東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物的應(yīng)用，尤其涉及東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)腸癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，結(jié)腸癌的耐藥現(xiàn)象是影響其化療療效和預(yù)后的主要原因之一。為克服腫瘤耐藥，多年來人們對腫瘤的耐藥機制進行了大量的研究。已證實多種腫瘤組織均有NF-xB的高表達，而多種抗癌藥物均可激活NF-kB，NF-kb高表達的腫瘤細胞表現(xiàn)為對化療、射線等介導凋亡的抵抗作用。目前，大量研究已表明NF-kB在炎癥、免疫反應(yīng)、腫瘤等方面發(fā)揮重要作用。在大多數(shù)細胞，當細胞未受刺激時，異二聚體NF-KB以非活性形式存在于細胞質(zhì)，并與抑制蛋白IkB形成夏合物。一旦接受剌激信號，lKBa在lKB激酶(IKK)作用下，其氨基末端Ser32/36磷酸化，隨后該區(qū)Lys21/22泛素化，在蛋白酶體作用下降解，并釋放出NF-KB，后者向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與靶基因的順式調(diào)節(jié)元件KB位點結(jié)合，調(diào)節(jié)這些基因的轉(zhuǎn)錄[22]。基于上述的活化過程，目前抑制NF-kB活化的方法有1.將突變型lKBa基因轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞內(nèi)，使NF-KB釋放障礙。Sumitomo等構(gòu)建了MBa基因N端截短突變的腺病毒重組體(AxlKBaAN)，并將它轉(zhuǎn)入一個分泌多種細胞因子的膀胱癌細胞系KU-19-19細胞中。發(fā)現(xiàn)AxlKBaAN能有效感染該細胞系并持續(xù)表達對NF-KB的抑制作用，且不會被磷酸化及水解，并能抑制KU-19-19細胞的生長及其細胞因子的產(chǎn)生(SumitomoM,TachibanaM，OzuC，etal.Inductionofapoptosisofcytokine—roducingbladdercancercellsbyadenovirus—mediatedIkappaBalphaoverexpression.HumGeneTher,1999，10(1):37-47.)。2.采用封閉NF-KB亞基的反義寡核苷酸，直接抑制其轉(zhuǎn)錄。封閉順式元件上的KB位點，可形成三股螺旋的寡核苷酸(TFO)，能夠特異性地識別雙股螺旋DNA的序列，TFO靶向定位于特定基因的NF-KB的KB位點，可以阻止NF-kB與之結(jié)合，從而抑制NF-kB的活性。3.蛋白酶和蛋白酶體抑制劑化學藥物，如蛋白酶抑制劑、鈣調(diào)節(jié)蛋白酶抑制劑等。抑制26S等蛋白酶小體的功能可以減少IkB的降解，從而阻止NF-kB通路的激活。這類抑制劑以多聚乙醛類為代表，包括MG-101、MG-132和MG-115，它們是通過抑制蛋白酶小體的蛋白酶活性來實現(xiàn)的。4.圈套寡核苷酸即合成與靶基因的形式調(diào)控元件一致的圈套雙鏈寡聚脫氧核糖核苷酸或圈套單鏈寡聚核苷酸或肽核酸，將其轉(zhuǎn)入細胞，它們能在NF-KB轉(zhuǎn)位入核前或入核后與NF-KB競爭性結(jié)合，干擾NF-KB靶基因啟動子順式調(diào)控元件的結(jié)合，故而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。顯然，就目前而言，直接將突變型lKBa基因轉(zhuǎn)移到腫瘤患者體內(nèi)還存在著許多技術(shù)難題尚未克服；反義寡核苷酸治療有可能導致機體一些重要基因功能的喪失；正常情況下，由于蛋白酶體和鈣調(diào)節(jié)蛋白酶等是細胞周期和細胞功能的重要調(diào)節(jié)劑，所以其抑制劑的臨床應(yīng)用還存在很大問題；而圈套寡核苷酸無論從技術(shù)和經(jīng)濟上目前也很難在臨床廣泛應(yīng)用。因此，如何選擇高效、安全的NF-kB抑制剤，仍是目前臨床醫(yī)學中有待解決的問題。進一步發(fā)掘靶點特異、高效、低毒的藥物,尋找天然NF-kB活性抑制剤，將為拮抗NF-kb功能開辟更加廣闊的前景。結(jié)腸癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，治療主要是手術(shù)、放療和化療等的有機結(jié)合，而作為具有全身性治療潛能的化療日益受到重視，在結(jié)腸癌的治療中占據(jù)著不可替代的地位。但普遍存在的腫瘤細胞對化療藥物的耐藥現(xiàn)象嚴重影響了結(jié)腸癌的治療效果，結(jié)腸癌的耐藥現(xiàn)象是影響其化療療效和預(yù)后的主要原因之一。為克服腫瘤耐藥，多年來人們對腫瘤的耐藥機制進行了大量研究，并在細胞乃至分子水平有了諸多進展，其中包括某些耐藥基因(MDR)和細胞表面蛋白(P-糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白)介導的多藥耐藥。然而針對這些耐藥機制所設(shè)計的治療方法，盡管在體外研究中效果顯著，但在臨床上卻難以奏效，特別是對實體瘤的治療更是令人失望。NF-KB信號通路的活化無論在獲得性耐藥或內(nèi)在性耐藥中均起著重要作用，近年有作者甚至認為，NF-KB活化可能代表一個比多藥耐藥基因更為重要的耐藥機制。合理設(shè)計與NF-KB活化抑制劑聯(lián)合的化療方案，將有助于降低腫瘤細胞的抗凋亡閾值，成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥和化療增敏新的策略和有效方法。而針對NF-KB活化抑制劑的研究就目前而言，直接將突變型lKBa基因轉(zhuǎn)移到腫瘤患者體內(nèi)還存在著許多技術(shù)難題尚未克服；反義寡核苷酸治療有可能導致機體一些重要基因功能的喪失；正常情況下，由于蛋白酶體和鈣調(diào)節(jié)蛋白酶等是細胞周期和細胞功能的重要調(diào)節(jié)劑，所以其抑制劑的臨床應(yīng)用還存在很大問題；而圈套寡核苷酸無論從技術(shù)和經(jīng)濟上目前也很難在臨床廣泛應(yīng)用。因此，以上各種NF-KB活化抑制劑與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用以逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥和化療增敏在臨床上應(yīng)用較困難。中醫(yī)中藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥，臨床上，許多中藥或中藥方劑應(yīng)用于腫瘤的治療。中藥以其獨特的優(yōu)勢及毒副作用相對較小等特點，在對腫瘤的治療中的作用正逐漸受到人們的重視。青蒿作為傳統(tǒng)清熱藥，在臨床上廣泛應(yīng)用，其青蒿素用于治療多型瘧疾，療效很顯著，并得到了世界的公認。青蒿在藥理上、化學成分的提取分離，臨床應(yīng)用都取得很大的進展，近年來的研究也發(fā)現(xiàn)青蒿及其相關(guān)的有效成分可以抑制NF-KB的活化，也具有一定的抗腫瘤作用。作為傳統(tǒng)的中藥，青蒿在抗腫瘤方面的作用正逐漸受到重視，人們對其抗腫瘤機制的研究也在逐步深入。由于中藥組成成分復(fù)雜，如能采用有效手段，確定與NF-KB作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，分離制備出抑制NF-KB活化的有效單體，將對NF-KB抑制劑的開發(fā)具有重要意義。光學生物傳感器技術(shù)是利用光學原理，在生物傳感器的樣品池表面包被固定受體，當受體與其配結(jié)合體時，以共振角度進入光線衰竭區(qū)的激光就會發(fā)生共振角度的改變，這一變化通過計算機處理后就可以檢測到傳感器表面受體與其配體分子之間的相互作用及親和力。通過特異性的洗脫及回收，即可得到純度極高的配體分子。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明在既往研究工作的基礎(chǔ)上，以青蒿為研究對象，利用生物傳感器技術(shù)，制備出青蒿中與NF-icB特異性結(jié)合的活性物質(zhì)，繼而對該物質(zhì)的理化性質(zhì)及抑制NF-kB活化的能力進行測定；在體外采用腫瘤細胞三維立體培養(yǎng)模型，觀察其抑制NF-kB活性及其對凋亡相關(guān)蛋白、細胞凋亡和對藥物敏感性的影響；同時進一步觀察其對動物腫瘤模型化療增敏和逆轉(zhuǎn)耐藥的效果，研究其作為NF-KB抑制劑的藥物活性。為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用，包括東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤的核轉(zhuǎn)錄因子-kB抑制劑中的應(yīng)用；東莨菪素在制備治療或預(yù)防結(jié)腸癌的核轉(zhuǎn)錄因子-kB抑制劑中的應(yīng)用；本發(fā)明還提供一種治療或預(yù)防腫瘤的藥物組合物，其含有治療有效量的東莨菪素和藥用載體。其中上述的藥學上可接受的載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體中的至少一種。上述的藥物組合物，還可以含有其它治療或預(yù)防腫瘤的藥物，所述的其它治療或預(yù)防腫瘤的藥物包含5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶或順銷中的至少一種。上述的藥物組合物，還可以是包含核轉(zhuǎn)錄因子-kB抑制劑組合物。上述的藥物組合物中，所述的核轉(zhuǎn)錄因子-!cB抑制劑組合物可以為注射制劑或口服制劑。本發(fā)明采用光學生物傳感器技術(shù)，創(chuàng)新地從中藥分離具有抑制NF-kB活性的中藥活性物質(zhì)。明確發(fā)現(xiàn)東莨菪素可以與NF-KB特異性結(jié)合，篩選出青蒿中的有效單體成分東莨菪素即為NF-KB的特異性抑制劑，從NF-KB抑制劑這一新的方向研究東莨菪素這一中藥的有效單體成分，為東莨菪素的藥理作用研究提供了新的思路和方向，同時也為選擇有效的NF-KB抑制劑提供了新的方法，為腫瘤的治療、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥和化療增敏提供了新的策略。本發(fā)明中將東莨菪素與治療腫瘤(結(jié)腸癌)的化療藥物5—氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用，對腫瘤(結(jié)腸癌)的治療效果明顯增加，用于制備含有治療有效量的東莨菪素和其它治療或預(yù)防腫瘤的藥物(如氟尿嘧啶、順鉑)的藥物組合物。本發(fā)明用于東莨菪素及其衍生物用于治療腫瘤的藥物，可不經(jīng)口服給藥，以注射劑或輸液劑等形式給藥，給藥量因藥物不同而各有不同，就體內(nèi)體外實驗研究結(jié)果，對成人而言，用藥量為每公斤體重每天0.251.0mg為宜。而本發(fā)明中篩選出的青蒿中NF-kB抑制劑一東莨菪素，為天然中藥的有效單體成分，其毒副作用小，安全性高、作用靶點特異，為一種有效可行的能與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)腸癌治療的NF-kB活化抑制劑，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥和化療增敏。而東莨菪素作為NF-kB抑制劑的藥物活性，為首次研究發(fā)現(xiàn)的東莨菪素的又一新的藥物活性。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。圖1為NF-kb蛋白生物傳感器包被圖；圖2為東莨菪素與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對結(jié)腸癌HT-29細胞球NF-KB活性的抑制作用結(jié)果；圖3為東莨菪素與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對結(jié)腸癌HT-29細胞球細胞周期分布的影響結(jié)果；圖4為東莨菪素與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對結(jié)腸癌HT-29細胞球細胞凋亡率影響結(jié)果；圖5為東莨菪素與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對結(jié)腸癌HT-29細胞球抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表達的影響結(jié)果；圖6為東莨菪素不同處理組裸鼠腫瘤組織NF-KB活性的變化情況結(jié)果；圖7為東莨菪素與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對裸鼠移植瘤腫瘤組織抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表達的影響結(jié)果；圖8為TLC法中計算Rf值的示意圖。具體實施方式一.方法(一)實驗所需材料實驗材料青蒿全草藥物重慶地產(chǎn)，由重慶市中藥研究所鑒定明確。硅膠(柱色譜用)100—200目，安徽良臣硅源材料有限公司提供。硅膠G薄層層析板安徽良臣硅源材料有限公司提供。結(jié)腸癌細胞株HT-29細胞為本室保存人結(jié)腸癌傳代細胞系，用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，含10%新生牛血清，各100U/mL的青、鏈霉素，用0.25%胰酶消化傳代。實驗動物46周齡BALB/Cnu/nu裸鼠，體重1822g，雄性，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK-(軍)2007015，詞養(yǎng)于SPF級無菌層流室中。主要儀器設(shè)備和試劑1.主要儀器設(shè)備生物傳感器Thermo公司美國生物傳感器樣品池Thermo公司美國Q-TRAP2000質(zhì)譜儀ABI公司美國Varian400MHz核磁共振波譜儀Varian公司美國FTIR8000紅外線光譜儀島津公司美國Agilent1200高效液相色譜儀Agilent公司美國R1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(10L)上海申順生物科技公司中國BUCHI回旋減壓蒸發(fā)儀(1L)BUCHI德國烘干機上海精密實驗設(shè)備公司中國臺式離心機Sigma美國電子天平上海安亭中國DK-8B型電熱恒溫水槽上海精密實驗設(shè)備公司中國純水機Millipore法國顯微熔點測定儀(XRC-1型)四川大學科學儀器廠中國pH計(828型)Orion美國恒溫振蕩器江蘇太倉實驗設(shè)備廠中國超凈工作臺安泰公司中國0)2培養(yǎng)箱ThermoForma美國倒置顯微鏡Olympus日本臺式離心機Sigma美國臺式低溫高速離心機Biofiige22R，德國培養(yǎng)板(6、12、24、96孔板)Costar美國照相顯微鏡Olympus曰本流式細胞儀BectonDickinson美國電子天平上海安亭中國超低溫冰箱ThermoForma美國垂直電泳槽Bio-Rad美國紫外分光光度計Bio-Rad美國pH計(828型)Orion美國純水機Millipore法國恒溫振蕩器江蘇太倉實驗設(shè)備廠中國長風水浴箱北京長風中國Model550酶標儀Bio-Rad美國2、主要試劑NF-kBP65蛋白Sigma美國兔抗人NF-kBP65SantaCruz美國氯仿重慶川東化工公司中國石油醚北京長海化工廠中國乙酸乙酯重慶川東化工公司中國正丁醇重慶川東化工公司中國甲醇重慶川東化工公司中國乙醇重慶川東化工公司中國碘重慶川東化工公司中國丙酮重慶川東化工公司中國東莨菪素標準品中國藥品生物制品檢定所中國小鼠抗人FASSantaCruz美國小鼠抗人FAS—LSantaCruz美國兔抗人Bcl-2SantaCruz美國FITC標記羊抗小鼠中杉生物中國FITC標記羊抗兔中杉生物中國FITC標記兔抗小鼠北京博奧森中國核蛋白提取試劑盒南京凱基生物中國EMSA試劑盒南京凱基生物中國，32P—ATP北京福瑞生物中國AnneexinV-FITC試劑盒深圳晶美生物中國DMEM(高糖)Gibco美國瓊脂糖Sigma美國DMSOSigma美國DTTSigma美國FBSTBD中國新生牛血清成都哈里中國TEMEDSigma美國5-FUSigma美國顯影液天津成信醫(yī)用輔料廠中國定影液天津成信醫(yī)用輔料廠中國Tris堿BoehringerMannheim美國丙烯酰胺鼎國生物中國MTTBD公司美國核因子-kB寡聚核苷酸探針的探針序列如下SEQIDNO:l-SEQIDNO:2NF-kB:PI:5'國AGCTTAGAGGGGACTTTCCGAGAGGA國3，NF國kB:P2:5'-TCCTCTCGGAAAGTCCCCTCTAAGCT-3，抗體稀釋液博士德中國中性樹膠中杉生物中國SP-9000免疫組化染色試劑盒中杉生物中國DAB試劑盒中杉生物中國(二)應(yīng)用生物傳感器方法對青蒿水煎液中NF-kB特異性抑制劑的篩選及其結(jié)構(gòu)鑒定1.青蒿水煎液濃縮液的制備及萃取(1)青蒿全草干藥材1公斤，用4升清水浸泡30分鐘，高火煮至沸騰后改低火煎40分鐘，濾去殘渣，濾渣再用4升清水同法煎40分鐘，合并兩次水煎液。(2)水煎液800gx30分鐘離心，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回旋濃縮至1升。(3)將濃縮液加入分液漏斗中，加入石油醚500ml，充分混合均勻后靜置，待分層明確后，打開活塞，收集位于下層的青蒿濃縮液，從分液漏斗上端收集石油醚層。重復(fù)前述步驟再進行石油醚萃取3次，收集石油醚萃取液。(4)分液漏斗中保留經(jīng)石油醚萃取后的青蒿濃縮液，加入氯仿500ml,充分混合均勻后靜置，待分層明確后，打開活塞，收集位于下層的氯仿層，保留水煎液。重復(fù)前述步驟再進行氯仿萃取3次，收集氯仿萃取液。(5)分液漏斗中保留經(jīng)氯仿萃取后的青蒿濃縮液，加入乙酸乙酯500ml，充分混合均勻后靜置，待分層明確后，打開活塞，收集位于下層的青蒿濃縮液，從分液漏斗上端收集乙酸乙酯層。重復(fù)前述步驟再進行乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液。(6)分液漏4中保留經(jīng)乙酸乙酯萃取后的青蒿濃縮液，加入正丁醇500ml，充分混合均勻后靜置，待分層明確后，打開活塞，收集位于下層的青蒿濃縮液，從分液漏斗上端收集正丁醇層。重復(fù)前述步驟再進行正丁醇萃取3次，收集正丁醇萃取液。(7)將收集得到的各相萃取液及萃取后的青蒿濃縮液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回旋濃縮成浸膏備用。2.硅膠G薄層層析(TLC)(1)點樣提取物用最少量氯仿溶解，濃度12%，用毛細管蘸取試樣溶液逐次在硅膠G薄層層析板上點樣，總量約15Hg,點樣孔距離X).5cm，點樣孔與底邊距離1.5cm，室溫下?lián)]干溶劑，在樣點上輕輕畫出一條平行于玻璃板底邊的細線。(2)展開劑選擇不同比例石油醚乙酸乙酯展開系統(tǒng)(O:1010:O)和氯仿甲醇展開系統(tǒng)(氯仿15%甲醇)(3)展開將已點好樣揮干溶劑的硅膠G薄層層析板豎直放入盛有展開劑的有蓋展開瓶中，展開劑要接觸到吸附劑下沿，但不能接觸到樣點，蓋上蓋子，展開。展開距離達到3/4處停止展開，再畫出展開劑的前沿線。分別應(yīng)用不同比例的石油醚乙酸乙酯展開系統(tǒng)和氯仿甲醇展開系統(tǒng)進行展開。(4)取出硅膠G薄層層析板，室溫下?lián)]干展開溶劑。(5)硫酸乙醇顯色劑顯色薄層層析板上用硫酸乙醇顯色劑噴霧后，110°C烤箱烘烤30分鐘，觀察顯色情況。(6)碘蒸氣顯色將揮干溶劑的薄層層析板放入碘蒸氣飽和的顯色缸內(nèi)，觀察顯色情況。(7)Rf值計算Rf展開點樣線至斑點中心距離/展開后點樣線至溶劑前沿距離。請參照圖8，計算公式為R尸Rac/Rab。3.硅膠柱色譜(1)裝柱將溶劑裝入層析柱中，打開活塞，使溶劑緩慢滴出。稱取柱色譜用硅膠(100200目，量約為上樣量的40倍)，用溶劑溶解濕潤后攪拌緩慢加入，邊沉降邊添加，直至加完為止，繼續(xù)加入45倍柱體積的溶劑緩慢沖洗柱床。當硅膠充分沉降后，放出多余的溶劑至液面與柱床頂端表面一致時關(guān)閉活塞。(2)拌樣提取物用少量氯仿溶解，稱取樣品量的11.5倍的100200目柱色譜用硅膠加入溶液中，充分混勻，揮干溶劑。(3)上樣將揮干溶劑的已吸附提取物的硅膠緩慢加入已裝好柱的層析柱中，使表面成平面。(4)梯度洗脫過柱用不同比例氯仿甲醇洗脫系統(tǒng)(氯仿15%甲醇)和石油醚乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)(O:1010:O)進行梯度洗脫柱色譜，洗脫液洗脫速度lml/min，每個比例洗脫系統(tǒng)約5倍柱體積容量。(5)洗脫液收集分段收集過柱后的洗脫液，2050ml/瓶，硅膠G薄層層析后合并洗脫液。(6)收集的洗脫液減壓回旋蒸發(fā)儀濃縮旋干保存。4.重結(jié)晶(1)提取物中加入少量熱丙酮，至剛好溶解。(2)加入少量石油醚至澄清溶液出現(xiàn)少量渾濁。(3)再加入少量熱丙酮至溶液重新澄清。(4)室溫放置冷卻，使溶劑緩慢揮發(fā)，結(jié)晶析出。(5)將混有結(jié)晶的飽和溶液過濾，石油醚沖洗，收集結(jié)晶并重復(fù)結(jié)晶過程。5.生物傳感器nf-kb蛋白的包被(圖1)(1)樣品池中加入HBSTE后，加入20nl親和素后結(jié)合反應(yīng)2分鐘，HBSTE洗3次，每次50pl。(2)HBSTE洗3次，使基線穩(wěn)定2分鐘。(3)加入5^1生物素阻斷樣品池中的生物素結(jié)合位點1分鐘。(4)用lOOmMHCL洗3次洗掉親和素，再用HBSTE洗3次。(5)加入20plSPDP反應(yīng)10分鐘。(6)50h1HBSTE洗3次，平衡基線1分鐘。(7)用5mMDTT40nl/次洗3次。(8)用HBSTE洗3次，平衡基線2分鐘。(9)再加入SPDP20nl反應(yīng)10分鐘(10)HBSTE洗3次，平衡2分鐘。(11)5(Vl亮丙瑞林酸3次，平衡基線2分鐘似加入5pgNF-kb蛋白入樣品池中，見到有結(jié)合發(fā)生的靜電吸收峰，反應(yīng)約15分鐘(13)HBSTE洗3次，平衡基線2分鐘。(14)50pll00mMHCL洗3次洗去過剩的蛋白，HBSTE洗3次，平衡基線2分鐘。(15)50pllM乙醇胺洗3次以除去剩余的巰基酯類。(16)HBSTE洗3次，平衡1分鐘。(17)抗體結(jié)合實驗證明蛋白已包被入樣品池中。6.生物傳感器對各提取物進行特異性結(jié)合洗脫(1)樣品池中加入50plHBSTE沖洗3次，至平衡后吸出以平衡基線。(2)分別加入lpl提取物溶液，至平衡后吸出，使提取物溶液與NF-kB蛋白能夠充分結(jié)合。(3)加入50plHBSTE沖洗3次，對未結(jié)合部分進行充分非特異性洗脫，平衡后吸出洗脫液。(4)加入lOOmMHCL沖洗1次，對結(jié)合部分進行特異性洗脫，充分平衡后吸出洗脫液。7.溶解度測定(1)稱取研成細粉的提取物，置于25士2'C，10ml的溶劑中。(2)每隔5分鐘強力振搖30秒鐘；觀察30分鐘內(nèi)的溶解情況，看不見溶質(zhì)顆粒即為完全溶解。(3)判定標準據(jù)藥典2000版二部凡例的標準判定近似溶解度極易溶解系指溶質(zhì)lg(ml)能在溶劑不到lml中溶解。易溶系指溶質(zhì)lg(ml)能在溶劑1不到10ml中溶解。溶解系指溶質(zhì)lg(ml)能在溶劑10不到30ml中溶解。略溶系指溶質(zhì)lg(ml)能在溶劑30不到100ml中溶解。微溶系指溶質(zhì)lg(ml)能在溶劑100不到1000ml中溶解。極微溶解系指溶質(zhì)lg(ml)能在溶劑1000不到10000ml中溶解。幾乎不溶或不溶系指溶質(zhì)lg(ml)在溶劑10000ml中不能完全溶解。8.熔點測定(1)熔點儀接通電源，開關(guān)打到加熱位置，從顯微鏡中觀察熱臺中心光孔是否處于視場中，若左右偏，左右調(diào)節(jié)顯微鏡。前后不居中，松動熱臺兩旁的兩只螺釘，然后前后推動熱臺上下居中，鎖緊兩只螺釘。(2)進行升溫速率調(diào)整，使其升溫速率為rC/min。(3)把測溫儀的傳感器插入熱臺孔到底。(4)先用熔點標準物質(zhì)進行測量標定，求出修正值。(修正值=標準值-所測熔點值)，作為測量時的修正依據(jù)。(5)將待測樣品放入干燥器內(nèi)進行干燥處理，研細粉末。(6)將蓋玻片放在熱臺上，放上待測物質(zhì)藥粉，再放上載波片測量。9.將所得物質(zhì)分別進行紅外線光譜儀、核磁共振波譜儀、質(zhì)譜儀檢測，分析得到的各光譜、波譜數(shù)據(jù)。(三)體外實驗中藥青蒿中NF-KB特異性抑制劑Scopoletin對體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細胞群集耐藥作用的影響1、實驗分組(l諏等量對數(shù)期生長的HT-29細胞分瓶行3D培養(yǎng)5d。(2)空白對照組換液后繼續(xù)培養(yǎng)24h。(S)單獨Scopoletin組加入含Scopoletin的培養(yǎng)液使終濃度達200jxg/ml繼續(xù)培養(yǎng)24h。(4)單獨5-FU組加入含5-FU的培養(yǎng)液使終濃度達100pg/ml繼續(xù)培養(yǎng)24h。(5)5-FU+50jig/ml組加入含5-FU100^ig/ml和Scopoletin50^ig/ml的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。(6)5-FU+100pg/ml組加入含5-FU100^ig/ml和Scopoletinl00^ig/ml的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。G05-FU+200ng/ml組加入含5-FU100ng/ml和Scopoletin200[ig/ml的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。2、Scopoletin對結(jié)腸癌細胞NF-kB活性的影響2.1細胞核蛋白的提取(按照試劑盒說明進行如下操作)(1)收集已經(jīng)按實驗分組處理好的細胞，1000xg，3min，棄去培養(yǎng)基，加入含0.02%EDTA的0.01MPBS將多細胞球吹打成單細胞。(2)離心500xg，3min，4'C預(yù)冷的PBS洗細胞兩次，離心500xg，3min后收集細胞。(3)用lml預(yù)冷的PBS將細胞轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml微量離心管中，加入lOjilPMSF，混勻。(4)4。C離心，500xg，3min收集細胞，用移液槍盡可能取去上清。(5)每20pL細胞壓積中，加入200^1預(yù)冷的BufferA(使用前每lml加入1WDTT，5plPMSF，l(Hil蛋白酶抑制劑)，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩15s，放置冰上10-15min。(6)加入llpl冷BufferB，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5s，放置冰上lmin，再次最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5s后，fC離心，16000xg，5min;將上清轉(zhuǎn)入另一預(yù)冷的潔凈微量離心管，置于冰上，得胞質(zhì)蛋白。(7)在離心沉淀物(細胞核)中加入100pl預(yù)冷的BufferC(使用前每lml加入l^ilDTT，5plPMSF，10pl蛋白酶抑制劑)，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩15s,放置冰上40min,每間隔10min渦旋劇烈振蕩15s。(8)4。C離心，16000x，10min，盡快將上清轉(zhuǎn)入一預(yù)冷的潔凈微量離心管，得核蛋白。(9)將核蛋白進行定量(Brodford比色法)，調(diào)整蛋白濃度為lmg/ml分裝，-7(TC保存，避免反復(fù)凍融。2.2NF-kB寡核苷酸探針的標記(1)在消毒的一次性Ep管中依次加入NF-kB寡核苷酸探針2.(^1[y-32p]ATPl.OplT4多聚寡核苷酸激酶10xbuffer1.0^1ddH205単T4多聚寡核苷酸激酶1.0^1(2)充分混勻上述液體，離心10s，使液體流入管底;(3)于37。C溫育反應(yīng)10min;(4)加入lnl0.5M的EDTA終止反應(yīng)；(5)加入89^1TEbuffer混勻，-20。C保存。2.3凝膠遷移阻滯分析(EMSA)法測定NF-kB的DNA結(jié)合活性(1)配制5%非變性聚丙烯酰胺凝膠，加入按廠家說明安裝好的電泳槽的膠槽中，凝固后去掉梳子，用0.5xTBE沖洗加樣孔，將凝膠固定在電泳槽中，加滿電泳緩沖液(0.5xTBE緩沖液)。(2)預(yù)電泳100V電壓電泳30min。(3)在20(Hd5x結(jié)合緩沖液中加入0.5pllMDTT(4)EP管內(nèi)分別加入以下反應(yīng)體系，室溫下放置10min:5x結(jié)合緩沖液2.0^1核提取物2.0pl雙蒸水5.0(xl總體積(5)每管分別加入[Y，P]ATP標記的NF-KB寡核苷酸探針1^，混勻后，于室溫中反應(yīng)20min。(6海管中加入1^1的上樣緩沖液。(7)電泳加樣至上樣孔中，于100-120V電泳2h。(8)取下玻璃板，0.5xTBE輕輕漂洗凝膠，洗凈游離探針。剪取合適大小的濾紙，使之恰好貼在凝膠的正面，將其從玻璃板上取下，保鮮膜覆蓋凝膠，盡量不產(chǎn)生氣泡。(9)將凝膠移至干燥濾紙上，吸干水分，小心將膠移至保鮮膜。保鮮膜封口。卿方婦寸自顯影在暗室內(nèi)糊繊方j(luò)(A0ti:，壓X光顯影膠片，將Bf^密封，-70。C曝光過夜。(ll)暗室內(nèi)取出膠片，顯影5min,自來水沖洗膠片，定影5min,自來水充分沖洗，晾干。3、流式細胞儀檢測Scopoletin對結(jié)腸癌細胞細胞周期的影響a)細胞培養(yǎng)及實驗分組同前述。(2)收集已經(jīng)按實驗分組處理好的細胞，1000xg，3min，棄去培養(yǎng)基，加入含0.02%EDTA的0.01MPBS將多細胞球吹打成單細胞。(3)離心500xg，3min，4。C預(yù)冷的PBS洗細胞兩次，離心500xg，3min后收集細胞。(4)將收集的細胞加入70%冷乙醇中，4'C，固定24h。(5)離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min，棄去PBS。(6)加入RNA酶，37。C孵育30min。(7)加入PI染液，4。C避光30min。(8)流式細胞儀上機檢測。4、流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測Scopoletin對結(jié)腸癌多細胞球細胞凋亡率的影響a)細胞培養(yǎng)及實驗分組同前述。(2)收集已經(jīng)按實驗分組處理好的細胞，1000xg，3min，棄去培養(yǎng)基，加入含0.02%EDTA的0.01MPBS將多細胞球吹打成單細胞。(3)離心500xg，3min，4'C預(yù)冷的PBS洗細胞兩次，離心500xg，3min后收集細胞。(4)用去離子水按1:4稀釋結(jié)合緩沖液。(5)用250^1結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)細胞濃度為lxl06/ml。(6)取100pl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5plAnnexinV-FITC和10jxl20ng/ml的PI溶液。(7)混勻后于室溫避光孵育15min。(8)在反應(yīng)管中加入400WPBS，流式細胞儀上機檢測分析。5、流式細胞儀檢測Scopoletin對結(jié)腸癌多細胞球Bcl-2、FAS、FAS-L表達的影響(1)細胞培養(yǎng)及實驗分組同前述分組。(2)收集已經(jīng)按實驗分組處理好的細胞，1000xg，3min，棄去培養(yǎng)基，加入含0.02%EDTA的0.01MPBS將多細胞球吹打成單細胞。(3)離心500xg，3min，4。C預(yù)冷的PBS洗細胞兩次，離心500xg，3min后收集細胞。(4)棄上清，各管分別加入Bcl-2、FAS、FAS-L—抗抗體，混勻，37。C孵育lh。(5)PBS離心洗滌2次，各管分別加入5(HilFITC標記的二抗，37。C避光孵育30min。(6)PBS離心洗滌2次，加入500WPBS，混勻，流式上機檢測。6、Scopoletin對結(jié)腸癌多細胞球藥物敏感性的影響(1)0.25r。胰蛋白酶消化收集對數(shù)期HT-29細胞，DMEM細胞培養(yǎng)液調(diào)濃度3xl05/ml，分于已用2%瓊脂糖鋪底的96孔板，100^1/孔。(2)置37。C、5。/。C02溫箱內(nèi)振蕩器振蕩搖動2h，靜置培養(yǎng)72h。(3)各孔中分別加入含不同濃度Scopoletin(0，50，100，200^ig/ml)和5-FU100pl(0.01，0.1，1.0，10，100，lOOO^ig/ml)的培養(yǎng)基20(HU,設(shè)3個復(fù)孔，設(shè)只加培養(yǎng)基和PBS的調(diào)零孔和不加5-FU的空白對照孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。(4)小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入含0.2。/。EDTA的無酶消化液10W，反復(fù)吹打使其盡量成單細胞。(5)將各孔轉(zhuǎn)入未用瓊脂糖鋪底的96孔板，每孔加入170]il新鮮DMEM培養(yǎng)液，再加入20plMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6h。(6)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150pl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩IOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。(7)抑制率(％)=(l-實驗組平均OD/對照組平均OD)xl00%，半數(shù)抑制濃度(IC50)計算軟件計算IC50。(四)體內(nèi)實驗中藥青蒿中NF-KB特異性抑制劑Scopoletin對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤化療作用的影響1、裸鼠移植瘤的建立人結(jié)腸癌HT-29細胞DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，0.25%胰蛋白酶消化后，離心，用不含血清的培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為lxl()S/ml。取裸鼠30只，在鼠右側(cè)腋下皮下接種瘤細胞液0.2ml，飼養(yǎng)于SPF凈化室內(nèi)。2、實驗分組及藥物待腫瘤長至0.5cmx0.5cm，將動物隨機分組，每組5只，開始應(yīng)用藥物。具體分組及應(yīng)用方法為，對照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水lmlx5天；單獨5-FU組腹腔內(nèi)注射5-FU溶液20mg/Kgx5天；單獨Scopoletin200^ig/ml組腹腔內(nèi)注射SP溶液200pg/mlx5天；5-FU+Scopoletin5(^g/ml組腹腔內(nèi)注射5-FU溶液20mg/Kg十Scopoletin5(^g/mlx5天；5-FU+Scopoletinl00jig/ml組腹腔內(nèi)注射5-FU溶液20mg/Kg+Scopoletinl00ng/mlx5天；5-FU+Scopoletin200pg/ml組腹腔內(nèi)注射5-FU溶液20mg/Kg+Scopoletin200iag/mlx5天。停藥后16天全部裸鼠處死取材。3、腫瘤組織測量及抑瘤率計算實驗期間動態(tài)觀察腫瘤生長情況,每3天用游標卡尺測量腫瘤長徑(a)和短徑(b)，用藥結(jié)束后第16天，處死荷瘤鼠，剝離瘤體，將剝出的腫瘤去除血污、脂肪等非瘤組織，測量瘤重。根據(jù)公式計算腫瘤體積和腫瘤體積抑制率平均瘤體積(cv"1/2ab2;腫瘤體積抑制率(TIR"(l-實驗組平均瘤體積/陰性對照組平均瘤體積)x100%，瘤重抑制率=(1-實驗組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)乂100%。4、提取物對裸鼠移植瘤組織NF-KB活性的影響4.1組織細胞核蛋白的提取(按照試劑盒說明進行如下操作)(l)勻漿的制備取得的腫瘤組織約0.5g放入平皿，用含EDTA的冷PBS緩沖液洗滌，加入少量PBS，用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入10mlPBS，用吸管吸取組織勻漿，用200目尼龍網(wǎng)過濾到試管內(nèi)。離心沉淀1500xg，3min，棄上層。再用PBS洗3次，每次以500xg短時低速離心除去細胞碎片，以300目尼龍網(wǎng)過濾去細胞團，作細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度。(2)離心500xg，3min，4""C預(yù)冷的PBS洗細胞兩次，離心500xg，3min后收集細胞。(3)用lml預(yù)冷的PBS將細胞轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml微量離心管中，加入10^1PMSF，混勻。(4)4。C離心，500xg，3min收集細胞，用移液槍盡可能取去上清。(5)每20^1細胞壓積中，加入200W預(yù)冷的BufferA(使用前每lml加入DTT，5ulPMSF，10pl蛋白酶抑制劑)，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩15s，放置冰上10-15min。(6)加入冷BufferB，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5s，放置冰上lmin,再次最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5s后，4。C離心，16000xg，5min;將上清轉(zhuǎn)入另一預(yù)冷的潔凈微量離心管，置于冰上，得胞質(zhì)蛋白。(7)在離心沉淀物(細胞核)中加入lOOpl預(yù)冷的BufferC(使用前每lml加入lplDTT，5ulPMSF，10^1蛋白酶抑制劑)，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩15s，放置冰上40min，每間隔10min渦旋劇烈振蕩15s。(8)4。C離心，16000xg,，10min，盡快將上清轉(zhuǎn)入一預(yù)冷的潔凈微量離心管，得核蛋白。(9)將核蛋白進行定量，調(diào)整蛋白濃度為lmg/ml分裝，-7(TC保存，避免反復(fù)凍融。4.2、NF-kB寡核苷酸探針的標記(1)在消毒的一次性Ep管中依次加入NF-kB寡核苷酸探針2.0卩[，32p]ATPl.OplT4多聚寡核苷酸激酶10xbufferl.OplddH205単T4多聚寡核苷酸激酶1.0^1(2)充分混勻上述液體，離心10s，使液體流入管底；(3)于37。C溫育反應(yīng)10min;(4)加入lpl0.5mol/L的EDTA終止反應(yīng)；(5)加入89^1TEbuffer混勻，-20°(:保存。4.3凝膠遷移法(EMSA)測定NF-kB的DNA結(jié)合活性(1)配制5%非變性聚丙烯酰胺凝膠，加入按廠家說明安裝好的電泳槽的膠槽中，凝固后去掉梳子，用0.5xTBE沖洗加樣孔，將凝膠固定在電泳槽中，加滿電泳緩沖液(0.5xTBE緩沖液)。(2)預(yù)電泳100V電壓電泳30min。(3)在200^15x結(jié)合緩沖液中加入0.5|xllmol/LDTT(4)EP管內(nèi)分別加入以下反應(yīng)體系，室溫下放置10min:5x結(jié)合緩沖液2.(^1核提取物2.(^1雙蒸水5.0jil總體積9.(^1(5)每管分別加入[，"P]ATP標記的NF-kb寡核苷酸探針1W，混勻后，于室溫中反應(yīng)20min。(6海管中加入1^1的上樣緩沖液。(7)電泳加樣至上樣孔中，于100-120V電泳2h。(8)取下玻璃板，0.5xTBE輕輕漂洗凝膠，洗凈游離探針。剪取合適大小的濾紙，使之恰好貼在凝膠的正面，將其從玻璃板上取下，保鮮膜覆蓋凝膠，盡量不產(chǎn)生氣泡。(9)將凝膠移至干燥濾紙上，吸干水分，小心將膠移至保鮮膜。保鮮膜封口。柳放射自顯影在暗室內(nèi)糊H^CA暗盒，壓X^M影膠片，將日f^密封，-70°C曝光過夜。(ll)暗室內(nèi)取出膠片，顯影5min，自來水沖洗膠片，定影5min，自來水充分沖洗，晾干。5、免疫組織化學檢測不同處理組腫瘤組織Bcl-2、FAS、FAS-L的表達情況5.1、操作步驟(1)組織石蠟切片置于6(TC烤箱60分鐘。(2)組織切片依次浸泡在二甲苯(15minx2次)，100。/。乙醇(2minx2次)，95%乙醇(5minx2次)，85%乙醇5min，75%乙醇5min，蒸餾水3min。(3)切片置于機酸緩沖液中,微波法抗原修復(fù)10min，自然冷卻后PBS漂洗5minx3次。(4)滴加3%過氧化氫，37。C孵育15min,PBS漂洗5minx3次。(5)滴加封閉用血清A液，37。C孵育15min，滴加適當比例稀釋的一抗(Bcl-2、FAS、FSA-L)，4'C過夜。PBS漂洗5minx3次。(6)滴加工作液B,37。C孵育30min,PBS漂洗5minx3次。(7)滴加工作液C，37。C孵育30min，PBS漂洗5minx3次。(8)滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色，以陽性顯色充分而背景無雜色干擾為標準，及時終止反應(yīng)，自來水充分沖洗。(9)滴加蘇木素復(fù)染5min，自來水沖洗。用1%鹽酸酒精調(diào)整復(fù)染程度。采用與(2)相反順序浸泡切片進行脫水透明。(10)中性樹脂封片。4.2、結(jié)果判定顯微鏡下觀察Bd-2、FAS、FAS-L腫瘤組織中的表達，結(jié)果判斷標準:Bcl-2陽性細胞為胞質(zhì)棕色，F(xiàn)AS、FAS-L陽性細胞為胞膜胞質(zhì)棕色表現(xiàn)。各組隨機選取細胞分布均勻的5個高倍視野(x400)，計數(shù)Bcl-2、FAS、FAS-L陽性表達的細胞數(shù)。陽性表達率-陽性的細胞數(shù)/腫瘤細胞數(shù)x100。/0。二、.結(jié)果1.成功分離提取制備得到青蒿中能與NF-kB特異性結(jié)合的有效活性物質(zhì)，并測定其理化性質(zhì)為淡黃色粉針狀，略溶于水，溶于乙醇，易溶于氯仿、乙酸乙酯，熔點在202-203°C。2.紅外光譜檢測結(jié)果，提取得到的化合物IRv^皿cm"在:3334.7、1701.1、1566.1、1290.3附近有明顯振幅波峰。提取物核磁共振波譜結(jié)果'H-畫R(CDCl3)Sppm:3.959(3H，s，OCH3)，6.207(1H，s，OH)，6.276(1H，d，J=9.2，H-3)，6.852(1H，s，H-8)，6.923(1H，s，H-5)，7.608(1H，d，J-IO,H-4)。13C-NMR(CDCl3)Sppm:161.383(C-2)，113.433(C-3)，143.236(C陽4)，107.542(C-5)，149,733(C-6)，150.301(C-7)，103.213(C-8)，144.029(C-9)，111.509(C曙10)，56.434(-OCH3)。東莨菪素標準品核磁共振結(jié)果'H-NMR(CDCl3)Sppm:3.957(3H，0CH3)，6.230(1H，s，OH)6.270(d，J=9.2,H-3)，6.851(1H，s，H誦8)，6.918(1H，s，H-5)，7.605(1H，d，J=9.2,H-4)。13C-NMR(CDCl3)5ppm:161.367(C-2)，113.441(C陽3)，143.221(C-4)，107.565(C-5)，149.756(C-6)，150.324(C-7)，103.221(C-8)，144.044(C國9)，U1.517(C畫10)，56.442(-OCH3)發(fā)明人分析所得到的提取物質(zhì)的理化性質(zhì)、紅外線光譜、核磁共振波譜、質(zhì)譜等結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)提取得到的物質(zhì)的理化性質(zhì)、基本結(jié)構(gòu)與青蒿中的有效單體成分東莨菪素相似。經(jīng)與東莨菪素標準品的核磁共振波譜、質(zhì)譜進行比較后,發(fā)現(xiàn)各波譜結(jié)果與東莨菪素標準品符合。將提取物與東茛菪素標準品混合后測定熔點，混合熔點不下降，同時參照文獻中東莨菪素的各波譜數(shù)據(jù)，可以確定分離得到的青蒿中的NF-kB的特異性抑制劑為已知的青蒿中有效單體成分一東茛菪素(Scopoletin)。3.Scopoletin應(yīng)用后，結(jié)腸癌HT-29細胞球NF-kB的活性受到抑制，Scopoletin與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對細胞球NF-kB活性的抑制作用更強。證實Scopoletin對腫瘤細胞NF-KB活性有抑制作用，請參照圖2，其中1:對照組；2:Scp200Pg/ml組；3:5-FU組；4:FU+Scp50Pg/ml組；5:FU+Scp100Mg/ml組；6:FU+Scp200Mg/ml組)。4.單獨Scopoletin應(yīng)用后，與對照組比較，結(jié)腸癌HT-29細胞球細胞周期的變化不明顯，大部分細胞位于Gl期；而Scopoletin與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，結(jié)腸癌HT-29細胞球細胞周期明顯受到影響，Gl期細胞明顯減少，細胞向S期轉(zhuǎn)化，且Scopoletin應(yīng)用劑量越大效應(yīng)越明顯，請參照圖3。5.Scopoletin與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，結(jié)腸癌HT-29細胞球細胞凋亡率與單獨化療組比較明顯增加，且隨著AH-I應(yīng)用劑量的增加，細胞球細胞凋亡率增加越明顯，存在劑量依賴效應(yīng)，請參照圖4。6.Scopoletin與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，結(jié)腸癌HT_29細胞球抗凋亡蛋白Bcl-2的表達與單獨化療組比較有所減少，而促凋亡蛋白Fas、Fas-L的表達較單獨化療組明顯增多，且都具有劑量依賴效應(yīng)，請參照圖5。7.體內(nèi)裸鼠移植瘤模型，Scopoletin與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后腫瘤的瘤體積與單獨化療組比較有所減小，腫瘤的瘤重與單獨化療組比較也有所減輕，瘤體積抑制率、瘤重抑制率與單獨5-FU組比較均明顯增加，腫瘤生長受到抑制。各組平均瘤體積及平均瘤體積抑制率組別平均瘤體積(cm3)平均瘤體積抑制率(％)對照組1.91±0.27單獨Scp200ng/ml組1.78±0.096.81單獨5-FU組1.40±0.17a26.705-FU+Scp50pg/ml組U6±0.11b39.275-FU+Scpl00ixg/ml組0.95±0.12e50.265-FU+Scp200(xg/ml組0.72±0.12d62.30<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>8.體內(nèi)裸鼠移植瘤模型應(yīng)用Scopoletin后，腫瘤組織NF-kB活性受到抑制，且Scopoletin與5-FU聯(lián)合應(yīng)用組腫瘤組織的NF-kB活性的抑制較單獨化療組更明顯，且同樣具有劑量依賴效應(yīng)。Scopoletin不同處理組裸鼠腫瘤組織NF-KB活性的變化情況(EMSA圖片)，請參照圖6。9.Scopoletin與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，裸鼠移植瘤腫瘤組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白Fas、Fas-L的表達增加，且與Scopoletin的應(yīng)用劑量有關(guān)，AH-I應(yīng)用劑量越大，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少及促凋亡蛋白Fas、Fas-L的表達增加更明顯，都具有劑量依賴效應(yīng)，請參照圖7。雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當可作些許之更動與改進，因此本發(fā)明之保護范圍當視權(quán)利要求所界定者為準。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學<120>東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用<130><160〉2<170>Patetitlnversion3.2<210>1〈211>26<212>腿<213〉核因子-kB寡聚核苷酸探針序列<400〉1agctt卿ggggactttccgagagga26<210>2〈211>26<212>■<213>核因子-kB寡聚核苷酸探針序列〈柳>2tcctctcggaaagtcccctctaagct2權(quán)利要求1.東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于該治療或預(yù)防腫瘤的藥物為核轉(zhuǎn)錄因子-KB抑制劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于該核轉(zhuǎn)錄因子-KB抑制劑為治療或預(yù)防結(jié)腸癌的核轉(zhuǎn)錄因子-KB抑制劑。4.一種治療或預(yù)防腫瘤的藥物組合物，其特征在于含有治療有效量的東莨菪素和藥用載體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥用載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的藥物組合物，其特征在于含有其它治療或預(yù)防腫瘤的藥物，所述的其它治療或預(yù)防腫瘤的藥物包含5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶或順鉑中的至少一種。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物為注射制劑或口服制劑。全文摘要本發(fā)明涉及東莨菪素在制備治療或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用，該治療或預(yù)防腫瘤的藥物為核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制劑，本發(fā)明還提供一種治療或預(yù)防腫瘤的藥物組合物，其含有治療有效量的東莨菪素和藥用載體或其它治療或預(yù)防腫瘤的藥物，本發(fā)明中所述的核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制劑為天然中藥的有效單體成分，其毒副作用小，安全性高、作用靶點特異，可用于制備核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制劑藥物或抗腫瘤藥物。文檔編號A61P35/00GK101401808SQ20081007028公開日2009年4月8日申請日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日發(fā)明者張艷玲,彭亦良,李建軍,梁后杰,鳳潘,胡紹毅,邊志衡,嵐鄒申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學