一種人胱硫醚β-合成酶重組蛋白及應用的制作方法

專利名稱：一種人胱硫醚β-合成酶重組蛋白及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種重組人胱硫醚e-合成酶(rhCBS)原核高效表 達技術及重組蛋白在制備用于防治心血管疾病的藥物應用，通過對完整的人CBS cDNA 進行克隆，獨立構建人CBS的原核表達體系，并表達出具有野生活性的重組CBS蛋白， 利用心血管細胞體外培養模型和大鼠高同型半胱氨酸血癥模型確定重組CBS蛋白作為 藥物的治療作用。
技術背景同型半胱氨酸是甲硫氨酸循環過程中一個代謝中間產物。近年來的研究已確認， 高同型半胱氨酸血癥與作為人類第一殺手的動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等多種 心血管疾病的發生有密切關系，是心血管疾病的一個新的獨立的和重要的危險因素.對 高同型半胱血癥的有效抑制已成為心血管疾病防治的一個極為重要的醫學途徑。HCY在體內存在兩種代謝途徑重新甲基化合成甲硫氨酸，或通過轉硫途徑經胱硫 醚轉變為半胱氨酸。其間，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、胱硫醚P-合成酶及甲硫 氨酸合成酶(MS)是HCY代謝所必需的三個關鍵酶；這些酶活性減小或缺失，或者其 相應輔酶如VitB6, VitB^和葉酸的缺乏，將導致HCY代謝異常，血漿濃度升高。研究 發現，CBS的轉硫途徑負責轉化體內46%的HCY，其對HCY的轉化能力是由MS和BHMT 所催化的兩個甲基化代謝途徑的近兩倍，CBS的基因表達和功能狀態對維持正常的HCY 血漿水平至關重要，CBS酶基因的部分缺失，或因營養原因導致輔酶缺失即可引起高同 型半胱氨酸血癥；c&轉基因小鼠實驗表明，CBS的高表達則可以降低血漿HCY的水平。 然而，以目前人類遺傳性缺陷的發生率及基本營養狀況卻難以詮釋高同型半胱氨酸血 癥的高發病率，高同型半胱氨酸血癥患者的個體研究也表明，有相當比例的患者不存 在遺傳性缺陷和營養素缺乏的原因。高同型半胱氨酸血癥的病因學機制至今尚不清楚， 還難以從阻斷病因的途徑達到高同型半胱氨酸血癥致心血管功能的損傷作用及其發病 機制，有關高同型半胱氨酸血癥動物模型等未能有系統體系，而對高同型半胱氨酸血 癥的治療措施只是普遍采用外源性給予輔酶VitB6、 VitB,2和葉酸的方法以強化上述代 謝酶，但臨床效果多不理想。CBS定位于胞漿，是由63kDa亞基(551個氨基酸)構成的同源四聚體。CBS是一個血紅 素蛋白，屬于吡哆醛磷酸(PLP)依賴酶中的B族。每個亞基與血紅素及PLP這兩個輔助因 子結合。人CBS包括一個血紅素結合區、 一個高度保守的催化結構域和一個調節結構域。 血紅素結合于N-端前70個氨基酸殘基,該區域Cys52和His65為血紅素鐵離子的結合殘 基。研究表明，血紅素并不參與催化步驟，但其鐵離子的氧化還原狀態可影響全酶的催化速率。高度保守的催化結構域位于第40 413氨基酸殘基，可形成45kDa的活性中心。 該區域Lysll9殘基為PLP結合殘基，PLP是CBS催化反應所必需的依賴因子。C-端140個氨 基酸殘基構成的調節結構域對于人CBS四聚體的形成和酶的活化起重要的作用，它包含 所謂"CBS結構域"，該疏水性系列包含第415 468氨基酸殘基，它的功能尚不清楚。C-端調節結構域包含一個S2腺苷蛋氨酸(adenosylmethionine， AdoMet)結合位點的自我 抑制區，其結合位點在氨基酸殘基第421 468處。AdoMet是蛋氨酸代謝過程中的重要調 節樞紐，它是CBS的變構激活劑，也是5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶 (5， 10-methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)和甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉 移醇(betaine—homocys—teinemethyltransferase， BHMT)催化反應白勺變構抑制劑。目前，許多研究已表明，CBS在同型半胱氨酸血癥發生過程中發揮至關重要的作用, 其活性缺失或點突變均可導致人CBS酶活性降低，這種活性的降低與高同型半胱氨酸 血癥的發生具有密切的相關性，而有關CBS在同型半胱氨酸血癥中的藥用研究尚未見報 道，但對其分子結構及生物學特性已獲得了相當深刻的認識；人CBS基因已被克隆， 但是國內未見CBS酶克隆表達及藥用應用性研究。我們在己有研究的基礎上加以改進， 建立了制備CBS重組蛋白的基因工程技術平臺，表達純化出具有生物活性的重組CBS 蛋白；并且建立高同型半胱氨酸血癥的動物模型，高同型半胱氨酸血癥治療效果的檢 測和評價體系，在此模型基礎上，觀察到重組CBS蛋白可以顯著促進高濃度HCY水平下 人內皮細胞的存活，顯著降低血中HCY水平，保護心血管系統，顯著降低高HCY導致 的心血管系統的損傷。對CBS作為治療高同型半胱氨酸血癥的生物藥物的研制技術路 線進行了設計并且進行了其應用性實驗。 發明內容本發明的目的在于提供一種可以治療高同型半胱氨酸血癥的生物制劑(rhCBS蛋 白)，及大量制備有活性的rhCBS的生物工程制備方法，其特征是對人CBS基因進行克 隆，單獨構建CBS原核表達體系，獲得具有生物學活性的rhCBS蛋白，并確定rhCBS 蛋白在高同型半胱氨酸血癥中的治療作用。本發明采用下述技術方案(1) 人CBS基因的獲取及pET-32a-CBS重組質粒的構建(2) BL21-CBS工程菌的構建及rhCBS蛋白的表達和純化(3) rhCBS蛋白活性測定(4) rhCBS蛋白治療高同型半胱氨酸血癥的應用(5) rhCBS蛋白與葉酸、VitB6、 VitB12治療高同型半胱氨酸血癥效果評價及在治 療相關心血管疾病的應用所建立的工藝穩定、純度高、活性好。本發明的主要特點為 1.利用原核表達系統成功表達了具有野生活性的rhCBS，并且根據已知的CBS的 生物學活性，基于我們對有關rhCBS對組織細胞內和細胞培養液中HCY水平的影響，且發現rhCBS蛋白對高水平HCY作用下的內皮細胞和心肌細胞具有保護功能，可以顯 著降低大鼠高同型半胱氨酸血癥模型中血中HCY水平，顯著減輕高同型半胱氨酸導致 的心血管損傷，提出以rhCBS作為治療高同型半胱氨酸血癥及其相關心血管疾病的生物 制劑。2. 建立了評價外源性rhCBS治療高同型半胱氨酸血癥效果的評價體系。包括整 體動物血漿，心血管功能損傷及恢復的監測，離體細胞HCY水平的檢測方法，心血管 細胞損傷的檢測方法等。3. 建立了 rhCBS高效表達的技術路線。包括重組DNA技術的運用，正交實驗設 計確定最佳誘導表達時間、溫度及IPTG濃度的方法，從而使產物以可溶形式表達并且 具有野生型活性，并且提高了產物的表達量，增加了 rhCBS蛋白與HCY的特異性結合 能力及其轉硫催化能力。說明書附l CBS PCR擴增測序。PCR擴增，對DNA進行序列測定。圖2 CBS基因克隆。1 DNA marker;泳道2-5 PCR擴增產物；在1200-2000bp之 間約1600bp位置特異性DNA條帶，箭頭所示即為PCR擴增的CBS DNA條帶。圖3 rhCBS蛋白表達。泳道1,蛋白Marker; 2, BL21正常菌；3， BL21 (轉化 pET-32a-CBS質粒)誘導菌；在泳道3分子量70kD左右出現特異性蛋白條帶，箭頭所示 即為rhCBS蛋白。圖4 rhCBS蛋白Wtstern Blotting鑒定。1,正常兔血清；2， CBS多克隆抗體。 抗原均是rhCBS蛋白，上樣量30ug;血清與抗體1: 500稀釋，羊抗兔二抗1: 5000 稀釋。圖5 rhCBS蛋白活性測定。按實施例6的方法進行測定，*P<0. 05與肝組織蛋白 比較。圖6 rhCBS蛋白對細胞培養液中HCY水平的影響。按實施例7的方法進行，培養 的細胞為人臍靜脈內皮細胞^P〈0. 05與對照組比較，對照組為添加等濃度的BSA蛋白。圖7 rhCBS蛋白對培養大鼠心肌細胞和人臍靜脈內皮細胞死亡率的影響，采用 lOmmol/L HCY干預培養細胞24h，其中對照為肝組織蛋白。*P<0. 05與對照組比較。圖8 rhCBS蛋白與葉酸、VitB6、 VitB12分別對大鼠血漿高同型半胱氨酸水平的影響。*P<0.05與高蛋氨酸組比較；弁PO.05與葉酸、VitB6、 VitB12組比較。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。 實施例1一種重組人胱硫醚e-合成酶(rhCBS)的制備方法，其特征是對人CBS基因進行克隆，單獨構建rhCBS原核表達體系，獲得具有生物學酶活性的rhCBS蛋白，具體步 驟包括構建pET-32a-CBS表達質粒；轉化BL21宿主菌；表達、分離純化具有酶活 性的rhCBS蛋白。 實施例2CBS基因克隆的獲取鑒于大腸桿菌對氨基酸密碼子的偏愛與人體細胞的差異，本發明設計合成了人基因5'端含大腸桿菌偏愛密碼子的DNA片段，它可以在不改變產物人CBS的氨基酸組成與 排列順序的基礎上，提高CBS在大腸桿菌中的表達水平；以Genbank報道的人CBS全 cDNA序列為基礎，在CBS基因的上下游的非編碼區和編碼區設計了兩對引物，非編碼 區引物1 Pl(上游引物)P2(下游引物)；在編碼區設計并合成引物2 P3(上游引物) P4(下游引物)，用此對引物擴增含起始密碼子ATG的CBS目的基因。其中引物P3(上游 引物)引入酶切位點EcoR I ，引物P4(下游引物)引入酶切位點BamH I及相應的保護堿 基。引物由上海英駿生物公司合成。參見表l，采用巢式PCR擴增全長CBS。引物序列擴增片斷長度Pl5' CACCAGGATCCCATGACAGATTCTGTTG3，P25' GTCACGTTCTGGAACATTCTGTCATCAC3，2021 bpP35' CGGAATTCCAGCACATCTGTCCGGTCCA3，P45' CCGAAGCTTCCAGGCCAGGCAGTTACCAAT3，1700 bp采用微量異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法自人肝癌細胞系H印G2純化總RNA，使 A260/A280比值〉1. 8，取10 yl (約5 u g)總RNA，加50 pmol 3'端引物，70。C熱 變性5min，室溫冷卻使其自然降溫，待降至室溫后，42'C水浴中依次加入下列樣品 反轉錄反應體系5 x反轉錄緩沖液 5 ul RNA酶抑制劑 20U 40nM焦磷酸鈉 3 P 1AMV逆轉錄酶 15U (1 y 1)dNTP (各2. 5mM) 2 y 1加無RNA酶水至 25 ii 1上述混合物42"C水浴60min，加H20 75 ul 7(TC作用5min滅活反轉錄酶，該反應 物可作為PCR擴增的起始模板，取反轉錄產物20ul，加入下列成分2 x Pfu 10u 1Pl引物 20pmo1 P2引物 20pmo1 力口 H20至 20 u 1上述混合物反應條件95°C、 4min; 95°C lmin、 56°C 60s、 72°C 3min，進行30個循環的擴增反應后延伸10min，取反應物進行電泳鑒定，觀察到2kb左右處的條帶； 用凝膠回收試劑盒回收此區域條帶，再以此回收產物為模板，用引物2進行PCR擴增， 反應條件95°C、 5min;95°C lmin、 55°C 60s、 72°C 4min，進行35個循環的擴增 反應后延伸10min結果在1700bp左右見單一條帶，與CBS序列長度一致。圖2所示 實施例3人CBS基因在大腸桿菌中的表達及序列分析表達載體的構建可通過以cDNA為模板擴增CBS基因全長，經限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切目的基因產物和表達載體質粒pET-32a,經瓊脂糖凝膠電泳分離和 回收得到兩DNA片段等摩爾混合，T4 DNA連接酶12-16。C連接反應過夜，連接物 pET-32a-CBS重組質粒轉化入CaCl2處理的E.Coli BL21中，經氨節青霉素篩選培養。 挑選單個菌落，制備質粒，用限制性內切酶酶切鑒定，含有人CBS基因片段并且插入 方向正確者為目的工程菌；測定CBS基因序列，經Blast比對，與Genbank報導的100% 匹配，見圖l。它能在大腸桿菌BL21中高效表達，使CBS占菌體總蛋白的20%左右，表 達率經100次以上傳代不降低。圖3工程菌在37匸條件下用液體LB培養基擴增培養、通過對溫度、IPTG和誘導時間三 個變量的正交實驗設計，最后確定工程菌的最佳誘導表達條件為30°C、 0.5mmol/L IPTG、誘導4h，此時rhCBS蛋白以可溶性形式存在，在70kd左右多出一條特異性蛋白 條帶，該蛋白能與人CBS多克隆抗體呈現特異反應。見圖4 實施例4rhCBS蛋白的分離純化根據實施例2的方法，在1L LB液體培養基大量表達rhCBS蛋白，以10: 1濃縮 菌液，加入lmg/mL溶菌酶，-7(TC反復凍融3次，在30%能量，6s/6s時間間隔超聲破 碎。經12000rpm離心10min，收集上清，按利用法瑪西亞公司的HisTr即純化試劑盒 進行純化。lml HisTrap預裝柱經平衡液平衡8ml——上樣(lml上清液，流速0. 2ml/min)— 一柱洗滌液洗滌8ml——20隱ol/L咪磋洗脫液預洗脫8ml——300ramol/L咪磋洗脫液洗 脫——收集2-8ml洗脫液，收集70kd的rhCBS洗脫液，再經透析袋(截流分子量約10kd) 透析過夜，其間換液4次，將透析后的樣品冷凍千燥，-7(TC保存。 實施例5rhCBS蛋白的鑒定按實施例3制備的rhCBS蛋白用SDS-PAGE法檢定純度，所用積層膠為5%，分離膠 為10%;檢測結果顯示，純度均在98%以上。經Western Bloting鑒定，選用人CBS 多克隆抗體為一抗，4t孵育過夜，洗膜三次，山羊抗兔二抗孵育lh，洗膜三次，ECL 顯影，在70kd處可見清晰的特異性條帶，表明rhCBS蛋白可以被多克隆抗體識別，具 有抗原性，適合進一歩實驗。見圖4。實施例6rhCBS蛋白活性測定rhCBS體外酶活測定，參照相關文獻[Kraus, 1987]的測定方法。整個反應體系 為100niMTris-HCl(pH8. 6)， 10mM ['t]絲氨酸(1000cpm/nmol) (Bio-Rad) ， 1,5mM絲 氨酸，0.5 mg/ml BSA， 4 mM L-胱硫醚，0. 5 mM PLP, 0.5 mM AdoMet，體系中加入 150ug重組CBS純品蛋白。添加15禮L-同型半胱氨酸啟動整個反應，在37。C孵育 4小時。反應體系離心，10ul上清液點在薄色譜板上，TLC在異丙醇甲酸水(80:6:20 v/v)液體中層析分離。以L-胱硫醚標準品指示反應產物位置，切下相應色譜區，浸入 閃爍液(含0. 5% PP0和0. 04% P0P0P的甲苯)中，用Phosphoi隨ger (Tri-Carb 2證R' Packard-Perkin Elmer, Boston, MA)測定[MC]胱硫醚放射性活性，用nmol/h'mg protein表示CBS活性，同時設立對照組為新鮮肝組織蛋白(肝中CBS酶活性最高)； 不同三人重復測量3次，取平均值。結果原核表達純化的rhCBS蛋白活性可達到 117.8,1/h'mg'顯著高于肝組織中的酶活性，見圖5。同時rhCBS可以明顯降低培養 細胞液中的HCY的水平，見圖6。表明rhCBS蛋白可以應用于體外的應用。 實施例7rhCBS蛋白對心血管細胞的保護作用體外常規培養大鼠心肌細胞，在細胞培養液加入10—2M HCY，同時給予0.8 mM PLP， 0.8mM AdoMet， 12mM絲氨酸，加入rhCBS蛋白0.2mg/ml，作用4h，檢測心肌細胞培 養液中HCY濃度變化，并檢測心肌細胞的死亡率。結果顯示:rhCBS蛋白使心肌細胞培養 液中HCY含量降低32。/。，心肌細胞死亡率降低3. l倍。表明外源性rhCBS蛋白對高水平HCY 作用下的心肌細胞具有保護功能。見圖7A體外常規培養人臍靜脈內皮細胞，在細胞培養液加入10—2MHCY，同時給予0.8mMPLP, 0.8mM AdoMet， 12mM絲氨酸，加入rhCBS蛋白0.2rag/tnl，作用4h，檢測內皮細胞培 養液中HCY濃度變化，并檢測內皮細胞的功能及死亡率。結果顯示，rhCBS蛋白使內皮 細胞培養液中HCY含量降低39。/。，內皮細胞死亡率降低4.2倍。表明外源性rhCBS蛋白對 高水平HCY作用下的內皮細胞具有保護功能。見圖7B以上的結果顯示,rhCBS可以顯著降低高HCY對心血管細胞的損傷作用， 實施例8rhCBS蛋白對大鼠高同型半胱氨酸血癥的保護作用成年Wistar大鼠，雌雄各半，體重180-200g，隨機分為對照組，高蛋氨酸組，高 蛋氨酸+葉酸組，高蛋氨酸+維生素B12 、高蛋氨酸+維生素B6組，高蛋氨酸+ rhCBS 組，每組12只，正常組給予正常飼料，高蛋氨酸給予高蛋飼料喂養，建立大鼠高同型 半胱氨酸血癥模型。結果顯示，葉酸組、維生素B12、維生素B6組、rhCBS組均可以使 高同型半胱氨酸血癥大鼠血漿HCY水平降低，rhCBS組降低最顯著，與高蛋氨酸組比較， 降低約4.4倍，通過rhCBS治療后，大鼠血漿HCY水平基本恢復到正常水平，見圖8。大鼠主動脈和心肌病理切片顯示葉酸組、維生素B12組、維生素B6組、rhCBS組與高蛋氨 酸組比較，均可以減輕心血管損傷，其中rhCBS組的保護作用最明顯。表明外源性rhCBS 蛋白可以顯著降低高同型半胱氨酸血癥大鼠血中HCY水平，抑制高同型半胱氨酸對心血 管系統的損傷作用，rhCBS蛋白可以作為治療高同型半胱氨酸血癥引起的心血管疾病。 治療效果優于傳統的治療高同型半胱氨酸血癥的葉酸、維生素B12、維生素B6，效果更 為顯著。
權利要求
1.重組人胱硫醚β-合成酶(rhCBS)在制備用于治療或預防高同型半胱氨酸血癥及其相關的糖尿病和心血管疾病的藥物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的rhCBS，其特征是與Genbank中收錄的人CBS蛋白有90%以上 的同源性的重組蛋白。
3. 根據權利要求1和2所述的rhCBS，其制備方法是可以是但不僅限于以下重組方法， 主要歩驟包括① 構建pET-32a-CBS表達質粒，轉化大腸桿菌，如BL21。② 在BL21宿主菌中表達、分離純化具有酶活性的rhCBS蛋白；(D在純化的rhCBS蛋白中加入可接受的藥用輔料，制備成藥學和臨床可接受制劑。
全文摘要
本發明公開了一種重組人胱硫醚β-合成酶(rhCBS)在制備用于治療或預防高同型半胱氨酸血癥及其相關的糖尿病和心血管疾病的藥物中的應用及其制備方法。制備方法主要采用大腸桿菌原核表達系統，經過表達條件的優化，獲得活性很高的rhCBS；rhCBS能夠顯著降低細胞培養液中HCY濃度，顯著提高心肌細胞、內皮細胞在高HCY水平下的存活率；在高同型半胱氨酸血癥整體動物模型中，與傳統的治療高同型半胱氨酸血癥的葉酸、VitB₆、VitB₁₂比較，rhCBS能夠顯著降低高蛋氨酸喂養的大鼠血漿中的HCY水平，減輕心肌和血管的損傷，具有非常明顯的治療高同型半胱氨酸血癥的作用。rhCBS可以應用于制備治療或預防高同型半胱氨酸血癥及其心血管疾病的藥物，具有廣闊的市場前景。
文檔編號A61P9/00GK101322840SQ20081005328
公開日2008年12月17日 申請日期2008年5月28日 優先權日2008年5月28日
發明者雪 冷, 杲修杰, 云 趙, 錢令嘉 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所