專利名稱：南瓜蛋白在制備治療慢性粒細胞白血病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及南瓜蛋白在制備治療慢性粒細胞白血病藥物中的應用，尤其 涉及南瓜蛋白與酪氨酸激酶抑制劑聯合應用治療慢性粒細胞白血病的用途。
背景技術：
慢性粒細胞白血病(CML)是造血干細胞惡性克隆增生性疾病，發病率 占成人白血病的15% 20%。 950/。CML患者具有特征性的Ph染色體，即9號染 色體abl原癌基因轉移到22號染色體的bcr斷裂聚集區，形成bcr-abl融合基因， 其編碼的BCR-ABL蛋白具有很強的酪氨酸激酶活性，可通過干擾正常細胞信 號傳導，刺激粒細胞異常增殖并抑制其凋亡，是CML發病的分子基礎。因此， 靶向于該融合基因及其表達產物已成為CML治療的重要策略。STI571 (甲磺 酸伊馬替尼，imatinib)是人工合成的BCR-ABL酪氨酸激酶特異性抑制劑，治 療CML具有細胞遺傳學緩解效果，是近來公認的治療CML的有效藥物，但其 對CML急變患者的療效仍不理想，并且單用STI571治療容易出現耐藥，導致 治療失敗。因此，繼續尋找治療CML的更為有效的新藥，尤其是能與STI571 產生協同作用或逆轉其耐藥性的藥物與治療方案仍是CML治療的迫切任務與 研究熱點。
從理論上講，STI571等酪氨酸激酶抑制劑僅影響BCR-ABL蛋白的功能， 而不能抑制該融合蛋白的表達，從而在治療上存在缺陷。因此，開發抑制 BCR-ABL蛋白表達的藥物無疑是治療CML的更為有效的途徑，也將是克服 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的主要措施。抑制BCR-ABL蛋白表達可以通過封 閉bcr- abl DNA、千擾bcr- abl mRNA及抑制bcr-abl翻譯等環節實現。前兩 種方法，因技術條件限制，可能在未來很長一段時間內仍無法應用于臨床； 目前也尚未有BCR-ABL蛋白合成的特異性抑制劑。而抑制蛋白生物合成的 一類活性物質一核糖體失活蛋白(ribosome畫inactivating protein, RIP)有可能在 翻譯環節下調BCR-ABL蛋白，值得關注。
核糖體失活蛋白廣泛存在于高等植物中，通常按結構不同分為兩型1 型RIP為單鏈蛋白，如天花粉蛋白(TCS)，在植物RIP中占多數；2型RIP是通 過二硫鍵連接的雙鏈蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。 2型RIP的A鏈與1型RIP— 樣，是一類RNAN-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷酶，能專一地水解真核細胞 核糖體28S rRNA第4324位上的腺嘌呤堿基與核糖之間的N-C糖苷鍵，釋放出一個腺嘌呤堿基，從而阻遏了延長因子與核糖體的結合，抑制蛋白質的生
物合成，具有抗生育、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學活性。由于2型RIP的B 鏈具有凝集素的功能，可識別正常細胞表面的D-半乳糖，因而有很大的毒性， 限制了其在人體內的應用。而1型RIP由于不具有B鏈，對人體的毒性較小， 作為抗腫瘤藥物更具應用前景。
南瓜蛋白(cucuraiosin， CUS)是從南瓜瓜瓤中提取的新的l型核糖體失 活蛋白，為堿性單肽鏈糖蛋白。我們測定了其氨基酸序列和DNA順序，培養 出單晶并測定了其結構(Chen MH, Ye XM， Cai JH, et al. Crystallization and preliminary crystallographic study of cucurmosin ,a ribosome-inactivating protein from the sarcocarp of cucurbita moschata[J]. ^cta OyM,2000, D56:665-666; Shi XL, Zhou EX，Ye XM， et al. Molecular replacement studies of cucurmosin from Ct/cwrZ)"a woscAa a:structure homology with trichosanthin[J].C7n.wese /iSVrwcf Ozew, 2003,22:165-168;陳明晃,葉曉明.一種多肽一具有南瓜蛋白的N端順序 的多肽[P].中國,發明專利，03135045.3, 2003-09-29;陳明晃,謝捷明,等.南瓜蛋 白及其編碼基因[P].中國，發明專利，200710008402.6, 2007-01-10)。我們前期 的研究表明南瓜蛋白具有RNA N-糖苷酶活性，能顯著抑制多種腫瘤細胞增 殖及誘導凋亡(謝捷明,陳明晃,等.南瓜蛋白在制藥中的應用[P].中國,發明專 利，200510119741.2,2005-11-03)，尤其對人CML細胞K562 (Ph+)的作用強， 活性比同類的天花粉蛋白強4-7倍，而對人正常肝細胞株和外周血淋巴細胞的 抑制作用較小，表現出明顯的選擇性。近期我們還發現南瓜蛋白能明顯下調 K562細胞的BCR-ABL蛋白(P21 據此，我們推測南瓜蛋白與STI571聯合 應用，可從蛋白表達水平和蛋白酪氨酸激酶活性兩方面雙重抑制BCR-ABL蛋 白，從而產生協同抗CML作用。
發明內容
本發明的目的是通過研究南瓜蛋白與酪氨酸激酶抑制劑的聯合應用時的 抗慢性粒細胞白血病活性，提供南瓜蛋白在制備治療慢性粒細胞白血病藥物 中的應用
本發明的發明人的研究表明，南瓜蛋白與BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑聯 用時，對慢性粒細胞白血病細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用均明顯增強，具 有協同作用。因而，南瓜蛋白可與酪氨酸激酶抑制劑聯合用于治療慢性粒細 胞白血病。
具體實施例方式
下面用具體的實施例來說南瓜蛋白聯合酪氨酸激酶抑制劑對慢性粒細胞 白血病細胞的作用。下列實施例只用于說明本發明，而對本發明的保護范圍 無任何限制作用。
實施例1:南瓜蛋白聯合STI571對K562細胞的抑制作用
方法取對數生長期的K562細胞，接種于96孔培養板上，每孔接種量 6xl03/120pL。實驗組分CUS組(2和4mg/L)、 STI571組(0.05、 0.1、 0.2和 0.4pmol/L)及CUS+STI571組(上述不同濃度的CUS和STI571的聯合)，每孔 加20pL，設4個復孔；陰性對照組每孔加等量溶劑，設8個復孔，空白對照孔 加營養液140nL,用于儀器調零。置5%(302、 37'C培養72h,每孔加5mg/mL 的MTT 10pL，繼續培養4h，每孔加裂解液(10%SDS， 5%異丁醇，用HCL 調至pH4.5) 140pL， 37。C放置24h，用酶標儀測定各孔的吸光度"57。)值。 計算聯合用藥指數(CDI)。 CDI-Sa+b/CSaX^)， 5"a+b表示藥物聯合作用組細胞 的存活部分與陰性對照的比值，SA和^分別代表A藥和B藥單獨使用組細胞的 存活部分與陰性對照的比值;CDK1、CDI二1和CDI〉1分別表示兩藥有協同、 相加和拮抗作用，當CDK0.75時，表示兩藥協同作用非常顯著。 結果見表l
表1不同濃度南瓜蛋白聯合STI-571對K562細胞的抑制作用(；±^ ，n
=4)
STI-57102(mg/L)4(mLg/L)
(|xmol/L )^570^570CDI^570CDI
01.54±0.080.96±0.07——0.63±0.03——
0.051.51±0.040.73±0.020.780.46±0.010.73
0.11.23±0.020.59±0.020.780.37±0.010.73
0.20.71±0.070.36±0.010.820.20±0.010.70
0.40.38±0.000.16±0.010.660.07±0.010.44
表1顯示，2mg/L和4mg/L南瓜蛋白與不同濃度的STI571均具有協同作用(CDKl)，尤其是4mg/L南瓜蛋白與STI571聯用時，協同作用非常顯 著(CDI<0.75)。
實施例2:南瓜蛋白聯合STI571誘導K562細胞凋亡的作用
方法分別收集經CUS (2和4mg/L)、 STI571 (0.1和0.2 pmol/L)及 CUS+STI571 (上述不同濃度的CUS和STI571的聯合)作用72h的K562細 胞約106， PBS洗滌后，加入預冷(4°C)的70%乙醇，置-20。C固定12h以上， 離心去乙醇，PBS洗滌2次后重懸，以PI溶液(含0.005% PI、 0.1°/。 Triton X-IOO、 0.1mmol'L"EDTA和0.01。/。RNaseA)在室溫避光染色30 min，流 式細胞儀測定凋亡細胞百分率。參照文獻(金正均.合并用藥中的相加.中國藥 理學報,1980;l(2):70-76)計算q值并判斷聯合用藥效果q=Ea+b/(Ea+Eb-EaxEb)， 其中E^為聯合用藥時的凋亡細胞百分率，&和Eb分別為A藥和B藥單用 時的凋亡細胞百分率；q值0.85 1.15為單純相加，U5 2.0為增強，>2.0為 明顯增強。
結果見表2。
表2南瓜蛋白聯合STI571誘導K562細胞凋亡的協同作用
4(mg.I/')^
STI-571 "NO
0
(%)
凋亡率
(%)
q值
凋亡率
q值
00.675.52一13.80一
0.14.1612.101.2846.804.95
0.214.4035.401.8568.803.60
表2顯示，2和4 mg/L南瓜蛋白單用時，K562細胞的凋亡率為分別為 5.52%和13.80%, 0.1和0.2pmol/LSTI571單用時，K562細胞的凋亡率分別 為4.16%和14.40%。 2mg/L南瓜蛋白與0.1和0.2 |amol/L STI571聯用時凋亡 率分別上升到12.10%和35.40% (q值分別為1.28和1.85)，而4mg/L南瓜 蛋白與0.1和0.2 nmol/L STI571聯用時凋亡率分別上升到46.80%和68.80% (q值分別為4.95和3.60)，說明南瓜蛋白具有顯著增強STI571誘導K562 細胞凋亡的作用。
權利要求
1. 南瓜蛋白在制備用于治療慢性粒細胞白血病藥物中的應用。
2. 南瓜蛋白與酪氨酸激酶抑制劑聯合在制備用于治療慢性粒細胞白血病藥物 的應用。
3. 如權利要求2所述的南瓜蛋白與酪氨酸激酶抑制劑聯合在制備用于治療慢性 粒細胞白血病藥物的應用，其特征在于所述的酪氨酸激酶抑制劑包括 BCR-ABL酪氨酸激酶特異性抑制劑和其他新型的酪氨酸、激酶抑審lj齊U 。
4. 如權利要求3所述的南瓜蛋白與酪氨酸激酶抑制劑聯合在制備用于治療慢性 粒細胞白血病藥物的應用，其特征在于所屬的BCR-ABL酪氨酸激酶特異性抑 制劑為甲磺酸伊馬替尼。全文摘要
本發明公開了南瓜蛋白在制備治療慢性粒細胞白血病藥物中的應用。南瓜蛋白與BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑聯用時，對慢性粒細胞白血病細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用均明顯增強，具有協同作用。因而，南瓜蛋白可與酪氨酸激酶抑制劑聯合用于治療慢性粒細胞白血病。
文檔編號A61K45/06GK101496827SQ200810070569
公開日2009年8月5日 申請日期2008年1月31日 優先權日2008年1月31日
發明者謝捷明, 陳明晃 申請人:福建醫科大學;中國科學院福建物質結構研究所