專利名稱：二羥基苯基乳酸的抗血栓應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥產品的新用途，特別涉及丹參提取物二羥基苯基乳酸在治療和預防血栓
中的應用。
背景技術：
丹參為中國的傳統中藥,其主要水熔性成份是二羥基苯基乳酸(丹參素)，丹參酸甲酯,次
甲丹參醌，丹參酚，乙，丙，e-谷甾醇，3， 4-二羥基苯甲醛,兒茶精，蕓香甙，原兒茶醛,原兒
茶酸，乳酸,維生素E等.經口投入丹酚酸類化合物后，在血清內可以檢測到的丹參水溶性 成分主要是二羥基苯基乳酸
HO、 ^^^^ yCH2CH(OH)COOH
又名丹參素-D(+) e-(3,4-二羥基苯基)乳酸u)是丹參水溶性各種成分的基本結構成
分，已被證明有抗氧化、抗纖維化等作用。
血管中的血栓是心血管是心腦血管疾病發生與致命性的決定因素。對于易感人群來說， 抗血栓藥則被廣泛地認為是一種降低這種風險有效的方法。臨床上，阿斯匹林由于其可 以抑制血小板聚集，因而已經普遍地應用于這種用途。然而，阿斯匹林易導致出血的副 作用促使人們開發出新型抗血栓的治療方案。
血栓主要由于血管內皮損傷所致，隨著活性氧簇的產生而產生，而那些活性氧簇則促進
血小板和白細胞表達出選擇蛋白和粘附分子從而粘附于內皮。超氧化物歧化酶(S0D)， 以及維生素C和E報道具有抗血栓的作用。抗粘附分子的單克隆抗體也發現具有抑制白 細胞粘附于內皮細胞的作用。因此，可以設想通過抑制活性氧簇的產生和粘附分子的 表達可能在早期中斷血栓形成的過程。
本發明人在對丹參中的提取物二羥基苯基乳酸進行的研究過程中，發現二羥基苯基乳酸 具有延遲血栓發作的作用，DLA還可以延長血栓本體積時間。
發明內容
本發明提供一種丹參提取物的新的治療用途。所述新的治療用途，是用丹參提取物治療血栓。
為此，本發明提供一種藥物新用途，即用丹參提取物制備一種治療和預防血栓的藥物。 本發明所述丹參提取物為二羥基苯基乳酸。
本發明所述的二羥基苯基乳酸是現有技術，可以從市場上買到，也可以根據現有技術制 備，符合藥用標準即可。優選純度>50%，更優選純度>90%，最優選純度>98%。 本發明所述制備的藥物，是用上述丹參提取物作為藥物活性成分制備成的藥物制劑組合 物。
本發明的藥物制劑組合物，根據需要可以含有藥物可接受的載體，其中丹參提取物作為 藥物活性成分，其在制劑中所占重量百分比可以是O. 1-99.9%，其余為藥物可接受的載體。 木發明的藥物制劑組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單位， 如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋，注射劑的每支等。 本發明的藥物制劑組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、 薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、 沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬 膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。
本發明的中藥制劑，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀 釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。 適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀 粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬 脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉。
可通過混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復混合可使活性物 質分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中。
口服液體制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者 可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的干燥產品。這種液體制劑可含有常 規的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧 甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸 酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘 油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山 梨酸，并且如果需要，可含有常規的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發明的活性物質和無菌載體。根據載體和濃度， 可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質溶解在一種載體中， 在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、
防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩定性，可在裝入小瓶以后將這 種組合物冰凍，并在真空下將水除去。
本發明的中藥制劑，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥 物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸 半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、 EDTA二鈉、E)TA鈣鈉， 一價堿金屬的碳酸鹽、 醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳 酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露 糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯垸酮、甘油、土溫80、 瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環糊精、P —環糊精、磷脂類材料、 高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。
本發明的制劑在使用時根據病人的情況確定用法用量，可每日服卜3次，每次1-2()劑，
如卜2()袋或粒或片，每劑lmg-10()0mg。
以下通過實驗數據證明本發明的有益效果
二羥基苯基乳酸(丹參素)對于大鼠光化學反應引起的小靜脈血栓的抑制作用 本研究采用微循環動態觀察系統，以光化學反應引發的大鼠腸系膜小靜脈血栓為模型考 察了二羥基苯基乳酸(丹參素)，簡稱DLA和丹酚酸B，簡稱SBA對于血栓形成以及過 氧化物產生的動態過程。此外，還使用了流式細胞儀(熒光激活細胞分揀儀[FACS])， 體外考察了 DLA和SBA對于大鼠噬中性粒細胞表達CDllb/CD18的作用。血管周圍肥大細 胞脫顆粒也進行了研究，用以評價DLA和SBA的作用。在每一個實驗中，均采用S0D作 為抗氧劑進行平行對照。 材料和方法 動物
雄性SD大鼠重2()(廣250g，購于北京大學醫學部動物中心，證書號SCXK 2002-000。大 鼠喂標準鼠飼料(北京大學醫學部動物中心)，溫度保持在24± rc ，相對濕度50± 1%。 實驗前，所有動物禁食12小時，但可以自由喝水。所有動物按照北京大學動物研究委員 會的規則進行處理。試劑
血葉啉(H畫IO購于上海紅綠光敏劑研究所(中國，上海)。DLA購于中國藥品生物制品 檢定所(中國，北京h SAB購于風山劍醫藥公司(中國，昆明)。二氫羅達明12:Ul)服) 和苯甲胺藍購于Sigma-AlcJ門'ch公司(美國)。FiTC標記的小鼠抗大鼠Cl)l th單克隆抗體， l'n'C標記的小鼠抗大鼠CD18單克隆抗體，F工TC標記的小鼠1GA， k和[MTC標記的小鼠
和k購于I5D生物科學公司(美國)。所有使用的其它藥物均為市售最高級別。 腸系膜微循環的觀察
動物采用腹腔注射20%烏拉坦G0ml/kg體重)進行麻醉。右頸靜脈和左股靜脈進行插 管以便注射藥物。腹腔中線切2cm的切口打開腹腔，腸系膜回腸部分(距腸系膜尾端1()
15cm的位置)輕輕外翻，掛在自制的透明塑料平臺上。腸系膜在恒溫槽保持:rrc并通過
不斷灌注生理鹽水保持濕潤。使用倒置的顯微鏡(DM-IRB， Lclca， Wetzlar，德國)通 過透射照明法觀察腸系膜微循環血流動力學。圖像通過懸掛于顯微鏡上的攝像機(.Ik — TU5:川，東芝，東京，日本)傳輸至彩色監視器(J2118A， TCL，惠州，中國)上，并使 用I)VI) (DVK — K25，萬利達，廈門，中國)進行記錄。在本研究中，選擇那些單--的、無 分支且無明顯彎曲的、直徑為25 45幽長度為200WH的血管測定各項參數。 血栓的誘發
本實驗中采用了光化學血栓法。
簡言之，進行l()分鐘基礎觀察后，通過股靜脈注射光敏劑HMME (lmg/kg體重)。采用熒 光顯微鏡的汞燈作光源(100W)照射波長488nm藍光光線，通過20倍目鏡聚焦于單個的 血管上。透射于血管上的光束點直徑大約為250Mm。持續照射直至血栓的達到血管直徑的 一半，通過顯微鏡觀察30分鐘監視血栓形成的動態過程。 給藥
大鼠隨機分成5組，每組6只。對照組中，所有動物進行10分鐘的基礎觀察后，通過右 側的頸靜脈插管注射生理鹽水(2 ml/kg)，持續觀察直至實驗結束。光化學反應組，所 有動物進行IO分鐘的基礎觀察后通過右側的頸靜脈插管注射生理鹽水(2ml/kg)，進行 20分鐘的基礎觀察后通過左側股靜脈插管注射剛ME (1 mg/kg體重)并進行照射。在DL八 +光化學反應、S0D+光化學反應組，所有進行10分鐘的基礎觀察后通過右側頸靜脈注射 l)LA (10 mg/kg體重)、或S0D (12000單位/kg體重)代替生理鹽水進行基礎觀察，10 分鐘后繼續通過左側股靜脈注射HMME (1 mg/kg體重)進行照射。DLA和S01)溶于生理鹽水中。在照射開始后，持續觀察30分鐘。 血栓形成動態的評價
本實驗中，測定了下列參數用以評價形成的血栓。(a)血栓起始時間，即從照射開始至 血栓出現之間的間隔時間，后者通過粘附于血管壁上的血小板進行判斷。(b)血栓的半 體積時間，即從照射開始至血栓體積到達血管直徑的一半的時間。(c)血栓/小靜脈的面 積比，即血栓與小靜脈的面積比，使用Image-Pro-Plus軟件(Media Cyhc3n1cU'i c,s公司， 美國)，在2()0nm長的小靜脈范圍內，分別在照射前以及照射后10、 2()和3()分鐘時進 行測定。
小靜脈壁的氧化應激的可視化觀察
如前所述，大鼠腸系膜小靜脈壁的氧化應激在另外的動物中測定。簡言之，腸系膜的灌 流液中連續加入熒光探針二氫羅達明DHR (lCmmo1/1)，當其與過氧化氫(I1A.)反應便轉 化成羅達明123 (5()5/5: nm)并在4S8nm波長下激發產生熒光。觀察到小靜脈壁上二氫 羅達明的熒光強度，分別在光化學反應前和反應后的30分鐘時通過高靈敏的攝像機(KB CCD c證ra C7190,濱松，日本)進行記錄，并采用IMAGP:-PUJS軟件進行分析。將光化 學反應前小靜脈壁和靜脈外間質的熒光強度差作為基線值，"二氫羅達明(I)IIR)熒光強 度比"為光化學反應后30分鐘時小靜脈壁與靜脈外間質的熒光強度差與基線值的比值。 肥大細胞脫顆粒在另外的動物中測定。在觀察后加分鐘時，大鼠腸系膜局部應用0.5% 甲苯胺藍進行活體染色來鑒定血管周圍的肥大細胞。在20倍的目鏡下，在光照區域的中 心隨機選擇三個區域記錄脫顆粒和未脫顆粒的肥大細胞，計算脫顆粒的肥大細胞與所記 錄肥大細胞總數的比值，表達為脫顆粒的肥大細胞百分率(％)。 粒細胞中粘附分子CDllb和CD18表達的測定
為了測定粒細胞中粘附分子CDllb和CD18的表達，在另外的動物中通過腹主動脈取血加 入肝素抗凝，包括每一組中的6只動物。對于DLA +光化學反應和SOD+光化學反應組的 樣品，分別加入DLA (2mg/ml)或者SOD (2mg/ml);而對于對照組或者光化學反應組的 樣品，加入等體積的賦性物。本實驗分組的所有樣品室溫培養20分鐘后加入H畫K (2.5 mg/ml)采用藍光照射5分鐘。除了加入HMME和光照外，對照組血液樣品的處理方法如 前所述。1小時后，每一組的血液樣品與1 p 1 FITC標記的抗CDllb或CD18的抗體(BI)生 物科學Phatiingen，美國)，或者與lu 1 FITC標記的小鼠同型IgGl k作為對照組室溫 條件下一起培養20分鐘。加入lml溶血素(IX) (BD生物科學Pharmingt'n，美國)，樣品中的紅細胞溶解，采用PBS離心(U)00卬m)洗滌5分鐘。之后，白細胞進行再懸浮。 使用流式細胞儀(FACS Ca]ibur， B.D.美國)測定平均熒光強度。通過FSC-SSC散點圖 選擇嗜中性粒細胞，每一樣品獲得5000個嗜中性粒細胞。 統計
統計學差異采用單因素方差分析法進行計算。P〈0.05為具有顯著性。數據表示為平均值
±標準差。
結果
圖2表示當大鼠腸系膜小靜脈暴露于光化學反應初始時，DLA和SOD對于血栓的作用。可 以看到，對照組沒有觀察到血栓。經過光化學剌激形成血栓，光化學反應組血栓的起始 時間為13. 77±2. 53s。顯然，預先給予DLA和SOD可以延長光化學反應引發血栓的時間， 它們的起始時間為別為36. 50±5. 52s和52. 85±6. 08s。
圖3表示了I1A和S0D對于光化學反應引發的大鼠腸系膜小靜脈血栓半體積時間的影響。 光化學組血栓半體積時間為50. 14土3.85s，而預先給予DLA后則顯著延長至91. 5()± 11.17s。另一方面，預先給予SOD則不會顯著影響血栓半體積時間。 圖,1描述了 l)I.A和S0D對于光化學反應中大鼠腸系膜靜脈的血栓/小靜脈的面積比。左邊 的部分顯示了面積比率的測定方法，右側則是其量化的評價結果。在光化學反應組中， 照射后l()、 20和30分鐘時，面積比率分別為48. 7±4. 58和23. 2L±5. 11。照射后20 分鐘時，預先給予DU或S0D能顯著減少血栓/小靜脈的面積比。
大鼠腸系膜小靜脈壁熒光強度的測定對于光化學反應誘發的氧化應激具有指示性的作 用，結果見圖5。如圖所示，對照組沒有觀察到二氫羅達明熒光。相反在光化學反應組， 熒光強度在照射后30分鐘時顯著增加，預先給予DLA和S0D則可以明顯地抑制小靜脈壁 上光化學反應誘發的熒光強度。
觀察30分鐘后，對光化學反應誘發的大鼠腸系膜血管周圍間質脫顆粒的肥大細胞百分率 進行了測定。結果表明，光化學反應刺激能夠明顯增加脫顆粒的肥大細胞百分率(化.M ±7. 65)，而對照組則為28. 75±2. 27。預先給予DLA和S01)則沒有觀察抑制化學反應誘 發的大鼠腸系膜中肥大細胞脫顆粒的作用，見圖6。
進行了體外實驗測定了 DU或SOD對于光化學反應誘發的大鼠粒細胞中CD] lb和Cl)18表 達的作用，結果見圖7。顯然，體外光化學反應刺激能夠引起大鼠粒細胞中O)Ub和CD18 表達的增加。預先給予SOD能夠顯著抑制光化學反應誘發的大鼠粒細胞中U)l lb的表達，但是()LA沒有這種作用(A部分)。另一方面，預先給予DLA和SOD能夠顯著抑制光化學
反應誘發的大鼠嗜中性粒細胞中CD18的表達。
結論
l)LA是丹參中主要的水溶性成份，為了說明其對于血栓的作用，本實驗利用了大鼠腸系膜 光化學反應誘發的血栓。同時，使用了微循環監視系統，保證了對于血栓的動態評價， 說明了 l)I.A可以推遲從刺激(光化學反應)到血栓起始的時間，并且能夠延長血栓半體 積時間。本實驗旨在探索一種機制，揭示了光化學反應后，預先使用[)LA可以減低二氫 羅達明在腸系膜小靜脈壁上的熒光性，使用DLA可以抑制光化學反應引起的性粒細胞中 (;1)18的表達，
總之，l)l,A可以抑制光化學引發的大鼠腸系膜血栓，表明這種成分可以臨床上應用于預防
和治療血栓。
圖l， [)LA的化學結構。
圖2， DLA和SOI〕對于光化學反應刺激的大鼠腸系膜血栓初始時間的影響。IW代表所在 組動物只受到光化學反應的刺激。DLA+PR和S0D+PR分別代表所在組動物光化學反應前預 先給與l)I.A和SOI〕治療。數據以"平均值士標準差"的方式表達。坩〕<0. ()5與光化學反應 組比較。
圖3， l)I.A和S()D對于光化學反應刺激的大鼠腸系膜血栓半體積時間的影響。W代表所在 組動物只受到光化學反應的刺激。DLA+PR和S0D+PR分別代表所在組動物光化學反應前預 先給與l兒A和S0D治療。數據以"平均值士標準差"的方式表達。#P<0. 05與光化學反應 組比較。
圖1， l兒A和SOD對于光化學反應中大鼠腸系膜靜脈的血栓/小靜脈的面積比的影響。左 邊的部分顯示了血栓/小靜脈面積比率的測定方法，右側則是血栓/小靜脈的時間進程。 PR代表所在組動物只受到光化學反應的刺激。DLA+PR和S0D+PR分別代表所在組動物光 化學反應前預先給與DLA和SOD治療。數據以"平均值士標準差"的方式表達。*P〈0.05 與對照組比較，ttP<(). 05與光化學反應組比較。
圖5， l)LA和SOD對于光化學反應中大鼠腸系膜靜脈的二氫羅達明熒光強度比率的影響。 對照組動物不進行任何治療。PR代表所在組動物只受到光化學反應的刺激。iiA+ra、和 S()D+PR分別代表所在組動物光化學反應前預先給與DLA和S()D治療。數據以"平均值士標準差"的方式表達。*1)〈().05與對照組比較，坩)〈0.05與光化學反應組比較。 圖6， DI,A和S()D對于大鼠腸系膜周圍間質脫顆粒的肥大細胞百分率的影響。對照組動物 不進行任何治療。W代表所在組動物只受到光化學反應的刺激。1)L八+I)K和S()I)+PK分別 代表所在組動物光化學反應前預先給與DLA和S〔)D治療。數據以"平均值土標準差"的 方式表達。*P<(). ()5與對照組比較，ffl)〈0. 05與光化學反應組比較。
圖7， l兒A和S()D對于體外粒細胞中粘附分子表達的影響。粘附分子表達以橫坐標上的熒 光強度表示。左側為CDllb的表達，右側CD18的表達。對照組粒細胞不進行任何治療。 W代表所在粒細胞只受到光化學反應的刺激。DLA+PR和SOD+PR分別代表所在組粒細胞 在光化學反應前預先給與DLA和SOD治療。數據以"平均值±標準差"的方式表達。*1)〈(). ()5 與對照組比較，ffl)〈(). 05與光化學反應組比較。
具體實施例方式
以下通過實施例進一歩說明本發明，但不作為對本發明的限制。 實施例1 病例1
男61歲，突發腦血栓，到醫院檢査CT、核磁共振顯示左側顳頂葉、腦干區有梗塞，使 用二羥基苯基乳酸注射液救治，七天一個療程，用完手腳不麻了，腿開始有勁了；第2 個療程用完，能喊出聲了，上廁所不用攙扶了，拄拐杖能夠行走；第3個療程，說話清 楚，行走自如。
權利要求
1、二羥基苯基乳酸在制備一種治療和預防血栓藥物中的應用。
2、 權利要求l的應用，其特征在于，所述二羥基苯基乳酸能推遲從刺激到血栓 起始時間。
3、 權利要求l的應用，其特征在于，所述二羥基苯基乳酸能夠延長血栓半體積 時間。
4、 權利要求l的應用，其特征在于，所述二羥基苯基乳酸被制備成藥物制劑組 合物用于人類血栓疾病。
5、 權利要求4的應用，其特征在于，所述藥物制劑組合物，以二羥基苯基乳酸 作為藥物活性成分，同時含有藥物可接受的載體，其中二羥基苯基乳酸在制劑中 所占重量百分比是0. 1-99. 9%，其余為藥物可接受的載體。
6、 權利要求4的應用，其特征在于，所述藥物制劑組合物，在使用時根據病人 的情況確定用法用量，可每日服J-3次，每次1-2()劑，每劑lmg-100()mg。
7、 權利要求5的應用，其特征在于，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山 梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨 酸、維生素C、 EDTA二鈉、EDTA鈣鈉， 一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽 或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木 糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖 醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土 溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環糊精、e—環糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂。
8、 權利要求6的應用，其特征在于，所述藥物制劑組合物是注射劑。
9、 權利要求l的應用，其特征在于，二羥基苯基乳酸的純度〉50%。
10、權利要求l的應用，其特征在于，二羥基苯基乳酸的純度>98%。
全文摘要
本發明涉及中藥產品的新用途，特別涉及丹參提取物二羥基苯基乳酸在治療和預防血栓中的應用，本發明實驗數據表明，二羥基苯基乳酸能推遲從刺激到血栓起始時間，還能夠延長血栓半體積時間。
文檔編號A61K31/185GK101530404SQ200810052429
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月13日 優先權日2008年3月13日
發明者劉育英, 劉連欹, 凱 孫, 王傳社, 韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司