專利名稱：：雙芐基異喹啉化合物及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬醫藥
技術領域：
，具體涉及一種以中藥烏藥為原料制備一種新雙節基異喹啉生物堿的方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。烏藥為傳統常用中藥，是重要的溫胃理氣止痛藥之一，具有溫中散寒、理氣止痛的功效。現代研究發現烏藥的化學成分復雜，含豐富的呋喃倍半砲及其內酯、黃酮、揮發油、異喹啉生物堿等，具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤、調節消化道、興奮心肌、改善中樞神經系統功能、抗炎鎮痛、防治糖尿病腎病、保護肝臟、調節凝血功能等藥理作用。烏藥中所含生物堿多為異喹啉生物堿，其中新木姜子堿(laureolistine)，波爾定堿(boldine)和牛心果堿(reticuline)為主要的三種異喹啉生物堿，在樟科植物中普遍存在(烏藥的化學成分及藥理作用.王崢濤，徐珞珊.中國野生植物資源，1999，18(3)，5-10.)。現代藥理研究表明烏藥提取物對小鼠肉瘤S180抑制作用明顯。烏藥提取物可誘導小鼠產生細胞生長抑制因子，抑制腫瘤生長，延長患肺癌小鼠的生存期，而對正常細胞不顯示任何毒性，療效與劑量正相關(烏藥的植化及藥理研究概況.王軍偉，阮冰.浙江中醫雜志，2006，41(11)，675-677.)。但目前尚未發現烏藥中含有雙芐基異喹啉類生物堿，更未見烏藥中該類生物堿的抗腫瘤細胞毒活性報道。本發明的目的是提供一種烏藥中提取的雙芐基異喹啉化合物(Linderegatine，I)，具有以下結構式
背景技術：
發明內容本發明的第二個目的是提供雙芐基異喹啉化合物(I)的制備方法，通過以下步驟實現烏藥干燥塊根切成薄片，粉碎后按藥材/溶劑重量/體積比加入IO倍量醇，室溫浸提或回流提取2-3次，至提取物顏色較淺。合并提取液，減壓濃縮得浸膏，用適量水將此浸膏混懸溶解，以無機酸酸化后用中極性有機溶劑萃取除去非生物堿成分，水相再用弱堿調節pH至10，用中極性有機溶劑萃取三次，有機溶劑層再用水反洗至中性，經溶劑回收后得到總生物堿的粗品；將此粗品以適量醇溶解，再加水保持醇含量^60%使沉淀完全，離心或過濾后即得精制總生物堿，取精制烏藥總生物堿，與硅膠拌樣，加入裝有硅膠的色譜柱頂端，以氯仿-甲醇溶劑系統從50:1—25:l洗脫，收集氯仿甲醇25:1極性段洗脫部分，濃縮除去溶劑后經過反相C-18硅膠色譜，以水-甲醇溶劑系統從80:20—40:60梯度洗脫，收集水甲醇40:60洗脫部分，濃縮除去溶劑后得目的化合物I。本發明的另一個目的是提供雙芐基異喹啉化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用有較強的細胞毒活性。在用H9C2心肌細胞系缺氧復氧模型篩選具有心肌保護作用的藥物時發現，總生物堿在10、30嗎/ml的較低濃度下可增加細胞的存活率及降低細胞LDH的活性，但在90iag/ml的較高濃度下對心肌細胞具有一定的毒性。因此推測總生物堿中的微量成分可能具有較強的細胞毒活性。隨后將研究重點放在微量活性成分的獲得。在活性實驗指導下，經過多級色譜分離(包括硅膠、氧化鋁、反相硅膠及凝膠色譜)得到了化合物I，通過多種波譜技術測試，包括紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質譜(MS)、核磁共振(NMR)，在對波譜信息進行詳細的解析后確證結構為含有高度不飽和共軛體系的雙芐基異喹啉生物堿。將該化合物I配制成90^M/L，30|iM/L和10|aM/L三個濃度對L1210,K562腫瘤細胞株進行抑制活性實驗，結果表明三個濃度均有較強的細胞毒活性，且呈現量效關系。本發明的有益之處是(1)首次從烏藥中發現具有高度不飽和共軛體系的雙芐基異喹啉生物堿，提供了化合物I的制備方法及波譜數據，為今后繼續從烏藥中發現結構新穎的該類化合物奠定了基礎；(2)首次發現化合物I對腫瘤細胞有強抑制作用，對化合物I進行構效關系研究，通過計算機輔助合理設計后，將有可能通過化學合成得到活性更強的抗腫瘤先導化合物或藥物；(3)化合物I在對腫瘤細胞產生強抑殺作用的濃度下，對正常細胞幾乎沒有毒性，提示該化合物具有較好的開發成抗腫瘤新藥前景。圖1為烏藥總生物堿的高效液相色譜圖。具體實施方式本發明結合具體實施例和附圖作進一步的說明。實施例1化合物I的理化及UV、IR、MS波譜數據如下化合物I為淺黃色固體，[oc]D2()-16°(cl.0,MeOH);電噴霧質譜(ESIMS)(正離子型positive)m/z595[M+H]+(100);(負離子型negative)w/z593(IOO);UV(MeOH)Xmaxnm(logs):207(5.30),288(4.87);IR(KBr)vmaxcm-13405,2937,2842,1664,1588，1510，1450,1371,1276，1228，1135，1028,756。化合物I的'HNMR，。CNMR數據及歸屬參見表1，每個氫、碳信號的歸屬通過測試二維核磁共振譜(碳-氫相關譜，碳-氫遠程相關譜，核Overhauser效應二維相關譜)獲得。表l.化合物I的1H(400MHz)和13C(100MHz)NMR數據及信號歸屬(CD3OD溶劑)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2烏藥5kg干燥塊根切成薄片，粉碎后加入50L乙醇，滲漉提取二次，第一次7天，濾液收集后補加50L乙醇繼續滲漉5天。合并兩次提取液后減壓濃縮得浸膏，用IOL水將此浸膏混懸溶解，以2NHN03酸化后用等體積乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層回收溶劑后棄去。水相再用5XNa2C03調節pH至10，用等體積乙酸乙酯萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，用蒸餾水洗至中性，經減壓回收乙酸乙酯后得到32.3g總生物堿的粗品。將此粗品以3L乙醇溶解，再加水使乙醇含量為60%，靜置后使沉淀完全，過濾、干燥后即得12.8g精制總生物堿。取上述精制烏藥總生物堿，與15g硅膠拌樣，加入裝有600g硅膠的色譜柱頂端，以氯仿-甲醇溶劑系統從50:1—25:l洗脫，收集氯仿甲醇25:1極性段洗脫部分，濃縮除去溶劑后經過反相C-18硅膠色譜，以水-甲醇溶劑系統從80:20—40:60梯度洗脫，收集水甲醇40:60洗脫部分，濃縮除去溶劑后得316mg化合物I。實施例3烏藥3kg干燥塊根切成薄片，粉碎后加入30L甲醇，回流提取二次，第一次2小時，提取液過濾后補加24L甲醇繼續回流提取1小時。合并兩次提取液后減壓濃縮得浸膏，用6L水將此浸膏混懸溶解，以3NHC1酸化后用等體積氯仿萃取三次，氯仿層回收溶劑后棄去。水相再用氨水調節pH至10，用等體積氯仿萃取二次，合并氯仿萃取液，用蒸餾水洗至中性，經減壓回收氯仿后得到21.7g總生物堿的粗品。將此粗品以3L甲醇溶解，再加水使甲醇含量為50%，靜置后使沉淀完全，過濾、干燥后即得8.6g精制總生物堿。取上述精制烏藥總生物堿，與10g氧化鋁拌樣，加入裝有260g氧化鋁的色譜柱頂端，以氯仿-甲醇溶劑系統從50:1—30:l洗脫，收集氯仿甲醇30:l極性段洗脫部分，濃縮除去溶劑后經過凝膠SephadexLH-20柱色譜，以甲醇為洗脫劑，TLC檢測獲得含化合物I的流份，濃縮除去溶劑后得到198mg化合物I。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>化合物a<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>化合物b<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>化合物c經實施例l-3方法得到的烏藥總生物堿純度較高，主要含有三種成分，高效液相色譜HPLC歸一化法測得三個化合物(化合物a，b，c)的含量之和超過85%，此外還含有一微量成分化合物I，參見附圖1，其中1為化合物a(norboldine);2:化合物b(boldine);3:化合物c(reticuline);4:化合物I(linderegatine)，結構式如下實施例4化合物I的中試制備烏藥100kg干燥塊根切成薄片，粉碎后加入1000L乙醇，回流提取二次，第一次2小時，提取液過濾后補加800L乙醇繼續回流提取1小時。合并兩次提取液后減壓濃縮得浸膏，用200L水將此浸膏混懸溶解，以2NHC1酸化后用等體積乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層回收溶劑后棄去。水相再用氨水調節pH至10，用等體積乙酸乙酯萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，用蒸餾水洗至中性，經減壓回收乙酸乙酯后得到766g總生物堿的粗品。將此粗品以80L乙醇溶解，再加水使乙醇含量為40%，靜置后使沉淀完全，過濾、干燥后即得362g精制總生物堿。取上述精制烏藥總生物堿，與400g氧化鋁拌樣，加入裝有8kg氧化鋁的色譜柱頂端，以氯仿-甲醇溶劑系統從50:1—30:l洗脫，收集氯仿甲醇30:l極性段洗脫部分，濃縮除去溶劑后經過反相C-18硅膠色譜，以水-甲醇溶劑系統從80:20~>40:60梯度洗脫，收集水甲醇40:60洗脫部分，TLC檢測獲得含化合物I的流份，合并濃縮除去溶劑后得到7.9g化合物I。實施例5烏藥總生物堿及化合物I的藥理活性研究5丄實驗材料L1210，K562腫瘤細胞株，PAA血清，H-DMEM5.2.實驗方法5.2丄藥物配制將烏藥總生物堿(LAA)配制成90iig/ml，30pg/ml和10(ig/ml三個濃度，化合物I(Linderegatine)配制成90|LiM/L，30|aM/L和10pM/L三個濃度。5.2.2.將H9C2，L1210，K562細胞株按10000個細胞/孔接種到96孔板中，加入各種濃度的藥物，培養48小時后，用MTT孵育4小時，檢測細胞存活率。5.2.3.統計方法所有數據用t-text進行統計分析。5.3.結果參見表2.表2.烏藥總堿及Linderegatine細胞毒活性測試數據<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過細胞毒實驗，可知烏藥總堿在90pg/ml的較高濃度下對心肌細胞產生一定的毒性，而化合物I在IO、30laM的較低濃度下對兩株腫瘤細胞L1210及K562均有很強的細胞毒活性，而在10(aM的濃度下對正常心肌細胞幾乎沒有毒性，提示該化合物具有潛在的抗腫瘤價值，可望開發成抗腫瘤新藥或作為先導化合物進行研究開發。實施例6.化合物I(Linderegatine)制劑的制備6丄制成片劑取化合物I(Linderegatine)3.0g與淀粉10g混勻，力卩10%淀粉漿3g制成軟材，加入硬脂酸鎂0.3g，干淀粉2g混勻后壓制成100片，即得。每片含烏藥總堿30mg。6.2.制成注射劑取化合物I(Linderegatine)1.0g，加入10g甘露醇，加注射用水至1000ml加熱溶解，經0.22(im微孔濾膜過濾后每瓶2ml分裝于5ml的西林瓶內，每瓶含Linderegatine2.0mg，放入真空冷動干燥機內凍干，取出后軋蓋包裝即得。權利要求1.一種雙芐基異喹啉化合物的制備方法，其特征是具有以下結構式id="icf0001"file="S2008100616889C00011.gif"wi="82"he="49"top="60"left="51"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.—種雙芐基異喹啉化合物的制備方法，其特征是通過以下步驟實現烏藥干燥塊根切成薄片，粉碎后按藥材/溶劑重量/體積比加入io倍量醇，室溫浸提或回流提取2-3次，至提取物顏色較淺。合并提取液，減壓濃縮得浸膏，用適量水將此浸膏混懸溶解，以無機酸酸化后用中極性有機溶劑萃取除去非生物堿成分，水相再用弱堿調節pH至lO，用中極性有機溶劑萃取三次，有機溶劑層再用水反洗至中性，經溶劑回收后得到總生物堿的粗品；將此粗品以適量醇溶解，再加水保持醇含量^60%使沉淀完全，離心或過濾后即得精制總生物堿，取精制烏藥總生物堿，與硅膠拌樣，加入裝有硅膠的色譜柱頂端，以氯仿-甲醇溶劑系統從50:1—25:l洗脫，收集氯仿甲醇25:1極性段洗脫部分，濃縮除去溶劑后經過反相C-18硅膠色譜，以水-甲醇溶劑系統從80:20—40:60梯度洗脫，收集水甲醇40:60洗脫部分，濃縮除去溶劑后得目的化合物3.權利要求1所述的雙芐基異喹啉化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。4.根據權利要求2所述的雙芐基異喹啉化合物的應用，其特征是所述雙芐基異喹啉化合物與制劑允許的藥用輔料制備成藥物。5.根據權利要求3所述的雙芐基異喹啉化合物的應用，其特征是所述藥物的制劑形式為注射劑或片劑。全文摘要本發明提供一種烏藥中雙芐基異喹啉化合物及制備方法，通過將烏藥干燥塊根為原料，用醇溶劑提取后，提取液減壓濃縮得到浸膏，將該浸膏經水溶解混懸、稀酸酸化后用有機溶劑萃取除去中性成分，水相再用弱堿調節pH至10，用有機溶劑萃取經溶劑回收后得到總生物堿的粗品，將此粗品以醇溶解、再加適量水沉淀處理后即得精制總生物堿，經氯仿-甲醇系統洗脫，及以水-甲醇梯度洗脫，收集洗脫部分，濃縮除去溶劑后即得。用本發明對L1210，K562腫瘤細胞株進行抑制活性實驗，結果表明均有較強的細胞毒活性，且呈現量效關系，可在制備抗腫瘤藥物中應用。本發明所述化合物具有以上結構式。文檔編號A61K36/185GK101284792SQ200810061688公開日2008年10月15日申請日期2008年5月23日優先權日2008年5月23日發明者吳理茂,周長新,甘禮社申請人:浙江大學