專利名稱：：水溶性青蒿素衍生物及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于化學制藥工程領域，具體涉及一種水溶性青蒿素衍生物及其制備與應用。
背景技術：
：青蒿素(artemisinin)是1971年我國科學工作者從菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.中提取的新型抗癡藥，具有高效、速效、低毒的特點，是中國唯一被世界衛(wèi)生組織認可的按西藥研究標準研究開發(fā)的植物藥，也是第一個真正得到全球公認的中藥產品。但由于青蒿素的溶解性差、復燃率高等缺點，限制了其臨床應用。藥物化學工作者開始對青蒿素進行了大量的結構修飾、構效關系的研究，并篩選出一些療效更優(yōu)良的藥物，而真正用于臨床的主要有青蒿琥酯、青蒿曱醚、二氫青蒿素等。青蒿素是一種新型倍半萜內酯，具有過氧鍵和內酯環(huán)，有一個包括過氧橋在內的1,2,4-三惡烷結構單元，在自然界中是非常罕見的，它的分子中包括7個手性中心。純凈青蒿素為無色針狀結晶，熔點為156-157°C,易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于乙醇、乙醚，微溶于冷石油醚，在油中的溶解度《艮小，幾乎不溶于水。薄層層析為單一色斑。因其具有特殊的過氧基團，對熱不穩(wěn)定，易受濕、熱和還原性物質的影響而分解。因此研究工作者在構效關系的指導下，結合實驗結果，在保留過氧橋這個活性中心的前提下，主要對青蒿素的12位碳原子進行不同類別反應的修飾，將親脂性、親水性基團引入青蒿素結構中，以增加其油溶性、水溶性；或者將具有生理活性的大分子，如甾體等引入青蒿素結構中，以增強其穩(wěn)定性等等。上個世紀七、八十年代，我國的科研工作者，尤其是5.23協(xié)作組的成員(1967年5月23日，毛澤東下令在全國范圍內開展青蒿素抗瘧疾的研究工作，國務院專門成立"5.23"辦公室，所有參與此研究工作的人員屬于5.23協(xié)作組)，對青蒿素的合成及其結構修飾做了大量的工作。后來這個課題也引起了國外研究工作者的關注，截止目前已經有成百上千種的青蒿素衍生物合成，但是成功應用于臨床的并不多。雖然有幾個青蒿素的衍生物已經應用于臨床，被認為是低毒安全的藥物。但在動物實驗中，發(fā)現(xiàn)大劑量長期使用青蒿素及其衍生物時，可出現(xiàn)兩方面的毒理作用損害中樞神經系統(tǒng)、引起心電圖的變化。而且這些藥物復燃率仍然高，半衰期短、口服生物利用度低。青蒿琥酯在水中不穩(wěn)定，必須用前溶解于碳酸氫鈉制成鈉鹽，使用不方便。因此對青蒿素的結構改造工作仍有待進一步研究，以尋找溶解性更好、毒理作用更小的衍生物，將對青蒿素的臨床應用和綜合利用有著重要的意義。眾所周知，糖本身具有良好的溶解性能以及藥理功能，近年來在藥物的修飾中成為研究的熱點領域。人們可以利用糖毒性小、結構新穎多樣、靶向性好等特點對一些具有生物活性的基團或先導化合物進行結構修飾，希望通過相互的協(xié)同作用提高藥物療效、降低毒副作用、提高親合性、增加生物利用度，以尋找和開發(fā)新藥。世紀80年代。如將一些水不溶解物質經與糖結合轉變成糖苷，水溶解性增高，糖苦的這種性質對除去動物體內許多具有毒性的苯酚化合物很重要，這些苯酚化合物轉變成糖苷后，能被水溶解，并與尿一并排出體外。許多糖苷藥品就是利用這個性質，增強溶解性，降低毒性。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的，是提供一種水溶性青蒿素衍生物及其制備方法。本發(fā)明用糖對青蒿素進行修飾，得到的水溶性青蒿素衍生物可以提高青蒿素的衍生物水溶性和降低毒副作用，并且易于制劑，具有成藥前景。本發(fā)明操作簡單，反應條件溫和，不需要額外的脫保護步驟。經初步細胞實驗證明，對正常細胞無毒副作用。本發(fā)明水溶性青蒿素^f汴生物具有下列通式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R-CH"所述水溶性青蒿素衍生物的化學名稱為(3R,5aS,6R,8aS，9R,12S,12aR)-八氬-3，6，9-三曱基-3，12-橋氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1，2-苯并二塞平-10-0-甘露糖基(D-甘露糖-青蒿素)，分子式C21H3A。，分子量為446.51。本發(fā)明對糖基進行保護(制備全乙酰吡喃溴代甘露糖)，完成了對青蒿素的羰基的還原，制備了二氫青蒿素，再與全乙酰吡喃溴代甘露糖發(fā)生醚合成反應，得到水溶性青蒿素衍生物，其總收率為20.5%。本發(fā)明的水溶性青蒿素衍生物制備方法包括兩個主體部分，一部分為通過糖基的全乙酰保護使其帶一個-Br,另一部分是將上述還原產物二氫青蒿素與單糖在相轉移催化劑催化下醚化得到新的糖基化青蒿素產物。本發(fā)明還對水溶性青蒿素衍生物進行了結構鑒定和水溶性的分析，證明其具有良好的水溶性。本發(fā)明采用化學方法對青蒿素進行糖基化修飾。在利用化學方法對藥物進行糖基修飾過程中，控制反應的區(qū)域選擇性和立體選擇性是兩個基本而關鍵的問題。而保護和去保護是提高區(qū)域選擇性和立體選擇性的重要方法。在糖苷的合成中，為了將糖環(huán)上定位地引入形成糖苷鍵，首先必須對糖環(huán)的各個羥基用不同性質的保護基團進行保護，然后再逐次選擇性地脫去保護基團并分別先后定位地引入糖基。選擇合適的糖基保護方法最為有效的糖基方法主要有乙?；Ｗo和糖與丙酮在催化劑(如高氯酸、硫酸、鹽酸、對甲苯磺酸和氯化鋅等)作用下即可得到異丙叉縮酮。本發(fā)明采用了乙?；Ｗo法，并且通過紅外圖譜初步檢測發(fā)現(xiàn)在水解作用下，保護基團即可水解掉，不需要額外的脫保護步驟，操作簡便，其具體操作如下乙?；Ｗo法取2.00克的D-葡萄糖加入到裝有10mL醋酸酐的懸浮液的三頸瓶中，加入135mg碘，室溫磁力攪拌反應至反應體系呈棕色透明(表明全乙酰化反應完成約530min),然后將反應混合物用50mL干燥的二氯曱烷稀釋，水浴冷卻下加入4(T/。溴化氪的冰醋酸溶液14mL。加畢室溫攪拌反應至TCL檢測反應完畢(約需l6h)。反應混合物用150mL二氯曱烷稀釋，依次用冰水(60mLx2)、飽和碳酸氫鈉溶液(50mLx2)、稀硫代硫酸鈉溶液(0.4mol/L，50tnLx2)洗滌。有機層用無水硫酸鈉千燥，過濾，濾液減壓7蒸餾濃縮得白色固體。用乙醚溶解后，向其中加入石油醚重結晶得白色針狀晶體。在糖基保護之后，將糖如何引入到青蒿素分子中也是合成的一個關鍵步驟。乙酰糖與青蒿素反應是在堿催化下的水-有機兩相反應，其中最為重要是相轉移催化劑的選擇，本文以乙酰葡萄糖為例考察了不同的相轉移催化劑，結果如下表_相轉移催化劑對反應的影響_催化劑TLC分析結果十二烷基三甲基氯化銨-十二垸基三甲基溴化銨-十二烷基芐基二甲基氯化銨_四丁基氯化銨+四丁基硫酸氫銨++_三乙基芐基氯化銨_^_-:無目標產物生成；+:少量目標產物生成；++:大量目標產物生成不同的相轉移催化劑催化反應經TLC分析生成目標產物的量存在較大差異。其中四丁基硫酸氫銨為相轉移催化劑效果最為理想，因此選用四丁基硫酸氫銨作相轉移催化劑催化乙酰糖與二氫青蒿素的醚化反應。本發(fā)明通過對青蒿素糖基化產物結構的鑒定，以確認糖基確實引入到青蒿素分子，并且通過糖基修飾青蒿素可以提高其母體的水溶性。本發(fā)明所述的水溶性青蒿素衍生物可以與藥物載體一起組成藥物制劑進行使用，經檢測本發(fā)明所述青蒿素衍生物的水溶性，結果表明，所述青蒿素衍生物具有良好的水溶性。對正常細胞的生長抑制作用很小，毒副作用很小，可以用于制備治療宮頸癌、肝癌、乳腺癌和治療人體免疫功能亢進引起的疾病的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點是一方面，青蒿素與糖同樣有著突出的生物活性，都在生命過程中扮演非常重要的角色，在有些方面表現(xiàn)出相似或相近的性質，如糖及其衍生物能與細胞膜表面上的糖蛋白或糖脂類受體分子結合，而青蒿素則與位于細胞核上的青蒿素受體結合；二者同在抗腫瘤、抗菌方面有良好的效果等。可以預期，青蒿素與糖的結合能很好的發(fā)揮二者的協(xié)同作用。第二方面，青蒿素與糖在其他性質方面也可以有效互補，如糖有良好的水溶性，而青蒿素水溶性差，二者的結合可以賦予青蒿素或糖及其衍生物以新的物理和化學特性，從而改變分子極性、溶解性及吸收代謝以提高藥物分子的活性，降低毒副作用等。青蒿素也可激活糖的生物活性，增強糖的生物和藥用價值。第三方面，在細胞表面的大量受體分子幾乎都是糖蛋白或糖脂類，因而青蒿素與糖的結合必然具有很強的靶向性，可以選擇性的靶向給藥，解決青蒿素藥物治療選擇性差的棘手問題，減少對身體其他組織的損傷，增加藥物的生物利用度，提高療效，減低毒副作用，還可緩慢釋放藥物作用基團，起到控制或緩釋作用。本發(fā)明所述水溶性青蒿素衍生物的合成，合成思路新穎，產物結構特殊，為青蒿素衍生物的合成以及其他活性藥物的糖基化修飾提供了新的思路。圖1為青蒿素還原的示意圖Artemisininreductionreaction;圖2為水溶性青蒿素衍生物的合成示意圖SyntheticrouteofD-mannose-artemisinin。具體實施例方式材料D-甘露糖購于國藥集團化學試劑，化學純Na服4及無水曱醇、乙酸乙酯購于國藥集團化學試劑廠，均為化學純青蒿素標準品購于中國藥品生物制品4企定所醋酸酐、碘、二氯曱烷(>99.0%)、四丁基硫酸氫銨購于國藥集團化學試劑廠，均為化學純溴化氫水醋酸溶液(40%，工業(yè)級)，購自濰坊匯博進出口有限公司201D-II型旋轉蒸發(fā)儀鄭州長城科工貿有限公司2XZ-1型旋片式真空泵浙江黃巖求精真空泵廠X-4數(shù)字顯微熔點測定儀北京福凱儀器有限公司2F-2型三用紫外線分析儀上海安亭電子儀器廠SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司DF-101T型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器江蘇金壇市虹盛實驗儀器廠注H1固R由VarianINOVA-400型核磁共振儀測定(CDCl3作溶劑,TMS作內標，化學位移5以ppm為單位)；MS由Finnigan-MAT4510型質譜儀測定(EI);IR由美國熱電Varon傅立葉紅外光譜儀測定(KBr壓片法)IMDM培養(yǎng)基美國Gibco/^司無水乙醇成都華西生物制品廠，分析純臺盼藍上?；瘜W試劑廠，分析純胰酶Sigma/>司產品蛋白酶KSigma公司產品新生小牛血清Sigma公司產品小鼠成纖維(3T3)細胞，猴腎(vero)細胞均購自眾磊(北京)生物科技發(fā)展有限公司駐滬辦。凈化工作臺水平式離心才幾AEL-40SM電子天平C02培養(yǎng)箱Whatman3mm濾紙倒置相差顯微鏡4匸冷室-80。C冰箱自動純凈水蒸餾器Hamilton纟效量注射器96孔培養(yǎng)4反25cm2培養(yǎng)瓶75cm'培養(yǎng)瓶蛘埠產水平式雙人超凈工作臺北京醫(yī)用離心才幾廠(LD4-2A)曰本島津日本平澤/>司生產CPD-172型USA曰本Olymmpus日本SANYO(MLC)日本SANYO上海亞容生化^f義器廠遼寧中山醫(yī)療器械廠DenmarkDenmarkDenmark各種國產玻璃器材如吸管、試管、離心管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、配液瓶等等，均需經過高溫滅菌處理。實施例1:青蒿素的還原在25mL三頸瓶中加入2.81g(0.Olmol)青蒿素、0.454g(0.012mol)NaHB4及10mL無水曱醇室溫下攪拌24h。濾液減壓蒸餾回收曱醇。殘液用250mL水溶解，然后用50mL乙酸乙酯萃取三次，有機層用少量水洗滌，水洗液及水層合并。再用乙酸乙酯萃取，合并有機層。蒸去溶劑，干燥得產品一二氫青蒿素(見圖1);實施例2.全乙酰吡喃溴代甘露糖的制備取2.00克D-甘露糖加入到裝有10mL醋酸酐的懸浮液的三頸jfe中(其中醋酸酐保護糖分子上的羥基，使其變成穩(wěn)定的酯)，加入135mg碘，室溫磁力攪拌反應至反應體系呈棕色透明(表明全乙?；磻瓿杉s5-30min),然后將反應混合物用50mL干燥的二氯甲烷稀釋，冰浴冷卻下加入40%溴化氬的水醋酸溶液14mL(加入溴化氫，使糖分子帶一個-Br)。加畢室溫攪拌反應至TCL檢測反應完畢(約需l-6h)。反應混合物用150mL二氯曱烷稀釋，依次用水水(60mLx2)、飽和石灰酸氫鈉溶液(50mLx2)、稀發(fā)u代石克酸鈉溶液(0.4mol/L,50mLx2)洗滌。有機層用無水硫酸鈉千燥，過濾，濾液減壓蒸餾濃縮得白色固體。用乙醚溶解后，向其中加入石油醚重結晶，得白色針狀晶體一全乙酰吡喃溴代甘露糖晶體。實施例3.D-甘露糖-青蒿素的制備參見圖2。向裝有》茲力攪拌器的100mL三頸瓶內加入實施例1得到的青蒿素還原產物二氫青蒿素1.354g，四丁基石克酸氬銨0.2g(四丁基辟L酸氫銨是相轉移催化劑)，蒸餾水50mL,加入氫氧化鉀0.134g,調整溶液的pH為8-9。攪拌回流4h后，向反應體系中加入1.62g實施例2所述全乙酰吡喃溴代甘露糖，冷凝回流5h后冷卻，過濾，濾餅用乙醚和石油醚重結晶，即得本發(fā)明所述水溶性青蒿素衍生物一D-甘露糖-青蒿素。實施例4:D-甘露糖-青蒿素的結構表征本實施例采用核磁共振、質譜和紅外光譜對D-甘露糖-青蒿素的結構進行鑒定核磁共振1HNMR(CDC13,300MHz)5:1.80~0.82(m，20H,CH3,CHorCH2),2.19(m,1H,CH)，2.5l(s，4H,OH),3..33~3.25(m,4H，CHorCH2),4.卯~4.40(m,1H,CH),6.25~6.37(m,2H,CH);質譜LC-MS(APCI:CHC13)m/z(%):445.49(M國l+,100);紅外光譜IR(KBrcm國1)3379(OHstretching),2946,2924(CH3，CHorCH2sp3C-Hstretching),1092，1026,1014(C-0stretching)。以上分析數(shù)據(jù)表明，合成產物的結構與所設計產物的結構吻合。實施例5.D-甘露糖-青蒿素的水溶性精確稱取25。C干燥至恒重的青蒿素標準品lOmg置100mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度。分別吸取O,2，4,6，8,10mL于50mL容量瓶中，以95%乙醇補充至10mL,補加0.2%NaOH溶液至刻度，置(50±1)。C水浴中孩史溫30min,冷水冷卻至室溫。另取乙醇10mL,用同一種方法加堿處理后，作為空白。分別在292nm處測吸光值，得到標準曲線的線性回歸方程C=l.05138xA+O.0105983(mg/50mL)，相關系數(shù)為0.999。將足夠量的青蒿素及D-甘露糖-青蒿素溶于相應pH的緩沖水溶液中，25。C恒溫下，超聲分散約40min,離心沉降除去溶液中的不溶物，取上層清液，即為25。C下的飽和溶液。飽和溶液經適當稀釋后，在292nm處測其吸光度值，代入上述的方程計算得出飽和溶液的濃度，結果見表2.1。__D-甘露糖-青蒿素在不同pH緩沖水溶液中的溶解度(mg，mlT"__^_溶解度(mg'mL二)D-甘露糖-青蒿素4.00-6.864.219.1811.47結果表明用不同的糖對青蒿素修飾之后，水溶性得到了提高。經糖修飾后青蒿素的水溶解性在石威性范圍比酸性范圍好，在pH為4的酸性環(huán)境中難溶，隨著pH的升高水溶性提高，在pH為9.18的水溶性均高于pH6.86。青蒿素被糖修飾后，由于糖基的引入，多羥基的親水特性可使得整個分子溶解性能顯著提高。由于糖帶有多羥基，有弱酸性，隨著pH升高溶解度有所提高。實施例6:D-甘露糖-青蒿素對正常細胞的抑制作用(1)配制藥物工作濃度根據(jù)參考文獻，藥物濃度可采用等比間隔，選用10、20、40、80、160、320pmol/L作為實驗濃度。將上述合成的D-甘露糖-青蒿素的原液用IMDM培養(yǎng)液稀釋成濃度分別為10、20、40、80、160、320jimol/L的工作液。(2)接種細胞取對數(shù)生長期小鼠成纖維3T3細胞、猴腎vero細胞分別用0.25°/。胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用10°/IMDM完全培養(yǎng)基配成單個細胞懸液。進行細胞計數(shù)后，按照5x104個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200jaL。將培養(yǎng)板移入C02培養(yǎng)箱中，在37°C5y。C02飽和濕度的條件下培養(yǎng)24小時。(3)加藥待上述細胞完全貼壁生長后，將培養(yǎng)液吸棄，換上含有不同濃度的D-甘露糖-青蒿素的培養(yǎng)基(IO、20、40、80、160、320pmol/L)和青蒿素培養(yǎng)基(40pmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)8，12,24,48,72小時，各濃度分別設計4個復孔。(4)呈色在培養(yǎng)結束前4小時，每孔加入MTT溶液20pL。繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液后，每孔加入150nLDMSO，振蕩均勻，使結晶物充分溶解。(5)比色選擇490nm波長，在自動酶標儀上檢測各孔吸光度值(0D值)，記錄結果。(實驗重復三次)(6)按下式計算各種濃度藥物對細胞的增殖抑制活性相對抑制率=(對照孔平均OD值一加藥孔平均OD值)/對照孔平均OD值x麵(7)統(tǒng)計分析用SPSS10.0forwindows統(tǒng)計軟件處理。檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(x士s)表示，并采用方差分析及t檢驗，P>0.05表示無顯著性差異，P<0.05表示有顯著性差異。D-甘露糖-青蒿素作用于3T3細胞48h的抑制率測定(％，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>D-甘露糖-青蒿素作用于vero細胞48h的抑制率的測定(％，x±s)青蒿素D-甘露糖-青蒿素3.87士1.627.32士1.5114.23士1.5610.43士2.0113.24士2,2416.22士2.5819,11士2.87例，05考察了青蒿素及D-甘露糖-青蒿素對正常細胞3T3和vero的增殖抑制影響。陽性對照青蒿素(4(Vmol/L)對正常細胞的生長無明顯抑制作用，毒副作用較小，從結果的統(tǒng)計分析得出，D-甘露糖-青蒿素與青蒿素相比，無顯著性差異(P>0.05)。結論目前青蒿素的化學修飾還停留在簡單小分子取代的水平上，還沒有涉及到一些大分子對青蒿素化合物的修飾。近年來對中藥單體化合物的糖基化研究較為活躍，也展示出比較突出的功能活性。因此，本發(fā)明對青蒿素進行糖基化修飾，會有更加廣闊的前景。隨著人們對多糖類物質的研究越來越深入，多糖與青蒿素結合可能會達到事半功倍的效果。同時，與其他已知的和將來新發(fā)現(xiàn)的活性物質結合，以期望產生共效、促效作用，從而獲得"me-too"和"me-better"的優(yōu)化產物。10umol/L20Pmol/140umol/L80umol/L160umol/L320umol/L權利要求1.一種水溶性青蒿素衍生物，具有下列通式2.根據(jù)權利要求1所述的水溶性青蒿素衍生物，其特征在于所述R基團為CH3。3.制備權利要求1所述的水溶性青蒿素衍生物的方法，其特征在于有以下步驟(1)制備二氫青蒿素取青蒿素、NaHB4及無水曱醇，室溫下攪拌24h,濾液蒸餾，用250mL水溶解后，再用乙酸乙酯萃耳又，蒸去溶劑，干燥得二氫青蒿素；(2)全乙酰吡喃溴代甘露糖的制備取D-甘露糖，加入到醋酸酐懸浮液中，>碘，室溫下攪拌，得到反應混合物，反應混合物用二氯曱烷稀釋，水浴冷卻下加入40%溴化氬的冰醋酸溶液，室溫攪拌至反應完全，反應混合物用二氯曱烷稀釋，洗滌，得到的有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，得到的固體用乙醚溶解后，加入石油醚重結晶得全乙酰吡喃溴代甘露糖晶體；(3)水溶性青蒿素衍生物的制備取二氫青蒿素，加入四丁基硫酸氫銨，蒸餾水，調整溶液的pH至8-9，攪拌回流4h后，向反應體系中加入全乙酰吡喃溴代甘露糖，冷凝回流5h后冷卻，過濾，濾餅用乙醚和石油醚重結晶，即得權利要求1所述水溶性青蒿素衍生物。4.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中青蒿素NaHB4:無水曱醇的摩爾比為1:0.8~1:90~100。5.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中D-甘露糖醋酸酐碘及40°/。溴化氬的水醋酸溶液摩爾比為1:2~2.5:0.15~0.2:1~1.2。6.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中二氫青蒿素:四丁基硫酸氪銨全乙酰吡喃溴代甘露糖的摩爾比為1:0.1~0.2:1.3~1.5。7.權利要求1所述的水溶性青蒿素衍生物在制備治療宮頸癌、肝癌、乳腺癌和治療人體免疫功能亢進引起的疾病的藥物用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種水溶性青蒿素衍生物及其制備方法，有以下步驟(1)制備二氫青蒿素；(2)全乙酰吡喃溴代甘露糖的制備；(3)水溶性青蒿素衍生物的制備。本發(fā)明對水溶性青蒿素衍生物進行了結構鑒定和水溶性的分析，證明其具有良好的水溶性，易于制劑，具有成藥前景。本發(fā)明操作簡單，反應條件溫和，不需要額外的脫保護步驟。經初步細胞實驗證明，對正常細胞無毒副作用。文檔編號A61P35/00GK101293889SQ200810069848公開日2008年10月29日申請日期2008年6月20日優(yōu)先權日2008年6月20日發(fā)明者任彥榮,胡宗利,陳國平申請人:重慶大學