專利名稱：復方丹參滴丸對心臟微循環障礙和心肌損傷的保護作用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥產品的新用途，特別涉及復方丹參滴丸在治療和/或預防心 臟微循環障礙和心肌損傷中的應用。
背景技術：
隨著人們生活水平的提高及生活習慣的改變，心血管疾病已經成為威脅人類 健康和生命、影響醫療財政的主要病種。每年全世界因心血管病而死亡的人數大
約有1650萬人，其中，中國約300萬人，占總死亡人數的45%。
心臟外科體外循環、冠狀動脈搭橋術、復雜先天性心臟病就治術、瓣膜置換 術及大血管外科手術等介入療法的臨床應用，某種程度上挽救了心血管患者的生 命，但是，術后缺血再灌注(ischemia / r印erfusion， I/R)損傷則成為阻礙 心臟血管外科手術遠期療效的主要難題。另一方面，心臟驟停后的復蘇和心血管 痙攣的環節引發的缺血再灌注損傷也已經影響了救治效果。因此預防和改善心肌
缺血再灌注損傷是提高心血管疾病就治效果、降低其死亡率的重要環節。
心臟冠狀血因痙攣、動脈硬化和血栓等因素阻塞時，造成起阻塞下流的缺血 和缺氧。缺血時ATP生成減少，AMP代謝分解產生次黃嘌呤，由于細胞內鈣離子增
多，激活蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶不可逆地轉變成黃嘌呤氧化酶。當溶栓、血管 擴張劑、或介入治療后，血流再通(再灌注)提供02時，次黃嘌呤和02及水在黃 嘌呤氧化酶催化下，產生大量負氧陰離子('02—) ， '02—在超氧化物歧化酶(SOD) 的作用下，轉化成過氧化氫(HA)，后者在過氧化氫酶(CAT)的作用下轉化成 H20， 一部分'(V和HA經過Haber-Weiss反應轉化成羥自由基(.OH)。另外， 血管內皮產生的N0與'02—結合成0N00-。 HA、 '0H、 ONOCT等都是毒性很強的過氧 化物，可以引起脂質過氧化、DNA斷裂等，導致血管內皮和心肌細胞損傷。I/R 產生的過氧化物，通過降解轉錄因子抑制蛋白-kb (i-kB)，活化核轉錄轉錄因 子(NF-kB)，引起其亞基P65, P50的核轉移，特別是P50的核轉移可以啟動調 亡相關蛋白的合成。血管內皮選折素(E-selectin)和白細胞選折素(L-selectin) 的表達引起白細胞沿血管壁滾動，血管內皮黏附分子ICMA-l和白細胞黏附分子CDllb/CD18的表達引起白細胞與血管壁的黏附。黏附與血管壁上的白細胞一方
面通過NADPH氧化酶進一步產生過氧化物，同時，又可以分泌蛋白酶，加重心臟
血管和心肌細胞的損傷。黏附于血管壁上的白細胞通過血管內皮細胞間隙或損 傷的血管內皮游出于血管外，加重血管周圍細胞的損傷。血管內皮細胞和血管基 底膜的損傷，增加了血管通透性，導致血漿白蛋白的外漏，造成血管周圍間質的
水腫。P50的核轉移還可以誘導腫瘤壞死因子-ct (TNF-a ) 、 IL-6等炎性介質的 合成和釋放，這些炎性因子進一步誘導黏附分子的表達和調亡蛋白的啟動，加重 心臟微循環障礙和心肌細胞損傷。缺血再灌注引起的心臟微循環障礙和心肌細胞 損傷是復雜的多環節的病理變化過程，氧自由基、鈣超載、白細胞與血管內皮細 胞的相互作用、炎性介質、細胞凋亡蛋白調控等均參與此過程，而過氧化物降解 I-kB,活化NF-kB，引起其亞基P65，或P50的核轉移，特別是P50的核轉移是加 重再灌注后微循環障礙和心肌細胞調亡的主要環節之一。
目前已經有過關于腺苷、降鈣素基因相關肽、緩激肽、PGI2 、 NO等對于心 臟I/R損傷的預防和改善作用的研究，但是，由于其僅可以作用于復雜的心臟I/R 損傷過程中的某一個環節或耙點，在改善心臟I/R后心微循環障礙和心肌細胞保 護方面的作用尚不盡人意。
復方丹參滴丸(CP)由丹參、三七、冰片的活性成份組成，在中國、韓國、 俄羅斯和越南等國主要用來治療心血管疾病。丹參是唇形科鼠尾草植物Salvia miltiorrhiza的干燥根，丹參水溶液的主要成分包括丹參素、原兒茶醛、原兒茶 酸、咖啡酸、丹酚酸A-G和紫草酸。其中，丹參素是其基本結構，參與了丹酚酸 A-G和紫草酸結構的構建。以往研究表明，在灌胃給予丹參總酸后，血清中可以 檢測到丹參素和咖啡酸。各種體內和體外研究表明丹參通過改善微循環，擴張冠 狀動脈，提高血流量，保護心肌來預防心肌缺血再灌注損傷。其機制主要為丹參 可以抑制心肌細胞內鈣離子的活化和超載，清除氧自由基，抑制心肌細胞凋亡和 保護血管內皮細胞等。丹參的水溶性成份可以提高I/R后大鼠的存活率，并且降 低左心室梗死面積，紫草酸B可以減少兔心臟缺血后心肌損傷的程度，丹酚酸A 和丹酚酸B可以保護大腦損傷，復方丹參滴丸可以改善I/R引起的肝臟損傷。丹參 素還可以減少由I/R引起的線粒體膜損傷和脂質過氧化，清除由黃嘌呤和黃嘌呤 氧化酶產生的超氧負離子('02-)，丹酚酸A可以抑制由I/R誘導的腦LPO和清除過氧化氫自由基(OH—),丹酚酸B可以清除l. 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， 抑制LPO并且清除大鼠肝細胞和肝星形細胞中的過氧化物，抑制在PCL2細胞中由 amyloid p印tide A引起的過氧化物的產生，抑制TNF-a誘導的人主動脈平滑肌 細胞過氧化物產生和NADPH氧化酶活性，紫草酸鎂B可以清除ON00-。此外，丹參 的水溶性成分還可以抑制TNF-a誘導的NF-icB的核轉移，原兒茶醛、丹酚酸B可 以抑制TNF- a誘導的HUVEC的ICAM-1和VCAM-1的表達和ICAM-l與VCAM-l的mRNA的 表達，抑制TNF-a誘導NF-kB和AP-1的DNA結合活性。丹參、丹酚酸B和丹參水 溶液可以抑制由TNF-a引起血管內皮細胞的E-selection的表達，CP劑量依存性 地抑制了TNF-a引起的HUVEC中ICAM-1和VCAM-l的表達，同時抑制血小板產生的 生長因子BB引起的在血管平滑肌細胞內DNA的合成和細胞增殖。丹參還可以抑制 心肌細胞內鈣離子的活化和超載，抑制心肌細胞凋亡。
三七是Panax notoginseng的干燥根，三七總阜苷(Panaxnotogiseng Saponins, PNS)為三七中的主要有效組分，主要包括30余種皂苷類成分。臨床 上廣泛用于心腦血管疾病、肝功能障礙等與微循環障礙相關疾病的治療。其機制 可能與三七的免疫調節功能，改善微循環障礙，抑制血小板的聚集和粘附因子的 表達，減少白細胞粘附于血管內皮以及提高內皮的功能相關。以PNS為主要成分 的傳統中藥復方制劑脈流能改善缺血再灌注(I/R)引起的大鼠腸系膜微循環障 礙，包括抑制白細胞粘與細靜脈管壁的黏附、細靜脈壁過氧化物的產生和血管周 圍肥大細胞脫顆粒，PNS還可以改善血管內皮功能。我們以往的體內研究結果證 明在LPS投入之前給予PNS能夠抑制白細胞與細靜脈的粘附，抑制體內肥大細胞脫 顆粒，體外研究結果證明了PNS可以抑制LPS誘導的粒細胞粘附分子CD18和CDllb 的表達。
復方丹參滴丸中的丹參的主要水溶性成分可以清除過氧化物、抑制血管內皮 細胞黏附分子的表達，PNS可以抑制白細胞黏附分子的表達。CP可以改善缺血再灌 注的肝微循環障礙有改善作用，抑制光化學方法引起的大鼠腸系膜血栓。此外CP 還可以抑制光化學方法引起的大鼠腸系膜血栓。但是，復方丹參滴丸對缺血再灌 注后的心臟微循環障礙是否有改善作用，對心臟細胞中I-KB-a降解和P50的核 轉移是否有抑制作用，對心肌細胞超微結構的損傷是否保護作用等尚未見報道。 為此，本實驗采用結扎冠狀動脈左前降支后再通造成缺血再灌注模型，用連接SIT攝像機和高速攝像機的正立顯微鏡和激光多普勒血流量儀動態觀察缺血再灌 注后大鼠心臟冠狀血管細動靜脈直徑和紅細胞流速，FITC標記的白蛋白的血管外 漏出狀態以及心臟血流量。同用TTC染色法計數心肌梗死體積，用TUNEL染色法觀 察和計數凋亡的心肌細胞，用透射電鏡觀察心臟血管和心肌細胞的超微結構的變 化，用Western檢測心臟組織的I-KB-a， P50, P65的表達，用紫外分光光度儀 檢測心臟組織中的MPO,研究復方丹參滴丸對再灌注后心臟微循環障礙和心肌損 傷的保護作用，并探討其機理。
發明內容
本發明提供復方丹參滴丸對心臟微循環障礙和心肌損傷的保護作用
本發明所述復方丹參滴丸，主要成份是丹參、三七和冰片組成的中藥復方制劑。
本發明所述丹酚總酸，復方丹參滴丸可以從市場上買到，也可以根據現有技術制
備，符合藥用標準即可。
本發明通過以下實驗數據證明本發明的效果
實驗一
復方丹參滴丸一次性預給藥對缺血再灌注引起的大鼠心臟微循環障礙和心肌損 傷的預防作用
1. 動物和試劑
雄性SD大鼠，體重250士10g，購買于北京大學醫學部動物中心，合格證號 SCXK(京)2006—0001。實驗動物的管理按衛生部發布的實驗動物管理指南執行， 動物飼養在溫度為24士rC，濕度為55±5%的條件下，自由飲食、飲水。
2. 手術過程
大鼠用2(^的烏拉坦(1.25g/kg)肌肉注射麻醉，仰臥位固定，頸部去毛，切 開皮膚，分離頸前肌，暴露氣管，行氣管插管。插管另端連于小動物呼吸機行加 壓呼吸(呼吸比1:1，呼吸頻率75次/min ，潮氣量12 mL/kg)。用熱毪維持肛 溫在37 - 37.5。C (YSI REF 401, Yellow Spring, Ohio, USA)度之間。胸部去 毛、消毒，沿胸骨左，右緣2 4肋開胸暴露心臟,剪開心包膜，用穿有3-0縫 合線的3/8彎針穿過肺動脈圓錐與左心耳交界稍下(1 2) mm處，結扎縫合線并 在絲線與心肌組間放一根聚乙烯小管,拉緊絲線形成造成缺血，心肌顏色變白為結扎成功的標志。30分種后放松絲線即發生再灌注，缺血區域恢復紅色為再灌 注成功的標志，假手術組只穿線不結扎。
3. 藥物及分組
復方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司提供，批號20040502)，常 溫下保存。實驗選用的SD大鼠，隨機分成5組(n=6)，假手術組(Sham)、缺血 再灌注模型(I/R)組、復方丹參滴丸0.1 g/kg+缺血再灌注組(CPO. l+I/R)、 復方丹參滴丸0.4 g/kg+缺血再灌注組(CPO. l+I/R)、復方丹參滴丸0.8 g/kg+ 缺血再灌注組(CP0.1+I/R)。在實驗前90分鐘，假手術組和缺血再灌注組分別 灌胃給予生理鹽水4 ml/kg，復方丹參滴丸各劑量組分別灌胃給予相應劑量復方 丹參滴丸(0. lg/kg, 0.4g/kg, 0.8g/kg)生理鹽水溶液4 ml/kg。
4. 心臟冠狀血管細動靜脈的血管徑和紅細胞流速
用連接在正立顯微鏡(BX51WI, Olympus, J鄰anese)的高速攝影機 (ultimate APX mOTRON， FASTCAM , US)，在落射光下，1用0倍物鏡，選直 徑在30-50 um的細靜脈，通過顯示屏(20PF5120, PHLIPS， US)觀察，并用CD 錄像機(DVR-560H， PHLIPS, US)記錄。設定高速攝影機的攝影速度為500幅/秒， 記錄在缺血前，缺血30分，再灌注30分、再灌注60分時同一視野內細動、靜 脈管徑和紅細胞流動速度。在25幅/秒的速度重放的錄像上，用Image-Pro Plus 5.0軟件測定細動、靜脈管徑及紅細胞流速。大鼠心臟細動、靜脈紅細胞流速用 mm/s表示，以缺血再灌注前的細動、靜脈紅細胞流速為基礎值，計算各組心臟 細動、靜脈紅細胞流速的變化率。大鼠心臟細動、靜脈管徑用mm表示，分別以 缺血再灌注前的細動、靜脈管徑為基礎值，計算心臟細動、靜脈管徑的變化率。
5. 心臟冠狀血管細靜脈血漿白蛋白漏出的測定
另取大鼠(每組^6),在缺血再灌注60分，將FITC標記的血漿白蛋白按 50mg/kg的劑量，經股靜脈緩慢推注。用正置熒光顯微鏡以455 nm激發光，汞 燈作為發射光源(100W)，記錄各組再灌注60分鐘時細靜脈血管內和相鄰的血 管外間質的FITC熒光圖象。用Image-Pro Plus 5. 0軟件測定細靜脈血管內和相 鄰的血管外間質的FITC熒光強度，用同一視野內細靜脈管外間質與血管內FITC 熒光的比表示大鼠心臟細靜脈白蛋白滲出的值。用連接計算機的激光多普勒血流灌注成像儀(PeriScan PIM3， PERIMED， Sweden)記錄在缺血前，缺血5分、10分、30分以及再灌注5分、10分、30 分、60分時心臟表面血流量。用LDPIwin軟件對圖像進行測量和評估數據。以 缺血再灌注前的血流量為基礎值，計算心臟血流量的變化率。
7. 心肌梗死面積的測定
再灌注60分鐘后，取出大鼠心臟(每組^6)，從心尖部開始延平行于房室 間隔的方向切成1 mm厚的5個薄片放入0. 375%的TTC中在37'C下孵育15分鐘， 行TTC染色。非梗塞區被染成紅色，梗塞區被染成白色，用Digital sight (DS-5M-U1, NIKON, Japan)拍攝圖心肌圖片，用圖像分析軟件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc， USA)計算出每片心肌的梗死面積與左心室面積 的百分比值，再以五片心臟切片的心肌梗死面積的百分比的平均值來表示總的梗 死面積。
8. 心肌細胞的TUNEL染色
在再灌90min，取大鼠心臟，灌流固定。冰凍切6um的切片，行TUNEL染 色。用激光掃描共聚焦(Radiance2100 Bio-Rad UK)， 63倍物鏡(Axiovert200 Carl Zeiss Germany)在心臟缺血再灌注區選擇5個視野，用圖像分析軟件 Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc, USA)計數TUNEL陽性細胞數， TUNEL陽性細胞數/視野表示。 9心臟毛細血管和心肌細胞的超微結構
另取部分大鼠(每組n-3)，再灌注90分鐘后，在結扎線與心尖中間取大約 2國3的新鮮組織用于電鏡觀察。組織用3%戊二醛前固定，用1%的鋨酸后固定。 樣本用梯度丙酮脫水后，用環氧樹脂812包埋后制成超溥切片。用醋酸鈾和檸檬 酸鉛染色用透射電鏡(JEM-1230; JEOL Ltd., Tokyo, Japan)觀察心臟毛細血 管和心肌細胞超微結構。 10. MPO活性的檢測
在再灌注180分后，取部分大鼠缺血再灌注區域的心肌組織100 mg，液氮 速冷，移入-80冰箱。取冰凍的心臟均槳后加入各級反應混合物提取MPO，用紫 外分光光度儀在460 nm處檢測，用U/g心臟組織表示。11. 大鼠心肌組織中I-k B-a 、 P50、 P65的免疫印跡分析 在再灌注60分鐘后，取缺血部位心肌組織200 mg， -80冰箱中保存。用蛋
白提取試劑盒提出全蛋白和核蛋白(Applygen Technologies Inc.)。取樣品加等 體積的2X電泳樣品緩沖液混合后，經10%SDS-PAGE電泳后(30 mA 2hour RT.)， 電轉膜至PVDF膜(90 mA過夜冰浴)。5%脫脂奶粉封閉1 hour， TBS-Tween漂 洗3次X5 min,剪取目的蛋白區域標記NF-kB p65 (用5% BSA-TBS-Tween 1: 1000稀釋;SC-109-G, Santa Cruz)、 NF-kB p50 (用5% BSA-TBS-Tween 1: 1000 稀釋；SC-109-G, Santa Cruz) 、 Tubulin (用5%脫脂奶粉1:5000稀釋；046k4770' sigma) 、 I-kB-ot (用5% BSA-TBS-Tween 1: 1000稀釋；PC 142， Calbiochem Inc., Germany) —抗，4 。C孵育過夜，Tbs-Tween沖洗3次X 5 min，用過氧化物酶標 記的二抗孵育，室溫lh, Tbs-Tween沖洗3次X20 min。 ECL顯色5 min,暗盒 曝光。X光片上的顯色條帶進行光密度掃描，用圖像分析軟件(Image-Pro plus 5.0， Media Cybemetrics Inc, USA)測條帶的灰度值。以Sham組的I-k B-a與 Tubulin的灰度值比為基礎值，計算各組的I- k B- a與Tubulin的比值與基礎值 的比。以Sham組的P65或P50的灰度值為基礎值，計算各組的P65或P50的灰 度值與基礎值比。
12. 外周血粒細胞表面粘附分子表達的測定 各組大鼠在再灌注60分鐘之后，腹主動脈取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝(枸櫞
酸鈉與血液的體積比為1: 9)，抽血后于10ml離心管中迅速混合，取抗凝全血 50ii 1，加入l^g FITC標記的CDllb、 CD18抗體(BD biosciences Pharmingen， USA)，用溶血素破碎紅細胞，經PBS洗滌2次后，用流式細胞儀(FACSCalibur， BD， USA)根據前向角/側向角分選粒細胞，計數5000個粒細胞，測定FITC標記 的抗CDllb和抗CD18抗體的陽性細胞數和平均熒光強度。
13. 統計方法
統計分析采用SPSS 11. 5數理統計軟件包，各組數據用One-Way ANOVA進行 統計，當各組比較具有統計學意義時用S-N-K (方差齊)或Tamhane' s T2 (方 差不齊)進行多重比較分析。數據用3f士 SE表示，當P < 0.05時表示差異具有 統計學意義。結果
1. 復方丹參滴丸對心肌缺血再灌注后大鼠心臟冠狀血管細動靜脈管徑的影響
圖1A表示Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠冠狀血管細動脈管徑的連續變化。Sham組大鼠在本觀察期間內，大鼠心臟冠 狀血管細動脈管徑沒有顯著地變化。1/R組大鼠在缺血再灌注早期，心臟冠狀血 管細動脈管徑有一過性收縮，CPO.l、 CPO. 4和CTO. 8預給藥沒有顯著地抑制再 灌注早期大鼠心臟冠狀血管細動脈的一過性收縮收縮。
圖lB表示Sham組、1/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠冠狀血管細靜脈管徑的連續變化。I/R組大鼠心臟細靜脈管徑在本觀察期間內 沒有顯著地變化，CP各預給藥組大鼠心臟細靜脈管徑也沒有顯著的變化。
2. 復方丹參滴丸對心肌缺血再灌注后大鼠心臟冠狀血管細動靜脈紅細胞流速的 影響
圖2A表示Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠冠狀血管細動脈紅細胞流速的連續變化。Sham組大鼠冠狀細動脈紅細胞流速 在本觀察期間內沒有顯著地變化。1/R組大鼠冠狀血管細動脈紅細胞流速在再灌 注開始時顯著地降低，再灌注30分鐘后恢復。CPO. 1和CPO. 4預給藥對大鼠冠 狀細動脈紅細胞流速沒有顯著的影響。CPO. 8+I/R組從再灌注30開始，大鼠冠 狀血管細動脈紅細胞流速顯著地高于I/R組。
圖2B表示Sham組、1/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠冠狀血管細靜脈紅細胞流速的連續變化。Sham組大鼠冠狀細靜脈紅細胞流速 在本觀察期間內沒有顯著地變化。I/R組大鼠冠狀血管細靜脈紅細胞流速在再灌 注開始時就顯著地降低，并持續到本觀察結束時。CP 0. 1+I/R組和CPO. 1+I/R 組組大鼠沒有顯著地抑制再灌注引起的大鼠冠狀血管細靜脈紅細胞流速的降低， 而CPO. 8+I/R組大鼠，從再灌注30分開始，顯著地抑制了缺血再灌注引起的紅 細胞流速的降低，并持繼到再灌注60分。
3. 復方丹參滴丸對心肌缺血再灌注后大鼠心臟冠狀血管細靜脈血漿白蛋白滲出 的影響
圖3A表示Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組 大鼠在再灌注60分鐘時冠狀血管細靜脈白蛋白的漏出狀態。Sham組大鼠僅可以觀察到少量的FITC標記白蛋白的血管外漏出(A-1)。 1/R組大鼠可明顯觀察 到FITC標記白蛋白的血管外漏出(A-2)。 CPO. 1和CPO. 4的預給藥組大鼠心臟 冠狀血管細靜脈FITC標記白蛋白的血管外漏出沒有減少(A-3， A-4)， CPO. 8+I/R 組大鼠的FITC標記白蛋白的血管外漏出明顯減少(A-5)。
圖3B表示在再灌60分鐘時Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟冠狀血管細靜脈內外FITC熒光強度比的比較。Sham 組大鼠心臟細靜脈血管外與血管內FITC標記白蛋白漏出的光密度的比為20. 13 ±2. 52。 I/R組大鼠的比值為41. 44±2. 46，顯著高于假手術組。CPO. 1+I/R組 和CPO. 4+I/R組大鼠心臟細靜脈血管外與血管內FITC標記白蛋白漏出的光密度 的比值分別為37. 42 ±3. 61、 33. 46 ±3. 32沒有顯著地抑制白蛋白的漏出。 CPO. 8+I/R組大鼠心臟細靜脈血管外與血管內FITC標記白蛋白漏出的光度的比 值為31.23±3.75，顯著低于缺血再灌注組。
4. 復方丹參滴丸對心肌缺血再灌注后大鼠心臟血流量的影響
圖4表示的是激光多普勒測獲得的Sham組、I/R組、CP0. 1+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟血流量的圖像。Sham組大鼠心臟血流量在本過程中沒 有明顯的變化(A)。 I/R組大鼠在再灌注30 min和60 min時血流量明顯降低 (B3， B4)。 CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組大鼠心臟血流量在再灌注30 min和60 min時與I/R相比有所恢復(C， D)。 CPO. 8+I/R組大鼠在再灌注30 min和60 min 時心臟血流量明顯恢復(E)。
圖5的表示Sham組、1/R組、CPO, 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組 大鼠心臟血流量的連續變化。Sham組大鼠心臟血流量在本觀察過程中沒有明顯 變化。I/R組大鼠心臟血流量在缺血和再灌注期間顯著地降低，CPO. 1和CPO. 4 的預給藥沒有顯著地抑制缺血再灌注后的大鼠心臟血流量的降低。CPO. 8+I/R組 從再灌注5分到再灌注30分的期間內，顯著地抑制了再灌注引起的大鼠心臟血 流量的降低。
5. 復方丹參滴丸對大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積的影響
圖6表示Shara組、I/魄、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠再 灌注60分鐘時心臟TTC染色圖。Sham組大鼠心臟未見梗死區域(A) ， 1/R組大鼠 心臟可見較大的呈白色染色的梗死區域(B) 。 CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組的心肌梗死區域略有減少(C， D) ， CPO. 8+I/R組心肌梗死區域顯著地減少(E)。
圖7表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠再 灌注60分鐘時心臟心肌梗死面積和。1/R組大鼠心肌梗死區面積和為31. 43±4. 07 mm'。 CPO. l+I/R組和CPO. 4+I/R組大鼠心肌梗死面積和分別為26. 63±4. 85、 24. 58 ±5.3 mm3,沒有顯著地減少心肌梗死面積。CPO. 8+I/R組大鼠心肌梗死面積和 為22.55±1.9 mm3,顯著地減少了缺血再灌注引起的心肌梗死面積。
6. 復方丹參滴丸對心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡的影響
圖8A為Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠再灌 注90時心臟TUNEL染色的圖象。Sham組大鼠偶見TUNEL陽性的心肌細胞(A-1), 1/R組大鼠心臟可以觀察到大量的TUNEL陽性的心肌細胞(A-2) , CPO. l+I/R組、 CPO. 4+I/R組、CP0. 8+I/R組的TUNEL陽性心肌細胞均明顯地減少(A-3， A_4， A-5)。
圖8B表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠心 臟TUNEL陽性心肌細胞結果。Sham組大鼠TUNEL陽性心肌細胞僅為0.36土0. 11個/ 視野，1/R組大鼠TUNEL陽性心肌細胞為14.7土1.17個/視野，顯著多于Sham組。 CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CP0. 8+I/R組大鼠TUNEL陽性心肌細胞數量分別為9. 9 ±0.71、 7. 16±1.431和5. 56±1 (個/視野),均顯著地低于I/R組。
7. 復方丹參滴丸對心肌缺血再灌注后大鼠心臟超微結構的影響
圖9A表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CP0.8+I/R組大鼠 心臟毛細血管的透射電鏡觀察結果。Sham組大鼠心臟毛細血管內皮完整，可觀察 到少量的小泡，沒有觀察到血管外周的水腫(A-1)。 1/R組大鼠心臟的毛細血管 內皮細胞腫脹，可觀察到血管內皮細胞內的大吞飲泡和血管外周水腫(A-2)。 CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組大鼠心臟的毛細血管內皮細胞腫脹減輕，沒有觀察到 內皮細胞內的大吞飲泡和血管外周水腫減少(A-3, A-4)。 CP0.8+I/R組大鼠心臟 的毛細血管內皮細胞完好，未見內皮細胞腫脹和血管外周水腫(A-5)。
圖9B表示Sham組、I/晚、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠 心肌細胞的投射電鏡觀察結果。Sham組大鼠心臟心肌細胞纖維排列整齊、均勻， 線粒體緊密排列、形狀規則、包膜完整、嵴密密集、規則(B-l)。 1/R大鼠心臟 心肌細胞水腫、肌絲溶解、斷裂，線粒體腫脹，多處空泡化(B-2)。 CP濃度依存 地改善了心臟心肌細胞的超微結構，纖維排列較整齊，線粒體腫脹減輕，包膜完整，形態規則(B-3, B-4， B-5)。
8. 復方丹參滴丸對心肌缺血再灌注后大鼠心肌組織MPO含量的影響
圖10顯示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CP0.8+I/R組大鼠 心臟左心室缺血再灌注區域組織MPO的含量。Sham組MPO的值為O. 18±0.016 U/g 心肌組織，1/R組的MP0值上升為0.63士0.034 U/g心肌組織，CPO. l+I/R組、 CP0.4+I/R組、CPO. 8+I/R組的MP0值分別為0. 55±0.027， 0. 54±0.026和0.5 ±0.022 (U/g心肌組織)，濃度依存性的抑制了大鼠心臟左心室缺血再灌注區 域心肌組織內MPO的含量。
9. 復方丹參滴丸對缺血再灌注后大鼠心臟組織中I- k B- a的影響
圖11A表示再灌注60分鐘時，Sham組、1/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟組織中I-k B-a的免疫印跡分析圖象。與Sham組相 比，1/R組大鼠心臟組織I-kB-a條帶灰度明顯減少，CPO. 8 g/kg的預給藥抑制 了缺血再灌注引起的大鼠心臟組織I- k B-a條帶灰度的減少。
圖11B表示了再灌注60分鐘時，Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟組織中全蛋白I-k B-a表達的Weatern blot定量分 析的結果。與Sham組相比，1/R組大鼠心臟組織I-KB-a/Tubulin灰度比明顯 減少，CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組I- k B-a/Tubulin灰度比減少沒有被顯著地 抑制。CP0.8 g/kg的預給藥抑制了缺血再灌注引起的大鼠心臟組織I-k B-a/Tubulin灰度比的減少。
10. 復方丹參滴丸對缺血再灌注后大鼠心臟組織P50、 P65的影響
圖12A表示再灌注60分鐘時，Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟組織中NF- k B亞基P50和P65的免疫印跡分析圖象。 與Sham組相比，I/R組在再灌注60分鐘時核蛋白P50條帶灰度明顯增高。 CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組的核蛋白P50條帶灰度明顯減少。然而，I/R組在 再灌注60分鐘時，沒有檢測到核蛋白P65的條帶。CP各劑量組在再灌注60分 鐘時也沒有檢測到核蛋白P65的條帶。
圖12B顯示的Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R 組大鼠大鼠心臟細胞核蛋白P50和P65蛋白含量的Western Blotting分析結果。 與Sham組大鼠相比，1/R組在再灌注60分后，大鼠心臟細胞核蛋蛋白P50的灰度顯著增加，提示P50蛋白的核轉移增加。CPO. 1 g/kg的預給藥沒有顯著地大 鼠心臟細胞核蛋白P50的灰度顯著增加，CPO. 4 g/kg和CPO. 8 g/kg的預給藥顯 著地抑制了缺血再灌注后大鼠心臟組織內P50蛋白的核轉移。但是，與Sham組
大鼠相比，1/R組大鼠心臟細胞核蛋白P65沒有顯著的變化，CP各預給藥組的大
鼠心臟細胞核蛋白P65也沒有顯著的變化。
11.復方丹參滴丸對心肌缺血再灌注損傷誘發粘附分子的影響
圖13A表示各組白細胞粘附因子CDllb的變化，假手術組白細胞粘附分子 CDllb平均熒光強度為31. 11±1.23。缺血再灌注組的白細胞粘附分子CDllb平均 熒光強度上升至41.86士2.87，與假手術組比較且具有統計學意義。復方丹參滴 丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg預投入后白細胞粘附因子CDllb的熒光強度值分別 為40.66土2.87， 42. 7±3.9和35.07±1.35。從結果我們可以看出復方丹參滴丸 預投入后CDllb的表達并無明顯影響。
圖13B表示各組白細胞粘附因子CD18的變化，假手術組白細胞粘附分子CD18 平均熒光強度為49. 1±3. 59。缺血再灌注組的白細胞粘附分子CD18平均熒光強度 上升至68. 93±4. 21，與假手術組比較且具有統計學意義。復方丹參滴丸0. lg/kg, 0. 4g/kg和0. 8g/kg預投入后白細胞粘附因子CD18的熒光強度值分別為74. 38± 4.83, 73.59±4.93和57.99±3.8。從結果我們可以看出復方丹參滴丸O. 8g/kg 可明顯抑制缺血再灌注引起的白細胞表面粘附分子CD18的表達。 小結
1. 復方丹參滴丸0. 8 g/kg —次性預給藥可以預防缺血再灌注引起的大鼠心 臟微循環障礙，包括抑制大鼠冠狀血管細動脈的收縮，血流速度降低，白蛋白漏 出增加，血流量降低和心肌血流量的降低。
2. 復方丹參滴丸0. 8 g/kg —次性預給藥可以減少缺血再灌注引起的大鼠心 肌梗死總面積。
3. 復方丹參滴丸0.4 g/kg 、 0.8 g/kg—次性預給藥可以減少缺血再灌注 引起的抑制心肌細胞調亡。
4. 復方丹參滴丸.O. 1 g/kg 、 0.4 g/kg 、 0.8 g/kg —次性預給藥均可以 抑制缺血再灌注后心臟組織MPO含量增加。
5. 復方丹參滴丸0. 8 g/kg —次性預給藥可以抑制缺血再灌注后外周血粒細胞粘附分子CD18的表達。
6.復方丹參滴丸0. 8 g/kg —次性預給藥抑制缺血再灌注后心肌組織細胞漿 內的I- k B-a降解和P50核轉移增加。
結論
本研究結果提示復方丹參滴丸0.8g/kg —次性預投入可以改善缺血再灌注 大鼠微循環障礙和心肌損傷。該作用可能與其抑制粒細胞粘附分子CD18的表達， 抑制MPO的活化，I-KB-a降解和P50的核轉移，抑制心肌細胞調亡相關。 復方丹參滴丸多次預藥對缺血再灌注引起的大鼠心臟微循環障礙和心肌損傷的 防護作用。
實驗二復方丹參滴丸多次預藥對缺血再灌注引起的大鼠心臟微循環障礙和心肌 損傷的防護作用
實驗二中實驗方法和材料同實驗一相同
1. 動物和試劑
雄性SD大鼠，體重250士10g，購買于北京大學醫學部動物中心，合格證號 SCXK(京)2006—0001。實驗動物的管理按衛生部發布的實驗動物管理指南執行， 動物飼養在溫度為24士rC，濕度為55±5%的條件下，自由飲食、飲水。
2. 手術過程
大鼠用2(^的烏拉坦(1.25g/kg)肌肉注射麻醉，仰臥位固定，頸部去毛，切 開皮膚，分離頸前肌，暴露氣管，行氣管插管。插管另端連于小動物呼吸機行加 壓呼吸(呼吸比l : 1 ,呼吸頻率75次/min ,潮氣量12 mL/kg)。用熱毯維持肛 溫在37 - 37.5'C (YSI REF 401, Yellow Spring, Ohio, USA)度之間。胸部去 毛、消毒，沿胸骨左，右緣2 4肋開胸暴露心臟，剪開心包膜，用穿有3-0縫 合線的3/8彎針穿過肺動脈圓錐與左心耳交界稍下(1 2) ran處，結扎縫合線并 在絲線與心肌組間放一根聚乙烯小管，拉緊絲線形成造成缺血，心肌顏色變白為 結扎成功的標志。30分種后放松絲線即發生再灌注，缺血區域恢復紅色為再灌 注成功的標志，假手術組只穿線不結扎。
3. 藥物及分組
復方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司提供，批號20040502)，常 溫下保存。實驗選用的SD大鼠，隨機分成5組(n=6)。假手術組(Sham):每日灌胃給予生理鹽水4 ml/kg，連續6日。 缺血再灌注模型(I/R)組每日灌胃給予生理鹽水4 ml/kg，連續6日。 復方丹參滴丸0. 1 g/kg連續6天給藥+缺血再灌注組(CPO. l+I/R):每日灌
胃給予復方丹參滴丸O.l g/kg，連續6日。
復方丹參滴丸0. 4 g/kg連續6天給藥+缺血再灌注組(CP0.4+I/R):每曰灌
胃給予復方丹參滴丸0.4 g/kg，連續6日。
復方丹參滴丸0. 8 g/kg連續6天給藥+缺血再灌注組(CP0.8+I/R):每日灌
胃給予復方丹參滴丸0. 8g/kg，連續6日。
4. 心臟血流量的測定
用連接計算機的激光多普勒血流灌注成像儀(PeriScanPIM3， PERIMED， Sweden) 記錄在缺血前，缺血5分、10分、30分以及再灌注5分、10分、30分、60分 時心臟表面血流量。用LDPIwin軟件對圖像進行測量和評估數據。以缺血再灌注 前的血流量為基礎值，計算心臟血流量的變化率。
5. 心肌梗死面積的測定
再灌注60分鐘后，取出大鼠心臟(每組^6)，從心尖部開始延平行于房室 間隔的方向切成1 mm厚的5個薄片放入0. 375%的TTC中在37。C下孵育15分鐘， 行TTC染色。非梗塞區被染成紅色，梗塞區被染成白色，用Digital sight (DS-5M-U1, NIKON, Japan)拍攝圖心肌圖片，用圖像分析軟件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc, USA)計算出每片心肌的梗死面積與左心室面積 的百分比值，再以五片心臟切片的心肌梗死面積的百分比的平均值來表示總的梗 死面積。
6. 心肌細胞的TUNEL染色
在再灌90min,取大鼠心臟，灌流固定。冰凍切6um的切片，行TUNEL染 色。用激光掃描共聚焦(Radiance2100 Bio-Rad UK)， 63倍物鏡(Axiovert200 Carl Zeiss Germany)在心臟缺血再灌注區選擇5個視野，用圖像分析軟件 Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc, USA)計數TUNEL陽性細胞數， TUNEL陽性細胞數/視野表示。
7. 外周血粒細胞粘附分子CDllb/CD18的表達
各組大鼠在再灌注60分鐘之后，腹主動脈取血，3.挑枸櫞酸鈉抗凝(枸櫞酸鈉與血液的體積比為1: 9)，抽血后于10ml離心管中迅速混合，取抗凝全血 50ul，加入l^g FITC標記的CDllb、 CD18抗體(BD biosciences Pharmingen， USA)，用溶血素破碎紅細胞，經PBS洗滌2次后，用流式細胞儀(FACSCalibur， BD， USA)根據前向角/側向角分選粒細胞，計數5000個粒細胞，測定FITC標記 的抗CDllb和抗CD18抗體的陽性細胞數和平均熒光強度。 8.統計方法
統計分析采用SPSS 11.5數理統計軟件包，各組數據用One-Way ANOVA進行 統計，當各組比較具有統計學意義時用S-N-K (方差齊)或Tamhane， s T2 (方 差不齊)進行多重比較分析。數據用？士 SE表示，當P 〈 0.05時表示差異具有 統計學意義。
結果
1. 復方丹參滴丸連續給藥對心肌缺血再灌注后大鼠心臟血流量的影響
圖14表示的是激光多普勒測得的Sham組、I/R組、CP0. l+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟血流量的圖像。Sham組大鼠心臟血流量在本過程中沒 有明顯的變化。1/R組大鼠在再灌注后血流量明顯降低。CP0.1+I/R組大鼠心臟 血流量在再灌注30 min和60 min時與I/R相比有所恢復。CPO. 4+I/R組、 CPO. 8+I/R組大鼠在再灌注后心臟血流量明顯恢復。
圖15的表示Sham組、1/R組、CPO. 1+I/R、 CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠心臟血流量的連續變化。Sham組大鼠心臟血流量在本觀察過程中沒有明顯變 化。I/R組大鼠心臟血流量在缺血和再灌注期間顯著地降低，CPO. lg/kg連續給 藥沒有顯著地抑制缺血再灌注后的大鼠心臟血流量的降低。CPO. 4+I/R組在再灌 注5分和再灌注60分可顯著抑制再灌注引起的血流量的降低。CPO. 8+I/R組從 再灌注5分到再灌注60分的期間內，均可顯著抑制再灌注引起的血流量的降低。
2. 復方丹參滴丸連續給藥對大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積的影響
圖16表示Shara組、1/R組、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CP0.8+I/R組大鼠 再灌注60分鐘時心臟TTC染色圖。Sham組大鼠心臟未見梗死區域，1/R組大鼠心臟 可見較大的呈白色染色的梗死區域。CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組和CP0. 8+I/R組 心肌梗死區域顯著地減少。
圖17表示Sham組、！/R組、CP0.1+I/R組、CP0.4+I/R組、CP0.8+I/R組大鼠再灌注60分鐘時心臟心肌梗死面積統計分析結果。1/R組大鼠心肌梗死區面積為 15.55±2.14%。 CP0.1+I/R組、CP0.4+I/R組和CP0.8+I/R組大鼠心肌梗死面積分別 為8.32±1.42%、 7.65±1.66%、 7.56±2.57%，顯著地減少了缺血再灌注引起的心 肌梗死的面積。
3. 復方丹參滴丸連續給藥對心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡的影響
圖18為Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4十I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠再 灌注90時心臟TUNEL染色的圖象。Sham組大鼠偶見TUNEL陽性的心肌細胞，1/R組 大鼠心臟可以觀察到大量的TUNEL陽性的心肌細胞，CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、 CPO. 8+I/R組的TUNEL陽性心肌細胞均明顯地減少。
圖19表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠心 臟TUNEL陽性心肌細胞結果。Sham組大鼠TUNEL陽性心肌細胞僅為0.36士0. 11個/ 視野，1/R組大鼠TUNEL陽性心肌細胞為14.7土1. 17個/視野，顯著多于Sham組。 CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CP0. 8+I/R組大鼠TUNEL陽性心肌細胞數量分別為7. 1 ±0.54、 7.23±0.66和6.4±0.44 (個/視野),均顯著地低于I/R組。
4. 復方丹參滴丸連續給藥對心肌缺血再灌注后外周血粒細胞粘附分子表達的影 響
圖20A表示各組外周血粒細胞粘附分子CDllb的變化。假手術組外周血粒細 胞粘附分子CDllb平均熒光強度為31. 11土1.23。缺血再灌注組外周血粒細胞粘附 分子CDllbCDllb平均熒光強度上升至41.86土2.87，顯著地高于假手術組。復方 丹參滴丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg預投入后對粒細胞粘附因子CDllb的表達的
增加沒有顯著的抑制作用。
圖20B表示各組白細胞粘附因子CD18的變化，假手術組白細胞粘附分子CD18 平均熒光強度為49. 1±3. 59。缺血再灌注組的白細胞粘附分子CD18平均熒光強度 上升至68.93土4.21，顯著地高于假手術組。復方丹參滴丸O. lg/kg, 0.4g/kg和 0.8g/kg預投入后白細胞粘附因子CD18的熒光強度值分別為54. 15±2.09, 57.42 ±2. 16和56.73±2.79，顯著地抑制了缺血再灌注引起的白細胞表面粘附分子 CD18的表達。 小結
缺血再灌注后大鼠心臟血流量降低，心臟梗死面積、凋亡的心肌細胞數顯著地增加，外周血細胞黏附分子CDllb/CD18表達顯著地增多。0. lg/kg、 0.4g/kg 和0.8g/kg用量的復方丹參滴丸多次預給藥可以劑量依存地抑制缺血再灌注后 的大鼠心臟血流量的降低，心臟梗死面積和凋亡的心肌細胞數，顯著地抑制外周 血粒細胞黏附分子CD18的表達。 結論
復方丹參滴丸多次性預給藥可以劑量依存地預防缺血再灌注引起的大鼠心 臟血流量的降低，抑制心肌細胞的損傷。
圖1A表示Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠冠狀血管細動脈管徑的連續變化。Sham組大鼠在本觀察期間內，大鼠心臟冠 狀血管細動脈管徑沒有顯著地變化。1/R組大鼠在缺血再灌注早期，心臟冠狀血 管細動脈管徑有一過性收縮，CPO. 1、 CP0.4和CPO. 8預給藥沒有顯著地抑制再
灌注早期大鼠心臟冠狀血管細動脈的一過性收縮收縮。
圖IB表示Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠冠狀血管細靜脈管徑的連續變化。I/R組大鼠心臟細靜脈管徑在本觀察期間內 沒有顯著地變化，CP各預給藥組大鼠心臟細靜脈管徑也沒有顯著的變化。
圖2A表示Sham組、1/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠冠狀血管細動脈紅細胞流速的連續變化。Sham組大鼠冠狀細動脈紅細胞流速 在本觀察期間內沒有顯著地變化。I/R組大鼠冠狀血管細動脈紅細胞流速在再灌 注開始時顯著地降低，再灌注30分鐘后恢復。CPO. 1和CPO. 4預給藥對大鼠冠 狀細動脈紅細胞流速沒有顯著的影響。CPO. 8+I/R組從再灌注30開始，大鼠冠 狀血管細動脈紅細胞流速顯著地高于I/R組。
圖2B表示Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠冠狀血管細靜脈紅細胞流速的連續變化。Sham組大鼠冠狀細靜脈紅細胞流速 在本觀察期間內沒有顯著地變化。I/R組大鼠冠狀血管細靜脈紅細胞流速在再灌 注開始時就顯著地降低，并持續到本觀察結束時。CP 0. 1+I/R組和CPO. 1+I/R 組組大鼠沒有顯著地抑制再灌注引起的大鼠冠狀血管細靜脈紅細胞流速的降低， 而CPO. 8+I/R組大鼠，從再灌注30分開始，顯著地抑制了缺血再灌注引起的紅 細胞流速的降低，并持繼到再灌注60分。
圖3A表示Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠在再灌注60分鐘時冠狀血管細靜脈白蛋白的漏出狀態。Sham組大鼠僅可
以觀察到少量的FITC標記白蛋白的血管外漏出(A-1)。 1/R組大鼠可明顯
觀察到FITC標記白蛋白的血管外漏出(A-2)。 CPO. 1和CPO. 4的預給藥組大鼠
心臟冠狀血管細靜脈FITC標記白蛋白的血管外漏出沒有減少(A-3， A-4)，
CP0.8+I/R組大鼠的FITC標記白蛋白的血管外漏出明顯減少(A-5)。
圖3B表示在再灌60分鐘時Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R
組、CP0.8+I/R組大鼠心臟冠狀血管細靜脈內外FITC熒光強度比的比較。Sham
組大鼠心臟細靜脈血管外與血管內FITC標記白蛋白漏出的光密度的比為20. 13
±2. 52。 I/R組大鼠的比值為41. 44±2. 46，顯著高于假手術組。CPO. 1+I/R
組和CPO. 4+I/R組大鼠心臟細靜脈血管外與血管內FITC標記白蛋白漏出的光密
度的比值分別為37.42±3.61、 33.46±3.32沒有顯著地抑制白蛋白的漏出。
CP0.8+I/R組大鼠心臟細靜脈血管外與血管內FITC標記白蛋白漏出的光度的比
值為31.23土3.75,顯著低于缺血再灌注組。
圖4表示的是激光多普勒測獲得的Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R
組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟血流量的圖像。Sham組大鼠心臟血流量在本過程中沒
有明顯的變化(A) 。
I/R組大鼠在再灌注30 min和60 min時血流量明顯降低
(B3， B4)。 CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組大鼠心臟血流量在再灌注30 min和60
min時與1/R相比有所恢復(C， D)。 CPO. 8+I/R組大鼠在再灌注30 min和60 min
時心臟血流量明顯恢復(E)。
圖5的表示Sham組、I/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組
大鼠心臟血流量的連續變化。Sham組大鼠心臟血流量在本觀察過程中沒有明顯
變化。1/R組大鼠心臟血流量在缺血和再灌注期間顯著地降低，CPO. l和CPO. 4
的預給藥沒有顯著地抑制缺血再灌注后的大鼠心臟血流量的降低。CPO. 8+I/R組
從再灌注5分到再灌注30分的期間內，顯著地抑制了再灌注引起的大鼠心臟血
流量的降低。
圖6表示Sham組、1/R組、CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠再灌注60分鐘時心臟TTC染色圖。Sham組大鼠心臟未見梗死區域(A) ， I/R 組大鼠心臟可見較大的呈白色染色的梗死區域(B) 。 CPO. 1+I/R組、CPO. 4+I/R 組的心
肌梗死區域略有減少(C， D) ， CPO. 8+I/R組心肌梗死區域顯著地減少(E)。圖7表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠再 灌注60分鐘時心臟心肌梗死面積和。1/R組大鼠心肌梗死區面積和為31. 43±4. 07 國'。CPO. l+I/R組和CPO. 4+I/R組大鼠心肌梗死面積和分別為26. 63±4. 85、 24. 58 ±5.3 mm3，沒有顯著地減少心肌梗死面積。CPO. 8+I/R組大鼠心肌梗死面積和 為22.55±1.9 ram3，顯著地減少了缺血再灌注引起的心肌梗死面積。
圖8A為Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠再灌 注90時心臟TUNEL染色的圖象。Sham組大鼠偶見TUNEL陽性的心肌細胞(A-1), 1/R組大鼠心臟可以觀察到大量的TUNEL陽性的心肌細胞(A-2) ， CPO. l+I/R組、 CPO. 4+I/R組、CP0. 8+I/R組的TUNEL陽性心肌細胞均明顯地減少(A-3， A-4， A-5)。
圖8B表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠心 臟TUNEL陽性心肌細胞結果。Sham組大鼠TUNEL陽性心肌細胞僅為0.36土0. 11個/ 視野，1/R組大鼠TUNEL陽性心肌細胞為14.7土1.17個/視野，顯著多于Sham組。 CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CP0. 8+I/R組大鼠TUNEL陽性心肌細胞數量分別為9. 9 ±0.71、 7. 16±1.431和5.56±1 (個/視野)，均顯著地低于I/R組。
圖9A表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠 心臟毛細血管的透射電鏡觀察結果。Sham組大鼠心臟毛細血管內皮完整，可觀察 到少量的小泡，沒有觀察到血管外周的水腫(A-1)。 1/R組大鼠心臟的毛細血管 內皮細胞腫脹，可觀察到血管內皮細胞內的大吞飲泡和血管外周水腫(A-2)。 CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組大鼠心臟的毛細血管內皮細胞腫脹減輕，沒有觀察到 內皮細胞內的大吞飲泡和血管外周水腫減少(A-3, A-4)。 CP0.8+I/R組大鼠心臟 的毛細血管內皮細胞完好，未見內皮細胞腫脹和血管外周水腫(A-5)。
圖9B表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CP0.8+I/R組大鼠 心肌細胞的投射電鏡觀察結果。Sham組大鼠心臟心肌細胞纖維排列整齊、均勻， 線粒體緊密排列、形狀規則、包膜完整、嵴密密集、規則(B-1)。 1/R大鼠心臟 心肌細胞水腫、肌絲溶解、斷裂，線粒體腫脹，多處空泡化(B-2)。 CP濃度依存 地改善了心臟心肌細胞的超微結構，纖維排列較整齊，線粒體腫脹減輕，包膜完 整，形態規則(B-3, B-4, B-5)。
圖IO顯示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CP0.8+I/R組大鼠 心臟左心室缺血再灌注區域組織MPO的含量。Sham組MPO的值為O. 18±0.016 U/g心肌組織，1/R組的MPO值上升為0. 63±0.034 U/g心肌組織，CPO. l+I/R組、 CP0.4+I/R組、CP0.8+I/R組的MP0值分別為0. 55±0.027, 0. 54±0.026和0. 5 ±0.022 (U/g心肌組織)，濃度依存性的抑制了大鼠心臟左心室缺血再灌注區 域心肌組織內MPO的含量。
圖11A表示再灌注60分鐘時，Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟組織中I-k B-a的免疫印跡分析圖象。與Sham組相 比，1/R組大鼠心臟組織I-kB-a條帶灰度明顯減少，CPO. 8 g/kg的預給藥抑制 了缺血再灌注引起的大鼠心臟組織I- k B-a條帶灰度的減少。
圖11B表示了再灌注60分鐘時，Sham組、I/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟組織中全蛋白I-k B-a表達的Weatern blot定量分 析的結果。與Sham組相比，I/R組大鼠心臟組織I- k B-a/Tubulin灰度比明顯 減少，CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組I- k B-a/Tubulin灰度比減少沒有被顯著地 抑制。CP0.8 g/kg的預給藥抑制了缺血再灌注引起的大鼠心臟組織I-k B-a/Tubulin灰度比的減少。
圖12A表示再灌注60分鐘時，Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟組織中NF- k B亞基P50和P65的免疫印跡分析圖象。 與Sham組相比，I/R組在再灌注60分鐘時核蛋白P50條帶灰度明顯增高。 CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組的核蛋白P50條帶灰度明顯減少。然而，I/R組在 再灌注60分鐘時，沒有檢測到核蛋白P65的條帶。CP各劑量組在再灌注60分 鐘時也沒有檢測到核蛋白P65的條帶。
圖12B顯示的Sham組、I/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R 組大鼠大鼠心臟細胞核蛋白P50和P65蛋白含量的Western Blotting分析結果。 與Sham組大鼠相比，1/R組在再灌注60分后，大鼠心臟細胞核蛋蛋白P50的灰 度顯著增加，提示P50蛋白的核轉移增加。CPO. 1 g/kg的預給藥沒有顯著地大 鼠心臟細胞核蛋白P50的灰度顯著增加，CPO. 4 g/kg和CPO. 8 g/kg的預給藥顯 著地抑制了缺血再灌注后大鼠心臟組織內P50蛋白的核轉移。但是，與Sham組 大鼠相比，1/R組大鼠心臟細胞核蛋白P65沒有顯著的變化，CP各預給藥組的大 鼠心臟細胞核蛋白P65也沒有顯著的變化。
圖13A表示各組白細胞粘附因子CDllb的變化，假手術組白細胞粘附分子CDllb平均熒光強度為3L 11±1.23。缺血再灌注組的白細胞粘附分子CDllb平均 熒光強度上升至41.86土2.87，與假手術組比較且具有統計學意義。復方丹參滴 丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg預投入后白細胞粘附因子CDllb的熒光強度值分別 為40.66土2.87, 42.7±3.9和35.07±1.35。從結果我們可以看出復方丹參滴丸 預投入后CDllb的表達并無明顯影響。
圖13B表示各組白細胞粘附因子CD18的變化，假手術組白細胞粘附分子CD18 平均熒光強度為49.1±3. 59。缺血再灌注組的白細胞粘附分子CD18平均熒光強度 上升至68. 93±4. 21，與假手術組比較且具有統計學意義。復方丹參滴丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg預投入后白細胞粘附因子CD18的熒光強度值分別為74. 38± 4.83, 73. 59±4.93和57.99±3.8。從結果我們可以看出復方丹參滴丸O. 8g/kg 可明顯抑制缺血再灌注引起的白細胞表面粘附分子CD18的表達。
圖14表示的是激光多普勒測得的Sham組、I/R組、CP0. l+I/R組、CPO. 4+I/R 組、CPO. 8+I/R組大鼠心臟血流量的圖像。Sham組大鼠心臟血流量在本過程中沒 有明顯的變化。1/R組大鼠在再灌注后血流量明顯降低。CPO. l+I/R組大鼠心臟 血流量在再灌注30 min和60 min時與I/R相比有所恢復。CPO. 4+I/R組、 CPO. 8+I/R組大鼠在再灌注后心臟血流量明顯恢復。
圖15的表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R、 CP0.4+I/R組、CPO. 8+I/R組大 鼠心臟血流量的連續變化。Sham組大鼠心臟血流量在本觀察過程中沒有明顯變 化。I/R組大鼠心臟血流量在缺血和再灌注期間顯著地降低，CPO. lg/kg連續給 藥沒有顯著地抑制缺血再灌注后的大鼠心臟血流量的降低。CPO. 4+I/R組在再灌 注5分和再灌注60分可顯著抑制再灌注引起的血流量的降低。CPO. 8+I/R組從 再灌注5分到再灌注60分的期間內，均可顯著抑制再灌注引起的血流量的降低。
圖16表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠 再灌注60分鐘時心臟TTC染色圖。Sham組大鼠心臟未見梗死區域，1/R組大鼠心臟 可見較大的呈白色染色的梗死區域。CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組和CP0. 8+I/R組 心肌梗死區域顯著地減少。
圖17表示Sham組、1/R組、CP0.1+I/R組、CP0.4+I/R組、CP0.8+I/R組大鼠再 灌注60分鐘時心臟心肌梗死面積統計分析結果。ITR組大鼠心肌梗死區面積為 15.55±2.14%。 CP0.1+I/R組、CP0.4+I/R組和CP0.8+I/R組大鼠心肌梗死面積分別為8.32±1.42%、 7.65±1.66%、 7.56±2.57%，顯著地減少了缺血再灌注引起的心 肌梗死的面積。
圖18為Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4十I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠再 灌注90時心臟TUNEL染色的圖象。Sham組大鼠偶見TUNEL陽性的心肌細胞，1/R組 大鼠心臟可以觀察到大量的TUNEL陽性的心肌細胞，CP0.1+I/R組、CP0.4+I/R組、 CPO. 8+I/R組的TUNEL陽性心肌細胞均明顯地減少。
圖19表示Sham組、1/R組、CPO. l+I/R組、CPO. 4+I/R組、CPO. 8+I/R組大鼠心 臟TUNEL陽性心肌細胞結果。Sham組大鼠TUNEL陽性心肌細胞僅為0.36土0. 11個/ 視野，1/R組大鼠TUNEL陽性心肌細胞為14.7士1.17個/視野，顯著多于Sham組。 CPO. l+I/R組、CP0.4+I/R組、CP0. 8+I/R組大鼠TUNEL陽性心肌細胞數量分別為7. 1 ±0.54、 7.23±0.66和6.4±0.44 (個/視野)，均顯著地低于I/R組。
圖20A表示各組外周血粒細胞粘附分子CDllb的變化。假手術組外周血粒細 胞粘附分子CD1 lb平均熒光強度為3L 11 ± 1. 23。缺血再灌注組外周血粒細胞粘附 分子CDllbCDllb平均熒光強度上升至41.86土2.87,顯著地高于假手術組。復方 丹參滴丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg預投入后對粒細胞粘附因子CDllb的表達的 增加沒有顯著的抑制作用。
圖20B表示各組白細胞粘附因子CD18的變化，假手術組白細胞粘附分子CD18 平均熒光強度為49. 1±3. 59。缺血再灌注組的白細胞粘附分子CD18平均熒光強度 上升至68.93土4.21，顯著地高于假手術組。復方丹參滴丸O. lg/kg， 0.4g/kg和 0. 8g/kg預投入后白細胞粘附因子CD18的熒光強度值分別為54. 15±2. 09， 57. 42 ±2. 16和56. 73±2. 79，顯著地抑制了缺血再灌注引起的白細胞表面粘附分子 CD18的表達。
具體實施方式
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以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。 實施例1
本發明的滴丸是如下方法制成的丹參提取物4-60重量份，三七提取物2-18 重量份，冰片卜10重量份，按處方量將丹參提取物，三七提取物和冰片細粉混合 均勻待用，丹參提取物4-60重量份，三七提取物2-18重量份，冰片1-10重量份， 按處方量將丹參提取物，三七提取物和冰片細粉混合均勻待用，按處方量，將丹參提取物，三七提取物和冰片粉碎，混合均勻待用；按藥粉基質l : 1-2將基質
PEG6000或PEG400熔融后，加入藥物混合均勻，60-9(TC保溫，以20-70滴/分鐘加 入甲基硅油中，收集滴丸即得。本發明制劑工藝先進、質量穩定可控、療效確切。 實施例2
本發明的復方丹參滴丸的制備工藝步驟為(l)將丹參和三七混合或單獨制 成水提液或醇提液；(2)對所述的提取液進行初步澄清處理；(3)進一步對所述的 提取液進行超濾處理；(4)將超濾液濃縮，加入冰片，制成滴丸。
權利要求
1、復方丹參滴丸在制備治療和/或預防心臟微循環障礙和心肌損傷的藥物中的應用。
2、 權利要求i的應用，其特征在于，所述復方丹參滴丸主要成份是丹參、三七 和冰片組成的中藥復方制劑。
3、 權利要求l的應用，其特征在于，所述應用是復方丹參滴丸一次性預投入可 以改善缺血再灌注微循環障礙和心肌損傷。
4、 權利要求1的應用，其特征在于，所述應用是復方丹參滴丸多次預藥對缺血 再灌注引起的心臟微循環障礙和心肌損傷的防護作用。
5、 權利要求3的應用，其特征在于，所述應用是預防缺血再灌注引起的心臟微 循環障礙，包括抑制冠狀血管細動脈的收縮，血流速度降低，白蛋白漏出增 力口，血流量降低和心肌血流量的降低。
6、 權利要求3的應用，其特征在于，所述應用是改善缺血再灌注微循環障礙和 心肌損傷，該作用與其抑制粒細胞粘附分子CD18的表達，抑制MP0的活化， 卜k13-a降解和P50的核轉移，抑制心肌細胞調亡相關。
7、 權利要求l的應用，其特征在于，所述應用是復方丹參滴丸多次性預給藥可 以劑量依存地預防缺血再灌注引起的心臟血流量的降低，抑制心肌細胞的損 傷。
8、 權利要求4的應用，其特征在于，所述多次預給藥是0. lg/kg、 0.4g/kg和 ().8g/kg用量的復方丹參滴丸多次預給藥可以劑量依存地抑制缺血再灌注后 心臟血流量的降低。
9、 權利要求4的應用，其特征在于，所述多次預給藥是0. lg/kg、 0.4g/kg和 0. 8g/kg用量的復方丹參滴丸多次預給藥可以劑量依存地抑制心臟梗死面積 和凋亡的心肌細胞數。
10、 權利要求4的應用，其特征在于，所述多次預給藥是0. 1g/kg、 (). 4g/kg 和().8g/kg用量的復方丹參滴丸多次預給藥可以劑量依存地抑制外周血粒細 胞黏附分子CD18的表達。
全文摘要
本發明涉及中藥產品的新用途，特別涉及復方丹參滴丸在治療和/或預防心臟微循環障礙和心肌損傷中的應用，本發明的實驗表明，復方丹參滴丸一次性預投入可以改善缺血再灌注微循環障礙和心肌損傷，復方丹參滴丸多次預給藥對缺血再灌注引起的心臟微循環障礙和心肌損傷的防護作用。
文檔編號A61K31/045GK101530467SQ20081005243
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月13日 優先權日2008年3月13日
發明者連 劉, 劉育英, 衛曉紅, 凱 孫, 昕 常, 響 李, 李志新, 芳 王, 胡白和, 娜 趙, 趙新榮, 韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司