專利名稱：一種抑制肝癌細胞生長的短肽系列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術醫藥領域，本發明更具體涉及了一種抑制肝癌細胞生長的短肽系列 及其應用。
技術背景在癌癥發生與治療的過程中，化學治療一直屬于主體部分。現有的臨床使用的化療藥物， 如環磷酰胺、順鉑、阿糖胞苷、阿霉素和長春新堿等，它們主要是用來破壞細胞的周期的， RNA、 DNA和蛋白質都是此類藥物的靶向目標。這些化療藥物，其本身都有自己的毒性，不管 是一種化療藥物單獨使用還是幾種化療藥物結合運用在臨床治療上，其在對癌癥有明顯療效， 殺傷殺死癌細胞的同時，也會損害病人的正常細胞。化療藥物的副作用最普遍的就是對病人 的骨髓產生極度抑制，造成病人的極大痛苦，甚至引起死亡。到目前，除了早發現癌癥病情 并實行手術切除腫瘤包塊外，對于已經擴散的腫瘤仍沒有特效藥物去治療[Cancer Biology癌 生物學，R.J.B金著，劉以訓主譯，科學出版社，2002]，現有臨床上用于癌癥治療的藥物 大都是化合物，而短肽在癌癥方面的直接治療上的應用尚無文獻報道。 發明內容本發明目的是針對上述問題，提供一種抑制肝癌細胞生長的短肽系列及其應用。本發明的一種抑制肝癌細胞生長的短肽，其特征在于組成短肽的氨基酸主序列〈1〉和編 碼短肽的核苷酸主序列〈2〉如下<1> J-Val-B-Trp-0-Arg其中，J代表氨基酸Pro, Asn或His; B代表氨基酸Ser或Gin; 0代表氨基酸Leu或Thr; <2> caq gtt或gtc或gta或gtg gam tgg ctn cgt或cgc或cgg或cga 其中，H代表核苷酸G,A或C; Q代表核苷酸G，T或C; M代表核苷酸A或G; N代表核苷酸C， A， G或T;所述短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對 應的氨基酸。本發明的抑制肝癌細胞生長的短肽片段，其氨基酸主序列具有與該短肽氨基酸主序列》 70%的相同性，》90%的相似性，片段為把所述的6個氨基酸的序列從任意位置截取成3個 或4個或5個氨基酸組成的與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。本發明的抑制肝癌細胞生長的短肽類似物具有與所述短肽相同的生物活性，所述類似物 是指在用所述短肽和另一種化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白質。本發明的抑制肝癌細胞生長的短肽衍生物，其氨基酸序列具有與短肽氨基酸主序列》 70%的相同性，》90%的相似性，該衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一個或者 幾個氨基酸的某個基團用另外的基團取代后與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。本發明的抑制肝癌細胞生長的短肽變體，其氨基酸序列具有與短肽氨基酸主序列》70% 的相同性，》90%的相似性，該變體是指一種具有一個或幾個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸 序列或編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中間的任 一位置缺失、插入或替換氨基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基酸或核苷酸。本發明的短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有 治療人實體腫瘤癌細胞增殖的肝癌癌細胞無限增殖引發的一切癌癥、診斷與檢測癌癥的發生 以及癌癥發生的惡性程度藥物的應用。本發明的短肽或核苷酸用于制備具有作為蛋白酶抑制劑或者促進劑或者親和試劑的藥物 或者檢測試劑的應用。本發明的顯著優點是本發明的短肽來自于運用生物信息學的方法把國際蛋白質數據庫 的蛋白進行序列比對，篩選出來的一種新型的具有活性功能的生物活性肽，運用本發明的短 肽抑制或殺傷癌細胞的同時對正常細胞無顯著傷害作用，解決了現有癌癥藥物在抑制或殺死 癌細胞的同時對人體正常細胞也有嚴重傷害的缺陷。
具體實施方式
短肽的制備方法采用化學合成的方法，即本領域熟知的已經非常成熟的固相肽合成方法， 既可以采用Boc方法也可以采用Fmoc方法。具體做法就是將被保護的氨基酸逐個偶聯到惰性 固相載體上去，然后利用強酸將肽鏈從載體上裂解下來，同時去除側鏈保護。短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對應的氨基 酸，例如，在J位置的氨基酸有3種Pro， Asn或His，此3種氨基酸都可以單一地安放在〈1〉 中J的位置上，不管選擇其中任何一種，該短肽仍具有其原有的生物活性，即抑制惡性肝腫 瘤細胞增長，同樣地B和0所代表的位置的氨基酸也有如此特性。核苷酸采用人工合成方法制備；編碼短肽的核苷酸包含下組中的一種(a) 編碼具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、類似物、衍生物或其變體的核苷酸；(b) 與(a)所述核苷酸互補的核苷酸；(c) 與(a)或(b)中所述核苷酸有》75%相同性的核苷酸；該核苷酸基本由編碼具有〈1〉氨基酸序列短肽的核苷酸組成，本發明的核苷酸序列包括〈2〉中的核苷酸序列，其形式為DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的也可 以是雙鏈的。編碼短肽的編碼區序列可以和〈2〉中的核苷酸相同，也可以不同，稱為變異體， 其中變異體是指具有編碼〈1〉中的氨基酸序列的編碼，但可以和〈2〉中的核苷酸不同。變異體 可以是一個或幾個核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸序列，但不會改變編碼〈1〉中氨基酸序列 的短肽的活性功能。該短肽或核苷酸的"變體"是指一種具有一個或幾個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列 或編碼它的核苷酸序列。改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插 入、添加或替換。變體可具有"保守性"改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的 結構或化學性質，也可以有"非保守性"改變，其中替換的氨基酸不具有與原氨基酸相類似 的結構或化學性質。"缺失"是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個或幾個氨基酸或核苷酸的 缺失；"插入"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中間任意位置插入一個或幾個氨基酸；"添 加"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一個或幾個氨基酸；"替換"是指用不 同的氨基酸或核苷酸替換一個或幾個氨基酸或核苷酸。該短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有抑制與 治療包括但不限于下述疾病的藥物的用途1.實體腫瘤癌癥肝癌以及其他的惡性細胞增殖類型的癌癥疾病。在計算短肽片段、短肽衍生物和短肽變體的氨基酸主序列具有與短肽氨基酸主序列的相 同性和相似性時，"相同性百分率"是指兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同的百 分率。根據Cluster法(Higging D. G. & Sharp P. M. ， Gene 1988， 73:234-237 )通過檢査 所有配對之間的距離將各組序列排列成簇，然后將各簇以成對或成組分配。兩個氨基酸序列 如序列A和序列B之間的相同性百分率通過下式計算_序列A與序列B之間匹配的殘基個數X 100%序列A的殘基個數_序列A中間隔的殘基個數-序列B中間隔的殘基個數 "相似性"是指在確定兩條氨基酸序列比對中相同氨基酸序列位置確定后，在相同氨基 酸之間排列的對應的氨基酸的保守性取代程度。根據生物信息技術領域周知的氨基酸得分PAM 250 scoring matrix (Dayhoff, M. Schwartz, R. M. and Orcutt, B. C. Atlas of Protein Structure 1978, 345-352; DeLisi, C. and Kanehisa, M. Mathematical Biosciences 1984.69: 77-85; Schwartz, R. M. and Dayhoff, M. O. Atlas of Protein Structure, 1979. 353-358)，當相對應的不同氨基酸比 較得分》0時，該兩個氨基酸相似；當不同氨基酸得分<0時，兩個氨基酸不相似。兩個氨 基酸序列如序列C和序列D之間的相似性百分率通過下式計算(序列C與序列D之間匹配的殘基個數+序列C與序列D之間相似的殘基個數)X 100% 序列C的殘基個數-序列C中間隔的殘基個數-序列D中間隔的殘基個數 其中，序列C中間隔的殘基個數和序列D中間隔的殘基個數都不包括相似氨基酸的個數。下面結合實施例，進一步闡述本發明。這些實施舉例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列所有列舉實施例所涉及的所有合成短肽都具有本發明涉及的藥物功能而不 限于所列舉功能。實施例l抑制肝癌細胞的試驗(合成本發明涉及的短肽Pro-Val-Ser-Trp-Leu-Arg)人肝癌細胞系H印g2細胞的培養是用含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養基來培養， 以5Xl()5/孔的細胞密度種植入96孔細胞板，24小時后，把本發明涉及的短肽按照不同的濃 度加入到細胞培養板中，以等體積的PBS為對照組，24、 48、 72小時后用MTT方法檢驗活細 胞成活率，給藥組和對照組比較，獲得肝癌細胞的抑制率可達71%。實施例2抑制肝癌細胞的試驗(合成本發明涉及的短肽Pro-Val-Ser;^Trp-Leu-Arg)人肝癌細胞系Bel-7402細胞的培養是用含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養基來培 養，以5乂105/孔的細胞密度種植入96孔細胞板，24小時后，把本發明涉及的短肽按照不同 的濃度加入到細胞培養板中，以等體積的PBS為對照組，24、 48、 72小時后用MTT方法檢驗 活細胞成活率，給藥組和對照組比較，獲得肝癌細胞的抑制率可達75%。核苷酸或氨基酸序列表 〈110〉福州大學<120>—種抑制肝癌細胞生長的短肽系列及其應用<160〉 17<210〉 1<211〉 6<212〉 PRT<213〉人工序列<220>〈223> J代表氨基酸Pro, Asn或His; B代表氨基酸Ser或Gin; 0代表氨基酸Leu或Thr <400> 1J-Va卜B-Trp-O-Arg<210> 2 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 2caq gtg gam tgg ctn cgs〈210> 3 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c， a， g或t〈400> 3caq gtg gam tgg ctn egg<210> 4 〈211> 18 〈212> DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 4caq gtg gam tgg ctn cgc<210> 5 <211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; ra代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 5caq gtg gam tgg ctn cgt〈210> 6 〈211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 6caq gta gam tgg ctn cga〈210> 7 〈211〉 18 〈212〉薩 〈213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400〉 7caq gta gam tgg ctn egg〈210〉 8 〈211〉 18 <212>畫 〈213〉人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 8caq gts gam tgg ctn cgc〈210〉 9 〈211〉 18 〈212〉腿 〈213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 9caq gta gam tgg ctn cgt<210〉 10 〈211〉 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400〉 10caq gtc gam tgg ctn cga〈210〉 11 <211〉 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 11caq gtc gam tgg ctn egg〈210〉 12 〈211〉 18 <212〉 ■ <213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 12caq gtc gam tgg ctn cgc〈210〉 13 〈211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c,a， g或t 〈400> 13caq gtc gam tgg ctn cgt<210〉 14 〈211〉 18 <212> ■ <213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 14caq gtt gam tgg ctn cga〈210〉 15 〈211〉 18 〈212>腿 〈213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 15caq gtt gam tgg ctn egg 〈210〉 16〈211〉 18 〈212>醒 <213>人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 16caq. gtt gam tgg ctn cgc<210> 17 〈211〉 18 〈212>薩 <213>人工序列 〈220〉〈223〉 h代表核苷酸g, a或c; q代表核苷酸g， t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 2caq gtt gam tgg ctn cgt
權利要求
1.一種抑制肝癌細胞生長的短肽，其特征在于組成短肽的氨基酸主序列<1>和編碼短肽的核苷酸主序列<2>如下<1>J-Val-B-Trp-O-Arg其中，J代表氨基酸Pro，Asn或His；B代表氨基酸Ser或Gln；O代表氨基酸Leu或Thr；<2>CAQ GTT或GTC或GTA或GTG GAM TGG CTN CGT或CGC或CGG或CGA其中，H代表核苷酸G，A或C；Q代表核苷酸G，T或C；M代表核苷酸A或G；N代表核苷酸C，A，G或T；所述短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對應的氨基酸。
2. —種如權利要求1所述的抑制肝癌細胞生長的短肽片段，其特征在于短肽片段的氨基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述片段為把 所述的6個氨基酸的序列從任意位置截取成3個或4個或5個氨基酸組成的與所述短肽 具有同樣生物活性的短肽。
3. —種如權利要求1所述的抑制肝癌細胞生長的短肽類似物，其特征在于所述短肽類似 物具有與所述短肽相同的生物活性，所述類似物是指在用所述短肽和另一種化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質而形成具有生物活性的多fik序 列或蛋白質。
4. 一種如權利要求1所述的抑制肝癌細胞生長的短肽衍生物，其特征在于所述短肽衍生 物的氨基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述 衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一個或者幾個氨基酸的某個基團用另外的 基團取代后與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。
5. —種如權利要求1所述的抑制肝癌細胞生長的短肽變體，其特征在于所述短肽變體的氨基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述變體 是指一種具有一個或幾個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中間的任一位置缺失、插入或替換氨 基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基酸或核苷酸。
6. 根據權利要求l、 2、 3、 4或5所述的一種抑制肝癌細胞生長的短肽，其特征在于所述編碼短肽的核苷酸包含下組中的一種(a) 編碼具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、類似物、衍生物或其變體的核苷酸；(b) 與(a)所述核苷酸互補的核苷酸；(c)與(a)或(b)中所述核苷酸有》75y。相同性的核苷酸； 所述核苷人工合成方法制備。
7. 根據權利要求6所述的抑制肝癌細胞生長的短肽，其特征在于所述的短肽采用化學合 成方法制備；所述核苷酸采用人工合成方法制備。
8. —種如權利要求l、 2、 3、 4或5所述的抑制肝癌細胞生長的短肽的應用，其特征在于 所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有治療 實體腫瘤人肝癌癌細胞無限增殖引發的癌癥、診斷與檢測肝癌癥的發生以及癌癥發生的 惡性程度藥物的應用。
9. 一種如權利要求6所述的抑制肝癌細胞生長的短肽的應用，其特征在于所述核苷酸用 于制備具有治療人實體腫瘤癌細胞增殖的肝癌癌癥、診斷與檢測肝癌癥的發生以及癌癥 發生的惡性程度藥物的應用。
10. —種如權利要求6所述的抑制肝癌細胞生長的短肽的應用，其特征在于所述短肽或核苷酸用于制備具有作為蛋白酶抑制劑或者促進劑或者親和試劑的藥物或者檢測試劑的應 用。
全文摘要
本發明提供一種抑制肝癌細胞生長的短肽系列及其應用，該短肽的短肽片段、類似物、衍生物、變體的氨基酸主序列具有與該短肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性；短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有治療治療人實體腫瘤癌細胞增殖的肝癌癌癥、診斷與檢測癌癥的發生以及癌癥發生的惡性程度藥物的應用，短肽或核苷酸用于制備具有作為蛋白酶抑制劑或者促進劑或者親和試劑的藥物或者檢測試劑的應用。該技術能夠解決現有癌癥藥物在抑制或殺死癌細胞的同時對人體正常細胞也有嚴重傷害的缺陷。
文檔編號A61K48/00GK101235079SQ200810070699
公開日2008年8月6日 申請日期2008年3月4日 優先權日2008年3月4日
發明者昊 李, 饒平凡 申請人:福州大學