創傷愈合劑和組合物的制作方法

專利名稱：創傷愈合劑和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及創傷的愈合。本發明特別涉及創傷愈合劑，包含所述創傷 愈合劑的組合物，和包含所述創傷愈合劑的醫療器械。
背景技術：
組織的創傷愈合是一個復雜的修復過程。例如，皮膚創傷愈合過程涉 及募集大量特化細胞到創傷部位，胞外基質和基底膜沉積，血管生成，選 擇性酶活性和上皮再形成。
一直需要提供一種促進創傷愈合的物質。在急性創傷和慢性創傷情況 下，或者對于普遍愈合受損的個體(例如老年人)，通常希望加快愈合速 率。創傷可能嚴重影響生活質量或者甚至導致死亡，因此需要在臨床上盡 可能加快愈合速率。
市場上已經存在大量創傷愈合劑和組合物，但沒有一種能完全令人滿 意。但是，提供可以產生有效、快速和美觀的創傷修復的可選擇的創傷愈 合劑和組合物仍是一個重要課題。
WO03/074073,以本申請人的名義，描述了參與血管生成調控的54 個基因的家族。在這些基因中，"基因156"(本說明書中SEQIDNol)， 其編碼"蛋白156A"(本說明書中SEQIDNo2)，在WO03/074073中也 稱為Angiodensine，被描述為促血管生成的。蛋白156A包含217個氨基 酸，且由w7/co實驗檢測具有線粒體序列信號。蛋白156A不包含任何 跨膜結構域和保守結構域。WO03/074073描述了人內皮細胞中基因156的 反義物(即基因156的抑制)的表達抑制毛細血管的形成。WO03/074073 還預見了基因156和蛋白156a的潛在促血管生成活性。

發明內容
在他們的研究基礎上進一步深入，本發明人驚奇的發現蛋白156A在體外和體內顯示很強的創傷愈合活性。WO03/074073只提及蛋白156A的 潛在體外促血管生成活性，因此本發明人不知道蛋白156a在體內對創傷 愈合的潛在作用。
因此本發明人確實非常驚奇的注意到蛋白156A在創傷修復中的強有 效性。
此外，本發明人發現蛋白156A還在疤痕的最終美觀方面特別有效， 所述疤痕顯得更規則，顏色更淺。
因此本發明第一個方面涉及創傷治療劑，其包括具有SEQIDNO:2所 示的氨基酸序列的多肽，或者與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少 50%,優選70%，更優選90%同一性的多肽。
術語"與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少50%，優選70%， 更優選90%同一性的多肽"是指與SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少 50%，優選70%，更優選卯％同一性并顯示創傷愈合活性的任何多肽。它 還包括具有創傷愈合活性的蛋白156A片段。
此處使用的術語"創傷"涉及，但不限于
一皮膚表皮和/或真皮的傷害，
一來自內部組織或者外部組織或者器官例如眼、粘膜、肺、腎、心臟、 腸、腱或者肝的損害、損傷或者創傷，
一血管組織例如靜脈、小靜脈、動脈和毛細血管的損傷或者損害。
本說明書中，術語"創傷治療"用于描述涉及創傷愈合的所有不同步 驟。因此它包括以下步驟形成填塞缺損的凝塊，炎性細胞侵入凝塊，然 后侵入成纖維細胞和毛細血管以形成將創傷邊緣匯聚到一起的收縮性肉 芽組織，切割表皮邊緣遷移以覆蓋剝蝕的創傷表面。術語"創傷治療"不 只限于皮膚的愈合，還包括上面所列的其他類型創傷的組織修復。
在第二個方面，本發明還涉及創傷治療的方法，包括給需要治療的患 者施用治療有效量的SEQIDNO:2，或者與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序 列具有至少50%，優選70%，更優選90%的同一性的多肽。
術語"治療有效量"是指在不產生不能接受的毒性癥狀的情況下，能 夠獲得預期醫療結果即創傷愈合的量。所述"治療有效量"將根據例如待 治療的特定病癥、患者的生理狀況和治療持續時間等因素而改變。第三個方面，本發明還涉及用于治療創傷的創傷治療組合物，其包括
具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的多肽，或者與SEQ IDNO:2所示的 氨基酸序列具有至少50%，優選70%，更優選90%的同一性的多肽，以及 任何合適的賦形劑。
在一個特定實施方式中，從所述組合物中去除內毒素，所述組合物包 括具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的多肽，或者與SEQ IDNO:2所示 的氨基酸序列具有至少50%，優選70%，更優選90%的同一性的多肽。
本發明創傷治療劑和創傷治療組合物的一個主要優點是加快愈合速 率且受損組織恢復得非常接近天然組織。
此外，本發明人指出本發明的創傷治療劑和創傷治療組合物在體外刺 激內皮細胞遷移中特別有效。蛋白156A似乎也在創傷愈合方面起著全面 作用，不僅限于對血管生成的單純刺激，還有對包括真皮和表皮細胞的再 生的創傷修復過程的廣泛刺激。
本發明還涉及一種用于人體或動物體創傷治療方法的創傷治療組合 物，其包括具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽，或者與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少50%，優選70%，更優選90%的同一性 的多肽。
在一個特定實施方式中，如上所述的創傷治療組合物，包括至少兩種 活性物質，其中一種是具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽，或者 與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少50%，優選70%,更優選90% 的同一性的多肽。在另一個實施方式中，另一種活性物質是止血活性物質、 生長因子、抗感染物質、鎮痛物質、抗炎物質，或者其組合。
在另一個實施方式中，本發明的創傷治療組合物為適于局部、全身、 口服、皮下、透皮、肌內或者腹膜內給藥的劑型。
適于局部給藥的劑型包括液體、軟膏、乳膏、凝膠、水凝膠、糊劑、 發膏劑、擦劑、乳液、洗劑、乳劑、噴霧劑、氣霧劑、洗眼劑、滴劑、粉 末。
適于全身給藥的形式包括注射液和栓劑。
適于口服給藥的形式包括可飲用懸浮液、糖漿劑、片劑、膠囊、丸劑。
根據本發明，在如上所述的創傷治療組合物中，所述多肽占總重的o.oi
6到90%,優選占總重的0.1%到10%，更優選占總重的1%到5%。
在一個特定實施方式中，本發明的組合物為液體劑型，其中活性多肽 的量為0.01 mg/mL到5 mg/mL，優選為0.1 mg/mL到1 mg/mL，更優選為 約0.5 mg/mL。
本發明中"組合物"的含義包括藥學(包括皮膚病學)的組合物和化妝 品組合物。
術語"合適的賦形劑"，包括公知的原料例如動物和植物油、礦物油、 合成油、酯油、蠟、線性高級醇、脂肪酸、表面活性劑、磷脂、膠凝劑和 /或增稠劑、醇、多元醇(包括甘油和丙二醇)、填充劑例如粘土礦物、超 細粉、防腐劑、香料、色素和純凈水。該術語還包括多糖，例如甘露聚糖、 葡甘聚糖、半乳甘露聚糖，fucomannans、蛋白多糖、葡糖胺糖、甲殼素、 chitomannans。申請人還提到本發明不限于以上所列的賦形劑。本領域技 術人員能夠選擇適于特定給藥劑型的最佳賦形劑。
在第四個方面，本發明還涉及創傷治療醫療器械，包括如上所述的創 傷治療劑或者創傷治療組合物。
在一個優選的實施方式中，醫療器械采用敷料、繃帶、透皮醫療器械、 藥物控釋醫療器械，或者藥物洗脫支架的形式。
屬于本發明含義的合適敷料是(但不限于)水膠體敷料、hydrocdlular 敷料、海藻酸鹽敷料、水凝膠敷料、基于殼聚糖的敷料、纖維素衍生物敷 料以及用于創傷保護和修復的任何其他類型的敷料。
"透皮醫療器械"是指用于物質通過透皮過程緩慢釋放的器械，例如貼片。
"藥物洗脫支架"，又稱為"涂層"或者"含藥"支架，是指涂有活 性物質"蛋白156A"的支架。
本發明還涉及如上所述的創傷治療劑、創傷治療組合物、或者創傷治 療醫療器械用于治療急性創傷和/或慢性創傷的用途。
本發明還涉及具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽，或者與 SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少50%,優選70°/。，更優選90%的
同一性的多肽在制備治療急性創傷和/或慢性創傷的藥物組合物中的用途。 基本上，根據造成創傷的物體，急性創傷可以分為不同類型。例如，切口或者切割傷、撕裂傷、擦傷和輕擦傷、燒傷、物體例如釘子或者針刺 入皮膚造成的刺傷、物體例如匕首插入身體造成的穿透傷、子彈或者類似 彈丸進入或者穿過身體造成的槍傷。急性創傷也可能是閉合傷，例如鈍挫 傷或者挫傷、血腫、大或者極大的力長時間作用造成的擠壓傷。其他急性 創傷由皮膚病例如牛皮癬、痤瘡和濕疹造成。
另一種可以用本發明治療的創傷類型是慢性創傷。常見的慢性創傷是 靜脈性潰瘍，通常在腿上發病并主要影響老人；糖尿病潰瘍，這是慢性創 傷的另一個主要原因；壓瘡，常見發病于患有疾病例如癱瘓的人中，癱瘓 阻礙了經常受壓的身體部分例如腳后跟、肩胛骨和骶骨的運動；角膜潰瘍， 最常見的是由細菌、病毒、真菌或者變形蟲的感染引起；和消化道潰瘍。 其他類型的慢性創傷可由例如缺血和輻射中毒引起。


現在將參照下列非限制性實施例進一步說明本發明。 圖1A和1B:體外創傷試驗后的HUVEC內皮細胞圖。損傷后，細胞 與VEGF和FGF2 (1A)或者與VEGF、 FGF2和蛋白156A(1B)培養。 圖2A:裸鼠的傷口圖。
圖2B:局部施用載體溶液48小時后，裸鼠中的傷口圖。 圖2C:局部施用蛋白156A48小時后，裸鼠中的傷口圖。 圖3A:施用載體96小時后，4只受傷小鼠的圖。 圖3B:施用蛋白156A96小時后，4只受傷小鼠的圖。 圖4:家豬后背兩道透皮平行的傷口圖。
圖5:在施用載體溶液(對照為"C")或者蛋白156A (測試為"T") 數小時后，兩道透皮平行的傷口圖。
圖6:在施用載體溶液(對照為"C")或者蛋白156A (測試為"T") 3周后，兩道透皮平行的傷口圖。
圖7A:施用載體溶液5天后取樣的傷口剖面圖。
圖7B:施用蛋白156A5天后取樣的傷口剖面圖。
具體實施方式
實施例l:重組蛋白156A的制備
蛋白156A是一種重組蛋白，對應基因156編碼的完整蛋白。蛋白156A 在大腸桿菌B121(DE3)pLys中表達，用8M尿素從細菌細胞中提取，并利 用液相色譜法在金屬離子(Ni)螯合柱上純化。用SDS-PAGE控制純化重 組蛋白156A的純度，并顯示超過65%。使用前，利用Endo-Tmp柱
(Phamacia)從包含純化蛋白156A的溶液中去除內毒素，并進行檢測。 純化的無內毒素重組蛋白156A保存于包含2M尿素、150mM NaCI和 O.lmM CaCl2的Tris-HCl (pH7.5)緩沖溶液中。
實施例2:蛋白156A在體外對內皮細胞遷移的刺激作用 利用稍加修改的Sato和Rifkin (J Cell Biol. 1988; 107: 1199)描述的創 傷檢測法測定細胞遷移。在生長培養基EGM-2MV (Cambrex)中生長的 HUVEC種于24孔板，每孔80 000個細胞，500^1生長培養基，37"C下在 包含5% C02的潮濕空氣中生長到匯合。細胞用塑料尖頭只刮出一條線。 損傷后，培養基換成添加500nM (15嗎.mL-l)蛋白156A (測試，圖1B) 或者不添加蛋白156A (對照，圖1A)的新鮮培養基。培養18小時后， 倒置顯微鏡下(Analysis, Olympus, Rungis, France)對細胞進行觀察和拍照。 圖1A顯示培養18小時后，對照條件下(只有生長培養基)傷口仍然 存在。
圖1B顯示培養18小時后，測試條件下(生長培養基+蛋白156A)傷 口完全愈合。
因為內皮細胞遷移是新生血管和創傷修復的一個重要特征，因此蛋白 156A是創傷愈合的一個潛在的治療關鍵物。
實施例3:蛋白156A在Swiss裸鼠體內的愈合活性的預試驗 兩只動物通過腹腔注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(80mg/kg — 12mg/kg; Ref. K-113, Sigma, France)進行麻醉，然后在每只小鼠的右脅用0.5/10刀 片進行透皮損傷(長lcm，深大約1到2mm，參見圖2A)。受傷后10分 鐘在動物傷口上局部施用20(VL載體溶液(Tris-HCI pH 7.5， 2M尿素, 150mMNaCl， O.lmM CaCl2)或者測試溶液(載體+0.5mg.mL"蛋白156A)。局部施用后48小時對創傷愈合的檢測顯示蛋白156A治療的傷口 (參 見圖2C)完全愈合，而載體治療的傷口 (參見圖2B)仍沒有愈合，仍保 持廣泛開放。
實施例4:蛋白156A在Swiss裸鼠體內的愈合活性的試驗 按照實施例3麻醉8只健康雌性Swiss裸鼠。利用0.5/10刀片在每只 小鼠的右脅造成兩個透皮傷口，每個lcm長，大約l到2mm深。
第1天，動物受傷后10分鐘，8只動物被隨機分成兩組，每組4只小
鼠。所有治療都通過局部施用來實現。治療計劃概述在表l中。
組動物數目治療治療劑量
14載體0
24蛋白156A0.5mg.mL-l
表1
受傷后10分鐘，在各傷口上局部施用200pL載體溶液(Tris-HCl pH 7.5, 2M尿素，150mMNaCl， 0.1mMCaCl2)對組1的小鼠進行治療。
受傷后10分鐘，在各傷口上局部施用200pL測試溶液(Tris-HCl pH 7.5, 2M尿素，150mMNaCl， O.lmM CaCl2， 0.5mg.mL"蛋白156A)對組2的小
鼠進行治療。
在用載體或者測試溶液治療96小時后，對傷口進行拍照。
圖3A:載體施用96小時后組1小鼠的圖片。
圖3B:蛋白156A施用96小時后組2小鼠的圖片。
如圖3的圖片所示，局部施用96小時后傷口愈合的檢測顯示蛋白156A 治療的傷口完全愈合(組2，圖3B)，而載體治療的傷口 (組l，圖3A) 還沒愈合，仍保持廣泛開放。
實施例5:蛋白156A在豬模型體內愈合活性的試驗 皮膚創傷愈合活性
家豬通過肌肉注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(10mg/kg-2mg/kg IM)進行
麻醉，然后切出兩條均深入皮下組織的平行縱向透皮傷口 (圖4)。
受傷后IO分鐘在動物傷口上局部施用5mL載體溶液(Tris-HCl pH 7.5，
102M尿素，150mMNaCl， O.lmM CaCl2，對照側"C")或者測試溶液(載體 十0.5mg.mL"蛋白156A,測試側"T")。
在緊接著手術后的階段，對兩個傷口的觀察顯示顯著的差異。手術后 幾小時測試側"T"就出現疤痕(圖5)。后來的疤痕持續兩周，然后脫落。 根據肉眼可見的創傷表面判斷，疤痕下的愈合似乎正常。3周后，傷口光 滑/平整并且較薄(圖6)。對照側"C"的疤痕在兩天后才形成。對照傷 口的表層較不平整，最后變得更厚、更皺縮。
角膜創傷愈合活性
通過肌肉注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(10mg/kg， 2mg/kg IM)麻醉家豬， 然后獲得角膜表層劃痕。
受傷后IO分鐘在劃痕處局部施用lmL載體溶液(Tris-HClpH7.5， 2M 尿素，150mMNaCl， O.lmM CaCl2，對照側)或者測試溶液(載體+0.5mg.mL—1 蛋白156A,測試側)。
第2天處死動物，對組織取樣。
在治療和未治療區域均觀察到睫狀突的水腫。但是，雖然在未治療區 無潰瘍的角膜上皮細胞由于劇烈水腫而側向剝離，這種水腫實際不存在于 治療區。
實施例6:治療和未治療的皮膚創傷的組織學分析
通過肌肉注射氯胺酮-二甲苯胺噻嗪(10mg/kg, 2mg/kg IM)麻醉家豬， 然后切出兩條均深入皮下組織的平行縱向透皮傷口 (圖4)。
受傷后10分鐘在動物傷口上局部施用5mL載體溶液(Tris-HCl pH 7.5, 2M尿素，150mM NaCl， O.lmM CaCl2，對照側)或者測試溶液(載體+ 0.5mg.mL"蛋白156A，測試側)。
第5天處死動物，對對照傷口和測試傷口區域取樣。對福爾馬林固定 的石蠟包埋塊進行處理，制備來自取樣區域的連續5個顯微剖面用于常規 HES染色。
在未治療動物中(圖7A)，結果顯示，受傷后第5天，傷口仍然貫穿 到皮下深層，而在治療組中(圖7B)，邊緣的接近涉及所有皮膚層(真 皮和表皮)。
ii這些不同的試驗表明治療傷口和未治療傷口間存在顯著的區別。測試
傷口 (經蛋白156A治療)的愈合在所有時間都是更快、更薄以及更平整 和完全的。傷口的最終美觀方面也更好。該分子還在角膜潰瘍的實驗模型 中顯示較強的活性。序列表
<110>基因信號國際公司 <120>創傷愈合劑和組合物
<I30> BEP
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211> 2153
<22〉 鵬
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1 caaagagacaaacactgatg貼gccgctaatgacaatatg gcagttcgccccaaagagcg60
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權利要求
1、一種用于治療創傷的創傷治療組合物，包含一種多肽和任何合適賦形劑，所述多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO2所示的氨基酸序列具有至少70％，優選90％的同一性。
2、 一種用于人體或動物體創傷治療方法的創傷治療組合物，包含一種多肽，所述多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%，優選90%的同一性。
3、 如權利要求l-2所述的創傷治療組合物，包括至少兩種活性物質，其中一種是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽，或者與SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%，優選90%的同一性的多肽。
4、 如權利要求3所述的創傷治療組合物，其特征在于另一種活性物質是止血活性物質、生長因子、抗感染物質、鎮痛物質、抗炎物質或者其組合。
5、 如權利要求1-4任一所述的創傷治療組合物，其是適于局部、全身、口服、皮下、透皮、肌內或者腹膜內給藥的劑型。
6、 如權利要求5所述的創傷治療組合物，其特征在于所述適于局部給藥的劑型包括乳膏、凝膠、糊劑、發膏劑、擦劑、乳液、洗劑、乳劑、噴霧劑、洗眼劑、滴劑、粉末。
7、 如權利要求5所述的創傷治療組合物，其特征在于所述適于全身給藥的劑型包括注射液和栓劑。
8、 如權利要求5所述的創傷治療組合物，其特征在于適于口服給藥的劑型包括可飲用懸浮液、糖漿劑、片劑、膠囊、丸劑。
9、 如權利要求1-8所述的創傷治療組合物，其特征在于所述多肽占總重的0.01到90%,優選占總重的0.1°/。到10%，更優選占總重的1%到5%。
10、 一種創傷治療醫療器械，包含權利要求l-9所述的組合物。
11、 如權利要求10所述的創傷治療醫療器械，其是敷料、繃帶、透皮醫療器械、藥物控釋醫療器械，或者藥物洗脫支架的形式。
12、 一種多肽在制備治療急性創傷和/或慢性創傷的藥物組合物中的用途，所述多肽具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%,優選卯％的同一性。
13、 如權利要求12所述的用途，其特征在于所述急性創傷包括切口、撕裂傷、擦傷、刺傷、穿透傷、鈍挫傷、血腫、擠壓傷。
14、 如權利要求12所述的用途，其特征在于所述慢性創傷包括由靜脈性潰瘍、糖尿病潰瘍、壓瘡、角膜潰瘍、消化道潰瘍、缺血、輻射中毒和皮膚病例如牛皮癬、痤瘡和濕疹造成的創傷。
全文摘要
本發明涉及用于治療創傷的創傷治療劑和組合物，包括具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽，或者與SEQ ID NO2所示氨基酸序列具有至少50％，優選70％，更優選90％同一性的多肽。
文檔編號A61L15/32GK101507811SQ200810085678
公開日2009年8月19日 申請日期2008年2月13日 優先權日2007年2月9日
發明者薩勒曼·阿勒-馬哈茂德, 西爾維·科蘭 申請人:基因信號國際公司