專利名稱：：一種高分子脂質體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的高分子脂質體的制備和應用。屬于脂質體的制備及應用技術。
背景技術：
：脂質體(Liposome)是磷脂依靠疏水締合作用在水中自發形成的一種分子有序組合體，為多層囊泡結構，每層均為類脂雙分子膜，層間和脂質體內核為水相，雙分子膜間為油相。脂質體應用非常廣泛，制備工藝簡單、方法多樣，其粒子大小處于納米級的介觀范圍，有許多獨特的物理、化學性質，粒徑還可根據需要進行控制；可用于納米粒子的制備、臨床檢驗和診斷、催化反應的控制、模擬膜研究及在體內外將基因或其它物質向細胞內傳遞等。脂質體自20世紀70年代開始作為藥物載體應用以來，由于具有制備簡單，對人體無害，無免疫原性反應，易實現靶向性，可提高和延長藥物療效，緩和毒性，避免耐藥性和改變給藥途徑等優點備受重視；它對所載藥物有廣泛的適應性，水溶性藥物被包于水相中，油溶性藥物溶于雙分子膜內，兩親性藥物插入雙分子膜。1988年，第一個脂質體藥物在美國進入臨床試驗，至今已有多種藥物(如阿霉素脂質體)在幾十個國家上市。脂質體進入體內后迅速被單核吞噬細胞系統(MPS)清除，半衰期很短，而且只有小于300nm的脂質體粒子才能穿過竇狀型毛細血管離開循環系統到相關組織(肝、脾、骨髓和實質性腫瘤等)；且由于血中的白蛋白、調理素、抗體等各種物質的作用，脂質體可能發生破裂，致使包封藥物快速滲漏，很快被網狀內皮系統識別、吸收，從體循環中清除，不能很好發揮"導彈"功能。脂質體在儲存期間，磷脂易氧化水解，雙分子膜易相變，小粒徑脂質體易相互聚集融合，包裹其中的藥物因而也發生滲漏；嚴重影響其性能。因此，研制穩定的多功能脂質體是走向實用的前提，有重要的現實意義和應用價值。而且，各國學者也都試圖用廉價的合成高分子材料替代合成磷脂，制備類脂泡囊，以降低成本，增加實用性，但經體外試驗證明，這類高分子類脂小囊受到生物相容性和生物可降解性的限制。
發明內容本發明的目的是提供一種新型高分子脂質體，它具有脂質體的優點，同時具有高分子物質特有的多功能和穩定性，可滿足上述應用對脂質體的要求。本發明的一種高分子脂質體，其結構中含有雙親性殼聚糖長鏈烷基季銨鹽和小分子磷脂的具有脂質雙層膜結構的囊泡。所述的雙親性殼聚糖長鏈垸基季銨鹽的重均分子量大于2000，可溶于有機溶劑氯仿或二氯甲烷。-所述的雙親性殼聚糖長鏈烷基季銨鹽的結構式如下nhch2ch(oh)ch2—n+'ch3x-(|h2)17ch3其中X為I，Br或Cl;n為241242;本發明中用于制備高分子脂質體的殼聚糖長鏈垸基季銨鹽為中國發明專利200710056993.4公開的一類雙親性殼聚糖長鏈垸基季銨鹽。所述的小分子磷脂包括通常使用的用于制備脂質體的膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺、葡萄糖苷、大豆甾醇、中性磷脂、負電荷磷脂和正電荷磷脂。所述的高分子脂質體為正電性陽離子高分子脂質體；并具有脂質雙層膜結構，殼聚糖長鏈垸基季銨鹽為膜的主體，小分子磷脂膽固醇鑲嵌其中起穩定作用。所述的高分子脂質體用于分別或同時包載水溶性物質、油溶性物質和兩親性物質；其中水溶性物質被包于水相中，油溶性物質分布于雙分子膜內，兩親性物質插入雙分子膜內。所述的高分子脂質體用于包載磁性物質制備磁性高分子脂質體，磁性高分子脂質體具有以下特征水溶液中穩定、分散性好、粒徑均勻、不易團聚、超順磁、粒徑可小于50nm。所述的高分子脂質體用于包載量子點制備量子點標記的高分子脂質體，量子點標記的高分子脂質體具有以下特征保持了量子點的熒光特性、水溶液中穩定、分散性好、粒徑均勻、粒徑可小于50nm。本發明的一種高分子脂質體的制備方法可以采用通常使用的制備方法如a)將殼聚糖長鏈烷基季銨鹽和小分子磷脂及油溶性物質共溶于有機溶劑中，混勻；b)將步驟a)中得到的混合溶液通入氮氣并除去有機溶劑使成薄膜，然后加入含有水溶性物質的水溶液使脂質水化；或將含有水溶性物質的水溶液與步驟a)得到的混合溶液共混超聲乳化，再除去有機溶劑。所述的水溶性、油溶性或雙親性物質包括藥物、蛋白、基因、營養物質、維生素、及磁性物質、量子點和Si02等無機顆粒。本發明的一種高分子脂質體為一種陽離子高分子脂質體。由本發明的高分子脂質體包被磁性納米顆粒所制備的磁性高分子脂質體具有粒徑均一、分散性好、不易團聚和超順磁的特性。本發明提供的高分子脂質體的制備方法為用于制備脂質體的所有方法，包括薄膜分散法、反向蒸發法、復乳法、離心法、pH梯度法、注入法和混溶法。其中薄膜分散法和反向蒸發法的基本步驟為先將殼聚糖長鏈垸基季銨鹽和小分子磷脂及油溶性物質共溶于氯仿或其他有機溶劑中，混勻得溶液I;然后配置含有水溶性物質的水溶液II。薄膜分散法為將溶液I通入氮氣并除去有機溶劑使成薄膜；用水溶液II超聲使脂質薄膜水化；反向蒸發法為將溶液I與水溶液II共混超聲乳化，再除去有機溶劑。最后全部采用柱過濾法、離心法或透析法進行純化。本發明中制備的羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽高分子脂質體的粒徑分布均勻，按結構分為單室高分子脂質體、多室高分子脂質體和多囊高分子脂質體。高分子脂質體具有脂質雙層膜結構，羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽為膜的主體，小分子磷脂膽固醇鑲嵌其中起穩定作用，其中水溶性物質被包于水相中，油溶性物質分布于雙分子膜內，兩親性物質插入雙分子膜。且高分子脂質體在水溶液中具有很好的物理和化學穩定性，表現在高分子脂質體的水溶液經冷凍和8(TC的高溫后結構不會發生變化，DSC譜圖上12(TC以下沒有熱量的變化。高分子脂質體的Zeta電位可達+52.72mv;且可以根據所使用的羧甲基殼聚糖十八垸基季銨鹽中季銨基團取代度進行調節，可以滿足作為基因載體的需要。本發明中制備的載有長春新堿的高分子脂質體對長春新堿的載藥率可達15.0%，包、,封率在90.0%以上，在Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液中具有良好的緩控釋功能，緩釋時間在兩周以上，突釋現象不明顯。本發明中制備的磁性高分子脂質體在水溶液中具有很好的分散性，幾乎不發生團聚現象，粒徑可達到100nm以下，且分布均勻，高聚物脂質體中的磁性粒子保持原Fe304的晶型結構，比飽和磁化強度可達27.9emu/g，具有超順磁性，可滿足磁靶向性的需要；磁性長春新堿高分子脂質體的包封率可達93.1%,在Tris-HC1(pH=7.4)緩沖溶液中具有良好的緩控釋功能。本發明中制備的量子點標記的高分子脂質體在水溶液中分散性好，粒徑可達到100nra以下，分布均勻，被包裹的量子點依然保持很高的熒光特性，不會發生熒光淬滅現象，且體系穩定，4'C下可保存6個月以上。本發明中制備的高分子脂質體表面含有羧基和氨基，可以連接多種靶向物質，所制備的跨膜肽Tat介導的高分子脂質體在PBS緩沖溶液中可穩定存在，并可保持小分子多肽Tat的活性，具有跨細胞膜和跨血腦屏障的功能。與現有產品和技術相比，本發明的特點在于1.整個制備過程簡單易行，條件要求不高，適合于工業化大生產要求。2.使用羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽為一種多功能的殼聚糖衍生物。其分子量在2000以上，可根據需要選擇不同的分子量；殼聚糖長鏈烷基季銨鹽中長鏈烷基季銨鹽的取代度可以進行調節，從而對高分子脂質體的親水親油性和Zeta電位進行控制，滿足不同的需要。3.高分子脂質體表面含有羧基和氨基等官能團，不用進行表面改性就可以連接多種靶向物質，省去了傳統脂質體必須用含羧基或氨基等制劑進行修飾才能連接耙向物質的過程。4.高分子脂質體的粒徑可達100nm以下，并可根據需要通過不同的制備方法來控制粒徑，整個體系的穩定性較高，耐酸堿和高溫；載藥高分子脂質體制備簡單，包封率和載藥率高，緩控釋功能良好，藥物滲漏較少。5.高分子脂質體的實用性強，可包裹不同的水溶、油溶和雙親性物質，并可同時包載兩種或兩種以上的物質，包載后的高分子脂質體粒徑分布均勻，穩定性高，且能發揮所包載物質的功能。圖1為使用反向蒸發法所制備的高分子脂質體的透射電鏡照片，由圖可見其粒徑基本在50nm左右。圖2為使用反向蒸發法所制備的高分子脂質體在水溶液中的粒徑分布圖，由圖可見其平均粒徑為74.lnm,粒徑分布較窄，多分散指數為0.224。圖3為包載水溶性磁粒子的高分子脂質體的透射電鏡照片，由圖可見其粒徑在20nm左右，分布均勻，分散性好。圖4為包載油溶性量子點的高分子脂質體的透射電鏡照片，由圖可見其粒徑在50nm左右，且大小均勻。具體實施方式下面的實施例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。實施例1:本實施例探討采用反向蒸發法時羧甲基殼聚糖十八垸基季銨鹽(QACMC)和膽固醇的不同配比對高分子脂質體粒徑產生的影響。將不同配比的羧甲基殼聚糖十八垸基季銨鹽(重均分子量為2萬，季銨鹽取代度為20.0%)和膽固醇共溶于二氯甲烷中，混勻得溶液I;準備去離子水溶液II，其中溶液I和溶液II的比例為l:2;將兩種溶液混合后，充分超聲乳化，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾除盡二氯甲垸得高分子脂質體溶液。該高分子脂質體為正電性的陽離子高分子脂質體，其表面Zeta電位可達+52.72mv。由表1可見，調整QACMC和膽固醇的質量配比可以得到不同粒徑大小的高分子脂質體，所得的高分子脂質體在水溶液中的粒徑大小分布也都比較均勻。表1為不同的羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽(QACMC)和膽固醇配比下高分子脂質體粒徑的大小。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2:本實施例為使用不同分子量的羧甲基殼聚糖長鏈烷基季銨鹽制備高分子脂質體的探討，采用反向蒸發法。稱取羧甲基殼聚糖十二烷基季銨鹽(重均分子量為1萬，季銨鹽取代度為80.0%)20mg，大豆甾醇10mg，溶于3ml二氯甲垸中，振蕩均勻得溶液I;稱取3.Omg牛血清白蛋白(BSA)溶于5mlPBS(pH=7.4)緩沖溶液中，搖勻使BSA充分溶解得水溶液II;然后將上述兩種溶液I和II共混乳化，超聲10min，待形成穩定的乳液后放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾至二氯甲垸揮發完全，過凝膠分離柱分離未包裹的BSA得載BSA的高分子脂質體，如圖1所示，所制備的高分子脂質體羧甲基殼聚糖十八垸基季銨鹽/膽固醇粒徑在50nm左右，粒徑較小，且對藥物的包封率在90%以上。其中可以使用重均分子量可以大于2000的羧甲基殼聚糖長鏈烷基季銨鹽制備高分子脂質體。實施例3:本實施例為使用除羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽外，使用其他種類殼聚糖長鏈垸基季銨鹽來制備高分子脂質體的實例。稱取羧甲基殼聚糖辛垸基季銨鹽(重均分子量為2000，季銨鹽取代度為40.0%)15mg，葡萄糖苷12mg,溶于3ml二氯甲烷中，振蕩均勻得溶液I，然后放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾，并不時的通入氮氣，直至二氯甲垸揮發完全，然后室溫真空干燥24h:稱取3.0mg長春新堿溶于5ralPBS(PH=7.4)緩沖溶液中，搖勻使長春新堿充分溶解得水溶液II;然后將上述5.0ml長春新堿溶液II加入茄形瓶中，在超聲的條件讓脂質薄膜充分水化，超聲10min后，過凝膠分離柱分離游離的藥物得載長春^堿的高分子脂質體，其粒徑分布圖如圖2所示，載藥高分子脂質體平均粒徑約為74.lnm,多分散指數為0.224，粒徑分布較窄。使用此方法制備的長春新堿高分子脂質體包封率可達90.0%以上，且在Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液中具有良好的緩控釋功能。用類似方法也可使用中國發明專利200710056993.4公開的一類雙親性殼聚糖長鏈垸基季銨鹽來制備高分子脂質體。實施例4:本實施例提供使用其他小分子磷脂的實例。稱取殼聚糖十八烷基季銨鹽(重均分子量為1萬)15.0mg,二油酰脂酰乙醇胺(DOPE)12.0mg共溶于3.0ml二氯甲烷中，振蕩均勻得溶液I，放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾，并不時的通入氮氣，直至二氯甲烷揮發完全，然后室溫真空干燥24h后再用溶有3.Omg水溶性磁粒子的5.OmlPBS(pH=7.4)緩沖溶液II超聲水化10min;或將溶液I溶液II共混乳化，超聲10min，待形成穩定的乳液后放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾至二氯甲垸揮發完全；過凝膠分離柱分離游離的藥物得磁性高分子脂質體(殼聚糖十八烷基季銨鹽/DOPE)。該類脂質體的Zeta電位可達+40.Omv，表面可吸附基因，可作為一種高效的基因轉染試劑。類似的可用其他小分子磷脂脂質代替DOPE制備其他高分子脂質體。實施例5:本實施例為利用高分子脂質體包載水溶性物質的探討。稱取羧甲基殼聚糖雙十二垸基季銨鹽(重均分子量為5000)15mg，卵磷脂12mg，溶于3ml二氯甲垸中，振蕩均勻得溶液I，然后放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾，并不時的通入氮氣，直至二氯甲垸揮發完全，然后室溫真空干燥24h;稱取3.0mg長春新堿溶于5mlPBS(pH=7.4)緩沖溶液中，搖勻使長春新堿充分溶解得水溶液II;然后將上述5.Oml長春新堿溶液II加入茄形瓶中，在超聲的條件讓脂質薄膜充分水化，超聲10min后，過凝膠分離柱分離游離的藥物得載長春新堿的高分子脂質體。使用此方法制備的長春新堿高分子脂質體包封率可達90.0%以上，且在Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液中具有良好的緩控釋功能。用類似方法也可分別制得包載其它水溶性物質的高分子脂質體，只須將需要的水溶性物質溶于相應的水溶液II既可。實施例6:本實施例為使用高分子脂質體包載油溶性物質的探討。稱取賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(重均分子量為5000，季銨鹽取代度為50.0%)15mg，磷脂酸5mg和3.0mg脂溶性維生素E共溶于3ml二氯甲烷中，振蕩均勻，放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾，并不時的通入氮氣，直至二氯甲垸揮發干凈，然后室溫真空干燥24h后再用5.0mlPBS(pH=7.4)緩沖溶液超聲水化；或將二氯甲烷溶液與5.Oml'PBS(pH=7.4)緩沖溶液共混乳化，超聲10min，待形成穩定的乳液后放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾至二氯甲烷揮發完全；過凝膠分離柱分離游離的藥物得載維生素E的高分子脂質體。所得維生素E高分子脂質體包封率可在80y。以上，粒徑可控，并具有緩釋效果。用類似方法也可分別制得包載其它油溶性物質的高分子脂質體。實施例7:本實施例為使用高分子脂質體包載兩種或兩種以上物質的探討。稱取O-羥乙基殼聚糖十八烷基季銨鹽(重均分子量為1萬，季銨鹽取代度為60.0%)15rag，硬脂酰胺5mg和3.0mg紫杉醇共溶于3ml二氯甲烷中，振蕩均勻，放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾，并不時的通入氮氣，直至二氯甲烷揮發完全，然后室溫真空干燥24h;稱取3.Omg阿霉素溶于5mlPBS(pH=7.4)緩沖溶液中，搖勻使阿霉素充分溶解；然后將上述5.0ml阿霉素溶液加入茄形瓶中，在超聲的條件讓含紫杉醇的脂質薄膜充分水化，超聲lOmin后，過凝膠分離柱分離游離的藥物得同載紫杉醇和阿霉素的高分子脂質體。用類似方法也可分別制得包載其它兩種或兩種以上藥物的高分子脂質體，其中油溶性藥物溶于油相中，水溶性藥物溶于水相中。實施例8:本實施例為制備磁性高分子脂質體的探討。稱取羧甲基殼聚糖十八垸基季銨鹽(重均分子量為2萬，季銨鹽取代度為60.0%)20mg，膽固醇5mg，2.5mg維生素E和2.5mg維生素C共溶于3.0ml二氯甲烷中，振蕩均勻得溶液I，放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾，并不時的通入氮氣，直至二氯甲垸揮發完全，然后室溫真空干燥24h后再用溶有3.0mg5-氟尿嘧啶和5.Omg水溶性磁粒子的5.0mlPBS(pH=8.0)緩沖溶液II超聲水化；或將溶液I與溶液II共混乳化，超聲10min,待形成穩定的乳液后放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾至二氯甲垸揮發完全；過凝膠分離柱分離游離的藥物得同載維生素和5-氟尿嘧啶的磁性高分子脂質體，其透射電鏡照片如圖3所示，該磁性高分子脂質體水溶液中的粒徑在20nm左右，可穩定存在、分散性好、粒徑均勻、不易團聚、并有超順磁性。用類似方法也可制得包載油溶性磁顆粒的磁性高分子脂質體。實施例本實施例為制備量子點標記的高分子脂質體的探討。稱取羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽(重均分子量為2萬，季銨鹽取代度為60.0%)lOmg，膽固醇10mg共溶于3ml二氯甲垸中，再加入含有0.5mgCdSe量子點的二氯甲烷溶液lml，振蕩均勻，放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾，并不時的通入氮氣，直至二氯甲烷揮發完全，然后室溫真空干燥24h后再用5.OmlPBS(pH=7.4)緩沖溶液超聲水化；或將二氯甲垸溶液與5.0mlPBS(pH=7.4)緩沖溶液共混乳化，超聲10min，待形成穩定的乳液后放入茄形瓶中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾至二氯甲垸揮發干凈；過凝膠分離柱分離后得量子點標記的高分子脂質體，其透射電鏡照片如圖4所示，該量子點標記的高分子脂質體水溶液中粒徑大多在50nm以下，分布均勻，分散性好，且保持了量子點的熒光特性。本發明提出的一種高分子脂質體的制備及其應用，已通過實施例進行了描述，相關技術人員明顯能在不脫離本發明的內容、精神和范圍內對本文所述的內容進行改動或適當變更與組合，來實現本發明。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發明的精神、范圍和內容中。權利要求1.一種高分子脂質體，其特征在于其結構中含有雙親性殼聚糖長鏈烷基季銨鹽和小分子磷脂的具有脂質雙層膜結構的囊泡。2.如權利要求書1所述的一種高分子脂質體，其特征在于所述的雙親性殼聚糖長鏈烷基季銨鹽的重均分子量大于2000，可溶于有機溶劑氯仿或二氯甲垸。3.如權利要求書1或2所述的一種高分子脂質體，其特征在于所述的雙親性殼聚糖長鏈烷基季銨鹽的結構式如下4.如權利要求書1所述的一種高分子脂質體，其特征在于所述的小分子磷脂包括用于制備脂質體的膽固醇、二油酰脂酰乙醇胺、葡萄糖苷、大豆甾醇、中性磷脂、負電荷磷脂和正電荷磷脂。'5.如權利要求書1所述的一種高分子脂質體，其特征在于所述的高分子脂質體為正電性陽離子高分子脂質體；并具有脂質雙層膜結構，殼聚糖長鏈烷基季銨鹽為膜的主體，小分子磷脂膽固醇鑲嵌其中起穩定作用。6.如權利要求書1所述的一種高分子脂質體的應用，其特征在于所述的高分子脂質體用于分別或同時包載水溶性物質、油溶性物質和兩親性物質；其中水溶性物質被包于水相中，油溶性物質分布于雙分子膜內，兩親性物質插入雙分子膜內。7.如權利要求書1所述的一種高分子脂質體的應用，其特征是所述的高分子脂質體用于包載磁性物質制備超順磁性的磁性高分子脂質體，磁性高分子脂質體粒徑可小于50nm。8.如權利要求書1所述的一種高分子脂質體的應用，其特征是所述的高分子脂質體用于包載量子點制備量子點標記的高分子脂質體，量子點標記的高分子脂質體粒徑可小于50nm。全文摘要本發明涉及一種新的高分子脂質體的制備和應用。其結構為含有雙親性殼聚糖長鏈烷基季銨鹽和小分子磷脂的具有脂質雙層膜結構的囊泡。殼聚糖長鏈烷基季銨鹽的特征為重均分子量大于2000，可溶于氯仿等有機溶劑，含有羧基、或氨基或季銨鹽基團，具體為中國發明專利200710056993.4公開的一類雙親性殼聚糖長鏈烷基季銨鹽。該類高分子脂質體表面可連接多種靶向制劑，可同時和分別包載水溶性、油溶性或雙親性物質，包括藥物、蛋白、基因、營養物質、維生素、磁性顆粒和量子點等。該種高分子脂質體具有包封率高、操作簡便、適用性強、成本低的優點，包衣后的高分子脂質體粒徑分布均勻，最小粒徑可在20nm以下，體系穩定，載藥微球緩控釋功能強。文檔編號A61K9/127GK101239041SQ20081005246公開日2008年8月13日申請日期2008年3月18日優先權日2008年3月18日發明者津常,梁曉飛申請人:天津大學