧基羰基、氨基、單低級烷基氨基、二低級烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子數1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環己基氧基羰基、低級烷基氨基羰基、低級烷基羰基氧基、鹵代低級烷基、羥基、甲酰基或低級烷氧基低級烷基作為取代基的苯基、吡啶基或吡嗪基；式
(式中，G表示式
表示的基團、式
表示的基團、式-O-表示的基團、式
表示的基團、式-CH2-O-表示的基團、式-CH2-SO2-表示的基團、式
表示的基團或式
表示的基團。B表示碳原子或氮原子。) 表示的基團；喹啉基；喹喔啉基；呋喃基或式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氫原子或低級烷氧基羰基)表示的基團。B表示式-(CH2)n-表示的基團、式-NR2-(CH2)n-(式中R2表示氫原子、低級烷基、苯基或低級烷基磺酰基)表示的基團、式-CONR3-(CH2)n-(式中，R3表示氫原子、低級烷基、可以具有低級烷基、低級烷氧基、鹵素或羥基作為取代基的苯基、芐基或吡啶基)表示的基團、式-NH-CO-(CH2)n-表示的基團、式-CH2-CO-NH-(CH2)n-表示的基團、式-CO-CH2-CH(OH)-CH2-表示的基團、式-CO-(CH2)n-表示的基團、式-C(OH)-(CH2)n-表示的基團或式-CO-CH＝CH-CH2-表示的基團(以上式中，n表示0或1～10的整數)。T1表示碳原子。K表示苯基可以具有低級烷基、低級烷氧基、硝基、鹵素、羧基、低級烷氧基羰基、氨基、單低級烷基氨基、二低級烷基氨基、氨基甲酰基、由碳原子數1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰氨基、環己基氧基羰基、低級烷基氨基羰基、低級烷基羰基氧基、鹵代低級烷基、羥基、甲酰基或低級烷氧基低級烷基作為取代基的苯基烷基(烷基的碳原子數1～2)；肉桂基；低級烷基；吡啶基甲基；環烷基(環烷基的碳原子數3～6)烷基；金剛烷甲基、糠基；碳原子數3～6的環烷基或酰基。q表示1或2(特許3078244號cl.1) (vi)以下通式(I-2)表示的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
[式中，J1-2表示可以具有碳原子數1～6的低級烷基或碳原子數1～6的低級烷氧基作為取代基的茚滿酮基。T2表示氮原子。B、K以及q含義如上所述。](特許3078244號cl.2) (vii)選自下式表示的化合物組的環狀胺衍生物或其可藥用鹽。
(特許3078244號cl.4) 在上述(1)以及(2)中，化合物的鹽優選鹽酸鹽，特別優選如下式所示的鹽酸多奈哌齊。
此外，在上述(2)中，作為神經細胞障礙可以列舉由腦缺血、興奮性毒性或Aβ毒性誘發的障礙，上述腦缺血以及興奮性毒性，可以列舉伴隨腦中風、腦梗塞或腦栓塞的任意一種的毒性。此外，上述Aβ毒性可以是伴隨阿耳茨海默病或唐氏病的毒性。
在上述(1)或(2)中，細胞為來源于腦的成熟神經細胞，特別可以列舉來源于選自大腦皮質、中隔區域以及海馬中的任意一種的成熟神經細胞。此外，該神經細胞也可以是原代培養細胞。
(3)含有上述(1)所述的保護劑、或(2)所述的預防劑和/或治療劑的腦中風、腦梗塞或腦栓塞中任一疾病的預后改善劑。
(4)一種中樞神經系統的神經細胞保護方法，其特征在于，給予患者上述(1)所述的保護劑的有效劑量。
(5)一種中樞神經系統的神經細胞障礙的預防方法和/或治療方法，其特征在于，給患者施用有效劑量的上述(2)所述的預防劑和/或治療劑。
在上述(5)中，作為神經細胞障礙，可以列舉由腦缺血、興奮性毒性或Aβ毒性誘發的障礙，上述腦缺血以及興奮性毒性，可以列舉伴隨腦中風、腦梗塞或腦栓塞的任意一種的毒性。此外，作為興奮性毒性，可以列舉例如由NMDA或紅藻氨酸引起的毒性。進而，上述Aβ毒性，也可以是伴隨阿耳茨海默病或唐氏病的毒性。
(6)一種腦中風、腦梗塞或腦栓塞的任一疾病的預后改善方法，其特征在于，給予患者上述(3)所述的預后改善劑的有效劑量。
(7)(1)所示化合物用于制備下述藥物的用途，該藥物是選自上述(1)所述的保護劑、(2)所述的預防劑和/或治療劑以及(3)所述的預后改善劑中的任意一種。
(8)具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選方法，其特征在于在Aβ存在下使候選化合物作用于中樞神經系統的膽堿能神經細胞，并檢測或測定Aβ凝聚量。
本發明的篩選方法，用上述Aβ凝聚量的檢測或測定結果，通過與在不存在上述候選化合物的情況下的Aβ凝聚量比較，可以判定上述候選化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用，是否為目標化合物。
(9)用于在上述(8)所述的方法中使用的，具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒。
(10)在由Aβ毒性誘發的中樞神經系統的神經細胞障礙的預防和/或在治療中有效的化合物或其可藥用鹽的篩選方法，其特征在于在Aβ存在下使候選化合物作用于中樞神經系統的膽堿能神經細胞，并檢測細胞損傷或細胞死亡。
在本發明的方法中，用上述細胞損傷或細胞死亡檢測的結果，通過與在不存在上述候選化合物的情況下的細胞損傷或細胞死亡程度比較，可以判定上述候選化合物是否具有對Aβ毒性的細胞保護作用，是否為目標化合物。
上述細胞損傷或細胞死亡，可以通過乳酸脫氫酶(LDH)的濃度測定或MTT測定檢測。
(11)用于在上述(10)所述的方法中使用的，在由Aβ毒性誘發的中樞神經系統的神經細胞障礙的預防和/或在治療中有效的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒。
圖1是表示在進行氧-葡萄糖除去(OGD)處理的12小時前，1小時前以及OGD處理1小時后向細胞中添加多奈哌齊情況下的大鼠原代培養細胞的LDH釋放的直方圖。OGD(-)表示沒有進行OGD處理，OGD(+)表示進行了OGD處理。Cont以及Vehi為未給藥組。采用Dunnett’s test對數據進行分析。圖1中[＊＊＊]表示P＜0.005(以‘載體組’作為對照)。
圖2表示有無OGD處理時的大鼠原代培養細胞的形態學觀察，分別表示下述狀態的顯微鏡照片，A為對照，B為實施OGD處理的照片，C為12小時前添加多奈哌齊后進行了OGD處理的照片。比例標尺表示0.1mm。
圖3是表示從進行OGD處理12小時前添加各種乙酰膽堿酯酶抑制劑的情況與添加多奈哌齊的情況下的大鼠原代培養細胞的LDH釋放的直方圖。OGD(-)表示沒有進行OGD處理，OGD(+)表示進行了OGD處理。Cont以及Vehi為未給藥組。采用Dunnett’s test對數據進行分析。圖3中[＊]表示P＜0.05，[＊＊]表示P＜0.01，[＊＊＊]表示P＜0.005(以‘載體組’作為對照)。
圖4是表示從進行OGD處理12小時前添加多奈哌齊的同時添加莨菪胺(Sco)或異莰胺(Mec)情況下的大鼠原代培養細胞的LDH的釋放的直方圖。OGD(-)表示沒有進行OGD處理，OGD(+)表示進行了OGD處理。Cont以及Vehi為未給藥組。采用ANOVA和Welch’st-test對數據進行分析。圖4中[＊]表示P＜0.05，[＊＊]表示P＜0.01，[＊＊＊]表示P＜0.005(以‘載體組’作為對照)。
圖5為表示多奈哌齊對因NMDA處理導致的大鼠原代培養神經細胞的LDH的釋放的效果的直方圖。多奈哌齊從12小時前添加。Cont以及Vehi為未給藥組。采用Dunnett’s test對數據進行分析。圖5中[＊＊＊]表示P＜0.005(以‘載體組’作為對照)。
圖6表示多奈哌齊對因紅藻氨酸處理導致的大鼠原代培養神經細胞的LDH釋放的效果。多奈哌齊從24小時前添加。Cont以及Vehi為未給藥組。采用Dunnett’s test對數據進行分析。圖6中[＊＊＊]表示P＜0.005(以‘載體組’作為對照)。
圖7為將培養的大鼠中隔區域神經細胞用抗膽堿乙酰轉移酶抗體免疫染色的圖。
圖8為以LDH作為指標評價多奈哌齊對Aβ(1-40)毒性的保護效果的結果的圖。
圖9為將培養大鼠中隔區域神經細胞用抗MAP2抗體免疫染色的圖。
圖10為表示采用CD的變化作為指標測定Aβ的凝聚的結果的圖。
圖11為表示siRNA對細胞內乙酰膽堿活性的效果的圖。
圖12為表示siRNA對Aβ(1-40)毒性的保護效果的圖。
圖13為表示siRNA對Aβ的凝聚的凝聚抑制效果的圖。
具體實施例方式 1.概述 本發明為含有如下所示的任一化合物(以下，稱為“化合物Q”)的中樞神經系統的神經細胞的保護劑、該神經細胞障礙的預防劑和/或治療劑。此外，通過本發明提供以適量給予預防劑和/或治療劑為特征的，中樞神經系統的神經細胞的保護方法和/或該神經細胞障礙的預防方法和/或治療方法。以下，對在本發明的保護劑、預防劑、治療劑、預后改善劑中使用的化合物Q進行如下說明。
2.化合物Q 以下的通式(I)表示的環狀胺衍生物以及其可藥用鹽(參照特開平1-79151號公報、特開平07-252216號公報、特開平10-067739號公報)。
[式中， J表示(a)取代或未取代的如下所示的基團；①苯基、②吡啶基、③吡嗪基(ピラジル基)、④喹啉基、⑤環己烷基、⑥喹喔啉基或⑦呋喃基， (b)選自苯基可以被取代的如下組的一價或二價基團；①二氫化茚基、②茚滿酮基、③茚基、④茚酮基、⑤茚滿二酮基、⑥四氫萘酮基、⑦苯并環庚酮基、⑧茚滿醇基、⑨式
表示的基團， (c)由環狀胺化合物衍生的一價基團， (d)低級烷基，或 (e)式R1-CH＝CH-(式中，R1表示氫原子或低級烷氧基羰基)表示的基團。
B為式
表示的基團、式
表示的基團、式
(式中，R3表示氫原子、低級烷基、酰基、低級烷基磺酰基、可以被取代的苯基或芐基)表示的基團，式
(式中，R4表示氫原子、低級烷基或苯基)表示的基團，式
表示的基團，式
表示的基團，式
表示的基團，式
表示的基團，式
表示的基團，式
表示的基團，式
表示的基團{在以上式中，n表示0或1～10的整數。R2表示氫原子或甲基，即式
表示的亞烷基不具有取代基，或具有1個或1個以上的甲基的形式。)，式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數)表示的基團，式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數)表示的基團，式＝(CH-CH)d＝ (式中，d表示0或1～5的整數)表示的基團， 式
表示的基團，式
表示的基團，式
表示的基團，式
表示的基團，式-NH-表示的基團，式-O-表示的基團，式-S-表示的基團，二烷基氨基烷基羰基或低級烷氧基羰基。
T表示氮原子或碳原子。
Q表示氮原子、碳原子或式
表示的基團。
K表示氫原子、取代或未取代的苯基、苯基可以被取代的芳基烷基、苯基可以被取代的肉桂基、低級烷基、吡啶基甲基、環烷基烷基、金剛烷甲基、呋喃甲基、環烷基、低級烷氧基羰基或酰基。
q表示1～3的整數。
式中，
表示單鍵或雙鍵。] 化合物(I)中的上述定義中，在J，K，R3，R4中可見的所謂低級烷基表示碳原子數1～6的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、己基、異己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基等。其中作為優選基團，可以列舉甲基、乙基、丙基、異丙基等，最優選甲基。
在J中的所謂‘取代或未取代的如下所示的基團；①苯基、②吡啶基、③吡嗪基(ピラジル基)、④喹啉基、⑤環己烷基、⑥喹喔啉基或⑦呋喃基’的定義中，作為取代基，可以列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基等碳原子數1～6的低級烷基；甲氧基、乙氧基等上述低級烷基對應的低級烷氧基；硝基；氯、溴、氟等鹵素；羧基；甲氧基羰基、乙氧基羰基、異丙氧基羰基、正丙氧基羰基、正丁氧基羰基等，與上述低級烷氧基對應的低級烷氧基羰基；氨基；單低級烷基氨基；二低級烷基氨基；氨基甲酰基；乙酰基氨基、丙酰基氨基、丁酰基氨基、異丁酰基氨基、戊酰基氨基、新戊酰氨基等由碳原子數1～6的脂肪族飽和單羧酸衍生的酰基氨基；環己基氧基羰基等環烷基氧基羰基；甲基氨基羰基、乙基氨基羰基等低級烷基氨基羰基；甲基羰基氧基、乙基羰基氧基、正丙基羰基氧基等上述定義的低級烷基對應的低級烷基羰基氧基；以三氟甲基等為代表的鹵代低級烷基；羥基；甲酰基；乙氧基甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙基等低級烷氧基低級烷基等。在上述取代基的說明中，所謂“低級烷基”、“低級烷氧基”包含由上述定義派生的全部基團。可以被相同或不同的1～3個取代基取代。
進而，苯基為包含在如下情況下被取代的苯基。即， 表示
所示的基團時(式中，G表示
所示的基團、式
所示的基團、式-O-所示的基團、式
所示的基團、式-CH2-O-所示的基團、式-CH2-SO2-所示的基團、式
聽示的基團或式
所示的基團。E表示碳原子或氮原子。
其中，作為苯基上優選的取代基，可以列舉低級烷基、低級烷氧基、硝基、鹵代低級烷基、低級烷氧基羰基、甲酰基、羥基、低級烷氧基低級烷基、鹵素、苯甲酰基、芐基磺酰基等，取代基相同或不同可以為2個以上。
作為吡啶基上優選的基團，可以列舉低級烷基、氨基、鹵原子等。
作為吡嗪基(ピラジル基)上優選的基團，可以列舉低級烷氧基羰基、羧基、酰基氨基、氨基甲酰基、環烷基氧基羰基等。
此外，作為J的吡啶基，優選2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，吡嗪基(ピラジル基)優選2-吡嗪基，喹啉基優選2-喹啉基或3-喹啉基，喹喔啉基優選2-喹喔啉基或3-喹喔啉基，呋喃基優選2-呋喃基。
在J的定義中，對于(b)組中所述的①～⑨，其代表例如下所示。
2，3-二氫化茚基
茚滿酮基
茚基
茚酮基
茚滿二酮基
四氫萘酮基
苯并環庚酮基
茚滿醇基
亞茚滿酮基 在上述一系列的式中，t表示0或1～4的整數，S表示相同或不同的在上述J(a)的定義中的取代基中的一種或者氫原子，可以優選列舉氫原子(未取代)、低級烷基或低級烷氧基。進而，在苯環相鄰碳原子間可以被亞甲基二氧基、亞乙基二氧基等亞烷基二氧基取代。
其中最優選的情況為，未取代或取代1～3個甲氧基。
此外，上述的亞茚滿酮基為在J(b)的定義中的苯基可以被取代的二價基團的示例。即由J(b)中②的茚滿酮基衍生的代表性二價基團。
在J的定義中，所謂由環狀酰胺化合物衍生的一價基團，可以列舉例如喹唑啉酮、四氫異喹啉酮、四氫苯并二氮
(テトラハイドロベンゾジアゼピン-オン)、六氫苯并苯偶氮萘乙二胺(ヘキサハイドロベンツアゾシン-オン)，結構式中只要存在環狀酰胺即可，并非僅限于此。
可以是由單環或稠合雜環衍生的環狀酰胺，作為稠合雜環，優選與苯環的稠合雜環。此時，苯環可以被碳原子數1～6的低級烷基，優選甲基，碳原子數1～6的低級烷氧基，優選甲氧基或鹵原子取代。
列舉優選例如下所示。
在上述式中，式(i)，(1)中的Y表示氫原子或低級烷基，式(k)中的V表示氫原子或低級烷氧基，式(m)，(n)中的W1、W2表示氫原子、低級烷基、低級烷氧基，W3表示氫原子或低級烷基。
此外，在式(j)，(1)中，右側的環為7元環，式(k)中右側的環為8元環。
J在上述定義中最優選的為，由苯環可以被取代的茚滿酮衍生的一價基團、由環狀酰胺化合物衍生的一價基團。
在B的定義中，式
表示的基團，R2為氫原子時以式-(CH2)n-表示，進而在亞烷基鏈的任一碳原子上也可以鍵合一個或一個以上的甲基。此時，n優選1～3。
此外，在B的一系列基團中，在基團內具有酰氨基的情況也為優選基團的一例。
作為更優選的基團，可以列舉式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數)表示的基團、式＝CH-(CH2)c-(式中，c表示0或1～9的整數)表示的基團、式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數)表示的基團、式-NH-表示的基團、式-O-表示的基團或式-S-表示的基團。
環
可以為5～7元環。具體可以列舉
等，特別優選的環為式
(T＝C、Q＝N)表示的哌啶。
在K的定義中的‘取代或未取代的苯基’、‘取代或未取代的芳基烷基’中，取代基與上述J的定義中的(a)的①～⑦中被定義的取代基相同。
所謂芳基烷基表示苯環被上述取代基取代，或未取代的芐基、苯乙基等。
所謂吡啶基甲基具體可以列舉2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基等。
對于K，最優選苯基可以被取代的芳基烷基、取代或未取代的苯基、苯基可以被取代的肉桂基。
優選的芳基烷基具體可以為例如芐基、苯乙基等，這些苯基也可以被碳原子數1～6的低級烷氧基、碳原子數1～6的低級烷基、羥基等取代。
表示單鍵或雙鍵。
作為雙鍵時的示例，可以列舉由上述苯環可以被取代的茚滿酮衍生的二價基團，即為亞茚滿酮基。
在本發明中，作為可藥用鹽，可以列舉例如鹽酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲基磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽等有機酸鹽。
此外依據取代基的選擇不同，有時也會形成例如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽的堿土類金屬鹽；三甲基胺鹽、三乙基胺鹽、吡啶鹽、甲基吡啶鹽、二環己基胺鹽、N，N’-二芐基亞乙基二胺鹽等有機胺鹽；銨鹽等。
此外，在本發明中上述化合物依據取代基的種類而具有手性碳，可能存在光學異構體，這些當然也應是屬于本發明的范圍。
作為具體的一例，當J具有茚滿酮骨架時，由于具有手性碳可能存在幾何異構體、光學異構體、非對映異構體等，均包含在本發明的范圍中。
綜合這些定義作為特別優選的化合物組如下所述。
[式中，J1表示選自苯基可以被取代的如下組的一價或二價基團；①二氫化茚基、②茚滿酮基、③茚基、④茚酮基、⑤茚滿二酮基、⑥四氫萘酮基、⑦苯并環庚酮基、⑧茚滿醇基 ⑨式
表示的基團。
B，T，Q，q，K具有與上述相同的意義。] 表示的環狀胺或可藥用鹽。
在上述J1的定義中，作為最優選的基團，可以列舉苯基可以被取代的茚滿酮基、茚滿二酮基、亞茚滿酮基。此外，此時，最優選苯基未被取代，或被相同或不同的羥基、鹵素、低級烷氧基取代的情況。作為低級烷氧基，可以為碳原子數1～6的例如甲氧基、乙氧基、異丙氧基、正丙氧基、正丁氧基等，可以為1～4取代，但優選2取代的情況。最優選甲氧基2取代的情況。
作為包含在(A)式中的化合物中更優選的化合物，可以列舉以下通式表示的化合物(B)。
[式中，J1表示選自苯基可以被取代的以下組的一價或二價基團；①二氫化茚基、②茚滿酮基、③茚基、④茚酮基、⑤茚滿二酮基、⑥四氫萘酮基、⑦苯并環庚酮基、⑧茚滿醇基 ⑨式
表示的基團。
B1表示式
(式中，n表示0或1～10的整數。R2表示氫原子或甲基即式
表示的亞烷基為不具有取代基，或具有1個或1個以上的甲基的形式。)表示的基團、式＝(CH-CH＝CH)b-(式中，b表示1～3的整數)表示的基團，式＝CH-(CH2)C-(式中，c表示0或1～9的整數)表示的基團或式＝(CH-CH)d＝(式中，d表示0或1～5的整數)表示的基團。
T，Q，q，K具有與上述相同的意義。] 作為包含在(B)式中的化合物中更優選的化合物組，可以列舉以下通式表示的化合物(C)。
(式中，J1，B1，K具有與上述相同的含義。) 即，式
表示的基團為式
表示的基團，即哌啶。
作為包含在(C)式中的化合物中更優選的化合物組，可以列舉以下通式表示的化合物(D)。
(式中，J2表示選自苯基可以被取代的茚滿酮基、茚滿二酮基、亞茚滿酮基的基團。
K1表示取代或未取代的苯基、可以被取代的芳基烷基、可以被取代的肉桂基。
B1具有與上述相同的意義。) 3.神經細胞保護 在本發明中，所謂中樞神經系統的神經細胞，表示來源于腦的成熟神經細胞(優選取自神經回路并且機能成熟的來源于人或人以外的哺乳動物的中樞神經系統的神經細胞)，為來源于選自大腦皮質、中隔區域以及海馬的任意一種的細胞。
在本發明中，所謂中樞神經系統的神經細胞保護是指對以下負荷的保護作用，由對中樞神經系統的神經細胞的腦缺血等缺血樣作用產生的負荷、NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)、由紅藻氨酸等興奮性物質產生的興奮性毒性引起的負荷、由肽或蛋白質的凝聚體毒性(包括Aβ毒性、朊病毒毒性)產生的負荷、由NO(一氧化氮)或活性氧引起的負荷，以及其他各種負荷。此外，在由腦缺血誘發的神經細胞損傷中，包含如下腦神經的變性疾病等的傷害，例如腦中風、腦梗塞、腦栓塞(最近也被認為是阿耳茨海默病的病因)等。該肽或蛋白質的凝聚體毒性，特別是Aβ毒性包括阿耳茨海默病或唐氏病伴隨誘發的毒性。
該神經細胞保護用于包含下述作用的廣泛含義中，除了可以切實地防止由對中樞神經系統的神經細胞的負荷(例如，由緊張狀態、營養障礙、疾病、外傷、手術等引起的體力下降、衰弱、老化等不利于維持穩態的物理或化學障礙或細胞毒性作用)產生的神經細胞死亡的作用之外，還有防止神經細胞的機能降低的作用。
為了研究神經細胞是否被保護，有必要制備神經細胞。此時，細胞沒有特殊限定，也可以是由生物體試樣制備的原代培養細胞。作為來源于生物體試樣的原代培養細胞的制備方法，例如來源于大腦皮質的原代培養神經細胞可以由大腦皮質得到，來源于中隔區域細胞的原代培養神經細胞可以由中隔部位，即包括中隔區域以及前腦基底核的部位得到。
作為細胞采集源的動物種類，可以為小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、家兔等的任意一種，沒有特殊限定。細胞可以采集自胎兒到成體的任意生長過程，優選由胎兒(例如胎生18日齡)制備。將采集到的組織，通過胰蛋白酶處理或采用膠原酶等處理，可以得到神經細胞。
細胞培養可以采用通常的動物細胞的培養方法進行，操作者可以設定適當的培養條件。
4.神經細胞保護劑、保護方法 上述化合物Q對神經細胞(尤其是中樞神經系統的神經細胞)障礙具有保護作用。此外，乙酰膽堿酯酶基因(AChE基因)的siRNA抑制AChE基因的表達而損害AChE的機能，抑制Aβ的產生。因此，作為上述腦中風、腦梗塞、腦栓塞等腦神經的變性疾病的中樞神經保護劑、神經細胞障礙的預防劑、治療劑和/或預后改善劑(以下，稱為‘本發明的保護劑等’)的有效成分，本發明中化合物Q或下述的AChE基因的siRNA是有效的，本發明提供阿耳茨海默病或唐氏病等的治療劑、治療方法、預后改善劑以及預后改善方法。
本發明的保護劑等的有效成分(例如，鹽酸多奈哌齊)可以為無水物；也可以形成水合物。此外，例如在上述多奈哌齊中可能存在多晶型但并非僅限于此，任意結晶形可以為單一的，也可以為結晶形混合物。
在本發明中使用的化合物Q(例如鹽酸多奈哌齊)，可以采用公知的方法制備。作為代表例，可以按照特開平1-79151號公報、特許2578475號公報、特許2733203號公報、或特許3078244號公報中公開的方法容易地制備。此外，鹽酸多奈哌齊也可以作為細粒劑等制劑得到。
在本發明中使用的siRNA為按照下述方法設計，操作者可以使用采用核酸合成裝置等的公知方法制備。
在本發明的保護劑等中，化合物Q或AChE基因的siRNA可以直接使用，也可以配合公知的可藥用的擔體等進行制劑。作為這種可藥用的擔體，可以列舉例如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味矯臭劑、穩定劑、乳化劑、吸收促進劑、表面活性劑、pH調整劑、防腐劑、抗氧化劑等。作為進行制劑的劑型，可以列舉在口服給藥方式中使用的片劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑等，或在非口服給藥方式中使用的栓劑、注射劑、軟膏劑、糊劑等。
此外，本發明的保護劑等給藥方式沒有特殊限定，可以口服或非口服給藥。例如，作為口服給藥方式，鹽酸多奈哌齊的細粒劑可以得到商品名アリセプト細粒(エ一ザイ株式會社)、片劑可以得到商品名アリセプト片(エ一ザイ株式會社)。或者，作為非口服給藥的形式，可以列舉經皮吸收、靜脈注射、皮下注射、皮內注射、肌肉注射或腹腔注射等，優選靜脈注射。此外，注射劑可以作為非水性的稀釋劑(例如丙二醇、聚乙二醇等乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類等)、懸濁劑或乳濁劑進行配制。注射劑的無菌處理可以通過濾膜進行過濾減菌，或通過配合殺菌劑等進行。此外，注射劑可以以用時制備的形式進行制備。即，可以通過冷凍干燥法等得到無菌的固體組合物，在使用前溶解至無菌的注射用蒸餾水或其他的溶劑中而使用。通過經皮吸收作為貼劑給藥時，優選不形成鹽的，所謂游離體。
在口服給藥中的化合物Q的給藥量，舉鹽酸多奈哌齊為例，優選0.1～100mg/日，進而優選1.0～50mg/日，此外作為AChE基因的siRNA的優選給藥量，為0.01～100mg/日，進而優選0.1～50mg/日。
在非口服給藥中，對于貼劑，作為優選的給藥量為5～50mg/日，進而優選10～20mg/日。此外，對于注射劑可以通過如下方法制備，在生理鹽水或市售的注射用蒸餾水等可藥用的擔體中溶解或懸濁以使成為0.1μg/mL擔體～10mg/mL擔體的濃度。如此制備的注射劑的給藥量，對于需要治療的患者為0.01～5.0mg/日，進而優選0.1～1.0mg/日，可以每日分1～3次給藥。
5.機能評價方法 本發明的神經細胞保護劑，對保護缺血性傷害神經細胞的效果，可以通過OGD(Oxygen Glucose Deprivation除去氧、葡萄糖)試驗評價。此外，本發明的神經細胞保護劑，對保護興奮毒性神經細胞的效果，可以通過NMDA或紅藻氨酸刺激試驗評價。進而，本發明的神經細胞保護劑，對保護Aβ毒性神經細胞的效果，可以通過Aβ毒性試驗或Aβ凝聚試驗評價。以下對各試驗方法進行說明。
(1)OGD試驗 在OGD試驗中，使用所謂對大鼠原代培養大腦皮質神經細胞通過氧·葡萄糖剝奪給予負荷而誘發缺血樣細胞損傷的模型。從而，使用該模型，進行鹽酸多奈哌齊對上述缺血樣傷害是否具有神經細胞保護作用的研究。
在本實施例中，原代培養神經細胞可以由大鼠胎兒(胎生17-19日齡)的大腦皮質得到。細胞在通常的動物細胞培養環境下，例如可以使用在37℃、5％CO2環境下，培養7日以上的細胞。OGD處理如下進行，將培養的大鼠原代培養大腦皮質神經細胞放置到沒有加入葡萄糖的緩沖液中，然后轉移到密封室中，在進行氮置換的低氧環境下進行。將沒加入葡萄糖的緩沖液置換為細胞培養用溶液，OGD處理后的細胞在37℃下，5％CO2環境下培養一晚。
(A)化合物Q，例如在確認多奈哌齊是否具有保護缺血性傷害神經細胞的效果時，首先，可以在OGD處理前后添加該化合物的條件下進行本實施例。例如比較從OGD處理12小時前添加多奈哌齊的Pre-12h，從OGD處理1小時前添加多奈哌齊的Pve-1h，和OGD處理1小時后添加多奈派齊的Post-1h，和沒有進行OGD處理的Cont以及在OGD處理前后沒有添加多奈哌齊的Vehicle的神經細胞保護作用。作為神經保護作用的指標，可以使用LDH的釋放抑制率。LDH乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)為存在于細胞質中的氧化還原酶，將丙酮酸轉變為乳酸，與此伴隨而使細胞內的NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)(nicotinamide adenine dinucleotide)量減少。因此，如果細胞受到由OGD產生的傷害則LDH從細胞內流到細胞外的溶液中，在該溶液中依據細胞的傷害度(細胞死亡)存在LDH。此外，在溶液中存在的LDH量可以通過在該溶液中加入丙酮酸、NADH，使用吸光光度計測定NADH的減少率而知道。由本試驗例表明從OGD處理12小時前添加多奈哌齊(Pre-12h)的情況最能起到神經保護效果。
(B)此外，通過對如上OGD處理的大鼠原代培養神經細胞通過顯微鏡觀察形態，可以觀察細胞受到的傷害程度，或化合物的神經細胞保護程度。與對照細胞相比較，Vehicle處置細胞不能得到正常的形態。另一方面，在OGD處理前進行多奈哌齊處置的情況，沒有發現如Vehicle處置細胞那樣的細胞損傷，顯示與OGD處理前的神經細胞相近的形態。因此，從細胞形態的角度也表明通過在OGD處理前添加多奈哌齊，神經細胞受到了保護。
(C)進而，通過與上述的試驗同樣的操作，將大鼠原代培養神經細胞進行OGD處理，這時可以使用各種乙酰膽堿酯酶抑制劑(雪花胺(galantamine)、他克林、雷司替明(Revastigmine))以及多奈哌齊并變化各自的濃度添加至細胞中，對此時的LDH釋放所產生的影響進行試驗。在該試驗中，多奈哌齊的乙酰膽堿酯酶50％抑制濃度與雷司替明基本相等，但雷司替明或其他乙酰膽堿酯酶抑制劑沒有顯示神經細胞保護作用。因此，提示了由多奈哌齊引起的對OGD處置神經的神經保護作用是基于與乙酰膽堿酯酶抑制作用不同的作用機制的。
(D)然后，為了研究上述多奈哌齊的神經細胞保護作用是否介入了乙酰膽堿受體，研究了將作為乙酰膽堿受體拮抗劑的莨菪胺(蕈毒堿受體拮抗劑)以及異莰胺(煙堿受體拮抗劑)添加至細胞中時多奈哌齊的保護作用如何受到影響。通過本試驗表明多奈哌齊的神經細胞保護作用沒有因為添加莨菪胺以及異莰胺而受到影響，因此，表明多奈哌齊的神經細胞保護作用并沒有介入乙酰膽堿受體。
(2)興奮性毒性試驗 (A)NMDA毒性 在興奮性毒性試驗中，研究對在原代培養神經細胞中的NMDA(N-methyl-D-aspartate)毒性的化合物(例如多奈哌齊)的細胞保護作用。使用通過給予大鼠原代培養大腦皮質神經細胞NMDA刺激而誘發細胞損傷的模型。方法可以如下進行，在如上得到的大鼠原代培養神經細胞中添加NMDA(例如9小時添加100μM)，然后測定在培養液中存在的LDH量即可。在施加NMDA刺激前例如12小時前添加多奈哌齊至細胞中。然后，在添加NMDA后，例如在9小時后，測定在培養液中存在的LDH量，可以以此作為神經保護作用的指標。
通過本實驗證明多奈哌齊對NMDA興奮性毒性顯示濃度依存性神經細胞保護效果。
(B)紅藻氨酸毒性 紅藻氨酸被稱為增強神經細胞死亡，該神經細胞死亡是由作為阿耳茨海默病的病因因子之一的β-淀粉狀蛋白誘發的。在本試驗中，研究在大鼠原代培養大腦皮質神經細胞中，化合物(例如多奈哌齊)對紅藻氨酸誘發的細胞損傷的細胞保護作用。
紅藻氨酸處置如下，例如在培養7日以上的細胞培養基中添加紅藻氨酸，在37℃、5％CO2環境下培養一晚。化合物Q(例如多奈哌齊)在施加紅藻氨酸刺激之前添加，例如從24小時前添加。然后添加紅藻氨酸后測定在培養液中存在的LDH量，例如24小時后測定，可以將其作為神經保護作用的指標。在本試驗中，由于多奈哌齊用量依存性地抑制神經細胞的LHD釋放，證明多奈哌齊對紅藻氨酸興奮性毒性顯示濃度依存性保護效果。
(3)Aβ毒性試驗或Aβ凝聚試驗 (A)培養中隔區域神經細胞 Aβ被認為是阿耳茨海默病的病因，此外，阿耳茨海默病中，涉及記憶或學習中樞的膽堿能神經脫落。
而且，膽堿能神經從中隔區域投射到海馬等阿耳茨海默病中易于受到損傷的區域中。考慮到以上認知和由給予鹽酸多奈哌齊抑制阿耳茨海默病引起的海馬體積減少，優選解釋為在膽堿能神經中，化合物(例如多奈哌齊)對Aβ毒性的保護效果以及Aβ凝聚抑制效果。
由于具有作為乙酰膽堿合成酶的膽堿乙酰轉移酶(ChAT)，多數中隔區域神經細胞被認為是膽堿能神經。在本發明中，作為膽堿能神經的上述中隔區域神經細胞中，首次發現由多奈哌齊引起的對Aβ凝聚作用引起的膽堿能神經細胞毒性的細胞保護效果。
中隔區域神經細胞采集自生物體，可以通過培養而得到，其來源可以是小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、家兔等，對種類沒有限定。細胞可以采集自從胎兒到成體的任一成長過程，但優選由胎兒(例如胎生18日齡)制備。切取腦的中隔部位，即含有中隔區域以及前腦基底核的部位，可以通過進行胰蛋白酶處理得到細胞。
中隔區域神經細胞可以如下培養，將如上得到的細胞在培養板上以適當的濃度播種進行培養。培養板優選涂覆聚D-賴氨酸的板，濃度優選例如在96孔聚D-賴氨酸涂覆板上以每孔1.2×105細胞進行播種。培養基可以使用含有5％胎牛血清的DMEM，DMEM更優選含有5μg/mL胰島素、30nmol/L亞硒酸鈉、100μmol/L腐胺、20nmol/L黃體酮、15nmol/L生物素、100單位/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1mmol/L丙酮酸鈉等。
確認培養中隔區域神經細胞為膽堿能神經可如上使用ChAT的表達作為指標。有無ChAT表達可將培養的中隔區域神經細胞用抗ChAT抗體進行免疫染色而確認。
(B)Aβ凝聚檢測 在本發明中，可使用Aβ的β-片狀結構形成而引起的在215～260nm的CD(圓二色性)色譜變化作為指標研究Aβ凝聚。如果Aβ形成α-螺旋結構或β-片狀結構，則在215～260nm下的CD(圓二色性)色譜減少。特別是，已知形成β-片狀結構則使215nm附近的CD光譜減少。
此外，為了簡便地研究培養液中的Aβ凝聚，作為其他方式，可以使用硫代黃素T測定Aβ的熒光。在細胞中添加Aβ(1-42)48小時后，采取培養基并加入10μmol/L的硫代黃素T，立即在激發波長450nm、發射波長490nm下進行熒光測定(Wall J.，Schell M.，MurphyC.，Hrncic R.，Stevens F.J.，Solomon A.(1999)Thermodynamicinstability of human lambda 6 light chainscorrelation withfibrillogenicity.Biochemistry.38(42)，14101-14108.)。
(C)Aβ毒性檢測 已知如果Aβ形成β-片狀結構則變得易于形成Aβ纖維固化，形成毒性。在本發明中Aβ毒性的檢測可以在中隔區域神經細胞中添加Aβ后，使用測定細胞障礙的公知方法進行，以下記述優選的代表例，但并非僅限于此。例如，與上述(1)同樣地使用培養基中的LDH量作為指標進行研究。或者，在本發明中，Aβ毒性在中隔區域神經細胞中添加Aβ后，通過MTT(二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)測定進行研究。MMT測定的方法可以如下進行，例如，在培養基中添加MTT(シグマ社制)以使終濃度為1mg/mL，在37℃下培育1小時后，去除培養基，將細胞用DMSO溶解，測定其吸光度(550nm)。或通過alamar blue細胞障礙測定方法進行研究。通過alamar blue的該方法為添加10分之1培養基量的alamar blue(和光純藥社制)，使其在5％CO2環境下反應。4小時后，在激發波長530nm，熒光波長590nm，增益35下進行測定。以只含培養基作為0％，對照作為100％進行換算。
在細胞中添加的Aβ，可以使用全長Aβ，也可以使用從N末端開始只具有40個殘基的Aβ(1-40)，只要是具有β片狀結構的構型，可以使用任一長度的Aβ。
此外，Aβ毒性引起的細胞死亡程度也可以通過由抗MAP2抗體的免疫染色進行研究。上述MAP2為神經細胞標記，因此由表達MAP2的細胞量，可以確認Aβ毒性引起的神經細胞的脫落程度。或者，通過使用錐蟲藍的細胞障礙測定方法進行研究。加入錐蟲藍(和光純藥公司制)，以沒有被染色為深藍色的細胞作為活細胞進行計數。
(D)對中隔區域神經細胞的Aβ毒性的神經保護劑以及Aβ凝聚抑制劑 如果將乙酰膽堿酯酶(AChE)基因的siRNA添加到中隔區域神經細胞中，則細胞內的AChE活性降低。siRMA處置緩和Aβ毒性引起的中隔區域細胞障礙這一點，可以通過測定上述(C)的LDH表明。
此外，在添加該siRNA的中隔區域神經細胞中，siRNA處置抑制Aβ凝聚作用的情況，可以通過測定上述(B)的CD光譜表明。
由上可知，在中隔區域神經細胞的Aβ毒性以及Aβ凝聚中，涉及AChE。因此本發明含有Aβ凝聚抑制劑，該Aβ凝聚抑制劑為具有抑制乙酰膽堿酯酶機能作用的化合物，并含有同時具有實際上抑制乙酰膽堿酯酶與Aβ間的相互作用的化合物。
所謂‘相互作用’表示乙酰膽堿酯酶與Aβ結合。所謂‘實際上抑制乙酰膽堿酯酶與Aβ間的相互作用’表示在乙酰膽堿酯酶存在下抑制Aβ的凝聚被促進。并且，只要Aβ毒性被抑制，則可以稱為‘實際上’相互作用被抑制。
乙酰膽堿的機能降低作用，可以是乙酰膽堿酯酶的活性抑制引起的，也可以是乙酰膽堿酯酶基因表達抑制引起的。
AChE的活性抑制，只要抑制乙酰膽堿與Aβ間的相互作用，只要抑制AChE的酶活性，則可以為任意化合物(例如下式的鹽酸多奈哌齊)，此外，也可以是抗AChE抗體。
AChE基因的表達抑制，抑制只要是乙酰膽堿與Aβ間的相互作用，并且，抑制AChE基因的表達，可以為生成RNAi的任意核酸(siRNA或shRNA)。通過RNAi抑制AChE基因的表達，例如設計和合成AChE基因對應的siRNA(small interfering RNA)或shRNA(short hairpinRNA)，使其作用生成RNAi即可。siRNA為在細胞內通過Dicer處理產生的短鏈RNA。而shRNA為折疊為發夾結構的小RNA分子，具有有意義鏈和反義鏈以環連接的莖環結構。
siRNA的設計基準如下。
(a)選擇編碼AChE的基因的起始密碼子的下游區域。只要是起始密碼子下游的序列即沒有特殊限定，任意的區域都可能成為候選。
(b)在選擇區域方面，選擇以aa開始的連續11～30堿基，優選21～25的序列。
具體地可將以下堿基序列作為靶序列，使用含有該靶序列，并且30堿基以下，例如11～30堿基長度(優選21～25堿基長度)的序列作為siRNA((i-1)和(i-2)，以及(ii-1)和(ii-2))。
(i-1)5′-AAUGUCAGUGACUCUGUUUTT-3′(序列編號1) (i-2)5′-AAACAGAGUCACUGACAUUTT-3′(序列編號2) (ii-1)5′-GCUGCCUCAAGAAAGUAUCTT-3′(序列編號3) (ii-2)5′-GAUACUUUCUUGAGGCAGCTT-3′(序列編號4) 本發明的AChE基因的siRNA，優選使用(i-1)與(i-2)組合，以及(ii-1)與(ii-2)組合而形成的雙鏈RNA的形式。
此外，shRNA的設計基準如下。
(a)在RNAi中使用的AChE對應的shRNA序列，從基因上特異性的5’末端區域開始至300堿基的范圍進行設計(Elbashir，S.M.et.al.Genes Dev.15，188-200(2001))。
(b)從各自基因轉錄產物的5’末端附近的區域開始，選擇和設計以aa或a開始的mRNA序列作為靶序列。目標區域的長度沒有被特殊限制，優選30bp以下，更優選21～25bp左右。
將siRNA以及shRNA導入培養的中隔區域神經細胞中時，可以采用將體外合成的siRNA以及shRNA連接至質粒DNA上而將其導入到細胞中的方法，將雙鏈RNA復性的方法等。
此外，由顯示Aβ凝聚抑制效果的siRNA或shRNA的結構解析而預見的化合物，并且具有Aβ凝聚抑制效果的化合物也被包含在本發明中。
(E)由膽堿酯酶抑制劑或膽堿酯酶基因的siRNA產生的Aβ凝聚抑制作用以及對Aβ毒性的保護作用的檢測 本發明提供具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選方法。即通過測定在中樞神經系統的神經細胞中，在Aβ存在下添加被檢化合物(候選化合物)時在215～260nm，特別是215nm處的CD光譜的減少，可以進行抑制Aβ凝聚的化合物的篩選。判斷被檢化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用，可以通過比較由被檢化合物引起的Aβ凝聚量，與在不存在候選化合物的條件下的Aβ凝聚量而進行。本發明還提供用于在上述方法中使用的具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒。
在本發明的試劑盒中，包含通過上述(B)的CD光譜法測定Aβ凝聚抑制的必要試劑。在Aβ凝聚中所必要的Aβ、CD光譜測定時使用的試劑種類優選使用下述實施例6以及實施例7中使用的試劑。
此外，本發明提供如下篩選方法，該方法篩選由Aβ毒性誘發的中樞神經系統的神經細胞障礙的預防和/或治療上有效的化合物或其可藥用鹽。即，通過檢測在培養的中隔區域神經細胞中添加被檢化合物以及Aβ時的細胞損傷或細胞死亡，可以進行由Aβ毒性誘發的中樞神經系統的神經細胞障礙的預防和/或治療上有效的化合物的篩選。上述細胞障礙或細胞死亡，可以通過測定上述(C)中所述的LDH量，或通過MTT測定等檢測。本發明還提供用于在上述方法中使用的由Aβ毒性誘發的中樞神經系統的神經細胞障礙的預防和/或治療上有效的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒。
此外，在本發明的試劑盒中，包含在以上述(C)的細胞外以LDH量為指標測定由Aβ毒性誘發的神經細胞障礙時的必要試劑，或用于實施MTT測定等的必要試劑。用于以LDH測定由Aβ毒性誘發的細胞障礙程度的必要試劑可以優選在下述實施例1，2，3，5以及7中使用的試劑，可以列舉例如NADH、丙酮酸。此外，用于通過MTT測定由Aβ毒性誘發的細胞障礙程度的必要試劑種類，可以列舉例如MTT。
構成這些試劑盒的各成分可以分別準備，或在不發生問題的限度下共存。試劑盒可以包含溶液，或者可以是用于配制這種溶液的成分的濃縮形態。
進而根據需要，該試劑盒還可以包含輔助劑、專用容器、其他必要的附件、說明書等。
在本發明中，如多奈哌齊這樣的乙酰膽堿酯酶抑制劑或乙酰膽堿酯酶基因的siRNA引起的Aβ凝聚抑制作用可以通過如下測定進行確認，在添加Aβ前(例如24小時)添加乙酰膽堿酯酶抑制劑，在添加Aβ后(例如48小時后)，測定上述的CD光譜。
此外，在同樣處置的細胞中，通過測定培養基中的LDH量，可以確認如多奈哌齊這樣的乙酰膽堿酯酶抑制劑或乙酰膽堿酯酶基因的siRNA引起的對Aβ毒性的保護作用。
以下，通過實施例具體說明本發明，本發明并非僅限于本實施例。
實施例1OGD試驗 在本實施例中，使用通過對大鼠原代培養大腦皮質神經細胞通過氧·葡萄糖剝離施予負荷而誘發缺血樣細胞損傷的模型。對鹽酸多奈哌齊對上述缺血樣傷害是否具有神經細胞保護作用進行研究。
在本實施例中，原代培養神經細胞由大鼠胎兒(胎生17-19日齡)的大腦皮質得到。培養液使用在DMEM(Gibco BRL)中含有10％胎牛血清(Gibco BRL)、10％馬血清(Gibco BRL)、5μg/mL胰島素(Sigma)、30nM亞硒酸鈉(Sigma)、100μM腐胺(Sigma)、20nM黃體酮(Sigma)、15nM生物素(Sigma)、100單位/mL青霉素(GibcoBRL)、100μg/mL鏈霉素(Gibco BRL)、8mM葡萄糖和1mM丙酮酸(Sigma)(參照文獻Scholtz et al.，1988)，細胞在37℃、5％CO2環境下培養。培養7日以上后，實施OGD處理。OGD處理如下進行，將大鼠原代培養大腦皮質神經細胞放置到沒有加入葡萄糖的緩沖液中，然后轉移到密封室中，氮置換，在低氧環境下進行處理，上述緩沖液組成如下Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液(5.36mM KCl，1.26mMCaCl2，0.44mM KH2PO4，0.49mM MgCl2，0.41mM MgSO4，137mMNaCl，4.17mM NaHCO3，0.34mM Na2HPO4，10mM HEPES(pH 7.4))。將沒加入葡萄糖的緩沖液置換為細胞培養用溶液，將OGD處理后的細胞在37℃下，5％CO2環境下培養一晚。首先，通過在OGD處理前后添加多奈哌齊研究是否有神經細胞保護效果，或是否變化。比較OGD處理12小時前添加多奈哌齊的Pre-12h，OGD處理1小時前添加多奈哌齊的Pre-1h以及OGD處理1小時后添加多奈哌齊的Post-1h，和沒有進行OGD處理的Cont以及在OGD處理前后沒有添加多奈哌齊的Vehicle的神經細胞保護作用。作為神經保護作用的指標，可以使用LDH的釋放抑制率。LDH(乳酸脫氫酶)為存在于細胞質中的氧化還原酶，將丙酮酸轉變為乳酸，使與此相伴存在的NADH(煙堿胺腺嘌呤二核苷酸)(nicotinamide adenine dinucleotide)量減少。因此，如果細胞受到由OGD產生的傷害則LDH從細胞內流到細胞外的溶液中，在該溶液中依據細胞的傷害度(細胞死亡)而存在LDH。此外，在溶液中存在的LDH量可以通過在該溶液中加入丙酮酸、和NADH，使用吸光光度計測定NADH的減少率而知道。結果如圖1所示。由圖1清楚地表明Pre-12h顯示最大的LDH釋放抑制作用，以下依次為Pre-1h、Post-1h。由該結果可知，在OGD處理12小時前添加多奈哌齊的情況下，有效地保護神經細胞。在以后的OGD試驗中多奈哌齊的添加時間均固定在Pre-12h。
然后，通過與上述試驗相同的操作將OGD處理大鼠原代培養細胞時的神經細胞通過顯微鏡進行觀察。結果如圖2所示。由圖2清楚地表明與對照(A)相比較V’ehicle(B)中細胞不能維持正常的形態，顯然因OGD受到了傷害。另一方面，在OGD處理前添加多奈哌齊的情況，未見如(B)中見到的那樣的神經細胞損傷，明顯為與OGD處理前的神經細胞的狀態相近的狀態(C)。因此，表明通過在OGD處理前添加多奈哌齊，神經細胞被保護。
然后，通過與上述的試驗同樣的操作，將大鼠原代培養神經細胞進行OGD處理，這時可以使用各種乙酰膽堿酯酶抑制劑(雪花胺、他克林、雷司替明)以及多奈哌齊并變化各自的濃度添加至細胞中，對此時的LDH釋放所產生的影響進行試驗。添加的濃度定為，多奈哌齊、他克林以及雷司替明0.1，1.0，10μM，雪花胺1.0，10，100μM。結果如圖3所示。如圖3A所示可知僅多奈哌齊用量依存性地抑制神經細胞的LHD釋放，該抑制是在統計學上顯著地抑制。此處，在各自的大鼠腦破碎懸濁液中的乙酰膽堿酯酶抑制劑的50％抑制濃度(IC50)如表1所示。
表1 Ogura et al.2000.Comparison of inhibitory activities of Donepeziland other cholinesterase inhibitors on acetylcholinesterase andbutyrylcholinesterase in vitro.Methods Find Exp Clin Pharmacol.22，609-613 如表1所示可知多奈哌齊的乙酰膽堿酯酶50％抑制濃度與雷司替明基本相等。但雷司替明或其他乙酰膽堿酯酶抑制劑沒有顯示神經細胞保護作用。該結果提示神經保護作用是基于與乙酰膽堿酯酶抑制作用不同的作用機制的。
然后，通過以下試驗研究了在將作為乙酰膽堿受體拮抗物的莨菪胺(蕈毒堿受體拮抗物)以及異莰胺(煙堿受體拮抗物)添加至細胞中時，多奈哌齊的神經細胞保護作用如何受到影響。
與上述試驗同樣地，OGD處理的12小時前在神經細胞培養液中添加多奈哌齊、莨菪胺、異莰胺、多奈哌齊和茛菪胺、或多奈哌齊和異莰胺，對由OGD處理引起的LDH釋放的影響進行試驗。添加的濃度設為，多奈哌齊、莨菪胺、異莰胺均為10μM。
結果如圖4所示。如圖4清楚表明多奈哌齊的神經細胞保護作用，在Cont(沒有OGD處理)、Vehi(沒有添加多奈哌齊)以及添加多奈哌齊的任意的試樣中并沒有因為是否添加作為乙酰膽堿受體拮抗物的茛菪胺(圖4A)或異莰胺(圖4B)而受到影響。這表明多奈哌齊顯示保護神經細胞的作用與是否抑制乙酰膽堿受體無關。因此，通過本試驗認為多奈哌齊通過抑制乙酰膽堿酯酶作用以外的作用機制發揮保護神經細胞作用。
實施例2興奮性毒性試驗 在本實施例中，研究多奈哌齊對NMDA毒性的細胞保護作用。使用通過對大鼠原代培養大腦皮質神經細胞通過施予NMDA刺激而誘發細胞損傷的模型。對如實施例1操作而得到的大鼠原代培養神經細胞添加100μM NMDA，在9小時后測定培養液中存在的LDH量。
在本實施例中，原代培養神經細胞由大鼠胎兒(胎生17-19日齡)的大腦皮質得到。培養液使用在MEM(invitrogen公司制)中添加葡萄糖(1g/L)、青霉素/鏈霉素(100單位/mL)、10％FCS的培養液。每2，3天進行培養基交換。表達KA毒性時，培養基使用添加B-27和0.25mM谷氨酰胺的神經基礎培養基(invitrogen公司制)。細胞在37℃下，5％CO2環境下培養。培養7天以上后，在培養基中添加100μMNMDA，在37℃下，5％CO2環境下培養一晚。施加NMDA刺激12小時前在細胞中添加多奈哌齊。然后，在添加NMDA 9小時后測定在培養液中存在的LDH量，作為神經細胞保護作用的指標。
本實施例的結果如圖5所示。由圖5可知，從0.1μM到10μM的范圍內多奈哌齊用量依存性地抑制神經細胞的LDH釋放。通過本實驗可知多奈哌齊對NMDA興奮性毒性顯示濃度依存性神經細胞保護效果。
實施例3興奮性毒性試驗 紅藻氨酸被稱為增強神經細胞死亡，該神經細胞死亡是由作為阿耳茨海默病的病因因子之一的β-淀粉狀蛋白(Aβ)誘發的。在實施例中，使用通過對大鼠原代培養大腦皮質神經細胞施予紅藻氨酸而誘發細胞損傷的模型。
在本實施例中，原代培養神經細胞由大鼠胎兒(胎生17-19日齡)的大腦皮質得到。細胞在37℃、5％CO2環境下培養。培養7日以上后，在培養基中加入NMDA或紅藻氨酸，在37℃、5％CO2環境下培養一晚。施加紅藻氨酸刺激24小時前在細胞中添加多奈哌齊。然后，在添加紅藻氨酸24小時后測定在培養液中存在的LDH量，作為神經保護作用的指標。
本實施例的結果如圖6所示。由圖6可知，從0.1μM到1μM的范圍內多奈哌齊用量依存性地抑制神經細胞的LDH釋放。通過本實驗可知多奈哌齊對紅藻氨酸興奮性毒性顯示濃度依存性保護效果。
在以下的實施例4～7中使用的試劑以及統計分析方法如下。
Aβ(人，1-40)由ペプチド研(Osaka，Japan)購入。胰蛋白酶溶液、青霉素、鏈霉素、Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)、HEPES由Life Technologies Inc.(Grand Island，NY)購入。胰島素、亞硒酸鈉、腐胺、DNase I、異莰胺、莨菪胺由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)購入。胎牛血清和熱滅活馬血清由Nichirei Co.(Tokyo，Japan)購入。ChAT、微管相關蛋白-2(MAP2)由Chemicon InternationalInc.(Temecula，CA)購入。Alexa Fluor 546由Molecular Probes(Eugene，OR)購入。Vecstain Elite ABC試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒由Vector Laboratories，Inc.(Burlingame，CA)購入。脂質體轉染試劑(Lipofectamine 2000)由Invitrogen Co.(Carlsbad，CA)購入。SiRNA委托日本バイオサ一ビス(Saitama，Japan)合成。
統計分析數據以平均值±標準偏差表示。比較檢驗使用Welch’st-test。P＜0.05為具有顯著性差異。統計分析軟件使用SAS 8.1(SASInstitute Japan Ltd.，Tokyo，Japan)。
實施例4中隔區域神經細胞的培養以及膽堿能神經的確認 中隔區域神經細胞由Wister大鼠(日本チヤ一ルズリバ一)的胎兒(胎生18日齡)制備。由胎兒腦切取中隔部位(包括中隔區域和前腦基底核)，在含有0.25％胰蛋白酶和0.2mg/mL DNase I的Ca2+/Mg2+ freeHank’s balanced salt solution中，在37℃下培育15分鐘。在得到的細胞中，加入已加入10％胎牛血清、10％馬血清的DMEM(含有5μg/mL胰島素、30nmol/L亞硒酸鈉、100μmol/L腐胺、20nmol/L黃體酮、15nmol/L生物素、100單位/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1mmol/L丙酮酸鈉)而使胰蛋白酶失活，洗滌細胞2次。在96-孔的涂覆聚-D-賴氨酸培養板上，以1.2×105細胞/孔的濃度播種細胞。播種的細胞在CO2培養箱(5％CO2，37℃)中培養。一天后，用含有5％胎牛血清的上述DMEM交換3分之2培養基。3天后，再用含有5％胎牛血清的上述DMEM交換3分之2培養基。6天后，用不含血清的上述DMEM(但不含谷氨酰胺)全量交換培養基。
將用以上方法培養的中隔區域神經細胞，用抗膽堿乙酰轉移酶(ChAT)抗體進行免疫染色。首先，將培養的中隔區域神經細胞用中性福爾馬林溶液固定60分鐘。用5％山羊血清培育30分鐘后，在1％山羊血清存在下用稀釋500倍的ChAT抗體培育1天。然后，將細胞用稀釋500倍的山羊抗-兔IgG以及HRP標記的親合素-生物素復合物培育1小時后，使用DAB作為過氧化物酶的基質進行細胞染色。
用抗ChAT抗體免疫染色培養大鼠中隔區域神經細胞的結果如圖7所示。圖7的標尺表示0.1mm。通過免疫染色表明大多的培養大鼠中隔區域神經細胞具有作為乙酰膽堿合成酶的膽堿乙酰轉移酶(ChAT)。這意味著培養大鼠中隔區域神經細胞為膽堿能神經。即，可以確認該細胞為膽堿能神經。
以往，報道了在阿耳茨海默病患者腦中的膽堿乙酰轉移酶的減少與識別障礙的嚴重程度有關(Perry E.K.，Tomlinson B.E.，Blessed G.，Bergman K.，Gibson P.H.and Perry R.H.(1978)Correlation ofcholinergic abnormalities with senile senile plaques and mental testscores in senile dementia.Br.Med.J.2，1457-1459.)。因此，可以說中隔區域神經細胞損傷的抑制程度與抑制阿耳茨海默病患者的識別機能降低相關。
實施例5多奈哌齊對Aβ(1-40)毒性的保護效果以及細胞死亡試驗 作為細胞障礙指標，測定LDH(乳酸脫氫酶)。細胞使用按照如實施例4的培養方法培養7天的中隔區域神經細胞。在中隔區域神經細胞的培養基中添加15μmol/L的Aβ(1-40)，在CO2培養箱(5％CO2，37℃)中培養。在添加Aβ(1-40)24小時前加入多奈哌齊(0.01，0.1，1，10μmol/L)、異莰胺(10μmol/L)、莨菪胺(10μmol/L)。在添加Aβ(1-40)48小時后，測定培養基中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。同時，將細胞用含有0.5％Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)溶解，并測定細胞中的LDH。計算在全部LDH(細胞內以及培養基中)中，在培養基中漏出的LDH量，以％表示(Koh J.Y.and Choi D.W.(1987)Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronalinjury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay.J.Neurosci.Meth.20，83-90.)。數據用ANOVA以及Welch’s t-test分析方法進行分析。
結果如圖8所示。在圖8中，白色直方表示沒有加Aβ的細胞，灰色直方表示加Aβ的細胞。求出各值以平均值±S.E.M.(n＝23-25)表示并將其圖形化。圖8的[＊]表示P＜0.05，[＊＊]表示P＜0.01，以及[＊＊＊]表示P＜0.001(以‘Control cells’作為對照)。
培養的中隔區域神經細胞易于受到由Aβ(1-40)引起的障礙(圖8[control細胞])。與添加Aβ(1-40)48小時時的毒性相比，多奈哌齊從0.1μmol/L開始顯示顯著地保護效果(圖8)。由多奈哌齊產生的Aβ(1-40)毒性的抑制效果沒有被作為乙酰膽堿受體拮抗劑的異莰胺以及莨菪胺抑制(圖8)。
然后，將如上用Aβ(1-40)處置的培養小鼠中隔區域神經細胞用抗MAP2抗體免疫染色。MAP2被用作神經細胞標記(Herzog W.andWeber K.(1978)Fractionation of brain microtubule-associated proteins.Isolation of two different proteins which stimulate tubulinpolymerization in vitro.Eur J Biochem.92(1).1-8)。MAP2染色按照上述實施例4的免疫染色方法進行，在中隔區域神經細胞中添加15μmol/L的Aβ(1-40)48小時后，固定細胞并進行免疫染色。添加Aβ(1-40)24小時前加入多奈哌齊。固定細胞后，用稀釋至300倍的抗MAP2抗體培育一天，用Alexa Fluor546作為熒光基質檢測。
結果如圖9所示。標尺表示0.1mm。A表示沒有加入Aβ(1-40)的對照細胞。B表示加入Aβ(1-40)的細胞。C、D、E分別表示加入Aβ(1-40)和多奈哌齊(0.1，1，10μmol/L)的細胞。左側的照片為Hoffman modulation的明視野照片。右側的照片為熒光照片。如果48小時加入Aβ(1-40)，則被MAP2染色的神經細胞減少(圖9B)。確認了多奈哌齊抑制由Aβ(1-40)引起的MAP2染色細胞的障礙(圖9)。
實施例6多奈哌齊對Aβ(1-40)凝聚的效果 為了研究在培養液中的Aβ(1-40)結構狀態而測定CD光譜。已知如果Aβ形成β-片狀結構則變得易于形成Aβ纖維固化，顯示毒性(Howlett D.R.，Jennings K.H.，Lee D.C.，Clark M.S.，Brown F.，Wetzel R.，Wood S.J.，Camilleri P.and Roberts G.W.(1995)Aggregation state and neurotoxic properties of Alzheimer beta-amyloidpeptide.Neurodegeneration.4，23-32.)。此外，已知如果Aβ(1-40)形成α-螺旋結構或β-片狀結構，則從205到225nm下的CD(圓二色性)色譜減少(Sreerama N.，Venyaminov S.Y.and Woody R.W.(2000)Estimation of peptide secondary structure from circular dichroismspectrainclusion of denatured peptides with native peptides in theanalysis.Anal.Biochem.287，243-251；Bokvist M.，Lindstrom F.，WattsA.and Grobner G.(2004)Two types of Alzheimer’s beta-amyloid(1-40)peptide membrance interactionsaggregation preventingtransmembrance anchoring versus accelerated surface fibril formation.J.Mol.Biol.335，1039-49.)。特別是，已知形成β-片狀結構使215nm附近的CD光譜減少。因此測定CD作為Aβ凝聚指標。
在培養的中隔區域神經細胞中添加15μmol/L Aβ(1-40)，在添加48小時后采取培養基，測定215～260nm的CD光譜。在CD光譜測定時使用JASCO(日本分光，J-720WI)。
結果如圖10所示。A表示沒有加入多奈哌齊的細胞。B表示添加多奈哌齊(10μM)的細胞。實線表示沒加入Aβ的細胞，虛線表示加入Aβ的細胞。此外，A2以及B2分別表示由A以及B圖的虛線值減去實線值。通過添加10μmol/L多奈哌齊，從215nm到225nm的CD光譜的減少被抑制。因此，通過本實施例，表明多奈哌齊抑制了Aβ形成α-螺旋結構或β-片狀結構。
實施例7siRNA對細胞內乙酰膽堿活性的效果以及對Aβ(1-40)毒性的保護效果 (1)siRNA處理 作為乙酰膽堿酯酶的雙鏈siRNA使用下述2組低聚核苷酸((i)以及(ii))。
(i)；5′-AAUGUCAGUGACUCUGUUUTT-3′(序列編號1)、5′-AAACAGAGUCACUGACAUUTT-3′(序列編號2)以及 (ii)；5′-GCUGCCUCAAGAAAGUAUCTT-3′(序列編號3)、5′-GAUACUUUCUUGAGGCAGCTT-3′(序列編號4). 在中隔區域神經細胞培養第6日和第7日，在培養基中加入1μmol/L的上述(i)以及(ii)的siRNA和lipofectamine 2000(0.4μL/mL)。在培養第9日，溶解細胞，測定細胞內的乙酰膽堿酯酶活性(AChE活性)。
(2)乙酰膽堿酯酶活性的測定 乙酰膽堿酯酶活性的測定按照Ellman等的方法進行(EllmanG.L.，Courtney K.D.，Anders V.J.，Feather-Stone R.M.(1961)A newand rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity.Biochem.Pharmacol.7，88-95)。將細胞用含有0.5％Triton X-100的磷酸緩沖液(pH 8.0)溶解。離心分離得到的細胞溶液，上清液用磷酸緩沖液(pH 8.0)稀釋3倍。在稀釋的上清液中，添加5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(0.33mmol/L)和碘化乙酰硫代膽堿(AthCh)(0.5mmol/L)，攪拌后，測定在412nm下的吸光度的增加(MolecularDevices，SpectraMax 190EXT)。數據用ANOVA和Welch’s t-test分析。
結果如圖11所示。各值以平均值±S.E.M.(n＝11)的形式圖形化(n＝11)。在圖11中，相對沒有添加siRNA的細胞，[＊＊]表示P＜0.01，[＊＊＊]表示P＜0.001。
確認了研究2種siRNA、(i)以及(ii)的，結果都有AChE活性抑制效果(圖11)。
(3)siRNA對Aβ(1-40)毒性的保護效果 測定LDH(乳酸脫氫酶)作為細胞障礙的指標。在培養第7日在中隔區域神經細胞中添加15μmol/L的Aβ(1-40)，培育48小時。在添加Aβ(1-40)的24小時前和添加之前立即加入1μmol/L siRNA。白色直方表示沒有加入Aβ(1-40)的細胞。灰色直方表示加入Aβ(1-40)的細胞。采用ANOVA和Welch’s t-test分析數據。
結果如圖12所示。各值以平均值±S.E.M.的形式圖形化(n＝7)。在圖12中，相對沒有添加siRNA的細胞，[＊＊＊]表示P＜0.001。
研究了上述2種siRNA((i)以及(ii))的效果，結果都抑制Aβ毒性(圖12)。
在LDH測定同時，用在215nm～260nm下的CD光譜變化分析Aβ的凝聚。
結果如圖13所示。A表示加入RNAi的細胞。實線表示沒加入Aβ的細胞，虛線表示加入Aβ的細胞。B表示由A的虛線值減去實線值的數值。通過添加siRNA從215nm到225nm的CD光譜減少被抑制(圖13)。
產業實用性 本發明中的神經細胞保護劑，對由缺血樣細胞損傷和興奮性毒性引起的傷害發揮神經細胞保護作用。因此，通過本發明的神經細胞保護劑可以防止、抑制由腦梗塞或腦血栓等誘發的缺血性神經細胞死亡以及由興奮性毒性誘發的神經細胞死亡。
序列表文本
序列編號1siRMA
序列編號2siRMA
序列編號3siRNA
序列編號4siRNA
序列表
<110>Eisai Co.，Ltd.
<120>淀粉狀蛋白-beta凝聚的抑制劑
<130>P04-108PCT
<150>JP 2003-167744
<151>2003-06-12
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<170>PatentIn version 3.2
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aaugucagug aoucuguuut t21
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
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aaacagaguc acugacauut t21
<210>3
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
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gcugccucaa gaaaguauot t21
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<213>人工的
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<223>siRNA
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gauacuuucu ugaggcagct t21
序列表
<110>Eisai Co.，Ltd.
<120>神經細胞保護劑
<130>G05-0066CN
<150>JP 2003-167744
<151>2003-06-12
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<223>siRNA
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aaugucagug acucuguuut t21
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<223>siRNA
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<223>siRNA
<400>4
gauacuuucu ugaggcagct t21
1
權利要求
1.具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選方法，其特征在于，在Aβ存在下使候選化合物作用于中樞神經系統的膽堿能神經細胞，并檢測或測定Aβ凝聚量。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，使用Aβ凝聚量的檢測或測定結果，通過與不存在候選化合物的情況下的Aβ凝聚量相比較，判定候選化合物是否具有Aβ凝聚抑制作用。
3.具有Aβ凝聚抑制作用的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒，其用于權利要求1或2所述的方法中。
4.一種在由Aβ毒性誘發的中樞神經系統的神經細胞障礙的預防和/或治療中有效的化合物或其可藥用鹽的篩選方法，其特征在于，在Aβ存在下使候選化合物作用于中樞神經系統的膽堿能神經細胞，并檢測細胞損傷或細胞死亡。
5.權利要求4所述的方法，其特征在于，使用細胞損傷或細胞死亡的檢測結果，通過與不存在候選化合物的情況下的細胞損傷或細胞死亡程度相比較，判定候選化合物是否具有對Aβ毒性的細胞保護作用。
6.權利要求4或5所述的方法，其中，細胞損傷或細胞死亡的檢測是通過測定乳酸脫氫酶的濃度或MTT測定實現的。
7.在由Aβ毒性誘發的中樞神經系統的神經細胞障礙的預防和/或治療中有效的化合物或其可藥用鹽的篩選試劑盒，其用于權利要求4或5所述的方法中。
全文摘要
本發明涉及中樞神經的神經細胞保護劑，以及中樞神經系統的神經細胞障礙的預防劑和/或治療劑，其含有以鹽酸多奈哌齊為代表的化合物。
文檔編號A61P25/00GK101348824SQ200810088570
公開日2009年1月21日 申請日期2004年6月14日 優先權日2003年6月12日
發明者赤祖父盛, 木村真奈美 申請人:衛材R&D管理有限公司